Αφηρημένο

Ιστορικό

Ο καρκίνος του παγκρέατος είναι η τέταρτη κύρια αιτία θανάτου από καρκίνο στις δυτικές χώρες, με το χαμηλότερο ποσοστό επιβίωσης 1-χρόνου μεταξύ κοινώς διαγνωστεί καρκίνους. Οι αξιόπιστες βιοδεικτών για τη διάγνωση του καρκίνου του παγκρέατος λείπει και χρειάζεται επειγόντως να καταστεί δυνατή η θεραπευτική επέμβαση. Όπως microRNA (miRNA) πρόσφατα αναδειχθεί ως υποψήφιος βιοδείκτες για τη νόσο αυτή, διερευνήσαμε στην παρούσα πιλοτική μελέτη, οι διαφορές στην σιελογόνους προφίλ microRNA μεταξύ των ασθενών με όγκους του παγκρέατος που δεν είναι επιλέξιμες για τη χειρουργική επέμβαση, προκαρκινικές αλλοιώσεις, φλεγμονώδη νόσο ή καρκίνο-free ασθενείς μια πιθανή πρόωρη διαγνωστικό εργαλείο.

Μέθοδοι

δείγματα ολόκληρου σάλιου από ασθενείς με καρκίνο του παγκρέατος (η = 7), παγκρεατίτιδα (η = 4), IPMN (n = 2), ή υγιείς μάρτυρες (n = 4) ελήφθησαν κατά την διάρκεια ενδοσκοπική εξέταση. Μετά την πλήρη απομόνωση του RNA, την έκφραση των 94 υποψήφιων miRNAs σαρώθηκε με q (RT) PCR χρησιμοποιώντας Biomark Fluidgm. παγκρεατικά καρκινικά κύτταρα ανθρώπινης προέλευσης ήταν ξενομόσχευμα σε αθυμικούς ποντικούς ως πειραματικό μοντέλο καρκίνου του παγκρέατος.

Αποτελέσματα

Εντοπίσαμε HSA-miR-21, HSA-miR-23a, HSA-ΜΙΚ 23b και miR-29c ως απορυθμίζεται σημαντικά σε σάλιο των ασθενών με καρκίνο του παγκρέατος σε σύγκριση με τον έλεγχο, δείχνοντας ευαισθησίες 71,4%, 85,7%, 85,7% και 57%, αντίστοιχα και εξαιρετική ειδικότητα (100%). Είναι ενδιαφέρον ότι, HSA-miR-23a και HSA-miR23b υπερεκφράζονται στο σάλιο των ασθενών με παγκρεατικό καρκίνο πρόδρομο αλλοιώσεις. Βρήκαμε ότι HSA-miR-210 και αφήστε-7c υπερεκφράζονται στο σάλιο των ασθενών με παγκρεατίτιδα σε σύγκριση με την ομάδα ελέγχου, με ευαισθησία 100% και 75%, και ειδικότητα 100% και 80%, αντίστοιχα. Τελευταία HSA-miR-216 ρυθμίζεται αυξητικά σε ασθενείς με καρκίνο, σε σύγκριση με ασθενείς που διαγνώστηκαν με παγκρεατίτιδα, με ευαισθησία 50% και ειδικότητα 100%. Σε πειραματικά μοντέλα της PDAC, σιελογόνων ανίχνευση microRNA προηγείται συστηματική ανίχνευση των καρκινικών κυττάρων δεικτών.

Συμπεράσματα

νέα ευρήματα μας δείχνουν ότι οι σιελογόνοι miRNA εισάγουν διακρίσεις σε ασθενείς με καρκίνο του παγκρέατος, που δεν είναι επιλέξιμες για τη χειρουργική επέμβαση. Επιπλέον, δείχνουμε σε πειραματικά μοντέλα που σίελο ανίχνευση miRNA προηγείται συστηματική ανίχνευση των καρκινικών κυττάρων δεικτών. Η μελέτη αυτή απορρέει για τη χρήση των σιελογόνων miRNA ως βιοδείκτη για την έγκαιρη διάγνωση των ασθενών με ανεγχείρητο καρκίνο του παγκρέατος

Παράθεση:. Humeau Μ, Vignolle-VIDONI Α, Sicard F, Martins F, Bournet Β, Buscail L, et al. (2015) σιελογόνων microRNA στον καρκίνο του παγκρέατος ασθενείς. PLoS ONE 10 (6): e0130996. doi: 10.1371 /journal.pone.0130996

Επιμέλεια: Kandiah Jeyaseelan, Εθνικό Πανεπιστήμιο της Σιγκαπούρης, Σιγκαπούρη

Ελήφθη: 10 Δεκεμβρίου 2014? Αποδεκτές: 27η Μάη του 2015? Δημοσιεύθηκε: 29, Ιουνίου, 2015

Copyright: © 2015 Humeau et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Δεδομένα Διαθεσιμότητα: Όλα τα σχετικά δεδομένα είναι εντός του Υποστηρίζοντας αρχεία πληροφοριών του χαρτιού και

χρηματοδότηση:.. Αυτοί οι συγγραφείς δεν έχουν καμία υποστήριξη ή χρηματοδότηση για να αναφέρετε

Αντικρουόμενα συμφέροντα: Οι συγγραφείς έχουν καταθέσει δίπλωμα ευρεσιτεχνίας για την «χρήση των σιελογόνων microRNA για τη διάγνωση του καρκίνου του παγκρέατος ». Ένα σχέδιο έχει γραφτεί σε συνεργασία με το τμήμα μας IP (INSERM Transfert), και κατατεθεί στο πλαίσιο της # EP15305020.8, αλλά δεν είναι ακόμα διαθέσιμα στο διαδίκτυο. Παρ ‘όλα αυτά, αυτό δεν αλλάζει την τήρηση των συγγραφέων σε όλους PLoS ONE πολιτικές για την ανταλλαγή δεδομένων και υλικών. Οι συγγραφείς δεν έχουν άλλες σχετικές δηλώσεις σχετικά με την απασχόληση, παροχή συμβουλών, διπλώματα ευρεσιτεχνίας, τα προϊόντα στην ανάπτυξη ή τροποποιημένα προϊόντα.

