Αφηρημένο

Η απώλεια του γονιδιώματος-ευρεία μεθυλίωση είναι ένα κοινό χαρακτηριστικό του καρκίνου, και ο βαθμός υπομεθυλίωσης έχει συσχετισθεί με γενωμική αστάθεια. Παγκόσμια μεθυλίωση των επαναλαμβανόμενων στοιχείων που ενδεχομένως προέκυψε ως μηχανισμός άμυνας έναντι παρασιτικών στοιχεία DNA, συμπεριλαμβανομένων ρετροτρανσποζόνια και ιικών παθογόνων. Δεδομένων των αλλαγών της παγκόσμιας μεθυλίωσης τόσο ιογενή λοίμωξη και καρκίνο, εξετάσαμε γονιδιώματος σε επίπεδο επίπεδα μεθυλίωσης στο κεφάλι και το καρκίνωμα των πλακωδών κυττάρων του τραχήλου (HNSCC), ένας καρκίνος αιτιολογικά σχετίζεται με τον ιό του ανθρώπινου θηλώματος (HPV). Εμείς προσδιορίστηκαν παγκόσμιο επίπεδο υπομεθυλίωση σε 26 δείγματα HNSCC, σε σύγκριση με συμφωνημένα φυσιολογικό γειτονικό ιστό τους, χρησιμοποιώντας δοκιμασίες μεθυλίωσης Pyrosequencing βασιζόμενων επαναλήψεις LINE. Επιπλέον, εξετάσαμε κυτταρικές σειρές που προέρχονται από μια ποικιλία συμπαγών όγκων για τη γραμμή και ημίτονου (

Alu

) επαναλήψεις. Ο βαθμός LINE και

Alu

υπομεθυλίωση ποικίλει μεταξύ διαφορετικών καρκινικών κυτταρικών γραμμών. Υπήρχε μόνο μέτρια συσχέτιση μεταξύ της γραμμής και

Alu

επίπεδα μεθυλίωσης, με το εύρος διακύμανσης στα επίπεδα μεθυλίωσης είναι μεγαλύτερη για τα στοιχεία LINE. LINE υπομεθυλίωση ήταν πιο έντονη σε HPV-αρνητικά σε σχέση με HPV-θετικών όγκων. Επιπλέον, αστάθεια του γονιδιώματος, όπως μετρήθηκε με ανάλυση του γονιδιώματος σε επίπεδο απώλειας ετεροζυγωτίας (ΑΕ) πολυμορφισμού ενός νουκλεοτιδίου (SNP), ήταν μεγαλύτερη σε δείγματα HNSCC με πιο έντονη LINE υπομεθυλίωση. Παγκόσμια υπομεθυλίωση ήταν μεταβλητή στην HNSCC. συσχέτισή του με τα δύο κατάσταση HPV και ο βαθμός της ΑΕ ως υποκατάστατο για την γενωμική αστάθεια μπορεί να αντανακλά εναλλακτική ογκογόνο περιόδων HPV-θετικά έναντι HPV-αρνητικούς όγκους

Παράθεση:. Richards KL, Zhang Β, Baggerly KA, Colella S , Lang JC, Schuller DE, et al. (2009) Genome-Wide υπομεθυλίωση σε καρκίνο κεφαλής και τραχήλου είναι πιο έντονη σε HPV-αρνητικούς όγκους και σχετίζεται με γενωμική αστάθεια. PLoS ONE 4 (3): e4941. doi: 10.1371 /journal.pone.0004941

Επιμέλεια: Sebastian Δ Fugmann, Εθνικό Ινστιτούτο Γήρανσης, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 17 Σεπτεμβρίου 2008? Αποδεκτές: 13 Φεβρουαρίου 2009? Δημοσιεύθηκε: 18 Μαρ, 2009

Copyright: © 2009 Richards et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε εν μέρει από το Ίδρυμα Kleberg, Πολιτεία του Τέξας καπνού Κονδυλίων έρευνας, μια θεσμική επιχορήγηση έρευνας από τις Τέξας καπνού ταμεία διακανονισμού (Πανεπιστήμιο του Τέξας MD Anderson Cancer Center), και του Υπουργείου Άμυνας W81XWH-05-2-0027 στην RK. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

η μεθυλίωση του DNA είναι μια επιγενετική τροποποίηση του DNA που λαμβάνει χώρα μέσω της δράσης της μεθυλοτρανσφεράσες DNA σε CpG δινουκλεοτίδια. είναι μεθυλιωμένα περιοχές του DNA που σχετίζονται με χρωματίνη αναδιαμόρφωση, γενικά συμβαίνουν σε περιοχές πιο συμπυκνωμένη χρωματίνη και μειωμένη μεταγραφική δραστηριότητα [1], [2]. Ανανεωμένο ενδιαφέρον για αυτή τη διαδικασία προέκυψαν μετά αναγνωρίστηκε ότι δύο τύποι παρεκκλίνοντα πρότυπα μεθυλίωσης είναι παρούσες σε κύτταρα καρκίνου [1], [3]. Το πρώτο είναι ειδική γονιδιακή υπερ-μεθυλίωση, όπου CpG νησίδες στις περιοχές υποκινητή των γονιδίων αποκτήσουν αυξημένη μεθυλίωση, γενικά οδηγεί σε μειωμένη έκφραση του γονιδίου κατάντη. Το δεύτερο είναι γονιδιώματος σε επίπεδο υπο-μεθυλίωση, ένα μεγάλο ποσοστό των οποίων λαμβάνει χώρα σε επαναλαμβανόμενα στοιχεία DNA. Σε κακοήθεια, η παγκόσμια μεθυλίωση συχνά παρεκκλίνοντα μειώνεται, ενώ ειδική γονιδιακή μεθυλίωση συχνά ανωμάλως αυξημένη. Ενώ οι επιδράσεις των ειδικών γονιδίων υπερμεθυλίωση (

