Αφηρημένο

διήθηση μακροφάγων είναι ένας αρνητικός προγνωστικός παράγοντας για τους περισσότερους καρκίνους, αλλά γαστρεντερικού όγκους φαίνεται να αποτελεί εξαίρεση. Η επίδραση των μακροφάγων για την εξέλιξη του καρκίνου εξαρτάται από τον φαινότυπο τους, η οποία μπορεί να ποικίλει μεταξύ Μ1 (προ-φλεγμονώδεις, αμυντικό) προς M2 (ανεκτικογόνος, προ-καρκινικές). Γαστρεντερικούς καρκίνους συχνά γίνονται μια έκτοπη πηγή γαστρίνες και μακροφάγων παρόντες υποδοχείς για τα πεπτίδια αυτά. Ο σκοπός της παρούσας μελέτης είναι να αναλύσει κατά πόσο γαστρίνες μπορεί να επηρεάσει το μοτίβο των μακροφάγων διείσδυση σε όγκους παχέος εντέρου. Έχουμε αξιολογήσει την σχέση μεταξύ της έκφρασης της γαστρίνης και του τρόπου διεξαγωγής των μακροφάγων διείσδυση σε δείγματα από καρκίνο του παχέος εντέρου και την επίδραση αυτών των πεπτιδίων στον φαινότυπο των μακροφάγων διαφοροποιούνται από ανθρώπινα περιφερικά μονοκύτταρα in vitro. Ο συνολικός αριθμός των μακροφάγων (CD68 + κύτταρα) ήταν παρόμοια σε όγκων και φυσιολογικό περιβάλλοντα ιστό, αλλά ο αριθμός των Μ2 μακροφάγα (CD206 + κύτταρα) ήταν σημαντικά υψηλότερη στον όγκο. Ωστόσο, ο αριθμός αυτών των όγκων που σχετίζονται με M2 μακροφάγα συσχετίζεται αρνητικά με την ανοσοαντιδραστικότητα για γαστρίνης πεπτίδια σε επιθηλιακά κύτταρα του όγκου. Τα μακροφάγα διαφοροποιούνται από ανθρώπινα περιφερικά μονοκύτταρα παρουσία προγαστρίνη έδειξε χαμηλότερα επίπεδα Μ2-δείκτες (CD206, IL10) με κανονικές ποσότητες του Μ1-δείκτες (CD86, IL12). Προγαστρίνη προκάλεσε παρόμοιες επιδράσεις στις ώριμες μακροφάγα αγωγή με IL-4 για να αποκτήσετε ένα M2-φαινότυπο ή με LPS συν ΙΡΝγ για να δημιουργήσει Μ1-μακροφάγα. Τα μακροφάγα διαφοροποιούνται παρουσία προγαστρίνη παρουσίασε μειωμένη έκφραση προσδεμάτων Wnt και μείωσε τον αριθμό και την αύξηση του κυτταρικού θανάτου του συν-καλλιεργημένων επιθηλιακών κυττάρων καρκίνου του παχέος εντέρου. Τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι προγαστρίνη αναστέλλει την απόκτηση ενός Μ2-φαινότυπο σε ανθρώπινα μακροφάγα. Αυτή η επίδραση που ασκείται επί των μακροφάγων που σχετίζονται με όγκο μπορούν να διαμορφώσουν την εξέλιξη του καρκίνου και θα πρέπει να λαμβάνονται υπόψη κατά την ανάλυση της θεραπευτικής αξίας της γαστρίνης ανοσοεξουδετερώσεως

Παράθεση:. Hernández C, Barrachina MD, Cosín-Roger J, Ortiz-Masiá D, Álvarez Α, Terrádez L, et al. (2014) προγαστρίνη καταστέλλει την Εναλλακτική ενεργοποίηση των ανθρωπίνων μακροφάγων κυττάρων και ρυθμίζει την επιρροή τους για τον καρκίνο του παχέος εντέρου επιθηλιακά κύτταρα. PLoS ONE 9 (6): e98458. doi: 10.1371 /journal.pone.0098458

Επιμέλεια: Ιωσήφ Najbauer, Πανεπιστήμιο του Πετς Ιατρική Σχολή, την Ουγγαρία

Ελήφθη: 4 Δεκέμβρη του 2013? Αποδεκτές: 4 του Μάη 2014? Δημοσιεύθηκε: 5 Ιουνίου του 2014

Copyright: © 2014 Hernández et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Το παρόν έργο υποστηρίχθηκε από Ministerio de Educación y Επιστημών /ΕΤΠΑ [αριθμός επιχορήγηση SAF2007-064201], Ministerio Επιστημών e Innovación [αριθμούς επιχορήγηση SAF2010-20231, SAF2010-16030 και RYC-2011 – 09571], υπουργείου Υγείας και προστασίας των καταναλωτών [αριθμός επιχορήγηση PI11 /00327], CIBERehd [αριθμός επιχορήγηση CB06 /04/0071] και Generalitat Valenciana [αριθμός επιχορήγηση PROMETEO /2010/060]. Carlos Hernandez αναγνωρίζει την υποστήριξη του προγράμματος «Ramon y Cajal» από Ministerio Επιστημών e Innovación της Ισπανίας (RYC-2011 – 09571). Jesús Cosín-Roger υποστηρίζεται από FPU υποτροφίες από το Ministerio de Educación, Cultura y Deporte. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