Εισαγωγή

παγκρεατικού πόρου αδενοκαρκίνωμα (καρκίνο του παγκρέατος, PDAC) είναι η τέταρτη κύρια αιτία θανάτου από καρκίνο στις δυτικές χώρες, με τα χαμηλότερα πέντε χρόνια σε σχέση [1] και 1-ετής επιβίωση [2] ποσοστά μεταξύ των συνήθως διαγιγνώσκονται καρκίνοι. καρκίνο του παγκρέατος αναμένεται να κινηθεί προς την δεύτερη κύρια αιτία θανάτου από καρκίνο σε όλο τον κόσμο μέχρι το 2020 ελλείψει βελτιώσεις στη θεραπεία [3]. Δεν υπάρχουν μέσα για την αξιόπιστη διάγνωση της πρώιμα στάδια του καρκίνου του παγκρέατος. Κατά συνέπεια, η συντριπτική πλειοψηφία των ασθενών (85%) εμφανίζει μια προχωρημένη νόσο που καταλήγει σε ένα χαμηλό ρυθμό εκτομή (15% των ασθενών) που οδηγεί σε μια μελαγχολική συνολική μέση επιβίωση 4 έως 6 μήνες. Έτσι, ανακαλύπτουν βιοδείκτες για την έγκαιρη διάγνωση του καρκίνου του παγκρέατος μπορεί να ευνοήσει τη διαχείριση και την πρόγνωση νωρίς ασθενών.

Τα microRNAs (miRNAs) έχουν πρόσφατα αναδειχθεί ως μια νέα κατηγορία ισχυρών βιοδεικτών για τη διάγνωση του καρκίνου, συμπεριλαμβανομένων PDAC [4]. Αυτές οι ισχυροί ρυθμιστές της γονιδιακής έκφρασης μπορεί να ποσοτικοποιηθεί λεπτομερώς σε ποικίλες ιστούς και υγρά, λόγω της εγγενούς υψηλή σταθερότητα τους σε σύγκριση με τις πρωτεΐνες και αγγελιαφόρο RNA. Σπουδαιότητας, miRNAs μπορούν να ποσοτικοποιηθούν σε πολύ μικρές ποσότητες υλικού, συμπεριλαμβανομένων των μικρο-βιοψίες, και ιδιαίτερα υποβαθμισμένη δείγματα. Πρόσφατες εκθέσεις απέδειξαν ότι εκτεταμένα προφίλ miRNA μπορεί να διακρίνει επιτυχώς την κανονική από καρκινικό παγκρεατικό ιστό, και μπορεί επίσης να προβλέψει την πρόγνωση του καρκίνου ή την ανταπόκριση στη θεραπεία [4]. Η σταθερότητα των miRNAs έχει και πάλι ως υπογραμμίζεται miRNA προφίλ στο πλάσμα αποδείχθηκε πρόσφατα να διαφοροποιήσει τους ασθενείς PDAC από υγιή δείγματα αναφοράς [4]. Αυτά τα ευρήματα ανοίγουν το δρόμο για τη χρήση των κυκλοφορούντων miRNAs ως ελάχιστα επεμβατική PDAC βιοδείκτες.

Πολλά άλλα υγρά του σώματος, όπως τα ούρα, σπέρμα και το σάλιο έχουν πρόσφατα θεωρηθεί ως αποθετήρια για τη διάγνωση του καρκίνου [5,6]. Το σάλιο έχει την ανώτερη πλεονέκτημα ως συλλογή δειγμάτων είναι απλή, μη επεμβατική, προκαλεί μικρή ανησυχία από την πλευρά των ασθενών και μπορεί να επαναληφθεί. Το σάλιο έχει αποδειχθεί ότι περιέχει πρωτεΐνες /πεπτίδια, νουκλεϊνικά οξέα, ηλεκτρολύτες, και τις ορμόνες που προέρχονται από τις τοπικές και συστημικές πηγές και οι πρόσφατες μελέτες έχουν ζητηθεί ενδιαφέρον για τη χρήση σάλιο ως πηγή βιοδεικτών. Συνεπώς, η χρήση του σάλιου για την ανίχνευση των νόσων του στόματος έχει εκτενώς αποδειχθεί [7], και το σάλιο πρόσφατα αναδειχθεί ως μια πλούσια πηγή των miRNAs, όπως έχει-miR-31, για τον καρκίνο του στόματος διάγνωση [8-11]. Από την άλλη πλευρά, η χρήση σάλιο για συστηματική νόσος είναι σε μεγάλο βαθμό ασαφής. Τα τελευταία χρόνια, το μεταβολικό [12], transcriptomic [13] και μικροχλωρίδας [14] προφίλ σιελογόνων αποδείχθηκε ότι διαθέτουν διακριτική εξουσία για την ανίχνευση PDAC, με υψηλή εξειδίκευση και ευαισθησία.

Για τις γνώσεις μας, η χρήση του σιελογόνων miRNAs για τη διάγνωση του μη χειρουργήσιμη καρκίνο του παγκρέατος δεν έχει αναφερθεί μέχρι σήμερα. Κατά συνέπεια, ο στόχος αυτής της μελέτης ήταν να διερευνήσει τα επιστημονικά στοιχεία και να παρέχουν ένα σκεπτικό για τη χρήση του σάλιου για ανεγχείρητο PDAC ανίχνευσης που αντιπροσωπεύει τη συντριπτική πλειοψηφία των ασθενών που έχουν διαγνωστεί με αυτόν τον καρκίνο. Σε αυτή την πιλοτική μελέτη, διαπιστώσαμε ότι τέσσερις σιελογόνων miRNAs (HSA-miR-21, HSA-miR-23a, HSA-miR-23b και HSA-miR-29c) με επιτυχία διαχωρίζονται PDAC ασθενείς από καρκίνο χωρίς χορηγούς, ενώ η HSA-miR -210 και αφήστε-7c δείχνουν παγκρεατίτιδα και HSA-miR-216 διακρίσεις παγκρεατίτιδα από καρκίνο. Επιπλέον, δείχνουμε εδώ σε πειραματικά μοντέλα PDAC ότι σιελογόνων ανίχνευση miRNA προηγείται ανίχνευση κυττάρων δεικτών συστημικής καρκίνου. Στο σύνολό τους, παρουσιάζουμε προκαταρκτικά στοιχεία που δείχνουν σημαντικές διαφορές στα προφίλ miRNA μεταξύ σάλιο από ασθενείς με PDAC και σάλιο από ασθενείς που είναι χωρίς όγκο. Οι ανακάλυψε βιοδείκτες σιελογόνων έχουν εγγενή δυνατότητα διακρίσεις για μια μη επεμβατική διαγνωστικό εργαλείο για PDAC, σε ασθενείς που δεν είναι επιλέξιμες για τη χειρουργική επέμβαση.

