Abstract

Οι παράγοντες μεταγραφής GLI (GLI1 /GLI2) έχουν ενοχοποιηθεί για την ανάπτυξη και εξέλιξη του καρκίνου του προστάτη, αν και την κατανόησή μας για το πώς πραγματικά συμβάλλουν στη βιολογία αυτών των κοινών όγκων είναι περιορισμένη. Παρατηρήσαμε ότι η δραστηριότητα ανταποκριτή GLI ήταν υψηλότερη σε φυσιολογικά (PNT-2) και την εμφάνιση όγκων (DU145 και PC-3) ανεξάρτητου από ανδρογόνα κυττάρων σε σύγκριση με εξαρτώμενων από ανδρογόνα καρκίνου του προστάτη LNCaP κύτταρα και, ως εκ τούτου, τα επίπεδα του mRNA GLI ήταν επίσης αυξημένα. Η έκτοπη έκφραση του GLI1 ή την ιδιοσυστατικά ενεργό μεταλλαγμένο ΔNGLI2 προκάλεσε μια διακριτή πλακόστρωτο μορφολογία παρόμοια σε κύτταρα LNCaP ότι, όσον αφορά το πρώτο, συσχετίζεται με αυξημένη GLI2 καθώς και έκφραση της βασικής /στελέχους-σαν δείκτες CD44, β1-ιντεγκρίνης, ΔNp63 και BMI1, και μειωμένη έκφραση του αυλού AR δείκτη (υποδοχέα ανδρογόνων). LNCaP κύτταρα-GLI1 ήταν βιώσιμα με την παρουσία του προφίλ αναστολέα AR βικαλουταμίδη και γονιδιακής έκφρασης αποκάλυψε ότι το μεταγραφικό των κυττάρων LNCaP-GLI1 ήταν σημαντικά πιο κοντά σε DU145 και PC-3 κύτταρα από το να ελέγχει τα κύτταρα LNCaP-ΡΒΡ (κενός φορέας), όπως καθώς και τον εντοπισμό LCN2 /NGAL ως εξαιρετικά επαγόμενη μεταγραφή η οποία συνδέεται με την ανεξαρτησία ορμόνη στον καρκίνο του μαστού και του προστάτη. Λειτουργικά, τα κύτταρα LNCaP-GLI1 εμφανίζεται μεγαλύτερη κλωνική ανάπτυξη και ήταν πιο επεμβατική από τα κύτταρα ελέγχου, αλλά δεν σχηματίζουν αποικίες σε μαλακό άγαρ ή prostaspheres στην αναστολή υποδηλώνοντας ότι αυτά δεν έχουν εγγενείς ιδιότητες των βλαστικών κυττάρων. Επιπλέον, στοχευμένη καταστολή των GLI1 ή GLI2 με siRNA δεν ανέστρεψε το μετασχηματισμένο φαινότυπο των κυττάρων LNCaP-GLI1 ούτε διπλή knockdowns GLI1 /GLI2 ενεργοποιήσετε AR έκφρασης σε DU145 ή PC-3 κύτταρα. Ως εκ τούτου, η έγκαιρη στόχευση των ογκοπρωτεϊνών GLI μπορεί να εμποδίσει την εξέλιξη σε μια ορμόνη ανεξάρτητο κράτος αλλά μια πιο λεπτομερή κατανόηση των μηχανισμών που διατηρούν αυτό φαινότυπο απαιτείται για να προσδιοριστεί αν η αναστολή τους θα ενισχύσει την αποτελεσματικότητα των αντι-ορμονική θεραπεία μέσω της επαγωγής ένα αυλού φαινότυπο και την αυξημένη εξάρτηση από τη λειτουργία AR

Παράθεση:. Nadendla SK, Hazan Α, Ward Μ, Harper LJ, Moutasim Κ, Bianchi LS, et al. (2011) GLI1 παρέχει Ριζική φαινοτυπικές αλλαγές κατά LNCaP του προστάτη καρκινικά κύτταρα που περιλαμβάνει την απόκτηση μιας ορμόνης ανεξάρτητο κράτος. PLoS ONE 6 (5): e20271. doi: 10.1371 /journal.pone.0020271

Συντάκτης: James McCubrey, Καρολίνα Πανεπιστήμιο East, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 8η Φεβρουαρίου, 2011? Αποδεκτές: 18, Απριλίου, 2011? Δημοσιεύθηκε: May 25, 2011

Copyright: © 2011 Nadendla et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο ήταν κατά κύριο λόγο (και γενναιόδωρα) που υποστηρίζεται από το Πανεπιστήμιο του Middlesex Συμφωνήθηκε Σχέδιο χρηματοδότησης (SKN), του προστάτη δράσης https://www.prostateaction.org.uk/(SKN και AH: κωδικοί Grant G2007 /55, G2008 /07 και G2009 /30 ) και Barts και το London Φιλανθρωπική https://www.bartsandthelondoncharity.org.uk/(GWN). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

ο καρκίνος του προστάτη (PCA) είναι η πιο κοινή μορφή καρκίνου στους άνδρες και παρόλο που οι όγκοι ανταποκρίνονται αρχικά και σε αντι-ορμονική θεραπεία, το γεγονός ότι πολλοί όγκοι αποκτούν αντίσταση σε αυτή τη μορφή της θεραπείας παρέχει ένα σημαντικό εμπόδιο στη θεραπεία προηγμένες μορφές της νόσου. Αν και οι ακριβείς παράγοντες που προκαλούν PCa παραμένουν ασαφή, πολυάριθμες μελέτες έχουν περιγράψει γενετικές βλάβες και μηχανισμούς παρεκκλίνουσα σηματοδότηση που μπορεί να συμβάλλουν στο σχηματισμό και την εξέλιξη του όγκου, και εκείνοι που βοηθούν προσδίδουν ανεξαρτησία από ανδρογόνα έχουν ιδιαίτερο ενδιαφέρον, καθώς μπορεί να αντιπροσωπεύουν νέους στόχους για θεραπευτική παρέμβαση ( αναθεωρηθούν [1]).