π.χ.

, μειωμένη έκφραση ενός γονιδίου που είναι σημαντικό για τον έλεγχο της ανάπτυξης) είναι εύκολα κατανοητό, οι επιπτώσεις της μειωμένης παγκόσμιας μεθυλίωσης είναι πιο ασαφής [1], [3].

έχει διατυπωθεί η υπόθεση ότι η μεθυλίωση του DNA αρχικά εξελίχθηκε ως ένας μηχανισμός άμυνας κατά των παθογόνων ιογενείς και άλλες DNA ως ένας τρόπος για να φιμώσουν ξένες αλληλουχίες DNA [4] – [6]. Αυτό είναι σύμφωνο με την παρατήρηση ότι LINE και ΣΙΝΕ (

Alu

) στοιχεία, που προέρχονται από μεταθετά στοιχεία, είναι σε μεγάλο βαθμό μετουσιωμένο σε φυσιολογικά κύτταρα. Η μεθυλίωση του ιικού γονιδιώματος HPV κατά την ενσωμάτωση στο γονιδίωμα του ξενιστή έχει αναφερθεί, και οι αλλαγές στη μεθυλίωση του DNA του HPV έχουν συσχετισθεί με ογκογένεση [7], [8].

Παγκόσμια μεθυλίωση επίσης κλινικά σχετική, όπως καταδεικνύεται από τις ενώσεις μεταξύ κλινικού αποτελέσματος και παγκόσμιο επίπεδο μεθυλίωσης σε έναν αριθμό τύπων καρκίνου [9] – [11]. Από μηχανιστική άποψη, η παγκόσμια μεθυλίωση φαίνεται να σχετίζεται με την πρόοδο του καρκίνου, δεδομένου ότι η απώλεια της παγκόσμιας μεθυλίωσης τείνει να γίνει πιο έντονη καθώς προκαρκινικές αλλοιώσεις Progress [12], [13]. Επιπλέον, σε κύτταρα καρκίνου του παχέος εντέρου, απώλεια LINE μεθυλίωσης συσχετίζεται αντίστροφα με αστάθεια μικροδορυφόρου και συσχετίζεται άμεσα με το χρωμόσωμα αστάθεια [14], [15].

Υποθέσαμε ότι η παγκόσμια επίπεδα μεθυλίωσης στον καρκίνο, που αντιπροσωπεύεται από τα επίπεδα της γραμμής και ΣΙΝΕ (

Alu

) μεθυλίωση, ενδέχεται να συσχετίζεται με ιογενή λοίμωξη. Εμείς, ως εκ τούτου, εξετάστηκε LINE μεθυλίωσης σε σχέση με την κατάσταση του HPV σε καρκίνους της κεφαλής και του τραχήλου. Σε αντίθεση με καρκίνους του τραχήλου, τα οποία είναι σχεδόν όλα συνδέονται με τη μόλυνση από HPV, HNSCC είναι ιικά μεσολάβηση μόνο σε ένα υποσύνολο των περιπτώσεων (25-30%) [16]. Για να προσδιοριστεί η επίδραση της ιογενούς λοίμωξης σε παγκόσμια επίπεδα μεθυλίωσης στο HNSCC, έχουμε αναπτύξει δοκιμασίες μεθυλίωσης Pyrosequencing με βάση για επαναλαμβανόμενα στοιχεία DNA και σύγκριση HPV-θετικά με HPV-αρνητικών καρκίνων. Προηγούμενες δημοσιεύσεις έχουν δείξει ότι η μεθυλίωση LINE είναι μεταβλητή σε HNSCC, αλλά δεν βρήκε τη σύνδεση μεταξύ των επιπέδων κατάστασης και LINE μεθυλίωσης του DNA του HPV [17], [18]. Εδώ μπορούμε να δείξουμε ότι η παγκόσμια υπομεθυλίωσης είναι μεταβλητή σε HNSCC και συσχετίζεται τόσο με την κατάσταση του HPV και της γονιδιωματικής αστάθειας.