τα μακροφάγα είναι μια σημαντική συνιστώσα των όγκων και να εμφανίσετε μια ποικιλία λειτουργιών, ανάλογα με το τοπικό περιβάλλον. Μπορούν να είναι προ-φλεγμονώδης και βοηθούν να παράγουν προσαρμοστικές άνοσες αποκρίσεις (κλασικά ενεργοποιημένα μακροφάγα, Μ1) ή ανεκτικογόνο /αντι-φλεγμονώδη (εναλλακτικά ενεργοποιημένα μακροφάγα, Μ2) [1], [2]. Σχετίζεται με όγκο-μακροφάγα (ΤΑΜ) συχνά μοιάζουν M2-μακροφάγων και, ως εκ τούτου, αντί να αγωνίζονται κατά καρκινικών κυττάρων, αυτά τα λευκοκύτταρα προωθούν την ανάπτυξη του όγκου αμβλύνοντας την ανοσοαπόκριση και μέσα από την έκκριση της ανάπτυξης και αγγειογενετικών παραγόντων, καθώς και τα ένζυμα που είναι απαραίτητα για την κυτταρική εισβολή. Κατά συνέπεια, η παρουσία των ΤΑΜ έχει συσχετιστεί με μειωμένη επιβίωση σε ασθενείς με π.χ. μελάνωμα, μαστού, νεφρών ή του καρκίνου της ουροδόχου κύστης. Η κατάσταση φαίνεται να είναι διαφορετική σε ορισμένες καρκινικές διαδικασίες που επηρεάζουν το γαστρεντερικό σωλήνα. Σε ασθενείς με ορθοκολικό ή γαστρικών καρκίνων υψηλότερη διείσδυση μακροφάγων συσχετίζεται με καλύτερη πρόγνωση [3]. Οι λόγοι για αυτή την απόκλιση ρόλος των μακροφάγων σε αυτές τις συγκεκριμένες ασθένειες είναι καθόλου σαφές, αλλά από την τρέχουσα γνώση μπορεί κανείς να συμπεράνει ότι η ορθοκολικό /γαστρικού μικροπεριβάλλον του όγκου σηματοδοτεί μια διαφορετική ισορροπία στη λειτουργία του διεισδύσει Μ1 και Μ2 μακροφάγα, με M2 μακροφάγα ασκώντας ένα ελαττωματικό αντίθεση με τις συνημμένες M1-φαγοκύτταρα [4], [5]. Ωστόσο, οι μηχανισμοί που είναι υπεύθυνοι για αυτή την επίδραση είναι άγνωστος.

Οι περισσότεροι αδενωματώδεις πολύποδες, του παχέος εντέρου και του γαστρικού όγκοι εκφράζουν εκτοπικά το γονίδιο γαστρίνης. Ωστόσο, αυτά τα καρκινικά κύτταρα δεν παρουσιάζουν ενδοκρινών φύση και κυρίως συνθέσει το πρόδρομο ορμόνη προγαστρίνη [6] – [8], η οποία έχει πολλαπλασιαστική δράση επί των καρκινικών κυττάρων [9]. Αν και προγαστρίνη μπορεί να συνδέονται με χαμηλή συνάφεια προς γαστρίνης CCK-2 υποδοχέων και αυτή η αλληλεπίδραση μπορεί να συνεισφέρει σε κάποιο βαθμό στην βιολογική ενεργότητα του [10], αποτέλεσμα προαγωγής της ανάπτυξης προγαστρίνη φαίνεται να διαμεσολαβείται κυρίως από ένα μη συμβατικό υποδοχέα προσδιορίζονται πρόσφατα ως αννεξίνη II [9]. Έχουμε παρατηρήσει ότι η γαστρίνη ασκεί μια προ-φλεγμονώδη δραστηριότητα μέσω CCK-2 υποδοχέων [11] – [13], τα οποία εκφράζονται σε μακροφάγα και ενδοθηλιακά κύτταρα, ενώ αννεξίνη II εκφράζεται έντονα στην επιφάνεια των μακροφάγων, όπου χρησιμεύει ως στοιχείο αναγνώρισης παθογόνων και μεσολαβεί η ενεργοποίηση των μακροφάγων [14].

η υπόθεσή μας ήταν ότι τα πεπτίδια γαστρίνης τοπικά παραγόμενων σε κολονικό όγκους μπορεί να επηρεάσει τη λειτουργία των μακροφάγων και διεισδύσει, με αυτόν τον τρόπο, να διαμορφώνει την ανοσοαπόκριση σε ασθένειες. Παρατηρήσαμε ότι η έκφραση της γαστρικής πεπτιδίων σε κύτταρα όγκου του ορθού συσχετίζεται με μειωμένη διείσδυση του Μ2-μακροφάγων και έδειξε ότι ρυθμίζει την προγαστρίνη διαδικασία ωρίμανσης των ανθρώπινων μακροφάγων in vitro, και καταστέλλει την απόκτηση ενός Μ2-φαινότυπο. Προγαστρίνη μείωσε επίσης την έκκριση συνδετών Wnt από Μ2-μακροφάγων και αυξημένη ικανότητά τους να επάγουν την απόπτωση των επιθηλιακών κυττάρων καρκίνου του παχέος εντέρου.

Μέθοδοι

Ασθενείς

Είκοσι μία θεραπευτικά εκτομή ασθενείς ορθοκολικό καρκίνωμα (Πίνακας 1) επιλέχθηκαν τυχαία από ασθενείς που λειτουργεί στο Νοσοκομείο de Manises. Κανένας από αυτούς δεν είχε καμία προεγχειρητική ραδιόφωνο /χημειοθεραπεία. Αμέσως μετά την εκτομή, ένα κομμάτι που περιέχει όγκου και του περιβάλλοντος κανονικού ιστού μονιμοποιήθηκε σε ρυθμισμένη φορμαλίνη και εγκλείστηκαν σε παραφίνη. Οι έμπειροι παθολόγους τεκμηριώσει τις ιστοπαθολογικές χαρακτηριστικά των όγκων, συμπεριλαμβανομένου του σταδίου του όγκου, το βαθμό διαφοροποίησης, το μέγεθος, το λεμφικό /αγγειακή προσβολή, περινευρικό εισβολή και τη συμμετοχή των λεμφαδένων. το στάδιο του όγκου ορίστηκε σύμφωνα με το σύστημα ΤΝΜ σταδιοποίηση. Η μελέτη εγκρίθηκε από το Διοικητικό Συμβούλιο Institutional Review του Νοσοκομείου του Manises (Valencia). Γραπτή συγκατάθεση λήφθηκε από όλους τους ασθενείς.