Όπως συμβαίνει με πολλές μορφές όγκων, ο ρόλος των καρκινικών βλαστικών κυττάρων (CSC) έχει λάβει σημαντική προσοχή σε προστάτη της βιολογίας, ιδίως σε σχέση με την έναρξη του όγκου, αλλά και την εξέλιξη και την μεταστατική εξάπλωση (αναθεωρούνται [2] στο). Καθώς οι όγκοι του προστάτη εμφανίζει ένα κυρίως αυλού φαινότυπο συμπεριλαμβανομένης της έκφρασης AR, που πιστεύεται ότι προέρχονται από αυλού εκκριτικά κύτταρα. Ωστόσο, με βάση CD προφίλ και κυτοκερατίνη έκφρασης, έχουν χαρακτηριστικά βασικής-όπως έχουν ταυτοποιηθεί σε πρωτογενείς όγκους και μπορεί να αυξηθεί σε μεταστατικούς και ορμονοάντοχου όγκους [3], [4]. Επιπλέον, η βασική /βλαστικά κύτταρα που μοιάζουν απομονωθεί τόσο από πρωτογενείς όγκους και κυτταρικές γραμμές καρκίνου επιδείξει μεγαλύτερη ογκογονικότητα σε πειράματα ξενομοσχεύματος ποντικού [5], [6], [7], [8], [9], [10]. Σε αντίθεση, Vander Griend et al [11] πρότεινε ότι το καρκινικό κύτταρο-κίνηση μπορεί να είναι ένα ενδιάμεσο AR-κύτταρο που εκφράζει ότι «αποκτά δραστηριότητα στέλεχος-όπως» και η ετερογένεια του προστάτη υπογραμμίζεται περαιτέρω από τις μελέτες των μοντέλων ποντικιού: Wang et al [12] περιγράφεται ένα σπάνιο αυλού πληθυσμό αρχέγονων κυττάρων (που εκφράζουν Nkx3-1) που μπορεί να προκαλέσουν όγκους ενώ Lawson et al [13] βρήκαν ότι βασικών επιθηλιακών βλαστικών κυττάρων μετασχηματίστηκαν πιο αποτελεσματικά.

Hedgehog (ΗΗ) σηματοδότηση αντιπροσωπεύει μια σημαντική αναπτυξιακή μονοπάτι που εμπλέκεται στο σχηματισμό και την εξέλιξη πολλών τύπων όγκων περιλαμβανομένων εκείνων του δέρματος, του μαστού, του παγκρέατος, του εγκεφάλου και του πνεύμονα. HH σηματοδότηση, κυρίως διαμεσολαβείται από το κατάντη GLI (αναφερόμενος τόσο GLI1 και GLI2) παράγοντες μεταγραφής, συνδέεται με ογκογένεση μέσω της ρύθμισης των διαφορετικών μηχανισμών όπως πολλαπλασιασμό, τη διαφοροποίηση, την απόπτωση, μετανάστευση /την εισβολή και τη διατήρηση των πληθυσμών CSC (ανασκόπηση στο [14], [15], [16]).

Πρόσφατες μελέτες έχουν περιγράψει την ενεργοποίηση του HH σηματοδότησης σε PCa αν και τα αποτελέσματα είναι συχνά αντικρουόμενες και ο μηχανισμός (οι) με την οποία GLI συμβάλλουν στην νεοπλασία δεν είναι καλά κατανοητό (αναθεωρηθούν [17], [18]). Για παράδειγμα, αρκετές μελέτες έχουν υποστηρίξει ότι η αυξημένη έκφραση των επιθηλιακών GLI1 προωθεί το σχηματισμό όγκων [19], [20], [21]. Σε αντίθεση, Fan et al [22] παρατηρήθηκε καμία σημαντική διαφορά στην SHH ή GLI1 mRNA επίπεδα μεταξύ του όγκου και της ζώνης συμφωνημένα καλοήθη ιστό και, πιο σημαντικά, ότι GLI1 εκφράστηκε στο στρωματικά, αλλά όχι επιθηλίων, συστατικό του ΒΡΗ και προστάτη. Όσον αφορά το πιο προχωρημένο στάδιο της νόσου, έχουν υψηλά επίπεδα της πρωτεΐνης ΕΛΕΡΠΕ και GLI1 mRNA έχουν περιγραφεί στο μεταστατικό δείγματα και DHH, GLI1 και GLI2 έχουν συνδεθεί με μετατροπή σε ένα ορμονοάντοχου κατάσταση [21], [23], [24], [25]. Επιπλέον, πρόσφατες μελέτες έχουν καθιερώσει μια σύνδεση μεταξύ HH /GLI και AR σηματοδότηση στην εξαρτώμενη από ανδρογόνο (Αϋ), του επιθηλίου του αυλού LNCaP καρκίνου του προστάτη κυτταρική γραμμή και απέδειξαν ότι GLI1 διατηρεί βιωσιμότητα των κυττάρων εν απουσία δραστηριότητας AR [25], [26 ], [27], [28].