Υλικά και Μέθοδοι

Ασθενείς

Αυτό το πρωτόκολλο ήταν που εγκρίθηκε από την Επιτροπή Δεοντολογίας (

Comité de Προστασίας des Άτομα Sud-Ouest et Outre Mer N ° 1

,

αριθμός 01/10/21

). Για να αποφευχθεί η μόλυνση του αίματος, ζητήθηκε από τους ασθενείς να μην βουρτσίζουν τα δόντια τους μέσα σε 45 λεπτά πριν από τη συλλογή του δείγματος. Το σάλιο συλλέχθηκαν με χρήση αποστειρωμένων συμβουλές και μικροσιφώνια κατά τη διάρκεια ενδοσκοπική εξέταση υπό γενική αναισθησία με προποφόλη. Το σάλιο τοποθετήθηκε αμέσως σε προ-ψύξη σωλήνες 1,5 ml που περιείχε μικροφυγοκέντρου και ίσος όγκος σάλιο προστατεύει αντιδραστήριο (Qiagen) και αποθηκεύτηκε στους -80 ° C μέχρι να είναι έτοιμο για χρήση. Σε αυτή την πιλοτική μελέτη, που περιελάμβανε ασθενείς ηλικίας & gt? 18 ετών οι οποίοι είχαν δώσει γραπτή συγκατάθεση τους. Άλλα κριτήρια για την ένταξη ήταν καμία αντένδειξη για τη γενική αναισθησία ή για ενδοσκοπική υπέρηχος. Πρόστιμο υλικό βελόνα αναρρόφησης χρησιμοποιήθηκε για ιστολογική, κυτταρολογική και μοριακή (ανάλυση KRAS ενεργοποίηση μετάλλαξη [15]) διάγνωση της παγκρεατίτιδας ή καρκίνο του παγκρέατος. Είκοσι ένας ασθενείς συμπεριλήφθηκαν σε αυτή τη μελέτη? 7 διαγνώστηκαν με τοπικά προχωρημένο, ανεγχείρητο καρκίνο του παγκρέατος, 4 διαγνώστηκαν με παγκρεατίτιδα (οξεία ή χρόνια) και 4 είχαν άσχετα παθήσεις του πεπτικού συστήματος (ομάδα ελέγχου) (Πίνακας 1). Οι ασθενείς με διάγνωση ενδοπορικού θηλώδη βλεννώδες νεοπλασία (IPMN) (n = 2) συμπεριλήφθηκαν επίσης. Οι ασθενείς που δεν υποβλήθηκαν σε θεραπεία πριν από τη συλλογή του σάλιου.

Η

Πειραματικό πρωτόκολλο

Όλα τα πειράματα τα ζώα διεξήχθησαν σύμφωνα με τις εθνικές δεοντολογικές κατευθυντήριες γραμμές για την πειραματική έρευνα και το πρωτόκολλο εγκρίθηκε από την περιφερειακή επιτροπή δεοντολογίας της Anexplo UMS 006 για τα πειράματα σε ζώα και εκτελέσθηκαν σύμφωνα με τον οδηγό για τη Φροντίδα και Χρήση των ζώων Εργαστηρίου (US National Institutes of Health). Ανθρώπινα καρκίνο του παγκρέατος προερχόμενα Mia κύτταρα PACA-2 που εκφράζουν εκκρίνεται Lucia λουσιφεράσης [16,17] αναπτύσσονται σε μέσο RPMI συμπληρωμένο με 10% ορό εμβρύου μόσχου, L-γλουταμίνη, ένα αντιβιοτικό, αντιμυκητικό κοκτέιλ (Life Technologies), και Plasmocin ( InvivoGen) σε υγροποιημένο επωαστή στους 37 ° C σε 5% CO

2. Έξι δύο εβδομάδων θηλυκοί ηυ /ηυ αναισθητοποιήθηκαν με ενδοπεριτοναϊκή ένεση πεντοβαρβιτάλης (80mg /kg) αραιωμένο σε 0,9% NaCl, συμπληρωμένο με από του στόματος αναισθησία χρησιμοποιώντας οξυγόνο /ισοφλουράνιο (2.5 μίγμα) και Mia PACA-2 κύτταρα Lucia εμφυτεύθηκαν στην ουρά του παγκρέατος, όπως περιγράφεται προηγουμένως [16,17]. έκκριση σάλιου δεν διεγείρεται από πιλοκαρπίνη. Το σάλιο ελήφθη από τη στοματική κοιλότητα με μικροπιπέττα και τοποθετήθηκε αμέσως σε προ-ψύξη σωλήνες 1,5 ml που περιείχε μικροφυγοκέντρου και ίσος όγκος σάλιο προστατεύει αντιδραστήριο (Qiagen). Συλλογή ολοκληρώθηκε σε 20 λεπτά και τα δείγματα αποθηκεύθηκαν στους -80 ° C μέχρι να αναλυθούν. Για μη επεμβατική παρακολούθηση της ανάπτυξης του όγκου, το αίμα λήφθηκε δείγμα από συλλογή οπισθοβολβικό και φυγοκεντρείται στα 1000 χ

g

για 10 λεπτά σε σωλήνες μικροφυγοκέντρου σε επεξεργασία με EDTA. παραγωγή Lucia μετρήθηκε σε 5 μΙ του πλάσματος χρησιμοποιώντας συνελεντεραζίνης (50μΜ) ως υπόστρωμα. Για τις μελέτες ποσοτικοποίηση miRNA, οι όγκοι καταψύχθηκαν σε υγρό άζωτο και αποθηκεύτηκαν στους -80 ° C μέχρι τη χρήση. Στο τέλος των πειραμάτων, τα ποντίκια θανατώθηκαν με ένεση μιας θανατηφόρου δόσης πεντοβαρβιτάλης.