Αποτελέσματα

LINE /ΣΙΝΕ (

Alu

) δοκιμασίες είναι ακριβής και επαναλήψιμη , αλλά δείχνουν μόνο μέτρια συσχέτιση μεταξύ LINE-1 και

Alu

επίπεδα μεθυλίωσης

για να προσδιοριστεί η παγκόσμια επίπεδα μεθυλίωσης, προσαρμόσαμε Pyrosequencing-based Ανάλυση μεθυλίωσης (PMA) δοκιμασία μας [19] για την αξιολόγηση της μεθυλίωσης επαναλαμβανόμενων LINE και ΣΙΝΕ (

Alu

) στοιχεία, παρόμοια με γονιδιώματος-ευρεία δοκιμασίες μεθυλίωσης αναφερθεί στο παρελθόν [20]. Για να επικυρώσετε τις δοκιμασίες, πραγματοποιήσαμε μια σειρά δοκιμών: (1) την ανάμιξη πειράματα με γνωστές ποσότητες μεθυλιωμένο /μη μεθυλιωμένο DNA? (2) μελέτες μεθυλίωσης σε μια ποικιλία καρκινικών κυτταρικών σειρών να συγκρίνουν LINE να ΣΙΝΕ μεθυλίωση και να ερευνήσει την παγκόσμια μεθυλίωσης σε ένα ευρύ φάσμα κακοηθειών? και (3), μεθυλίωση των δειγμάτων από διαφορετικές ηλικίες και φύλα για την εξάλειψη αυτών των παραγόντων ως πιθανούς συγχυτικούς παράγοντες της παγκόσμιας μετρήσεων μεθυλίωσης.

προσαυξήσεις Σταδιακή μεθυλιωμένων DNA παρασκευάσθηκαν με μίξη καθολικά μη μεθυλιωμένο (U2M.L) DNA με καθολικά μεθυλιωμένο (UM.L) DNA σε διάφορες αναλογίες. Τα μικτά δείγματα στη συνέχεια όξινο θειώδες επεξεργασία και υποβάλλονται σε PMA μας LINE-1 (LINE) και

Alu

(ΣΙΝΕ) δοκιμασίες. Γραμμική ανάλυση παλινδρόμησης έδειξε ότι LINE-1 και

Alu

επίπεδα μεθυλίωσης ήταν πολύ στενά συνδεδεμένη με τα επίπεδα που προβλέπονται από κλάσμα εισόδου μεθυλιωμένων DNA (

r

= 0,995,

p

– τιμή & lt? 0,0005 για LINE-1, και

r

= 0.980,

σ

-τιμή & lt? 0,0005 για

Alu

? Σχήμα S1). Θα πρέπει να σημειωθεί ότι, ακόμη και όταν το DNA εισόδου ήταν εντελώς μεθυλιωμένη, το μέγιστο ποσοστό της παγκόσμιας μεθυλίωσης όπως μετράται με τη δοκιμασία ΡΜΑ είναι μόλις πάνω από 50%, δεν είναι 100%. Αυτό οφείλεται στο γεγονός ότι μεμονωμένα επαναλαμβανόμενα στοιχεία απέκλιναν στη σειρά την πάροδο του χρόνου? και CpG δινουκλεοτίδια, αν μεταλλαχθεί σε TpG δινουκλεοτίδια, είναι δυσδιάκριτες από μη μεθυλιωμένα CpGs μετά την κατεργασία όξινου θειώδους. Αυτό το επίπεδο θορύβου υποβάθρου λαμβάνεται υπόψη από την ομαλοποίηση κάθε αποτέλεσμα με την καθολικά μετουσιωμένο ελέγχου (

δηλαδή

, αναφέροντας το ποσοστό μετουσιωμένο αναφοράς, ή PMR).

Τέσσερις πισίνες των κανονικών δειγμάτων DNA ( από λευκοκύτταρα περιφερικού αίματος) δημιουργήθηκαν για να εκτιμηθεί η επίδραση της ηλικίας και του φύλου στις LINE-1 και

Alu

επίπεδα μεθυλίωσης. Κάθε πισίνα (θηλυκά ≤40 ετών, άνδρες ≤40 ετών, θηλυκά & gt? 40 ετών, άνδρες & gt? 40 ετών) περιείχε DNA από τουλάχιστον πέντε άτομα. Δεν υπήρχαν sex- ή εξαρτάται από την ηλικία διαφορές ανάμεσα στις πισίνες στο LINE-1 ή

Alu

επίπεδα μεθυλίωσης (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται).

Κάθε γραμμή-1 και

Alu

δοκιμασία μεθυλίωσης δοκιμάστηκε σε ένα πάνελ κυτταρικών γραμμών 23 του καρκίνου. Διαφορετικές θέσεις CpG συγκρίθηκαν μέσω τριών διακριτών LINE 1-προσδιορισμούς και τρεις διακριτές

Alu δοκιμασίες

, το καθένα προέρχεται από διαφορετικές περιοχές της γραμμής-1 και

Alu

συναινετικές αλληλουχίες, αντίστοιχα (Πίνακας 1). Ως μάρτυρας, ελέγξαμε επίσης επτά φυσιολογικούς λεμφοβλαστοειδείς κυτταρικές σειρές, οι οποίες έδειξαν κανονικά επίπεδα μεθυλίωσης (όλα & gt? 80% στις LINE-1 προσδιορισμούς μας). Αντιθέτως, όπως αναμένεται από προηγούμενες εκθέσεις [12] – [14], [21], πολλές από τις κυτταρικές σειρές όγκων έδειξε παγκόσμια υπομεθυλίωση, η οποία ήταν περισσότερο έντονη στις δοκιμασίες LINE-1 (Σχήμα 1). Για να ελέγξετε τη συνοχή μεταξύ LINE και ΣΙΝΕ επίπεδα μεθυλίωσης (εκπρόσωπος LINE-1 και