Η

Inmunohistochemistry

Serial τμήματα (4 μm) των δειγμάτων που περιέχουν όγκο και φυσιολογικό βλεννογόνο από κάθε ασθενή βάφτηκαν για γαστρίνη, Wnt1, CD68 όπως ένα μακροφάγο δείκτη, CD86 ως δείκτης Μ1-μακροφάγων ή CD206 ως Μ2-μακροφάγων δείκτη. Τα δείγματα υποβλήθηκαν σε διάφορες μεθόδους ανάκτησης αντιγόνου, ανάλογα με τον επίτοπο (Πίνακας 2). Η ενδογενής δραστικότητα υπεροξειδάσης κατεστάλη με εμβάπτιση σε υπεροξείδιο του υδρογόνου 0,3%. Μόλις αποκλείστηκαν με 5% ορό αλόγου, οι τομές επωάστηκαν για όλη τη νύχτα (4 ° C) με το αντίστοιχο πρωτεύον αντίσωμα (Πίνακας 2). Ένα βιοτινυλιωμένο αντίσωμα αλόγου αντι-ποντικού /κουνελιού (Vector Laboratories, CA, USA, 1:200) χρησιμοποιήθηκε ως δευτερεύον αντίσωμα. Η Vectastain ABC Kit ελίτ σύστημα (Vector Laboratories, CA, USA), που ακολουθείται από την DAB ενισχυμένο σύστημα υπόστρωμα Υγρό για ανοσοϊστοχημεία (Sigma-Aldrich, Missouri, USA) χρησιμοποιήθηκαν για την ανάπτυξη. Όλοι οι ιστοί χρωματίσθηκαν για αντίθεση με αιματοξυλίνη και η εξειδίκευση της ανοσοχρώσης επιβεβαιώθηκε εάν ανάλογες τομές ιστών έδειξε την απουσία χρώσης μετά τη χρήση μη-άνοση ανοσοσφαιρίνη του ίδιου ισότυπου και την ίδια συγκέντρωση όπως το πρωτογενές αντίσωμα ή μετά παραλείποντας το δευτερεύον αντίσωμα.

Μια αντιπροσωπευτική περιοχή (στόχος 40Χ, 6 τομείς, 0,22 mm

2) από καρκινικό ιστό ή γειτονικό φυσιολογικό αδενικό ιστό επιλέχθηκε για την ποσοτική ανάλυση των μακροφάγων διείσδυση. χρώση γαστρίνη σε κάθε δείγμα αξιολογήθηκε και μια βαθμολογία για ένταση από 1 έως 4 αποδόθηκε. Μόνο ο καρκίνος των επιθηλιακών κυττάρων αντέδρασαν με το αντίσωμα γαστρίνης και η ένταση της χρώσης ήταν πολύ ομοιογενής σε όλο το διαμέρισμα επιθηλιακών όγκων. Όλα τα δείγματα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία παράλληλα και έναν παρατηρητή, γνωρίζει τον αριθμό των ασθενών και διαφορετικό από το άτομο που επεξεργάστηκαν και αναλύθηκαν τα ανοσοκηλιδώσεις μακροφάγων, αποδίδεται ένα σκορ σε κάθε ασθενή με βάση την ένταση της χρώσης που παρατηρήθηκε σε τρεις εικόνες αντιπροσωπευτικά των διαφόρων τμημάτων του όγκου.

Κυτταροκαλλιέργεια

Ανθρώπινα μονοπύρηνα κύτταρα περιφερικού αίματος απομονώθηκαν από υγιείς δότες με φυγοκέντρηση σε διαβάθμιση πυκνότητας Ficoll. Τα μονοκύτταρα σπάρθηκαν σε πλάκες ιστοκαλλιέργειας και ωριμάσει σε μακροφάγα με καλλιέργεια σε Χ-νίνο 15 μέσο (BioWhittaker) συμπληρωμένο με 1% ανθρώπινο ορό και 20 ng /NL ανασυνδυασμένης ανθρώπινης M-CSF (Peprotech) στους 37 ° C σε 5% CO

2 έως 6 ημέρες. Προκειμένου να ληφθεί μια πόλωση Μ1, τα κύτταρα επωάστηκαν με LPS 1 μg /ml (από Escherichia coli 0111: Β4, Sigma-Aldrich) συν 20 ng /ml ανθρώπινης ανασυνδυασμένης ΙΡΝγ (Peprotech) για τις τελευταίες 24 ώρες. Μ2 πόλωση λήφθηκε με κατεργασία κυττάρων με 20 ng /ml ανθρώπινου ανασυνδυασμένου IL-4 (Peprotech) για τις τελευταίες 48 ώρες της περιόδου καλλιέργειας. Η διαδικασία ωρίμανσης καθώς και οι θεραπείες ενεργοποίηση διεξήχθησαν με την παρουσία ή απουσία διαφορετικών συγκεντρώσεων του προγαστρίνη (10

-11 έως 10

-7M, Abgent).

Caco-2 κύτταρα (American Type Culture Collection, VA, USA) καλλιεργήθηκαν σε μέσο ΜΕΜ (Sigma-Aldrich) συμπληρωμένου με 20% απενεργοποιημένο βόειο εμβρυϊκό ορό, 100 U /ml πενικιλλίνη, 100 μg /ml στρεπτομυκίνη, 2 mM L-γλουταμίνη, 100 mM νάτριο πυροσταφυλικό και 1% μη ουσιώδη αμινοξέα.

Caco-2 κύτταρα συν-καλλιεργήθηκαν με μακροφάγα προερχόμενα από μονοκύτταρα χρησιμοποιώντας ένθετα Transwell (Corning Incorporated, ΜΑ, USA) με μια πορώδη μεμβράνη 0,4 μm [12] . Τα μονοκύτταρα σπάρθηκαν σε αυτά τα ένθετα και να διαφοροποιηθούν σε μακροφάγα, παρουσία ή απουσία διαφορετικών συγκεντρώσεων του προγαστρίνη. Την ημέρα 6 μετά την σπορά, τα ένθετα τοποθετήθηκαν πάνω σε κύτταρα Caco-2 (t = 0) και διατηρήθηκαν σε συν-καλλιέργεια για 24 ώρες.