RNA

εκχύλιση

Πριν χρησιμοποιήθηκαν δείγματα σιέλου, είχαν αποψυχθεί σε πάγο και φυγοκέντρηση για 15 λεπτά σε 2600 x

g

στους 4 ° C. Η ελεύθερη κυτταρικό υπερκείμενο συλλέγεται από το σφαιρίδιο και χρησιμοποιήθηκε αμέσως στο επόμενο στάδιο. Ολικό RNA απομονώθηκε από 250 μL υπερκείμενου σάλιο και από όγκους χρησιμοποιώντας το αντιδραστήριο ΤπζοΙ LS (τεχνολογίες Life) και κιτ εκχύλισης miRNAeasy (Qiagen), αντίστοιχα. ΫΝάση Ι αγωγή (ϋΝάση Ι, Qiagen) χρησιμοποιήθηκε για την απομάκρυνση μολυσματικών DNA κατά την εκχύλιση RNA. Η συγκέντρωση του ολικού RNA μετρήθηκε χρησιμοποιώντας Nanodrop Ν-100.

miRNA ποσοτικοποίηση

Σύνολο σιελογόνους, κυτταρική ή όγκου RNA (20 ng) μεταγράφηκε ανάστροφα και προ-ενισχύθηκε χρησιμοποιώντας το κιτ σύνθεσης cDNA καθολική (Exiqon), ακολουθούμενη από την ειδική στόχου ενίσχυσης (STA) χρησιμοποιώντας TaqMan προενισχυτή Master Mix (τεχνολογίες ζωής) και συγκεντρώθηκαν 94 σύνολα εκκινητών microRNA LNA PCR (Exiqon, που παρατίθενται στο S1 πίνακα). Μετά από 15 κύκλους προ-amplifaction, STA αντιδράσεις αραιώνονται 1:10 σε νερό χωρίς νουκλεάση. qPCR Μίγμα Δοκιμασίας αποτελούνταν από TaqMan Gene Expression Master Mix (τεχνολογίες Life), Αντιδραστήριο Δείγμα Φόρτωση δέσμευσης DNA Dye (Fluidigm), EvaGreen (Biorad), εμπρός και όπισθεν εκκινητή μίγματος (Exiqon) και Αντιδραστήριο Φόρτωση Δοκιμασία, και παρασκευάζονται σύμφωνα με τις υποδείξεις του κατασκευαστή . Δείγματα και δείγμα μίγμα φορτώθηκε σε ένα τσιπ Fluidigm (Fluidgm) και ποσοτική πραγματικού χρόνου PCR αντίδραση διεξήχθη στους 95 ° C για 10 λεπτά, ακολουθούμενη από 30 κύκλους στους 95 ° C για 10 δευτερόλεπτα και 60 ° C για 1 λεπτό για την Fluidigm πλατφόρμα (Fluidgm). Η τιμή του κύκλου ποσοτικού προσδιορισμού (Cq) ορίζεται ως ο αριθμός κύκλου της εκπομπής φθορισμού, η οποία υπερβαίνει εκείνη ενός σταθερού κατωφλίου. Μια Cq από 15 έως 30 θεωρήθηκε υψηλή έκφραση και ένα Cq 35 θεωρείται χαμηλή έκφραση. Μια τιμή Cq πάνω από 40 θεωρήθηκε ως μη ανιχνεύσιμο miRNA. κανονικοποίηση των δεδομένων έγινε με τη Διαχείριση RQ 1.2.1 και δεδομένων Assist 3.0 από Applied Biosystems.

Η στατιστική ανάλυση

Οι τιμές γονιδιακής έκφρασης qPCR με βάση μεταξύ των διαφόρων ομάδων συγκρίθηκαν χρησιμοποιώντας την μη παραμετρική Wilcoxon τεστ rank-sum. miRNAs υποψήφιο βιοδείκτη στη συνέχεια επιλέγονται με βάση την P & lt? 0.05

Αποτελέσματα

Αναγνώριση του καρκίνου του παγκρέατος-ειδικό σιελογόνων miRNAs

Για αυτή την πιλοτική μελέτη, επιλέχθηκαν 94 miRNAs από τη βιβλιογραφία ως εξής:. Έχουν αναφερθεί στο παρελθόν βιοδείκτες για τον καρκίνο, έχουν αναφερθεί στο παρελθόν βιοδείκτες για τον καρκίνο του παγκρέατος, ανιχνεύεται στο αίμα των ασθενών με καρκίνο ή να ανιχνευθεί στο σάλιο των ασθενών με καρκίνο (S1 πίνακα). Η έκφραση του υποψηφίου miRNAs σαρώθηκε με q (RT) PCR με τη χρήση Biomark Fluidgm σε ασθενείς με καρκίνο του παγκρέατος (η = 7), παγκρεατίτιδα (η = 4), ενδοπορικού θηλώδη βλεννώδες νεοπλασία (IPMN, η = 2) ή χωρίς καρκίνο (n = 4) (Πίνακας 1).

Από τις 94 miRNAs, 23 miRNAs ήταν μη ανιχνεύσιμα σε όλα τα δείγματα που εξετάστηκαν (S2 πίνακα). Βρήκαμε ότι το 4 miRNAs (HSA-miR-21, HSA-miR23a, HSA-miR-23b και HSA-miR-29c) ήταν σημαντικά εκφράζονται στο σάλιο από ασθενείς με καρκίνο του παγκρέατος (η = 7), ενώ μη ανιχνεύσιμο στο σάλιο του ασθενείς της ομάδας ελέγχου (n = 4? δοκιμή Wilcoxon, 0.001 & lt?

ρ

& lt? 0,03) (Εικόνα 1 και Πίνακας 2). Η έκφραση των υποψήφιων miRNAs ήταν αυστηρά ειδικό του καρκίνου του παγκρέατος (100%) με εξαιρετική ευαισθησία (που κυμαίνεται από 57% έως 86%, Πίνακας 2). Τα υποψήφια miRNAs ανιχνεύθηκαν επίσης εντός σάλιο του ασθενή με διάγνωση άλλων καρκίνων (n = 2, Πίνακας 2), ενώ HSA-miR23a και HSA-miR-23b ανιχνεύθηκαν σε σίελο των ασθενών που διαγιγνώσκονται με IPMN, καλώς χαρακτηρισμένης πρόδρομος αλλοίωση της PDAC. Αξίζει να σημειωθεί, HSA-miR-21, HSA-miR23a, HSA-miR-23b και HSA-miR-29c θα μπορούσε να ανιχνευθεί στο σάλιο των ασθενών με παγκρεατίτιδα (Σχήμα 1).