Alu

αναλύσεις μας, αντίστοιχα), συγκρίναμε ο βαθμός συσχέτισης μεταξύ των αποτελεσμάτων από τις τρεις LINE-1 προσδιορισμούς, μεταξύ των αποτελεσμάτων από την τρεις

Alu

αναλύσεις, καθώς και μεταξύ των διαφόρων LINE-1 και

Alu δοκιμασίες

. Η ανάλυση γραμμικής παλινδρόμησης έδειξε ότι τα επιμέρους αποτελέσματα του προσδιορισμού LINE-1 σχετίζεται ισχυρά με το άλλο, για παράδειγμα

r = 0,93

για τη συσχέτιση μεταξύ των αποτελεσμάτων προσδιορισμού L1-2 και L1-3 (Σχήμα S2A). Το ίδιο υψηλό βαθμό συσχέτισης ήταν παρόντες μεταξύ των αποτελεσμάτων από το

Alu

προσδιορισμούς, για παράδειγμα

r

= 0,82 για τη συσχέτιση μεταξύ της Alu-1 και Alu-3 αποτελέσματα της ανάλυσης (Σχήμα S2B) . Ωστόσο, LINE-1 αποτελέσματα της ανάλυσης ήταν μόνο μέτρια συσχέτιση με

Alu

αποτελέσματα της ανάλυσης, για παράδειγμα

r

= 0.33 σύγκριση L1-1 και Alu-1? Εικόνα S2C). Ένα παρόμοιο επίπεδο μέτρια συσχέτιση μεταξύ LINE-1 και

Alu αναλύσεις

αναφέρθηκε προηγουμένως σε νευροενδοκρινείς όγκους [22].

Α.

Alu

μεθυλίωση χρησιμοποιώντας τη δοκιμασία Alu-3. B. LINE-1 μεθυλίωση χρησιμοποιώντας τον προσδιορισμό L1-3. Τα αποτελέσματα αναφέρονται ως η PMR (επί τοις εκατό μεθυλιωμένα αναφοράς) ρυθμίζεται σύμφωνα με την καθολικά μεθυλιωμένο DNA αναφοράς. Καθολικά μη μεθυλιωμένη (U2M), καθολικά μεθυλιωμένα (UM) των ελέγχων και κανονική DNA ελέγχου από PBLs παρουσιάζονται επίσης.

Η

LINE-1 υπομεθυλίωση του HNSCC δείγματα ασθενών

Matching κανονικό, πρωτογενούς όγκου, και όπου είναι διαθέσιμα, μεταστάσεις λεμφαδένα δειγμάτων κεφαλιού και του λαιμού του ασθενούς (Πίνακας S1) ελέγχθηκαν χρησιμοποιώντας προσδιορισμούς PMA LINE-1 μας (Σχήμα 2). Λόγω της μεγαλύτερης δυναμικό εύρος του προσδιορισμού LINE-1 και περιορισμένες ποσότητες δείγματος, δοκιμασίες μόνο LINE-1 διεξήχθησαν για το υπόλοιπο της μελέτης. Σε γενικές γραμμές, HNSCC πρωτογενείς όγκους και μεταστατικούς λεμφαδένες ήσαν υπο-μεθυλιωμένα σε σύγκριση με την κανονική ταιριάζουν γειτονικούς ιστούς τους. Με τη δοκιμασία LINE1-1, η μέση πρωτογενή PMR όγκου ήταν 65,5%, ενώ η μέση κανονική PMR ήταν 90,0% (

σ

-τιμή = 6.7 × 10

-8 χρησιμοποιώντας μια αντιστοιχισμένη

t

-τεστ). Ωστόσο, υπήρχε αρκετή μεταβλητότητα των πρωτογενών όγκων, που κυμαίνονται από 31,2% (σοβαρή υπομεθυλίωση) σε 90,8% (κανονική). Η μέση PMR σε μεταστάσεις λεμφαδένων (73,8%? Εύρος 31,8% -93,8%) ήταν επίσης εξαιρετικά μεταβλητή, ακόμη και σε σχέση με την αντίστοιχη πρωτογενή όγκο, μερικές φορές χαμηλότερες και μερικές φορές υψηλότερες από ό, τι το PMR του πρωτογενούς όγκου με την οποία συνδέεται.