Εδώ μπορούμε να δείξουμε ότι η υψηλή δραστηριότητα GLI παρατηρείται στα ανδρογόνα-ανεξάρτητο (AI) DU145 και PC-3 επιθηλιακού καρκίνου του προστάτη κυτταρικές σειρές και ότι η έκτοπη GLI1 προωθεί την ανεξαρτησία των ανδρογόνων στο LNCaP κύτταρα τα οποία συσχετίζεται με τη μετατροπή τους σε ένα φαινότυπο περισσότερο χαρακτηριστικό των DU145 και PC-3 κύτταρα. Ωστόσο, η καταστολή GLI δεν προωθούν ένα φαινότυπο μ.Χ. στην DU145 ή PC-3 κύτταρα. Ως εκ τούτου, η έγκαιρη στόχευση των ογκοπρωτεϊνών GLI ενδέχεται να εμποδίζουν την εξέλιξη σε μια ορμόνη ανεξάρτητο κράτος, αλλά αυτή η προσέγγιση δεν μπορεί να ενισχύσει την αποτελεσματικότητα των αντι-ορμονική θεραπεία σε κύτταρα όγκου που έχουν χάσει έκφραση AR και που δεν εξαρτώνται από τη σηματοδότηση της για τη βιωσιμότητά τους .

Αποτελέσματα

Ανάλυση της έκφρασης GLI σε καρκινικά κύτταρα του προστάτη

για να διερευνήσουν ένα υποθετικό ρόλο για GLI στον καρκίνο του προστάτη, θα καθορίζεται πρώτα το επίπεδο της δραστηριότητας ρεπόρτερ GLI σε διάφορες κυτταρικές σειρές προστάτη. δραστηριότητα ανταποκριτή GLI ήταν υψηλότερη στην AI DU145 και καρκινικές κυτταρικές σειρές PC-3 προστάτη σε σύγκριση με την AD LNCaP κυτταρική σειρά καρκίνου του προστάτη και τη δραστηριότητα ανταποκριτή ήταν επίσης υψηλότερη στην AI PNT-2 φυσιολογικά επιθηλιακά κυτταρική σειρά προστάτη (Σχ. 1Α). Κατά συνέπεια, GLI1 και έκφραση GLI2 mRNA ήταν υψηλότερη σε όλες τις κυτταρικές σειρές AI σε σύγκριση με LNCaP κύτταρα (Σχ. 1Β). Ως εκ τούτου, αναλύσαμε την επίδραση της υπερ-εκφράζουν GLI1 και της ενεργού μεταλλαγμένου ΔNGLI2 κατόπιν βιολογία κυττάρων LNCaP. Το πλέον εντυπωσιακό αποτέλεσμα της έκτοπης GLI1 (eGLI1) και ΔNGLI2 που σχετίζονται με κυτταρική μορφολογία: σε αντίθεση με το χαρακτηριστικό ατρακτοειδόμορφα μορφολογία των γονικών ή ελέγχουν LNCaP-ΡΒΡ (κενός φορέας) κύτταρα, μέσα σε λίγες ημέρες τα κύτταρα μετά την μεταγωγή /αποικίες με ένα λιθόστρωτο-όπως μορφολογία ήταν εμφανή σε κύτταρα LNCaP που υπερεκφράζουν eGLI1 ή ΔNGLI2 (Εικ. 1 C). Μετά την επιλογή του φαρμάκου, τόσο LNCaP-GLI1 και τα κύτταρα LNCaP-ΔNGLI2 είχε μεταμορφωθεί πλήρως τη θέσπιση μορφολογία θυμίζει PNT-2 ή DU145 κυττάρων (βλέπε Σχ. 5Α για να δείτε την πλήρη μετατραπεί μορφολογία). Έκτοπη GLI1 και η δραστηριότητα της πρωτεΐνης ΔNGLI2 επιβεβαιώθηκε από την επαγωγή της PTCH1 mRNA (Εικ. 1D). Επιπλέον, ενδογενούς mRNA GLI2 επάχθηκε σε κύτταρα LNCaP-GLI1 ενώ, απροσδόκητα, ενδογενούς mRNA GLI1 κατεστάλη στα κύτταρα LNCaP-ΔNGLI2 αποκαλύπτοντας ότι η μορφολογική αλλαγή μπορεί να προκαλείται από GLI2 (Σχ. 1Ε). Όπως DU145 και PC-3 κύτταρα εκφράζουν υψηλά επίπεδα τόσο GLI1 και GLI2 σε σύγκριση με LNCaP κύτταρα (Εικ. 1Β), επιλέξαμε να διερευνήσει περαιτέρω τη βιολογία των κυττάρων LNCaP-GLI1.

(Α) Ανάλυση του GLI δραστικότητας ανταποκριτή λουσιφεράσης σε διάφορες κυτταρικές σειρές ανεξάρτητος από ανδρογόνο και σε σύγκριση με την κυτταρική γραμμή LNCaP ανδρογόνο-εξαρτώμενη. (Β) ανάλυση ποσοτικής PCR των επιπέδων GLI1 και GLI2 mRNA στις κυτταρικές γραμμές ανεξάρτητου από ανδρογόνο και σε σύγκριση με τα κύτταρα LNCaP (C) Cobblestone-σαν κύτταρα /αποικίες αναδύονται σε κύτταρα LNCaP με έκτοπη GLI1 ή έκφραση ΔNGLI2 (συμβολίζεται με τα βέλη). (D) qPCR ανάλυση της έκφρασης PTCH1 mRNA σε κύτταρα LNCaP-GLI1 και LNCaP-ΔNGLI2. ανάλυση (Ε) qPCR έκφρασης GLI2 mRNA σε κύτταρα LNCaP-GLI1 και έκφραση GLI1 mRNA σε κύτταρα LNCaP-ΔNGLI2. (F) Η μορφολογία των κυττάρων LNCaP που εκφράζουν EGFP δεν αλλάζει όταν συν-καλλιεργήθηκαν με κύτταρα LNCaP-GLI1.