Τα αποτελέσματα παρουσιάζονται ως μουστάκια κουτί (min-max) και η μέση (+) ενδείκνυται. Η

σ

αξίας (μη παραμετρική δοκιμή Wilcoxon rank-sum) ενδείκνυται.

Η

Η παγκρεατίτιδα είναι μια κοινή φλεγμονή του παγκρέατος. Παρά τις σύγχρονες τεχνικές απεικόνισης, εξακολουθούν να υπάρχουν δυσκολίες να διαφοροποιηθούν PDAC από καλοήθεις ασθένειες όπως η χρόνια παγκρεατίτιδα ειδικά στην pseudotumoral μορφή του [15]. Τέτοια εξέταση είναι κρίσιμη για την αποφυγή περιττών εκτομή καλοήθεις αλλοιώσεις (όπως εστιακών βλαβών της χρόνιας παγκρεατίτιδας ή αυτοάνοσων παγκρεατίτιδα) ή να καθυστερήσει την θεραπεία του PDAC σε μία υποομάδα ασθενών. Έχουμε στο παρελθόν έδειξαν ότι το RNA υπογραφές [18] ή

KRAS

ανάλυση μετάλλαξης [15,19] μπορεί να είναι χρήσιμη για τη διάγνωση. Στην παρούσα εργασία, θα διερευνηθεί κατά πόσον σιελογόνων miRNA μπορεί να αντιπροσωπεύει μια μη επεμβατική μέθοδος ελέγχου για την ανίχνευση παγκρεατίτιδα. Βρήκαμε ότι σιελογόνους HSA-miR-216 μπορεί να βοηθήσει διάκριση παγκρεατίτιδα από PDAC, με εξαιρετική εξειδίκευση (100%), αλλά η κακή ευαισθησία (50%) (Πίνακας 3). Από την άλλη πλευρά, HSA-miR-210 και αφήστε-7c υπερεκφράζονται στο σάλιο των ασθενών που διαγιγνώσκονται με παγκρεατίτιδα, αλλά δεν μπορούσε να ανιχνευθεί στο σάλιο των ασθενών ελέγχου (Πίνακας 4). Επιπλέον, HSA-miR-210 παρουσιάζει αξιοσημείωτη εξειδίκευση και ευαισθησία για παγκρεατίτιδα, είτε χρόνια ή οξεία (100%, Πίνακας 3). Από την άλλη πλευρά, HSA-miR-210 ανιχνεύθηκε στο σάλιο των ασθενών με PDAC. Στο σύνολό τους, πιλοτική μελέτη μας υποδηλώνει σαφώς ότι σιελογόνων miRNAs θα μπορούσε να είναι χρήσιμη για τη διάγνωση της παγκρεατίτιδας και μη χειρουργικά εξαιρέσιμων PDAC.

Η

miRNAs σιελογόνων προηγούνται με βάση τις πρωτεΐνες, η συστηματική ανίχνευση των PDAC σε πειραματικά μοντέλα

στη συνέχεια ερευνήσαμε την κινητική των σιελογόνων ανίχνευσης miRNA σε πειραματικό μοντέλο καρκίνου του παγκρέατος. Mia PACA-2 προερχόμενα από άνθρωπο παγκρεατικά καρκινικά κύτταρα εμφυτεύθηκαν στο πάγκρεας αθυμικών ποντικών (n = 6). Βρήκαμε ότι τα κύτταρα αυτά και προκύπτουν ξενομοσχευμάτων εκφράζουν υψηλά επίπεδα HSA-miR-21, HSA-miR-23a, HSA-miR-23b και HSA-miR-29c (S3 και S4 Πίνακες). Αυτά τα κύτταρα τροποποιημένα ώστε να εκφράζουν υψηλά επίπεδα-εκκρινόμενης λουσιφεράσης για την πρωτεΐνη, συστημική-based, μη επεμβατική παρακολούθηση του όγκου [16,17]. Πειραματικό όγκους του παγκρέατος καρκίνο ανιχνεύθηκαν 25 ημέρες μετά την εμφύτευση των κυττάρων του όγκου χρησιμοποιώντας συστημική δοσολογία εκκρίνονται λουσιφεράσης και πριν γίνουν ψηλαφητοί (Σχήμα 2).

Τα αποτελέσματα είναι μέσες ± S.D. 6 βιολογικών επαναλήψεων γίνει σε πειραματική τριπλούν. Τα επίπεδα miRNA εκφράζονται σε Cq, τα επίπεδα Λουκία εκφράζονται σε σχετικές μονάδες φωτός (r.l.u.). Η γκρίζα ζώνη αντιστοιχεί σε ανίχνευση όγκου χρησιμοποιώντας εκκρίνεται Lucia ως συστημικό, δείκτη όγκου που βασίζονται σε πρωτεΐνες.

Η

Είναι ενδιαφέρον ότι, HSA-miR-21 ανιχνεύθηκε εύκολα σε υψηλά επίπεδα στο σάλιο από ποντίκια που φέρουν όγκο, συντομότερο 14 ημέρες μετά την επαγωγή όγκου (μέση Cq = 24,41 ± 1,29 Σχ.2 και S5 πίνακα), ενώ μη ανιχνεύσιμο στο σάλιο των ζώων άνευ όγκου (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Επιπλέον, οι σιελογόνοι έκφραση HSA-miR-21 παρέμειναν αυξημένα κατά τη διάρκεια του πειράματος (Σχήμα 2). Από την άλλη πλευρά, οι σιελογόνοι HSA-miR-23a, HSA-miR-23b και HSA-miR-29c ανιχνεύθηκαν σε χαμηλά επίπεδα στο σάλιο του PDAC φέρουν ποντίκια (Εικόνα 2 και S5 Πίνακα). Έτσι, επικυρώνει HSA-miR-21 ως βιοδείκτη σιελογόνων σε αυτό το πειραματικό μοντέλο της PDAC? εκτός από τα αποτελέσματά μας υποδεικνύουν έντονα ότι σιελογόνους miRNA είναι πιο ευαίσθητα από τους δείκτες συστηματικής πρωτεΐνη για τη διάγνωση των παγκρεατικών όγκων.