Αξιόπιστες όγκων και φυσιολογικών δειγμάτων και, όπου είναι διαθέσιμα, λεμφαδενικές μεταστάσεις αναλύθηκαν για LINE-1 μεθυλίωσης. Οι τιμές PMR απεικονίζονται χρησιμοποιώντας το κανονικό δείγμα PMR ως χ-αξίας και πρωτογενούς όγκου (κύκλοι) ή μετάστασης (τρίγωνο) PMR ως τιμή y. Οι οριζόντιες γραμμές παριστούν τιμές PMR για καθολικά μεθυλίωσης (UM) και μη μεθυλιωμένο (U2M) μάρτυρες, φυσιολογικά λεμφοκύτταρα (πράσινο) και για τέσσερις HNSCC κυτταρικές γραμμές (κίτρινο). οικόπεδα κουτί στα δεξιά δείχνουν την μέση και την κατανομή των πρωτογενών όγκων και μεταστάσεων στο υποσύνολο των δειγμάτων όπου συνδυάζεται μεταστάσεις και πρωτογενείς όγκους ήταν διαθέσιμα.

Η

HPV-θετικούς όγκους διατηρούν περισσότερα LINE-1 μεθυλίωση από HPV -αρνητικοί όγκους

Επειδή υπήρχε τόση μεταβλητότητα στην HNSCC όγκου PMR, υποθέσαμε ότι το επίπεδο της παγκόσμιας υπομεθυλίωσης θα μπορούσε να ποικίλλει σε διαφορετικές υποομάδες HNSCC. Να διερευνήσει τη σχέση μεταξύ της απώλειας των LINE-1 υπερμεθυλίωση και την κατάσταση του HPV, συγκρίναμε το μέσο επίπεδο μεθυλίωσης LINE-1 από τις τρεις ομάδες που διέφερε από την κατάσταση του HPV τους. Η πρώτη ομάδα (n = 8) ήταν HPV αρνητικό (- /-)? Η δεύτερη ομάδα (n = 8) περιείχαν HPV DNA, ακόμη ήταν μεταγραφικά σιωπηρό σε σχέση με το ογκογονίδιο ιού Ε6, υποδεικνύοντας έλλειψη έκφρασης της παρούσας ογκοπρωτεϊνης (+/-). Η τρίτη ομάδα των όγκων (n = 8) ήταν θετικό για τον HPV DNA και έκφραση Ε6 (+ /+). Το μέσο επίπεδο μεθυλίωσης των τριών ομάδων των όγκων είναι στατιστικά διαφορετική, με ένα

σ

-τιμή = 0,011 για την τάση (Σχήμα 3).

Κουτί οικόπεδα επίπεδα μεθυλίωσης (PMR) του οι HNSCC πρωτογενείς όγκους (δεξιά σε κάθε ζεύγος) και φυσιολογικό γειτονικό ιστό (αριστερή σε κάθε ζεύγος) που φαίνεται σύμφωνα με την κατάσταση του HPV. + /+, HPV-θετικά και εκφράζουν Ε6 ιικού mRNA? +/-, HPV-θετικά, αλλά μεταγραφικά σιωπηλή? και – /-, HPV αρνητικό

Η

Επίσης, σε σύγκριση με την παγκόσμια επίπεδα μεθυλίωσης σε συμφωνημένα κανονική παρακείμενους ιστούς από τις ίδιες τρεις ομάδες.. Σε αντίθεση με τα αποτελέσματα για τους πρωτογενείς όγκους, δεν υπήρχαν διαφορές στα παγκόσμια επίπεδα μεθυλίωσης στους ταιριάζουν φυσιολογικούς ιστούς και ως εκ τούτου δεν υπάρχει καμία συσχέτιση με την κατάσταση του HPV (Σχήμα 3). Βασισμένο σε ένα προηγουμένως αναφερθεί συσχέτιση μεταξύ LINE-1 μεθυλίωση και το στάδιο TNM [18], ψάξαμε για μια τέτοια σύνδεση στο σύνολο του δείγματος μας, αλλά βρήκε κανένα (

σ

-τιμή = 0,31).

Επίπεδα LINE-1 υπομεθυλίωση και LOH σε όγκους HNSCC συσχετίζεται

καρκίνο του παχέος εντέρου κυτταρικές γραμμές με πιο έντονη LINE υπομεθυλίωση είχαν προηγουμένως αναφερθεί ότι έχουν ένα υψηλότερο βαθμό LOH [14], [15]. Να εξετάσει κατά πόσον αυτός ο συσχετισμός είναι αληθής σε δείγματα HNSCC ασθενή μας, πραγματοποιήσαμε μια συνολική ανάλυση ΑΕ με τη χρήση των δεδομένων 10K SNPChip. Γονότυπους συγκρίθηκαν μεταξύ φυσιολογικό γειτονικό ιστό και αντίστοιχα δείγματα όγκων? κατατοπιστική loci ήταν αυτά που ήταν ετερόζυγα στον φυσιολογικό ιστό. Το Σχήμα 4 δείχνει μία γραφική παράσταση του ποσοστού του ενημερωτικού loci για κάθε πρωτογενούς όγκου με LOH έναντι του βαθμού LINE-1 μεθυλίωση στο ίδιο δείγμα. Εμείς χωρέσει μια γραμμική τάση στα δεδομένα, τα οποία έδειξαν συσχέτιση Pearson του -0.494, με ένα

σ

-τιμή = 0,017. Ως έλεγχος της ευρωστία, υπολογίσαμε επίσης τη συσχέτιση Spearman (rank-based), η οποία ήταν επίσης σημαντική. Ο συντελεστής συσχέτισης Spearman για αυτή την σχέση ήταν -0,428 (

σ

-τιμή = 0,042), διαπιστώνεται ότι ΑΕ πράγματι συσχετίστηκε σημαντικά με το βαθμό LINE υπομεθυλίωσης.