Η

Αρχικά, η δραστικότητα ανταποκριτή GLI μετρήθηκε σε κύτταρα LNCaP-GLI1 και φαίνεται να είναι σε επίπεδο συγκρίσιμο με το PC-3 και DU145 κύτταρα (Σχ. 1 Β, στήλες πρβλ 2-4). Στη συνέχεια, θα απευθύνεται κατά πόσον η ικανότητα των eGLI1 να επάγει την πλακόστρωτα μορφολογία παρόμοια στα κύτταρα LNCaP ήταν μέσω αυτόνομων μέσων ή αν αυτό απαιτείται παρακρινής /juxtacrine σηματοδότηση μέσω μόρια που εκκρίνονται από τα κύτταρα LNCaP-GLI1 ή όχι. Η μορφολογία των κυττάρων LNCaP που εκφράζουν EGFP δεν άλλαξε όταν συν-καλλιεργήθηκαν με κύτταρα LNCaP-GLI1 αποκαλύπτοντας ότι το λιθόστρωτο που μοιάζει μορφολογία επάγεται αυτόνομα (Εικ. 1 F). Ωστόσο, δεν μπορούμε να αποκλείσουμε την περίπτωση ότι η επαγωγή της λιθόστρωτα μορφολογία παρόμοια διαμεσολαβείται μέσω υποδοχέων που εκφράζονται σε κύτταρα LNCaP-GLI1 (αρχικά με μια κανονική μορφολογία) και ότι στη συνέχεια συνδέονται προς μόρια που εκκρίνονται από τον ίδιο (ή άλλες) LNCaP- κύτταρα GLI1 ενεργώντας μέσω σηματοδότησης παρακρινούς /juxtacrine

GLI1 παρέχει ανδρογόνο ανεξαρτησία στα κύτταρα LNCaP

η έκφραση των επιθηλιακών δεικτών ερευνήθηκε για να καθοριστεί εάν ο φαινότυπος του αυλού των κυττάρων LNCaP μεταβλήθηκε από eGLI1.: AR έντονα καταστέλλεται στα κύτταρα LNCaP-GLI1 ενώ η βασική /βλαστικά όπως δείκτες CD44, β1-ιντεγκρίνης, ΔNp63 και BMI1 ήταν όλα αυξήθηκαν (Εικόνα 2Α).? Αυτό επιβεβαιώθηκε με ανάλυση Western blot για AR και CD44, με αυξημένη έκφραση κυτταρικής επιφάνειας του τελευταίου επιβεβαιώθηκε με FACS (Σχ. 2Β και C). Λόγω της ομοιόμορφης παγκόσμια μετατόπιση στην έκφραση CD44 επιλέξαμε να χρησιμοποιήσει τον ετερογενή πληθυσμό για περαιτέρω μελέτη. Όσον αφορά την εξάρτηση από ανδρογόνα, ενώ η έκθεση στον βικαλουταμίδης αναστολέα AR κατέστειλε ισχυρά τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων LNCaP-ΡΒΡ, η αυξημένη πολλαπλασιαστικού δυναμικού των κυττάρων LNCaP-GLI1 ήταν ανεπηρέαστη και αυτό επιβεβαιώθηκε με κυτταρομετρία ροής (Σχ. 2D, λωρίδες 1-4 και Ε ). Ως εκ τούτου, όπως προσδιορίζεται από την έκφραση των επιθηλιακών δείκτη και έλλειψης ευαισθησίας σε βικαλουταμίδη, αυτά τα δεδομένα υποδηλώνουν ότι eGLI1 επάγει υποχώρηση (ή απο-διαφοροποίηση) των κυττάρων LNCaP σε βασική /μορφή στέλεχος που μοιάζει που είναι φυσικά ανεξάρτητη από AR σηματοδότηση για τη βιωσιμότητα.

(Α) ανάλυση της έκφρασης qPCR επιθηλιακών δείκτη σε κύτταρα LNCaP-GLI1 σε σχέση με κύτταρα LNCaP-PBP (Σημείωση: το δεδομένα παρουσιάζονται ως φυσικοί λογάριθμοι έτσι η σχετική επαγωγή του CD44 είναι σχεδόν 7000 φορές). (Β) Ανάλυση Western blot των AR και CD44 έκφρασης σε LNCaP-PBP, LNCaP-GLI1 και τα κύτταρα DU145 (βέλη υποδηλώνουν ισομορφές CD44 κοινά σε LNCaP-GLI1 και τα κύτταρα DU145). (Γ) FACS ανάλυση της έκφρασης CD44 σε LNCaP-ΡΒΡ και LNCaP κύτταρα-GLI1. (Δ) Προσδιορισμός πολλαπλασιασμού να συγκρίνουν και να προσδιοριστεί η επίδραση της βικαλουταμίδης από τον ρυθμό πολλαπλασιασμού των LNCaP-ΡΒΡ και LNCaP κύτταρα-GLI1, καθώς και την επίδραση του AG1478 (αναστολέας EGFR) και U0126 (αναστολέας ΜΕΚ) κατά την τελευταία. (Ε) Ανάλυση του κυτταρικού κύκλου με κυτταρομετρία ροής σε LNCaP-PBP και τα κύτταρα LNCaP-GLI1 εκτίθενται σε βικαλουταμίδη.