Συζήτηση

Ένα σημαντικό ζήτημα στην παγκρέατος έρευνα για τον καρκίνο είναι η ανάγκη των βιοδεικτών για την έγκαιρη διάγνωση, όχι μόνο για την έγκαιρη ανίχνευση της νόσου σε ομάδα ασθενών, αλλά και για να επιταχύνει τη λήψη αποφάσεων σε δύσκολα διάγνωση παγκρεατικής μάζες. Αυτό είναι εξαιρετικά σημαντικό δεδομένου ότι η επιβίωση και η πρόγνωση των ασθενών εξαρτάται από το στάδιο του όγκου κατά τη στιγμή της διάγνωσης. Θεωρητικά, η έγκαιρη διάγνωση μπορεί να επιτρέψει για την εκτομή του όγκου και συνδέεται συνήθως με την καλύτερη πρόγνωση. Ωστόσο, η δυσκολία της έγκαιρης διάγνωσης και η υψηλή επικράτηση της μετάστασης που σχετίζονται με τον καρκίνο του παγκρέατος συμβάλλουν στην μελαγχολική πρόγνωση της [1]. Έτσι, τα τελευταία χρόνια έχει παρατηρηθεί εντατική μελέτη για την αναζήτηση πιο ευαίσθητη, ειδική και αποδοτική βιοδείκτες. Μέχρι σήμερα, πολλές στρατηγικές μοριακής βάσης, multi-omics που χρησιμοποιούνται για την επίτευξη αυτού του στόχου. miRNAs ιστού αποδείχθηκε πρόσφατα ως νέα βιοδεικτών για τη διάγνωση, την πρόγνωση και την πρόβλεψη για την ανταπόκριση στη θεραπεία για τους ασθενείς με καρκίνο του παγκρέατος [4]. Αξιοσημείωτα, αυτές οι μικρές μη κωδικοποιητική RNAs μπορούν επίσης να ανιχνευθούν σε πολλές, αν όχι όλες σωματικά υγρά [20]. Κατά συνέπεια, προφίλ miRNA στο αίμα αποδείχθηκε πρόσφατα να διαφοροποιήσει τους ασθενείς με καρκίνο από υγιή δείγματα αναφοράς [4], και κυκλοφορεί ανάλυση miRNA έχουν όλο και περισσότερο προταθεί ως νέο βιοδείκτη για παγκρεατικό τη διάγνωση του καρκίνου.

Στη διάρκεια των τελευταίων χρόνων, miRNAs στο ανθρώπινο σάλιο έχει αποδειχθεί ότι είναι πιθανοί βιοδείκτες για σκοπούς διάγνωσης. Επειδή η συλλογή είναι μη επεμβατική, ατραυματική και εύκολα προσβάσιμο, χρησιμοποιώντας το σάλιο για την έγκαιρη διάγνωση της νόσου είναι ιδανικό. Ιστορικά, HSA-miR-31 ήταν ένα από τα πρώτα βιοδεικτών σιελογόνους διακρίσεις miRNA εντοπίζονται για τον καρκίνο του στόματος [21]. Πρόσφατα, η υπερ-έκφραση του έχει-miR-17 και έχει-miR-20a έχει αναφερθεί ότι σχετίζονται σημαντικά με κακή έκβαση των σιελογόνων αδενοκυστικό καρκίνωμα [22]. Επιπλέον, 13 miRNAs βρέθηκαν σημαντικά απελευθερωμένη στο σάλιο των ασθενών από το στόμα πλακώδες καρκίνωμα σε σύγκριση με τους υγιείς μάρτυρες [23]. Τέλος, σιελογόνους προφίλ miRNA διαφέρουν στο σάλιο από ασθενείς με κακοήθη από το σάλιο από ασθενείς με καλοήθη όγκο παρωτίδα, και επομένως αντιπροσωπεύουν μία νέα μη επεμβατική διαγνωστικό εργαλείο για την διάγνωση όγκων στους σιελογόνους αδένες [9]. Κατά τη διάρκεια της σύνταξη αυτού του χειρογράφου, Xie

et al

περιγράφεται ότι σιελογόνων miR-3679-5p και miR-940, δύο πρόσφατα χαρακτηρίζεται miRNAs που δεν μελετήθηκαν στην παρούσα εργασία, μπορεί να είναι ειδικά των ασθενών με χειρουργικά εξαιρέσιμων PDAC , με εύλογη εξειδίκευση και ευαισθησία [24]. Από την άλλη πλευρά, η χρήση του σάλιου για ανίχνευση miRNA δεν έχει αξιολογηθεί μέχρι σήμερα σε ανεγχείρητο PDAC ασθενείς που αντιπροσωπεύουν τη συντριπτική πλειοψηφία (85%) των ασθενών που διαγιγνώσκονται με αυτόν τον καρκίνο.

Στην παρούσα έννοια απόδειξη της μελέτη, συλλέξαμε σάλιο από ασθενείς με ανεγχείρητο καρκίνο του παγκρέατος (η = 7), παγκρεατίτιδα (η = 4), IPMN (n = 2), και ασθενείς με καρκίνο χωρίς (n = 4) υποβλήθηκαν σε ενδοσκοπική εξέταση. Άνω του 90 miRNAs δοκιμάστηκαν, 4 ταυτοποιήθηκαν ως απορυθμισμένη σημαντικά στο σάλιο των ασθενών με καρκίνο του παγκρέατος σε σύγκριση με τον έλεγχο (HSA-miR-21, HSA-miR-23a, HSA-miR-23b και HSA-miR-29c). Επιπλέον, HSA-miR-21, HSA-miR-23a και HSA-miR-23b ήταν αυστηρά ειδικά για ασθενείς με καρκίνο, με εξαιρετική ευαισθησία (71,4% και 85,7%, αντίστοιχα). Από την άλλη πλευρά, ας-7c και HSA-miR-210 απουσίαζαν στο σάλιο των ασθενών ελέγχου, αλλά εύκολα ανιχνεύσιμη στο σάλιο των ασθενών με παγκρεατίτιδα, με εξαίσια ειδικότητα και εκλεκτικότητα (HSA-miR-210).