LINE-1 μεθυλίωση χαράσσεται ως PMR, και LOH είναι το κλάσμα του 10Κ SNP τόπους που δείχνουν LOH σε σχέση με όλα τα ενημερωτικά τόπους. συντελεστής συσχέτισης Pearson είναι -0,494 (

σ

-τιμή = 0,01) για την συσχέτιση μεταξύ των δύο τιμών.

Η

Συζήτηση

Έχουμε αναπτύξει διάφορες LINE (LINE- 1) και ημίτονου (

Alu

) δοκιμασίες μεθυλίωσης με PCR εκκινητές σε διατηρημένες περιοχές αυτών των επαναληπτικών στοιχείων. Αυτοί οι προσδιορισμοί χρησιμοποιούν πολλαπλές θέσεις CpG (3-6) για τον προσδιορισμό των επιπέδων μεθυλίωσης και επιτρέπουν την ταυτόχρονη ενίσχυση της πολλές ατομικές LINE και ΣΙΝΕ στοιχεία σε όλο το ανθρώπινο γονιδίωμα ως εκπρόσωπος γονιδιωματική ορόσημα για την παγκόσμια ανάλυση μεθυλίωσης. Όπως ήταν αναμενόμενο, τα αποτελέσματα από μεμονωμένες LINE-1 ανιχνεύσεις ήταν πολύ καλά συσχετίστηκαν με αποτελέσματα από άλλες LINE-1 ανιχνεύσεις, παρά τη μέτρηση μεθυλίωση σε διαφορετικές περιοχές της αλληλουχίας LINE-1. Το ίδιο ισχύει και για το

Alu

προσδιορισμούς, με υψηλή συσχέτιση μεταξύ των αποτελεσμάτων από τρία διαφορετικά δοκιμασίες. Ωστόσο, όταν LINE-1 και

Alu

επίπεδα μεθυλίωσης συγκρίθηκαν μεταξύ τους, η συσχέτιση ήταν πιο μέτρια, μόνο περίπου 40%. Οι λόγοι για αυτό το χαμηλότερο συσχέτιση μπορεί να σχετίζεται απλώς σε διαφορές στην ευαισθησία της δοκιμασίας: LINE-1 ανιχνεύσεις κυμαίνονταν από 0-50% μεθυλιωμένες στην ανάμειξη μελέτες, ενώ

Alu δοκιμασίες

είχε μικρότερη πλάτος, που κυμαίνονται από 0-30% μετουσιωμένο, ενδεχομένως, τη δευτεροβάθμια στην τριτοβάθμια μεταξύ των ατόμων θόρυβο του περιβάλλοντος που οφείλεται στις διακυμάνσεις ακολουθία μεταξύ μεμονωμένων

Alu

στοιχεία (Εικόνα S1). Μια άλλη πιθανότητα είναι ότι υπάρχει μια λειτουργική ή βιολογική διαφορά μεταξύ των δύο τύπων των επαναλαμβανόμενων DNA σε συντήρηση μεθυλίωση τους. επαναλήψεις LINE είναι πιο συχνή σε γονίδιο-φτωχές περιοχές του γονιδιώματος, ενώ το

Alu

στοιχεία είναι πιο συχνές σε γονίδιο-πλούσιες περιοχές [23]. Από παγκόσμια μεθυλίωση μπορεί να μετρηθεί με μία ποικιλία μεθόδων, αυτές οι διαφορές μεταξύ των ανάλυσης πρέπει να θεωρηθούν κατά τη σύγκριση αποτελέσματα χρησιμοποιώντας διαφορετικούς τύπους δοκιμασιών και μελετών.

Τα αποτελέσματά μας δείχνουν μειώσεις στην παγκόσμια μεθυλίωση σε κυτταρικές σειρές από μία ποικιλία τύπους καρκινικών κυττάρων (Σχήμα 1), παρόμοια με προηγουμένως δημοσιευμένα αποτελέσματα για μια ποικιλία τύπων όγκου [12] – [14], [21]. Αξίζει να σημειωθεί ότι οι κυτταρικές σειρές καρκίνου γενικά είχαν χαμηλότερα επίπεδα μεθυλίωσης από τα δείγματα HNSCC, ίσως αντανακλά περισσότερο χρόνο για να συσσωρεύσουν απώλεια μεθυλίωση ή την κλωνική φύση αυτών των κυτταρικών σειρών. Ωστόσο, ορισμένες κυτταρικές σειρές (π.χ., RKO) είχαν ελάχιστη ή και καμία απώλεια της μεθυλίωσης. Αυτό συνεπάγεται, όπως για τους όγκους πρωτογενή HNSCC, ότι υπάρχει μεταβλητότητα στην υποκείμενη βιολογία. Η περαιτέρω έρευνα σε ό, τι προκαλεί αυτή η μεταβλητότητα θα μπορούσε να παρέχει σημαντικές πληροφορίες σχετικά με μονοπάτια της και το ρόλο των επιγενετικών αλλαγών στην εξέλιξη του καρκίνου.