Η παρουσία της επιφανειακών μορίων CD86 (Μ1) και CD206 (Μ2) σε καλλιεργημένα μακροφάγα αναλύθηκε με μικροσκοπία φθορισμού (μικροσκόπιο IX81, τον Όλυμπο, το Αμβούργο, Γερμανία). Τα μακροφάγα επωάστηκαν με Hoescht για τον προσδιορισμό των πυρήνων και με επισημασμένα φθορίζοντα αντισώματα εναντίον αυτών των στόχων (πίνακας 2). Ο φθορισμός αναλύθηκε με την ScanR λογισμικό στατική κυτταρομετρία (& gt? 5.000 κύτταρα /φρεάτιο). .Η Συγκέντρωση των κυτοκινών IL12 (Th1) και IL10 (Th2, αντιφλεγμονώδη) σε υπερκείμενα κυττάρων προσδιορίστηκε με ELISA (Diaclone)

Ο αριθμός των κυττάρων Caco-2 μετά συν-καλλιέργειας μετρήθηκε σε ένα θάλαμο Newbauer. Η απόπτωση σε αυτά τα κύτταρα μελετήθηκε με κυτταρομετρία ροής ως διμεταβλητή αννεξίνη V /PI ανάλυση (απόπτωση Detection Kit, Abcam).

Ολικό RNA από μακροφάγα ή κύτταρα Caco-2 απομονώθηκε με χρήση του κιτ εκχύλισης (Illustra RNAspin Mini , GE Healthcare Life Science) και cDNA ελήφθη με τον Πρωθυπουργό Script RT Κιτ αντιδραστηρίων (Takara Biotechnology). Real-time PCR πραγματοποιήθηκε με τον Πρωθυπουργό Script ΚΙΤ ΑΝΤΙΔΡΑΣΤΗΡΙΩΝ Perfect Real Time (Takara Biotechnology) σε LightCycler θερμο ανακυκλωτή (Roche Diagnostics, Mannheim, Germany). Ειδικά ολιγονουκλεοτίδια σχεδιάστηκαν σύμφωνα με τις αλληλουχίες που φαίνονται στον Πίνακα 3. Σχετική έκφραση γονιδίου εκφράστηκε όπως περιγράφηκε προηγουμένως [15].

Η

Στατιστική ανάλυση

Τα δεδομένα εκφράζονται ως μέση τιμή ± s.e.m. και συγκρίθηκαν με ανάλυση μεταβλητής (one way-ANOVA) με ένα Newman-Keuls διόρθωση post-hoc για πολλαπλές συγκρίσεις ή ένα t-test, όταν απαιτείται. Μια τιμή Ρ & lt? 0,05 θεωρήθηκε ως στατιστικά σημαντική. Οι κλινικές συσχετίσεις σε ανθρώπινα δείγματα αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας το συντελεστή συσχέτισης του Pearson του.

Αποτελέσματα

M2 αριθμό μακροφάγων αυξάνεται στην καρκινική περιοχή

Εμείς ανέλυσε πρώτα το ποσό και το φαινότυπο μακροφάγα στις μη όγκου και καρκινικών περιοχών των ασθενών με καρκίνο του παχέος. Ανοσοϊστοχημεία για CD68 (μακροφάγων δείκτης), CD86 (Μ1 μακροφάγων δείκτης) και CD206 (Μ2 μακροφάγων δείκτης) πραγματοποιήθηκε σε δείγματα βιοψίας από εκτομές ορθοκολικό καρκίνωμα. Αξίζει να σημειωθεί ότι ο αριθμός των μακροφάγων ήταν παρόμοια σε όγκο και φυσιολογικό περιβάλλοντα ιστό, αλλά ο αριθμός των Μ1 και Μ2 μακροφάγων ήταν σημαντικά διαφορετική μεταξύ των δύο περιοχών (Σχήμα 1). Tumor στρώμα περιείχε ένα μικρότερο αριθμό CD86 (+) κύτταρα από υμένα του φυσιολογικού ιστού. Αντίθετα, ένας μεγαλύτερος αριθμός των κυττάρων CD206 (+) ήταν ανέκυψαν κατά των όγκων του ιστού σε σύγκριση με το φυσιολογικό περιβάλλοντα ιστό, γεγονός που υποδηλώνει ότι η ανάπτυξη του όγκου ευνοεί την διαφοροποίηση των μονοκυττάρων σε μακροφάγα Μ2.

Η ανοσοαντιδραστικότητα για CD68 (δείκτης MF, Α-Β), CD86 (δείκτης Μ1-MF, C-D) και CD206 (δείκτης Μ2-MF, Ε-Ρ) αναλύθηκε σε ορθοκολικό καρκίνο (Β, D, F) και υγιή περιβάλλοντα βλεννογόνο (Α, C, E ). (G) Ποσοτική ανάλυση των θετικών κυττάρων για αυτά τα μόρια σε μια αντιπροσωπευτική περιοχή από 0,22 mm

2 (Κλίμακα bar = 0,2 mm). Ράβδοι αντιπροσωπεύουν μέση τιμή ± SEM (n = 21). ** Ρ & lt? 0,01 και *** Ρ & lt?. 0.001 vs αντίστοιχη αξία σε φυσιολογικό βλεννογόνο

Η

έκφραση γαστρίνη είναι αυξημένη στον όγκο αλλά αρνητικά συσχετίζεται με τον αριθμό των Μ2 μακροφάγων

ψάχνοντας για μεσολαβητές που θα μπορούσαν να ρυθμίζουν το φαινότυπο των μακροφάγων εντός του όγκου μελετήθηκε ο ρόλος της γαστρίνης πεπτιδίων επί της έκφρασης διαφορετικών δεικτών των μακροφάγων στα δείγματα βιοψίας. Δεδομένου ότι το αντίσωμα γαστρίνης χρησιμοποιήθηκε στη μελέτη αυτή αναγνωρίζει και τις δύο προδρόμων γαστρίνης και γαστρίνη, όπως προγαστρίνη, δεν μπορούμε να διακρίνουν μεταξύ διαφορετικών πεπτιδίων γαστρίνης, αλλά παρατηρήσαμε εκτεταμένη ανοσοαντιδραστικότητα σε καρκινικά επιθηλιακά κύτταρα των βιοψιών που αναλύθηκαν. Χρώση σε κάθε δείγμα αξιολογήθηκε και μια βαθμολογία για ένταση από 1 έως 4 αποδόθηκε (Σχήμα 2Α). Δεν παρατηρήθηκε συσχέτιση μεταξύ των επιπέδων γαστρίνης στους όγκους και ο αριθμός του συνόλου των (CD68 + κύτταρα) ή M1 (CD86 + κύτταρα) μακροφάγα είτε στον όγκο ή σε φυσιολογικό ιστό (Σχήματα 2Β και 2C). Παραδόξως, ο αριθμός των μακροφάγων Μ2 στην ογκική και φυσιολογικό ιστό συσχετίζεται αρνητικά με την έκφραση της γαστρίνης. Η συσχέτιση αυτή ήταν πιο σημαντική στον όγκο, όπου το πεπτίδιο συντίθεται. Λαμβανόμενα μαζί αυτά τα δεδομένα προτείνουν ότι η γαστρίνη πεπτίδια συντίθενται από τα κύτταρα του όγκου μειώνει τον αριθμό των Μ2 μακροφάγων, χωρίς να επηρεάζεται το συνολικό αριθμό των μακροφάγων.