Ωστόσο, σε αυτό το στάδιο του έργου αυτού, δοκιμές σιελογόνων απέτυχαν να διαφοροποιηθούν παγκρεατίτιδα και PDAC, όπως ανιχνεύεται HSA-miR-216 μόνο σε παγκρεατίτιδα και όχι στον καρκίνο, αλλά με την κακή ευαισθησία. Στο σύνολό τους, δείχνουμε για πρώτη φορά ότι σίελο miRNA είναι ενδεικτικά της παγκρεατικής νόσου και μπορεί να χρησιμοποιηθεί για τη διάγνωση ανεγχείρητο PDAC (HSA-miR-21, HSA-miR-23a, HSA-miR-23b) ή παγκρεατίτιδα (HSA-miR -210). HSA-miR-21, HSA-miR-23a και HSA-miR-23b βρέθηκαν σημαντικά απελευθερωμένη στο σάλιο των PDAC ασθενών χειρουργήσιμη σε σύγκριση με υγιή έλεγχο κατά τη φάση της ανακάλυψης, αλλά δεν διερευνήθηκαν περαιτέρω διότι δεν εμφανίζουν στο τουλάχιστον 4 φορές την αλλαγή στην έκφραση μεταξύ των δύο ομάδων [24].

σε αυτό το έργο, έχουμε αρχίσει να διερευνούν αν miRNAs σιέλου μπορεί να βοηθήσει για τη διάγνωση του πληθυσμού σε κίνδυνο να αναπτύξουν καρκίνο του παγκρέατος, και ως εκ τούτου θα μπορούσε να να χρησιμοποιηθεί ως δείκτης για την πρόληψη της εμφάνισης των όγκων. Εντός του πόρου θηλώδες βλεννώδες νεοπλάσματα (IPMNs) είναι μη επεμβατική πρόδρομος βλαβών του καρκίνου του παγκρέατος. Πρόσφατα, miRNAs σε ρευστό κύστη έχει αποδειχθεί για να προσδιορίσουν υψηλής ποιότητας IPMN που απαιτεί εκτομή και τον αποκλεισμό των μη βλεννώδες κύστεις υπονοώντας συντηρητική διαχείριση με υψηλή ευαισθησία και ειδικότητα [25]. Έχουμε πάρει τα προκαταρκτικά αποτελέσματα που υποδηλώνει ότι η HSA-miR-23a και HSA-miR-23b είναι επίσης παρόντα στο σάλιο από ασθενείς διαγνώστηκαν με IPMN, και θα μπορούσαν να χρησιμοποιηθούν για τη λήψη αποφάσεων στον τομέα της διαχείρισης IPMN.

Ωστόσο, μας μελέτη τείνει να δείξει ότι HSA-miR-21, HSA-miR-23a και HSA-miR-23b είναι παρόντα στο σάλιο των ασθενών με παγκρεατίτιδα, ενώ HSA-miR-210 ανιχνεύεται στο σάλιο του κλάσματος των ασθενών με PDAC . Επιπλέον, HSA-miR-23a και HSA-miR-23b είναι παρόντα στο σάλιο των ασθενών με IPMN. Αυτό θα μπορούσε εύκολα να εξηγηθεί ως παγκρεατίτιδα και IPMN είναι δύο καλά χαρακτηρισμένα PDAC πρόδρομες βλάβες, υποδεικνύοντας ότι PDAC θετικό για HSA-miR-210, ή HSA-miR-23a και HSA-miR-23b, μπορεί να προέρχεται από παγκρεατίτιδα ή IPMN, αντίστοιχα. Αντίθετα, οι ασθενείς με διάγνωση παγκρεατίτιδας και αυξημένα σιελογόνους HSA-miR-21, HSA-miR-23a και HSA-miR-23b, ή ασθενείς που διαγνώστηκαν με IPMN και αυξημένα σιελογόνους HSA-miR-23a και HSA-miR-23b μπορεί να είναι σε κίνδυνο ανάπτυξης PDAC και μπορεί να απαιτούν προσεκτική κλινική παρακολούθηση. Γνωρίζουμε ότι η παρούσα μελέτη πάσχει από μικρό μέγεθος του δείγματος και απαιτεί μια εξωτερική πληθυσμού επικύρωσης. Κατά συνέπεια, έχουμε αποτέλεσε πρόσφατα το πρώτο κλινικά σχολιασμένη ομάδα των δειγμάτων ασθενών με καρκίνο του παγκρέατος »από διάφορα ινστιτούτα (η πρωτοβουλία BACAP, https://www.chu-toulouse.fr/-projet-bacap-). Τέτοια ομάδα θα είναι πάρα πολύ κατατοπιστική για περαιτέρω επικύρωση και τη μελλοντική κλινική εφαρμογή της μεθόδου μας, επειδή αντιπροσωπεύει μια μοναδική πηγή των δειγμάτων PDAC, αλλά και επειδή είναι ανακεφαλαιώνουν την «φυσική ιστορία» αυτής της ασθένειας. Τέτοια ομάδα μπορεί να βοηθήσει στην εξακρίβωση των σιελογόνων miRNAs, σε συνδυασμό με πρόσθετες κλινικές μεταβλητές, ως νέων βιοδεικτών για τη διαχείριση των ασθενών με καρκίνο του παγκρέατος ». Επιπλέον, έχουμε ακόμα να εκτελέσουν συγκριτικές μελέτες μεταξύ διαφορετικών ασθενών με καρκίνο για να δικαιολογήσει ότι οι βιοδείκτες που προσδιορίζονται στο παρόν είναι ειδικά για τον καρκίνο του παγκρέατος.