Τα αποτελέσματά μας καταδεικνύουν μια θετική συσχέτιση μεταξύ της διατήρησης της κανονικής μεθυλίωσης LINE και HPV-θετικότητα. Επιπλέον, η διατήρηση της κανονικής μεθυλίωσης LINE επίσης συσχετίζεται με λιγότερο LOH ή αστάθεια γονιδιώματος. Αν ΑΕ αντιμετωπίζεται ως υποκατάστατο για το χρωμόσωμα αστάθειας (CIN), το αποτέλεσμα αυτό είναι σύμφωνο με την προηγουμένως αναφερθείσα αποτέλεσμα ότι οι καρκίνοι του παχέος εντέρου έχουν επίσης τη σύνδεση μεταξύ CIN και η απώλεια της γραμμής υπερμεθυλίωσης [14], [15]. Έτσι, είναι δελεαστικό να υποθέσουμε ότι η γραμμή της μεθυλίωσης και CIN είναι σχετίζεται αιτιολογικά, ίσως μέσω γνωστών συσχέτιση της μεθυλίωσης με πιο πυκνά χρωματίνης συσκευασία, η οποία μπορεί να μεταφραστεί σε περισσότερες πιστότητα κατά τη διάρκεια των χρωμοσωμάτων του διαχωρισμού και επομένως λιγότερο ΑΕ. Ωστόσο, τα αποτελέσματά μας και έχουν αναφερθεί στο παρελθόν τα αποτελέσματα είναι καθαρά διασυνδέσεων? λειτουργικές μελέτες θα είναι αναγκαίες προτού μπορεί να αποδειχθεί αυτή η αιτιώδης σχέση.

Το νέο εύρημα στα αποτελέσματά μας είναι ότι ο HPV-θετικότητα συσχετίζεται με τη συντήρηση της γραμμής μεθυλίωσης. Μια πρόσφατη επιδημιολογική μελέτη προσδιορισμός των παραγόντων κινδύνου για LINE-1 υπομεθυλίωση αναφερθεί καμία σημαντική συσχέτιση μεταξύ της κατάστασης HPV DNA και τα επίπεδα μεθυλίωσης LINE-1 [17]. Ωστόσο, υπήρχαν μεθοδολογικές διαφορές μεταξύ αυτής και της μελέτης μας, συμπεριλαμβανομένης της χρήσης των δύο HPV Ε6 DNA και την κατάσταση του RNA στην ανάθεση κατάστασης HPV, με τη χρήση ενός διαφορετικού προσδιορισμού μεθυλίωση, και η χρήση του επιπέδου μεθυλίωσης ως συνεχή μεταβλητή στο ανάλυση. Παρά το γεγονός ότι Furniss και οι συνεργάτες του δεν παρουσιάζουν άμεση συσχέτιση, έδειξαν ότι τα αποτελέσματα ποικίλουν από τα επίπεδα μεθυλίωσης LINE-1 για τον HPV-αρνητικούς όγκους [23]. Απαιτούνται περαιτέρω μελέτες για να διευκρινιστεί η σχέση μεταξύ κατάστασης HPV και LINE μεθυλίωσης. Μια πιθανή υπόθεση είναι ότι, σε μια προσπάθεια να φιμώσει τον ιό HPV, τα μολυσμένα κύτταρα επάγουν μια πιο πληθωρική αντίδραση μεθυλίωσης, harkening πίσω στις απαρχές της μεθυλίωσης ως μηχανισμός ιογενή άμυνας. Αν και αυτό θα απαιτήσει και πάλι μηχανιστικών μελετών ή ίσως μελέτες σε πρόσθετους τύπους ιούς μεσολάβηση καρκίνων (π.χ., Ηπατίτιδα B και C με τη μεσολάβηση HCC σε σύγκριση με μη-ιικά προκαλούμενη HCC, ή EBV + λέμφωμα εναντίον EBV- λέμφωμα) να καθορίσει την αιτιότητα, τα αποτελέσματά μας κατά μήκος με εκείνες των Furniss και οι συνεργάτες του [17] σίγουρα παρέχουν περισσότερη υποστήριξη για την υπόθεση ότι ο HPV-θετικά HNSCC και HPV-αρνητικών HNSCC αντιπροσωπεύουν διαφορετικές βιολογικές οντότητες που προκύπτουν μέσω ξεχωριστών ογκογόνο οδών.