Ο αριθμός των συνολικών μακροφάγα (CD68 + κύτταρα, Β), Μ1-μακροφάγα (CD86 + κύτταρα, C), και Μ2-μακροφάγα (κύτταρα CD206, D), στον όγκο και φυσιολογικό περιβάλλοντα ιστό αναλύθηκαν σε σχέση με την έκφραση σε γαστρίνης όγκων ιστού (Α, βαθμός 1 έως 4, γραμμή κλίμακας = 0,2 mm). Μια αρνητική και σημαντική συσχέτιση παρατηρείται μεταξύ της έντασης της χρώσης γαστρίνης και τον αριθμό των Μ2-μακροφάγων σε φυσιολογικό βλεννογόνο και όγκων ιστού (D).

Η

προγαστρίνη μειώνει τη διαφοροποίηση των μακροφάγων προς ένα φαινότυπο M2

Υποθέσαμε ότι προγαστρίνη θα μπορούσε να είναι υπεύθυνη για τις επιδράσεις που παρατηρούνται σε μακροφάγα φαινότυπο, επειδή ο καρκίνος του παχέος εντέρου κύτταρα στερούνται των ενζύμων που απαιτούνται για την πλήρη ωρίμανση γαστρίνης [7]. Για να διερευνηθεί αν προγαστρίνη μπορούν να διαμορφώσουν τη διαφοροποίηση των μακροφάγων σε Μ1 ή Μ2-φαινότυπο αντιμετωπίσαμε ανθρώπινα περιφερικά μονοκύτταρα ελήφθησαν από υγιείς εθελοντές με διάφορες συγκεντρώσεις προγαστρίνη και τους άφησε να διαφοροποιηθούν. Στατική πειράματα κυτταρομετρίας διενεργείται με ειδικά φθορίζοντα αντισώματα έδειξε ότι προγαστρίνη μείωσε την έκφραση του CD206 Μ2-δείκτη σε μακροφάγα που προέρχονται από μονοκύτταρα, ακόμη και στη χαμηλότερη συγκέντρωση αναλύθηκε. Αντιθέτως, δεν ανιχνεύθηκαν αλλαγές στην έκφραση του CD86 Μ1-δείκτη. Επιπλέον, μετρήθηκε η συγκέντρωση της IL-12 και IL-10 στο υπερκείμενο των μακροφάγων που προέρχονται από μονοκύτταρα μετά από 6 ημέρες της διαφοροποίησης με την παρουσία αυξανόμενων δόσεων προγαστρίνη. Ο πρόδρομος γαστρίνης προκάλεσε μια σημαντική μείωση της IL-10 έκκριση αλλά δεν μετέβαλλε τα επίπεδα IL-12 (Σχήμα 3). Τα δεδομένα μας δείχνουν ότι προγαστρίνη αναστέλλει την έκφραση του Μ2-δεικτών κατά την διάρκεια της διαφοροποίησης μακροφάγων χωρίς να επηρεάζει την έκφραση του Μ1-δεικτών.

Ανθρώπινα περιφερικά μονοκύτταρα προήλθαν σε μακροφάγα, παρουσία ή απουσία προγαστρίνη και του φαινοτύπου του προκύπτοντος μακροφάγα αξιολογήθηκε αναλύοντας τις ακόλουθες παραμέτρους: την έκφραση του CD86 (Α, C, η = 3)? έκφραση του CD206 (B, D, n = 3)? έκκριση του IL12 (F, η = 4)? και έκκριση IL10 (G, η = 4). Ράβδοι αντιπροσωπεύουν μέση τιμή ± SEM. * Ρ & lt? 0.05 και ** Ρ & lt?. 0.01 vs αντίστοιχη αξία σε κύτταρα υπό αγωγή με όχημα

Η

Για να μελετηθεί η επίδραση της προγαστρίνη επί IL4 μεσολάβηση διαφοροποίηση των μακροφάγων προς ένα M2-φαινότυπο επωάσαμε πλήρως διαφοροποιημένα μακροφάγα προερχόμενα από μονοκύτταρα με IL-4 και διαφορετικές δόσεις προγαστρίνη για δύο ημέρες. Basal μακροφάγα σε επεξεργασία με IL-4 έδειξαν σημαντική αύξηση στην έκφραση CD206, μία μη σημαντική αύξηση των IL-12 έκκριση και παρόμοια παραγωγή IL-10 από ό, τι οι έλεγχοι. Προγαστρίνη μείωσε σημαντικά την επαγωγή του CD206 από την IL-4 και αυξημένη έκκριση IL-12 σε επίπεδα σημαντικά υψηλότερα από εκείνα που παρατηρούνται σε κύτταρα ελέγχου, ενώ η έκκριση της IL-10 παρέμειναν αμετάβλητες. Ωστόσο, η διαφοροποίηση των μακροφάγων προς ένα Μ1-φαινότυπο δεν επηρεάστηκε από προγαστρίνη. Η θεραπεία με LPS συν ΙΡΝγ αύξησε την έκφραση του CD86, και την έκκριση της τόσο IL12 και IL10 σε μακροφάγα, αλλά προγαστρίνη δεν μεταβάλλει κάθε μία από αυτές τις παραμέτρους (Σχήμα 4).