Σε αυτό το άρθρο, έχουμε εντοπίσει HSA-miR-21, HSA-miR -23a και HSA-miR-23b που διαφορετικά εκφράζονται μεταξύ των δειγμάτων σιέλου των ασθενών με κακοήθη όγκο και τους ασθενείς με καρκίνο-free, με εξαιρετική εξειδίκευση και ευαισθησία. Ενώ HSA-miR-21 συνδέεται επίσης με πολλές φυσιολογικές συνθήκες περιλαμβάνουν αλλά δεν περιορίζονται σε καρδιαγγειακών και πνευμονικών παθήσεων, συμπεριλαμβανομένων των καρδιακών και πνευμονική ίνωση, καθώς και έμφραγμα του μυοκαρδίου, αλλά επίσης με ανοσολογικές και αναπτυξιακές διεργασίες [26], HSA-miR-21 είναι ένα από τα πιο αναφέρεται miRNA στην ογκολογία [27], συμπεριλαμβανομένου του καρκίνου του παγκρέατος [4]. Έχουμε προηγουμένως αποδείξει ότι HSA-miR-21 είναι νωρίς εκφράζεται κατά την διάρκεια του παγκρέατος καρκινογένεση [28], και ότι η στόχευση HSA-miR-21 προκαλεί υποχώρηση του όγκου σε πειραματικά μοντέλα καρκίνου του παγκρέατος [17]. Εντυπωσιακά, HSA-miR-21 φαίνεται να συνεχώς επάνω ρυθμισμένο σε καρκίνο του παγκρέατος, και να είναι ενδεικτική της κακής επιβίωση, απόκριση σε θεραπεία και /ή μεταστατική νόσο [4]. Επιπλέον, μια πρόσφατη μετα-ανάλυση απέδειξε προσφάτως κυκλοφορούντων HSA-miR-21 προγνωστικό παρά διαγνωστική αξία σε διαφορετικές μορφές καρκίνου [29]. Στην παρούσα μελέτη, εικάζουν ότι σιελογόνων HSA-miR-21 μπορεί επίσης να παρουσιάζουν ενδιαφέρον για τη διάγνωση του καρκίνου του παγκρέατος, και να ολοκληρώσει το προηγούμενο χαρακτηρισμό των σιελογόνων HSA-miR-21 για την ανίχνευση του καρκίνου του οισοφάγου [10]. Για τις γνώσεις μας, παρέχουμε ενταύθα η πρώτη απόδειξη ότι HSA-miR-23a και HSA-miR-23b θα μπορούσε να ανιχνευθεί στο σάλιο των ασθενών διαγνωστεί με καρκίνο? Ωστόσο, η ιδιαιτερότητα των δύο υποψήφιων miRNAs για PDAC είναι ακόμη να αποδειχθεί. HSA-miR-23a έχει πρόσφατα συνδεθεί με KRAS [30] και C-MYC [31] με τη μεσολάβηση οδό σηματοδότησης, και περιγράφεται ως υποψήφιος οδήγηση miRNA σε παγκρεατικού καρκίνου [30]. HSA-miR-23a έχει επίσης συνδεθεί με μειωμένη κυτταροτοξικότητα ΝΚ κυττάρων [32], ΕΜΤ [33] και την αντίσταση στη θεραπεία [34-36]. Είναι ενδιαφέρον ότι, HSA-miR-23b αποδείχθηκε πρόσφατα να ρυθμίσει autophagy συνδέονται με ραδιοαντοχή παγκρεατικών καρκινικών κυττάρων [37].

Στη συνέχεια ερευνήσαμε την κινητική του εντοπισμού των miRNAs σιελογόνων σε ένα πειραματικό μοντέλο καρκίνου του παγκρέατος. Ενώ HSA-miR-23a και HSA-miR-23b ήταν εντόνως εκφρασμένο σε ανθρώπινα καρκινικά κύτταρα του παγκρέατος που προέρχονται από ξενομοσχεύματα, ήταν ελάχιστα ανιχνεύσιμη στο σάλιο σε αυτό το μοντέλο ποντικών που φέρουν όγκο. Από την άλλη πλευρά, HSA-miR-21 ανιχνεύθηκε εύκολα σε όγκους και στο σάλιο ποντικών ξενομόσχευμα με ανθρώπινα παγκρεατικού καρκίνου που προέρχεται από κύτταρα, ενώ ανιχνεύεται στα ζώα ελέγχου. Αυτό το τελευταίο εύρημα υποδεικνύουν έντονα ότι σιελογόνων HSA-miR-21 προέρχεται από πειραματικών όγκων, πιθανότατα

μέσω

εξωσώματα που προέρχονται από όγκους, όπως περιγράφηκε πρόσφατα [38]. Επιπλέον, δείχνουμε εδώ ότι σιελογόνους ανίχνευση HSA-miR-21 προηγείται ανίχνευση ειδικών δεικτών όγκου του καρκίνου των κυττάρων σε αυτό το πειραματικό μοντέλο της PDAC. Αυτό υποδηλώνει σαφώς ότι σιελογόνων miRNA, συμπεριλαμβανομένων HSA-miR-21, είναι πιο ευαίσθητα από τους δείκτες συστημικού με βάση πρωτεΐνη για τη διάγνωση της PDAC.

Συμπέρασμα

Στο σύνολό τους, έχουμε αποδείξει εδώ μέσα για την πρώτη φορά που σίελο miRNA θα μπορούσε να είναι πολύτιμη βιοδεικτών για τη διάκριση των ασθενών με ανεγχείρητο PDAC από υγιείς μάρτυρες, και ότι σιελογόνων miR-210 μπορεί να βοηθήσει στην ανίχνευση παγκρεατίτιδα. Ενώ οι πολυκεντρικές μελέτες με μεγαλύτερα μεγέθη δειγμάτων που απαιτούνται, το έργο αυτό οφείλεται για τη χρήση των σιελογόνων miRNA ως νέων βιοδεικτών για τη διάγνωση του ανεγχείρητο PDAC.

Υποστήριξη Πληροφορίες

Πίνακα S1. miRNA ποσοτικά σε αυτή τη μελέτη

doi:. 10.1371 /journal.pone.0130996.s001

(XLSX)

S2 πίνακα. τιμές miRNAs Cq σε ολόκληρο σίελο από ασθενείς χωρίς καρκίνο (n = 4), begning παγκρεατίτιδα (η = 4), παγκρεατικό αδενοκαρκίνωμα (n = 7) ή IPMN (n = 2)

doi:. 10.1371 /journal.pone. 0130996.s002

(XLSX)

S3 πίνακα. Υποψήφιος τιμές miRNAs Cq από Mia PACA-2 κύτταρα Lucia (n = 3)

doi:. 10.1371 /journal.pone.0130996.s003

(XLSX)

S4 πίνακα. τιμές υποψήφιος miRNAs Cq από n = 6 πειραματική όγκους του παγκρέατος (ET)

doi:. 10.1371 /journal.pone.0130996.s004

(XLSX)

S5 πίνακα. Εκκρίνεται λουσιφεράσης και σιελογόνων υποψήφιος miRNAs Cq τιμές από n = 6 ποντίκια με πειραματικό όγκους του παγκρέατος

doi:. 10.1371 /journal.pone.0130996.s005

(XLSX)

Ευχαριστίες

Οι συγγραφείς θα ήθελαν να ευχαριστεί δρχ Geneviève Ταβερνιέ και ο Ζαν-José Maoret για τις χρήσιμες συμβουλές τους.