Η

Για να διερευνήσουν περαιτέρω το θέμα, LNCaP-PBP, LNCaP-GLI1, DU145 και PC- 3 κύτταρα αναλύθηκαν με μικροσυστοιχίες DNA: παγκόσμιες προφίλ συστοιχία αποκάλυψε ότι το μεταγραφικό των κυττάρων LNCaP-GLI1 ήταν περισσότερο παρόμοια με DU145 και PC-3 κύτταρα από το να LNCaP κύτταρα-ΡΒΡ αποκαλύπτοντας έτσι το βαθμό στον οποίο LNCaP-GLI1 κύτταρα έχουν αλλάξει φαινότυπο ( Σχ. 3Α). Σε άμεση σύγκριση με κύτταρα LNCaP-ΡΒΡ, η έκφραση του 260 μεταγράφων διέφεραν περισσότερο από 10 φορές (144 έως και 116 προς τα κάτω) σε κύτταρα LNCaP-GLI1 (Σχ. 3Β και σχήματα S1 και S2). Λειτουργική ταξινόμηση αυτών των μεταγραφημάτων που παράγονται 15 οντολογική ομάδες, συμπεριλαμβανομένων εκείνων που σχετίζονται με τη βιολογία του όγκου, όπως προσκόλληση κυττάρου-κυττάρου, κυτταρική κινητικότητα, EMT (επιθηλιακά-μεσεγχυματικά μετάβαση) και την ανεξαρτησία ορμόνη (Σχήμα S3)? η τελευταία ομάδα που περιλαμβάνει LCN2 (λιποκαλίνη 2) και CAV2 (caveolin 2), που είχαν προηγουμένως ταυτοποιηθεί ως μέρος μιας κοινής υπογραφής για ανεξαρτησία ορμόνης σε καρκίνο του μαστού και του προστάτη [29]. Η πλειοψηφία των 144 αυξήθηκε μεταγραφές εκφράστηκαν σε παρόμοια επίπεδα σε κύτταρα LNCaP-GLI1 όταν συγκρίνεται με DU145 και /ή κύτταρα PC-3 (& lt? 3-πλάσια διαφορά), ενώ η έκφραση του 12 μεταγραφών (συμπεριλαμβανομένων LCN2) ήταν & gt? 3 φορές υψηλότερη σε LNCaP-GLI κύτταρα σε σύγκριση με τους δύο τύπους κυττάρων (Εικόνα S1 και Πίνακας 1). Αντίστοιχα, από το 116 μειώθηκε μεταγραφές μόνο ένα, MRPL23, εκφράστηκε & gt?. 3-φορές χαμηλότερη σε κύτταρα LNCaP-GLI1 σύγκριση τόσο με DU145 και PC-3 κύτταρα (Σχήμα S2)

(α) ένα στατιστικό σύγκριση των παγκόσμιων προφίλ γονιδιακής έκφρασης για να προσδιοριστεί το ποσοστό των μεταγράφων που εκφράζονται σε σημαντικά διαφορετικά επίπεδα σε LNCaP-ΡΒΡ, DU145 και PC-3 κύτταρα σε σύγκριση με LNCaP-GLI1 (Pearson συσχέτιση συντελεστή ≥0.7, ρ & lt? 0,05) (Β ) Heat χάρτη που δηλώνει μεταγραφές σε LNCaP-GLI1 κύτταρα όπου η αλλαγή στην έκφραση είναι τόσο & gt? 10 φορές και άκρως σημαντικά διαφορετική σε σύγκριση με τα κύτταρα LNCaP-PBP (μαθητή

t

-test, p & lt? 0,01): λίστες αριστερό πλαίσιο αυξημένη γονίδια, δεξιά λίστες πάνελ μειώθηκε γονίδια και DU145 και PC-3 κύτταρα δείχνονται για σύγκριση (* δηλώνει παραλλαγές μεταγραφής του ίδιου γονιδίου). (Γ) ανάλυση κηλίδας Western συγκρίνοντας την έκφραση ορισμένων πρωτεϊνών σηματοδότησης μεταξύ LNCaP-ΡΒΡ και LNCaP-GLI1 κυττάρων με DU145 και PC-3 προϊόντα λύσης συμπεριλαμβάνεται για σύγκριση. (Δ) Η φωσφορυλίωση του κυτταροσκελετού πρωτεΐνης MLC2 διαμεσολαβείται από ROCK στα κύτταρα LNCaP-GLI1 (Σημείωση: Το αντίσωμα για το σύνολο MLC δεν λειτούργησε στα χέρια μας).