Ανθρώπινα μακροφάγα προερχόμενα από μονοκύτταρα διεγέρθηκαν με LPS συν ΙΡΝγ για να ληφθεί ένα Μ1-φαινότυπο ή με IL-4 για να ληφθεί Μ2-μακροφάγων παρουσία ή απουσία προγαστρίνη, και το προκύπτον φαινότυπο αξιολογήθηκε αναλύοντας τις ακόλουθες παραμέτρους: την έκφραση του CD86 (Α, n = 3)? έκφραση του CD206 (B, n = 5)? έκκριση του IL10 (C, D, n = 5)? και έκκριση της IL12 (E, F, η = 5). Ράβδοι αντιπροσωπεύουν μέση τιμή ± SEM. * Ρ & lt? 0,05 vs αντίστοιχη αξία σε κύτταρα υπό αγωγή με όχημα?

+ P & lt? 0,05 και

++ P & lt?. 0.01 vs αντίστοιχη αξία σε κύτταρα ελέγχου

Η

προγαστρίνη ρυθμίζει προς τα κάτω Wnt συνδέτες στα μακροφάγα και αυξάνει τον κυτταρικό θάνατο σε συν-καλλιεργημένα κύτταρα Caco2

Στη συνέχεια αναλύσαμε εάν η διαφοροποίηση των μακροφάγων φαινοτύπου από προγαστρίνη θα μπορούσαν να επηρεάσουν τα γύρω κύτταρα του όγκου. Έχουμε αναφέρει πρόσφατα ότι Μ2-μακροφάγα συνθέτουν και εκκρίνουν συνδέτες Wnt που μπορούν να διαμορφώσουν από κοινού καλλιεργημένων επιθηλιακών κυττάρων συμπεριφορά [16] και στην παρούσα μελέτη παρατηρήσαμε ανοσοαντιδραστικότητα για Wnt1 σε κύτταρα του στρώματος του όγκου. Ποιοτική αξιολόγηση της έκφρασης αυτού του συνδέτη Wnt δηλώνει ότι η ποσότητα των θετικών κυττάρων μειώνεται καθώς η παραγωγή γαστρίνης σε καρκινικά κύτταρα αυξήσεις (Σχήμα 5Α). Μια αιτιώδης σχέση μεταξύ των δύο παραγόντων επισημαίνεται από in vitro μελέτες μας δείχνουν ότι τα μακροφάγα maturated παρουσία προγαστρίνη παρουσιάζουν σημαντικά μειωμένη έκφραση του mRNA των τριών διαφορετικών Wnt συνδέτες (Wnt1, Wnt3A και Wnt5, Σχήματα 5Β-5D). Λειτουργική συνάφεια της ρύθμισης προς τα κάτω των τριών Wnt συνδέτες στα μακροφάγα αποδεικνύεται από το γεγονός ότι τα κύτταρα Caco2 συν-καλλιεργήθηκαν με μακροφάγα προγαστρίνη επεξεργασμένο εκφράζεται λιγότερο mRNA Lgr5 από κύτταρα Caco2 συν-καλλιεργήθηκαν με μακροφάγα ελέγχου (Σχήμα 5Ε). Αυτά τα δεδομένα υποδεικνύουν ότι οι επιδράσεις της προγαστρίνη επί Wnt συνδετήρες μακροφάγα προερχόμενα διαμορφώνουν την οδό σηματοδότησης Wnt σε περιβάλλοντα κύτταρα του όγκου.

ανοσοαντιδραστικότητα με Wnt1 στο στρώμα του ορθοκολικού καρκίνου σε σχέση με την έκφραση της γαστρίνης στον ίδιο ιστό (γραμμή κλίμακας = 0.2 mm) (Α)? και των αποτελεσμάτων της παρουσίας προγαστρίνη κατά τη διάρκεια της διαφοροποίησης των ανθρώπινων περιφερικών μονοκυττάρων σε μακροφάγα στην έκφραση του mRNA του τριών διαφορετικών Wnt συνδέτες σε αυτά τα μακροφάγα (Β-Δ, η = 5) και η έκφραση του mRNA του Lgr5 σε συν-καλλιεργημένα κύτταρα Caco-2 (Ε , η = 7). Ράβδοι αντιπροσωπεύουν μέση τιμή ± SEM. * Ρ & lt? 0.05 και ** Ρ & lt?. 0.01 vs αντίστοιχη αξία σε κύτταρα υπό αγωγή με όχημα

Η

Επιπλέον, η συν-καλλιέργεια των Caco-2 με μακροφάγα προγαστρίνη επεξεργασμένο ως αποτέλεσμα τη σημαντική μείωση των συνολικών αριθμός των επιθηλιακών κυττάρων μαζί με αυξημένο ρυθμό απόπτωσης (Εικόνα 6).

Τα αποτελέσματα των ανθρώπινων προερχόμενων από μονοκύτταρα μακροφάγων που λαμβάνεται με την παρουσία ή απουσία του προγαστρίνη στον αριθμό (Α) και του ρυθμού της απόπτωσης ( Β) των κυττάρων Caco-2 αναλύθηκαν σε ένα σύστημα συν-καλλιέργειας (24 ώρες, η = 4). Ράβδοι αντιπροσωπεύουν μέση τιμή ± SEM. * P & lt? 0,05 vs αντίστοιχη αξία σε μακροφάγα υπό αγωγή με όχημα,

+ P & lt? 0,05 και

++ P & lt? 0.01 vs κύτταρα επωάζονται με ένα άδειο ένθετο (w /o MF)

Η

Συζήτηση

Αυτή η μελέτη δείχνει ότι τα μακροφάγα που διηθούν όγκους παχέος εντέρου έχουν ένα διαφορετικό προφίλ φαινοτυπική από εκείνες που υπάρχουν στο φυσιολογικό ιστό που περιβάλλει το καρκινική βλάβη, με ένα υψηλότερο ποσοστό των αντιφλεγμονωδών Μ2-μακροφάγων και σημαντικά χαμηλότερους αριθμούς των κλασικά ενεργοποιηθεί Μ1-μακροφάγα. Είναι ενδιαφέρον ότι, τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι η έκφραση της γαστρίνης σε όγκων ιστού ασκεί μια αρνητική επίδραση στον αριθμό των καρκινικών Μ2-μακροφάγων.