Η

Όπως και μικροσυστοιχιών DNA προφίλ, η έκταση των μεγάλων ενεργοποίηση μονοπατιού σηματοδότησης εκτιμήθηκε με κηλίδωση Western σε κύτταρα LNCaP-GLI1. ανεξαρτησία ορμόνη συνδέεται με την ενεργοποίηση της οδού EGFR και αν και έχει αποδειχθεί ότι η έκφραση EGFR mRNA δεν αυξάνεται σημαντικά σε κυτταρικές γραμμές AI ([29] και τα δεδομένα μικροσυστοιχιών μας), μια ισχυρή αύξηση στην έκφραση της πρωτεΐνης EGFR παρατηρήθηκε σε κύτταρα LNCaP-GLI1 σε επίπεδο συγκρίσιμο με DU145 και τα κύτταρα PC-3 (Σχ. 3C). ERK (εξωκυτταρικό σήμα-Ρυθμιζόμενη κινάσης) δραστηριότητα ήταν επίσης αυξημένη σε κύτταρα LNCaP-GLI1 (Εικ. 3C) και φαρμακολογική αναστολή του EGFR ή ERK καταστέλλεται υψηλού πολλαπλασιαστικού δυναμικού τους (Σχ. 2D, βλέπε στήλες 1, 3, 5 και 6) . Όσον αφορά ΑΚΤ, αν και αυξημένη δραστηριότητα σχετίζεται με μεταλλακτική αδρανοποίηση της ΡΤΕΝ σε κύτταρα LNCaP [30], [31], [32], eGLI1 αυτό μειώνεται σε ένα επίπεδο συγκρίσιμο με κύτταρα DU145 υποδηλώνοντας ότι υπάρχουν μηχανισμός (ες) που θα μπορούσαν να αξιοποιηθούν να αποφευχθούν απώλεια αυτού του σημαντικού ογκοκατασταλτικών γονιδίων (Σχ. 3C). Αναφορικά με τον κυτταρικό σκελετό, τα κύτταρα LNCaP-GLI1 εμφανίζεται μια αύξηση του MLC2 (μυοσίνης ελαφριάς αλυσίδας 2) φωσφορυλίωση η οποία ήταν παρόμοια τόσο DU145 και PC-3 κύτταρα (Σχ. 3C και τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). MLC2 ρυθμίζει τον κυτταρικό σκελετό ακτίνης (συμπεριλαμβανομένου του σχηματισμού ινών στρες) και είναι η ίδια που ρυθμίζονται από MLCK (μυοσίνης ελαφριάς αλυσίδας κινάσης) και ROCK (Rho-κινάσης που σχετίζεται)? έκθεση στον Y27632 αναστολέα ROCK αλλά όχι ο αναστολέας MLCK ML-7 μειωμένη φωσφορυλίωση MLC2 αν και αυτό δεν ανέστρεψε το πλακόστρωτο που μοιάζει με μορφολογία των κυττάρων LNCaP-GLI1 (Εικ. 3D και αδημοσίευτες παρατηρήσεις). Συνοπτικά, τα στοιχεία αυτά αποδεικνύουν περαιτέρω την έκταση στην οποία LNCaP-GLI1 κύτταρα μοιάζουν DU145 και PC-3 κύτταρα.

LNCaP κύτταρα-GLI1 δεν εμφανίζουν αγκύρωση-ανεξάρτητη ανάπτυξη

HH σηματοδότησης /GLI ρυθμίζει φυσιολογικών και καρκινικών βλαστικών κυτταρικών πληθυσμών και οι πρόσφατες μελέτες έχουν περιγράψει πώς ΕΜΤ είναι εγγενές χαρακτηριστικό των κυττάρων αυτών [15], [16], [33]. Είναι ενδιαφέρον, παρά λιθόστρωτα-όπως μορφολογία τους, τα αποτελέσματα της μικροσυστοιχίας αποκάλυψε ότι eGLI1 επάγει ΕΜΤ σε κύτταρα LNCaP (Σχήμα S3). Πράγματι, η μειωμένη Ε-καδερίνη και η αυξημένη έκφραση βιμεντίνης επιβεβαιώθηκε με κηλίδωση Western, αν και αυτό δεν ήταν εξαρτάται EGFR ή ΜΕΚ-ΕΚΚ σηματοδότηση [34] (Σχ. 4Α). Κατά συνέπεια, τα κύτταρα LNCaP-GLI1 ήταν ιδιαίτερα επεμβατική μέσω ενός υποστρώματος Matrigel ™ (Εικ. 4Β) και εμφανίζονται επίσης μεγαλύτερη κλωνική ανάπτυξη όταν εμβολιάζονται σε χαμηλής πυκνότητας (Εικ. 4C). Ωστόσο, παρά την έκφραση των δεικτών «βλαστική ικανότητα» (συμπεριλαμβανομένων των CD44, β1-ιντεγκρίνης και BMI1), ΕΜΤ και μεγαλύτερη κλωνική ανάπτυξη (Σχ. 2Α, 4Α και 4C), σε αντίθεση με τα κύτταρα ελέγχου LNCaP κύτταρα-GLI1 δεν σχηματίζουν prostaspheres σε εναιώρημα ή αποικίες σε μαλακό άγαρ (Εικ. 4D). Για την αντιμετώπιση του πιθανότητα ότι LNCaP-GLI1 κύτταρα δεν πολλαπλασιάζονται σε 3-D καλλιέργεια επειδή δεν είναι σε θέση να διαφοροποιήσουν προς ένα φαινότυπο του αυλού (δηλαδή λόγω της συστατικής έκφρασης eGLI1), τα κύτταρα DU145 ήταν επίσης καλλιεργείται υπό τις ίδιες συνθήκες. Δεν αποικίες παρατηρήθηκαν σε είτε δοκιμασία με κύτταρα DU145 υποδηλώνοντας ότι AR

– κύτταρα είναι ελάχιστα κλωνογονικού σε ανεξάρτητη από προσκόλληση

in vitro

συστήματα καλλιέργειας (δεν παρουσιάζονται τα δεδομένα)? Αυτό υποστηρίζεται από Thiyagarajan κ.ά. [35] ο οποίος παρατήρησε ότι DU145 (και τα κύτταρα PC-3) ήταν πολύ λιγότερο πολλαπλασιαστική σε μαλακό άγαρ σε σύγκριση με κύτταρα LNCaP αν και μερικές ανάπτυξη αποικίας ήταν εμφανής στη μελέτη τους.