Η έκφραση της γαστρίνης σε επιθηλιακά κύτταρα όγκων συσχετίζεται αρνητικά με τον αριθμό των καρκινικών Μ2-μακροφάγων και μας in vitro αποτελέσματα δείχνουν μια αιτιώδη σχέση μεταξύ των δύο παραγόντων. Ανθρώπινα μακροφάγα λαμβάνονται από καλλιέργεια περιφερικά μονοκύτταρα παρουσία προγαστρίνη έδειξαν μειωμένη έκφραση του CD206. Επιπλέον, αυτό το πεπτίδιο εμπόδισε σημαντικά την έκφραση του CD206 όταν ώριμα μακροφάγα διεγέρθηκαν με την κυτοκίνη IL-4 Th2 να επάγουν μια M2-φαινότυπο. Σε αντίθεση, προγαστρίνη δεν επηρέασε την έκφραση του συν-διεγερτικού μορίου CD86 είτε ηρεμίας συνθήκες ή σε μακροφάγα διεγερμένα με LPS συν ΙΡΝγ να αναπτύξει ένα Μ1-φαινότυπο. Προγαστρίνη επηρεάζει επίσης το πρότυπο της έκκρισης κυτοκίνης. Τα μακροφάγα maturated παρουσία αυτού του πεπτιδίου που απελευθερώνεται χαμηλότερες ποσότητες αντι-φλεγμονώδους κυτοκίνης IL10 διατηρώντας την κανονική απελευθέρωση του Th1 επαγωγέα IL12. Σε IL4-διεγερμένα μακροφάγα, τα αποτελέσματα επί της έκκρισης κυτοκίνης ήταν διαφορετικές, αλλά προς την ίδια κατεύθυνση. Σε αυτήν την περίπτωση, η απελευθέρωση IL10 ήταν ανεπηρέαστη, ενώ το πεπτίδιο διευκόλυνε την έκκριση IL12. Έτσι, είναι αναμενόμενο ότι οι μακροφάγα που βρίσκονται υπό την επιρροή του προγαστρίνη στον καρκινικό ιστό παρουσιάσει μια αμβλεία αντιφλεγμονώδη, ανοσοκατασταλτική προφίλ.

Αυτή η επίδραση είναι σύμφωνη με την προηγουμένως περιγραφείσα προφλεγμονωδών δράση της γαστρίνης [11 ] – [13]. Παρατηρήσαμε ότι η γαστρίνη συμβάλλει στη φλεγμονή που προκαλείται από το ελικοβακτηρίδιο του πυλωρού σε αρουραίους πιθανώς μέσω της ενεργοποίησης του υποδοχέα CCK-2 σε μακροφάγους, ενώ η διέγερση του υποδοχέα αυτού ενεργοποιεί ανθρώπινα ενδοθηλιακά κύτταρα για την προώθηση της πρόσφυσης των μονοκυττάρων. CCK-2 υποδοχείς μπορεί να δεσμεύσει όλα τα πεπτίδια γαστρίνης, αν και συγγένεια τους για τον ώριμο γαστρίνης είναι σημαντικά υψηλότερο από ότι αποδείχθηκε για προγαστρίνη. Οι δράσεις του τελευταίου μπορεί να μεταδοθεί εναλλακτικά με την προσφάτως χαρακτηριζόμενη μη συμβατικών υποδοχέων αννεξίνης-II [9]. Και τα δύο είδη υποδοχέων υπάρχουν σε μακροφάγα και αμφότερες οι οδοί προαγωγή ενεργοποίησης μακροφάγων [14]. Έτσι, τα παρόντα αποτελέσματα ενισχύουν την αντίληψη ότι τα πεπτίδια γαστρίνης έχουν την τάση να συμβάλλουν στη φλεγμονή αν και διαφορετικού μηχανισμού μπορεί να εμπλέκονται σε κάθε περίπτωση.

Η επίδραση των μακροφάγων για την εξέλιξη του καρκίνου οφείλεται στην επίδρασή τους στην ανοσολογική αντίδραση κατά του όγκου αλλά επίσης σε μια άμεση τοπική επίδραση στα γύρω επιθηλιακά καρκινικά κύτταρα. Οι μακροφάγοι μπορεί να είναι μια πηγή συνδετήρων Wnt [17], την ογκογόνο οδό ενεργοποιημένης στην πλειονότητα των καρκίνων του παχέος εντέρου και σημαντική συμβολή στο καρκινικό κύτταρο βλαστική ικανότητα [18], [19]. Έκκριση αυτών των παραγόντων είναι ιδιαίτερα σημαντική σε έναν υποπληθυσμό ΤΑΜ που φαίνεται να παίζουν ιδιαίτερο ρόλο στην εισβολή όγκου μέσω της προώθησης αγγειογένεση και καρκινική κυτταρική μετανάστευση μέσω Wnt σηματοδότησης [20], [21]. Wnt1 ανιχνεύθηκε σε κύτταρα του στρώματος του όγκου και η παρουσία της έτεινε να μειώνεται, καθώς το επίπεδο της γαστρίνης στον όγκο αυξήθηκε. Έχουμε παρατηρήσει πρόσφατα ότι η έκκριση των προσδεμάτων Wnt είναι ειδικά αυξάνεται σε Μ2 μακροφάγα, τα οποία προωθούν Wnt /β-κατενίνης οδό σηματοδότησης και την επακόλουθη δραστικότητα πολλαπλασιασμού στην συν-καλλιεργημένα καρκινικά κύτταρα κόλου [16]. παρόντα αποτελέσματα μας δείχνουν ότι τα μακροφάγα maturated παρουσία προγαστρίνη εκφράζουν μικρότερες ποσότητες από τρία διαφορετικά Wnt συνδετήρες και να προκαλέσει μια σημαντική μείωση του αριθμού των συν-καλλιεργημένα κύτταρα Caco-2. Αυτό το αποτέλεσμα επιτυγχάνεται με μια συνακόλουθη μείωση στην έκφραση σε αυτά τα κύτταρα του κόλου του Lgr5, ένα γονίδιο στόχος Wnt [22] η οποία ενισχύει Wnt /β-κατενίνης σηματοδότηση [18]. Επιπλέον, τα μακροφάγα maturated παρουσία προγαστρίνη τείνουν να αυξήσουν το ποσοστό απόπτωσης σε κύτταρα Caco-2, μια επίδραση που μπορεί επίσης να σχετίζονται με σηματοδότηση Wnt μειωμένη [23]. Έτσι, οι φαινοτυπικές μεταβολές που προκαλούνται από προγαστρίνη σε μακροφάγα να τροποποιήσει την επιρροή τους σε επιθηλιακά κύτταρα καρκίνου του παχέος εντέρου με αποτέλεσμα μια μειωμένη αριθμός αυτών των κυττάρων πιθανώς από ένα συνδυασμό μειωμένης πολλαπλασιασμού και αύξηση αποπτωτικό κυτταρικό θάνατο. Επιπλέον, η μειωμένη παραγωγή συνδετήρων Wnt επάγεται από προγαστρίνη μπορεί επίσης να συνεισφέρει στις περιγραφόμενες φαινοτυπικές μεταβολές που προκαλούνται από αυτό το πεπτίδιο αφού αυτοκρινή επίδραση των Wnt5a σε μακροφάγα να μειώνουν την έκφραση του IL12 σε απόκριση σε βακτηριακά προϊόντα έχει περιγραφεί [24].

από τα αποτελέσματα μας, μπορούμε να συμπεράνουμε ότι γαστρίνες, αναστέλλοντας την εξαγορά του Μ2-φαινότυπο σε τοπικό μακροφάγα, μπορεί να ρυθμίζει την εξέλιξη του καρκίνου. Είναι σαφές ότι Μ2 μακροφάγα διεγείρουν την ανάπτυξη των επιθηλιακών κυττάρων παχέως εντέρου καρκίνου in vitro και πειραματικές μελέτες καταδεικνύουν ότι Μ2-μακροφάγων στον όγκο προωθήσει καρκίνου του παχέος εντέρου σε ποντικούς [25] – [27]. Στην ανθρώπινη παχέος εντέρου, η επίδραση της Μ2-μακροφάγων φαίνεται να είναι πιο πολύπλοκη και επηρεάζεται από διάφορους παράγοντες όπως η χωρική κατανομή τους [4], η σχετική ποσότητα του Μ1 μακροφάγων [5] ή το στάδιο της νόσου [4]. Παρά το γεγονός ότι η παρουσία τους έχει θεωρηθεί ως ένα αρνητικό προγνωστικό παράγοντα από μερικούς συγγραφείς [28], ενώ άλλοι προτείνουν ότι M2 μακροφάγα έχουν λιγότερο επικίνδυνες επιπτώσεις στην ανθρώπινη καρκίνο του παχέος εντέρου σε σχέση με τις άλλες ρυθμίσεις και το σημείο με την ιδέα ότι ορισμένες τοπικές παράγοντας ειδικά παρόντες σε αυτό το είδος των όγκων μπορεί να είναι προς τα κάτω ρύθμιση του όγκου τους, την προώθηση της δράσης [4], [5], [29]. Έχοντας κατά νου ότι Μ1 και Μ2 μακροφάγα δεν είναι κλωνική διαφορετικές σειρές κυττάρων, αλλά τα άκρα της ένα ευρύ φάσμα των ενδιάμεσων φαινοτύπων και ότι η κατάταξη ενός κυττάρου ως μακροφάγων Μ2 μπορεί να είναι μεροληπτική από το μοριακό δείκτη που επιλέγεται σε κάθε περίπτωση, θα ξεκινήσει η ιδέα ότι τα μακροφάγα προσδιορίζεται ως Μ2 σε αυτές τις μελέτες μπορεί να είναι λιγότερο επιβλαβή, λόγω της προγαστρίνη.

Μια άμεση πολλαπλασιαστική λειτουργία του προγαστρίνη σε επιθηλιακά κύτταρα έχει αποδειχθεί σαφώς σε απομονωμένα κύτταρα και τα ποντίκια, και πειραματικές μελέτες με τα διαγονιδιακά ζώα δείχνουν ότι η υπερέκφραση του γαστρίνες παρουσία παραγόντων προκαλούν βλάβη στο DNA ενισχύει καρκινογένεση. Αυτά τα στοιχεία ώθησε αρκετές φαρμακολογικές στρατηγικές για την εξουδετέρωση της δραστικότητας της γαστρίνης πεπτιδίων, με επιτυχή αποτελέσματα σε μοντέλα ποντικών, αλλά, δυστυχώς, λίγοι και αόριστη αποτελέσματα σε ασθενείς [30]. Τα ευρήματά μας δείχνουν ότι, τουλάχιστον σε ανθρώπους, προγαστρίνη μπορεί να παίξει ένα πολύπλευρο ρόλο στην πρόοδο των όγκων παχέος εντέρου, καθώς πολλαπλασιαστική δραστικότητα του σε επιθηλιακά κύτταρα θα αντιτίθεται μια δυνητικά αντι-ογκική δράση που ασκείται επί των μακροφάγων. Η σημασία αυτής της επίδρασης στα κύτταρα του ανοσοποιητικού για την παγκόσμια δραστηριότητα προγαστρίνη περιμένει αξιολόγησης από τη μελλοντική έρευνα.

Συμπεράσματα

Η μελέτη μας δείχνει ότι γαστρίνη πεπτίδια που συντίθενται από τα καρκινικά κύτταρα του παχέος εντέρου έχουν μακροφάγα ως στόχους τους και πιθανώς επηρεάζουν το φλεγμονώδες διήθημα του όγκου, η οποία με τη σειρά της επηρεάζει την εξέλιξη του καρκίνου. Η αναστολή της Μ2-πόλωση που επάγεται από προγαστρίνη θα αντισταθμίσει πολλαπλασιαστική δράση τους και, αν και είναι δύσκολο να εκτιμηθεί το μέγεθος αυτής της επίδρασης, θα πρέπει να ληφθεί αυτή η παρατήρηση υπόψη κατά την ανάλυση της θεραπευτικής αξίας της γαστρίνης ανοσοεξουδετερώσεως [31].

Ευχαριστίες

Σας ευχαριστούμε Brian Normanly για την αγγλική γλώσσα επεξεργασίας του και το Αιματολογικό Υπηρεσία του Νοσοκομείου Clínico Universitario de Valencia για την εκχύλιση των δειγμάτων αίματος.