(Α ) ανάλυση κηλίδας Western σύγκριση της έκφρασης των δεικτών ΕΜΤ Ε-καδερίνης και βιμεντίνης μεταξύ κυττάρων LNCaP-GLI1 και LNCaP-ΡΒΡ (ΝΒ μείωση της Ε-καδερίνης σε κύτταρα LNCaP-GLI1 μερικώς αντιστρέφεται με την παρουσία του αναστολέα EGFR AG1478 και να σε μικρότερο βαθμό, ο αναστολέας ΜΕΚ U0126). δοκιμασία εισβολής (Β) Transwell συγκρίνοντας την επεμβατική δυναμικό των LNCaP-PBP και τα κύτταρα LNCaP-GLI1 μέσω ενός υποστρώματος Matrigel. (Γ) κλωνογονικότητας δοκιμασία αξιολόγησης της ικανότητας σχηματισμού αποικίας των LNCaP-ΡΒΡ και LNCaP κύτταρα-GLI1 όταν εμβολιάζονται σε μικρή πυκνότητα. (D) Anchorage-ανεξάρτητη ανάπτυξη παρατηρείται σε κύτταρα LNCaP-ΡΒΡ αλλά όχι LNCaP-GLI1 κύτταρα (άνω πάνελ – δοκιμασία μαλακού άγαρ αποικία? Κάτω πάνελ – δοκιμασία prostasphere).

Η

καταστολή GLI δεν προάγει ένα αυλού μοιάζουν με φαινότυπο σε μη εξαρτώμενου από ανδρογόνα καρκίνου του προστάτη κύτταρα

Τέλος, επιδιώξαμε να προσδιοριστεί εάν στοχευμένη καταστολή του GLI ήταν αρκετή για να αντιστρέψει τον μετασχηματισμένο φαινότυπο των κυττάρων LNCaP-GLI1 ή να προκαλέσει μια αυλική φαινότυπο σε DU145 ή PC-3 κύτταρα. Επιμόλυνση των LNCaP-GLI1 κύτταρα με GLI1 ή GLI2 siRNA δεν επηρεάζουν την μορφολογία των κυττάρων LNCaP-GLI1 ούτε υπήρξε οποιαδήποτε αλλαγή στην έκφραση του ΔNp63 ή AR mRNA (Σχήματα 5A-C και το σχήμα S4A.)? Αυτό υποδεικνύει ότι η φαινοτυπική μετατροπή που προκαλείται από eGLI1 σε κύτταρα LNCaP είναι μη αναστρέψιμη και ότι η διατήρηση του φαινοτύπου AI δεν εξαρτάται από GLI2. Όσον αφορά DU145 και τα κύτταρα PC-3, η αποτελεσματικότητα της διπλής knockdowns GLI1 /GLI2 επιβεβαιώθηκε από τη μείωση της δραστηριότητας GLI δημοσιογράφος, αλλά δεν υπήρξε καμία αλλαγή στη μορφολογία των κυττάρων, ούτε υπήρξε οποιαδήποτε αλλαγή στην έκφραση του ΔNp63 ή AR mRNA (Σχ. 5D -F, Εικόνα S4B και αδημοσίευτες παρατηρήσεις). Χρησιμοποιήσαμε επίσης την GANT61 αναστολέα GLI (30 μΜ) [36], αλλά αυτό ήταν λιγότερο αποτελεσματικό στην καταστολή της δραστικότητας ανταποκριτή GLI από RNAi (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Ως εκ τούτου, αν και AI κύτταρα καρκίνου του προστάτη εμφανίζουν έκφραση mRNA υψηλή GLI και δραστηριότητα και eGLI1 είναι σε θέση να προωθήσει ένα φαινότυπο ΑΙ σε κύτταρα LNCaP, καταστολή GLI δεν προάγει μια αυλού-όπως και AD φαινοτύπου σε AI κύτταρα καρκίνου του προστάτη.

(Α) Το μετασχηματισμένο μορφολογία των LNCaP-GLI1 κύτταρα δεν αντιστραφεί μετά την επιμόλυνση με GLI1 ή GLI2 siRNA. (Β) qPCR ανάλυση GLI1 και GLI2 mRNA σε κύτταρα LNCaP-GLI1 επιμολυσμένα με GLI1 ή GLI2 siRNA. (Γ) RT-PCR ανάλυση του ΔNp63 και AR mRNA σε κύτταρα LNCaP-GLI1 επιμολυσμένα με GLI1 ή GLI2 siRNA. (D) qPCR ανάλυση GLI1 και mRNA GLI2 σε DU145 και κύτταρα επιμολυσμένα με GLI1 και GLI2 siRNA 3 PC-. δραστηριότητα ανταποκριτή (Ε) GLI καταστέλλεται σε DU145 και PC-3 κύτταρα επιμολυσμένα με GLI1 και GLI2 siRNA (δραστικότητα ρεπόρτερ Ν.Β. μπορεί να επηρεαστεί από την έκφραση GLI3 σε PC-3 κύτταρα [17]). (F) RT-PCR ανάλυση των ΔNp63 και mRNA AR σε DU145 και τα κύτταρα 3 PC-επιμολυσμένα με GLI1 και GLI2 siRNA.

Η

Συζήτηση

Ο ρόλος της HH σηματοδότησης έχει αποδειχθεί αμφιλεγόμενο σε προστάτη βιολογία? αυτό περιλαμβάνει συζήτηση ως προς το κατά πόσον ή όχι η οδός συμβάλλει στο σχηματισμό πρωτογενούς όγκου καθώς και την πραγματική λειτουργία σηματοδότησης (αυτοκρινή ή παρακρινή). Επιπλέον, υπήρξε συγκρουόμενα δεδομένα για το εάν ή όχι Gli έκφραση προκαλείται μέσω κανονικών ή μη-κανονικών μονοπατιών σε κυτταρικές σειρές προστάτη (που επισκοπείται στο [18]). Δεν έχουν ασχοληθεί με την φύση της ρύθμισης GLI αλλά έχουν δείξει ότι το AI κυτταρικές γραμμές υψηλότερα επίπεδα GLI mRNA από το AD LNCaP κυτταρική σειρά καρκίνου του προστάτη και PNT-2, DU145 και οθόνη PC-3 αυτό συσχετίζεται με αυξημένη δραστηριότητα GLI ανταποκριτή (Σχ . 1Α και Β). Το γεγονός ότι η έκφραση GLI1 ήταν συγκρίσιμη μεταξύ των κανονικών PNT-2 κύτταρα και την εμφάνιση όγκων DU145 και PC-3 κύτταρα ήταν αναπάντεχη, αλλά σε αντίθεση με Karhadkar et al [21], βρήκαμε επίσης ότι GLI1 το mRNA εκφράζεται έντονα σε εμπορικές πρωτογενή προστάτη βασικά επιθηλιακά κύτταρα (PRECs), αν και μια πιστή σύγκριση με τις κυτταρικές σειρές που χρησιμοποιήθηκαν σε αυτή τη μελέτη δεν ήταν δυνατή επειδή PRECs καλλιεργούνται σε ειδικό μέσο που δεν περιέχει ορό (SKN και GWN, μη-δημοσιευμένο). Παρά τις παρατηρήσεις αυτές, σε GLI1 επίπεδο πρωτεΐνης είναι σπάνια ανιχνεύεται στη βασική στοιβάδα του φυσιολογικού ιστού ανθρώπινου προστάτη, ενώ η έκφραση είναι περισσότερο διαδεδομένη σε υπερπλαστικά βασικά κύτταρα και τα καρκινώματα [20]. Ως εκ τούτου, κατά τρόπο παρόμοιο με ρύθμιση GLI2 [37], αν και η έκφραση GLI1 mRNA είναι σταθερή μεταξύ φυσιολογικών και ογκογόνο κύτταρα, η πρωτεΐνη μπορεί να σταθεροποιηθεί στην τελευταία (πιθανόν μέσω συντετηγμένων [38]) και αυτό, μαζί με την GLI2, θα μπορούσε να εξηγήσει την αύξηση της δραστηριότητας ρεπόρτερ GLI.

Τα δεδομένα μας δείχνουν ότι GLI1 επάγει ανδρογόνο ανεξαρτησία σε κύτταρα LNCaP μέσω της ικανότητάς του να επάγει μια βασική φαινότυπο που σχετίζεται με κυτταρικούς πληθυσμούς βασική και ότι είναι φυσικά ανεξάρτητο δραστηριότητας AR? Αυτό υποστηρίζεται από μειωμένη έκφραση AR συνδυασμό με την αύξηση των πολυάριθμων βασικών /σημειωτές στέλεχος-όπως. Chen et al [26] περιγράφεται επίσης ένα ρόλο για GLI1 στην προώθηση της ανάπτυξης ΓΠ σε LNCaP κύτταρα, αλλά αυτό δεν συσχετίστηκε με μειωμένη έκφραση AR και μπορεί να αντανακλά το γεγονός ότι η έκφραση eGLI1 ήταν χαμηλότερη στο σύστημά τους, όπως καθορίζεται από μικρότερο πτυσσόμενο αύξηση του δραστηριότητα δημοσιογράφος GLI1. Αν και οι μελέτες μας εκτελέστηκαν σε έναν ετερογενή πληθυσμό κυττάρων, ο φαινότυπος ήταν ομοιόμορφη και δεν ήταν σε θέση να απομονώσουν κλωνικές γραμμές LNCaP-GLI1 που διατηρούν κανονική μορφολογία LNCaP υποδεικνύοντας ότι ρετροϊική eGLI1 προάγει μία απόκριση «όλα ή τίποτα», αλλά ως το επίπεδο του GLI δραστηριότητα ανταποκριτή ήταν συγκρίσιμη με DU145 και PC-3 κύτταρα Αυτό υποδεικνύει ότι το σύστημά μας έχει βιολογική σημασία. Πώς eGLI1 μεσολαβεί ο μετασχηματισμός των κυττάρων LNCaP δεν έχει διευκρινιστεί, αλλά μπορεί να περιλαμβάνει πολλαπλούς μηχανισμούς: eGLI1 αναστολή της AR σηματοδότησης και μόνο είναι απίθανο να κινήσει τη φαινοτυπική αλλαγή, αλλά, σε συνδυασμό με την ικανότητά του να διατηρήσει τη βιωσιμότητα των κυττάρων εν απουσία σηματοδότησης AR [27] [28], η παρούσα μπορεί να συνθέσει τις επιδράσεις του κύριου ρόλου της ως μεταγραφικός ενεργοποιητής.

όπως σημειώνεται παραπάνω, eGLI1 αυξημένη συνολική δραστηριότητα GLI σε κύτταρα LNCaP σε επίπεδο συγκρίσιμο με DU145 και PC-3 κύτταρα. 3Β.