Εν ολίγοις, έχουμε αναπτύξει αρκετά νέα γραμμή (γραμμή-1) και ημίτονου (

Alu

) δοκιμασίες ολόκληρου γονιδιώματος μεθυλίωση, την οποία εφαρμόζονται για τον προσδιορισμό της κατάστασης μεθυλίωσης μιας ποικιλίας καρκινικών κυτταρικών σειρών και δείγματα πρωτογενούς όγκου HNSCC. Βρίσκουμε ότι κυτταρικές γραμμές καρκίνου σε γενικές γραμμές έχουν μειωμένα επίπεδα μεθυλίωσης των επαναλαμβανόμενων στοιχείων. Ακόμη πιο μεταβλητότητα LINE-1 μεθυλίωση σημειώθηκε μέσα σε δείγματα HNSCC. Είναι σημαντικό, ανακαλύψαμε ένα συσχετισμό μεταξύ HPV-αρνητικότητα, αυξημένη αστάθεια του γονιδιώματος, και την απώλεια του γονιδιώματος μεθυλίωσης. Η συσχέτιση αυτή ενισχύει την έννοια ότι ο HPV-θετικά και HPV-αρνητικών καρκίνων είναι βιολογικά διακριτά και παρέχει μια βάση για μελλοντικές μελέτες για να καθορίσει περαιτέρω την βιολογική μηχανισμό που διέπουν αυτά τα ευρήματα.

Υλικά και Μέθοδοι

Ασθενών δείγματα και κυτταρικές σειρές

Συμφωνήθηκε όγκου /φυσιολογικό παρακείμενο δείγματα ιστού, και όταν θα είναι διαθέσιμα του τραχήλου της μήτρας μεταστάσεις στους λεμφαδένες από ασθενείς HNSCC συλλέχθηκαν στο Ohio State University, όπως περιγράφηκε προηγουμένως (Πίνακας S1) [24]. Γενωμικό DNA εκχυλίστηκε από τη φάση της DNA-πρωτεΐνης ΤΡΙΖΟΙ εκχυλίζεται ιστών σύμφωνα με τις υποδείξεις του κατασκευαστή (Invitrogen). DNA εκχυλίζεται χρησιμοποιώντας το κιτ Puregene (Gentra) επί σφαιρίδια κυττάρου από τέσσερις κυτταρικές γραμμές HNSCC (SCC-4, SCC-9, SCC-15 και SCC-25), κυτταρικές σειρές καρκίνου του πνεύμονα πέντε (H1395, H520, H2170, SK- MES-1 και SW-900), το ένα στήθος κυτταρική σειρά καρκίνου (MCF7), ένα τραχηλικό καρκίνο κυτταρική σειρά (HeLa), κυτταρικές σειρές καρκίνου τρία εγκεφάλου (U251, SK-Ν-AS και M059K), ένα μήτρας καρκινικής κυτταρικής γραμμής ( AN3CA), ένα κύτταρο σαρκώματος γραμμής (ΗΤ1080), ένα νεφρό καρκινικής κυτταρικής γραμμής (ΗΕΚ293), και κυτταρικές σειρές καρκίνου έξι κόλον (LoVo, SW48, ΗΟΤ-15, DLD-1, COLO 320DM και RKO) σύμφωνα με τις υποδείξεις του κατασκευαστή. Επιπλέον, το DNA από την κυτταρική γραμμή λεμφοβλαστοειδούς BL1395 χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος αντιστοίχιση προς H1395. Όλες οι κυτταρικές σειρές είναι διαθέσιμες από την ATCC (Manassas, VA).

Κανονική πισίνες και μετουσιωμένο ελέγχους

Τέσσερις πισίνες των κανονικών δειγμάτων παρήχθησαν εκπροσωπούν διαφορετικά φύλα και τις ηλικίες. δείγματα DNA ελήφθησαν από ανώνυμους δότες αίματος και ήταν ένα δώρο του Δρ Michael J. Siciliano (Πανεπιστήμιο του Τέξας Μ D. Anderson Κέντρο Καρκίνου). Τρεις από τις πισίνες (γυναίκες ηλικίας άνω των 40 ετών, γυναίκες ηλικίας 40 και κάτω, και τα αρσενικά ηλικίας 40 ή κάτω) ήταν το καθένα αποτελείται από πέντε άτομα ανά πισίνα. Η τέταρτη πισίνα (άνδρες ηλικίας άνω των 40 ετών) αποτελούνταν από έξι άτομα. Εμπορικά παρασκευάζεται καθολικά μεθυλιωμένα και καθολικά μη μεθυλιωμένο DNA (UM.C και U2M.C, αντίστοιχα) ελήφθησαν από την Chemicon. UM.L (καθολικά μεθυλιωμένο DNA) παρήχθη ως θετικός έλεγχος δια κατεργασίας κανονική λευκοκυττάρων περιφερικού αίματος (PBL) DNA με το CpG μεθυλάση

M.Sss

Ι (New England Biolabs) [25]. U2M.L (καθολικά μη μεθυλιωμένο DNA) παρήχθη ως αρνητικός έλεγχος ενισχύοντας το ίδιο DNA χρησιμοποιήθηκε για να δημιουργηθεί το DNA θετικού μάρτυρα χρησιμοποιώντας το κιτ GenomiPhi (GE Healthcare) όπως περιγράφεται από τον κατασκευαστή.

Αστάρια και συνθήκες PCR

εκκινητές PCR και εκκινητές προσδιορισμού αλληλουχίας σχεδιάστηκαν χρησιμοποιώντας λογισμικό PSQ Assay Design (Biotage) [26]. Τρεις δοκιμασίες για ΣΙΝΕ (

Alu

) στοιχεία και τρεις δοκιμασίες για LINE 1-στοιχεία σχεδιάστηκαν (Πίνακας 1). Η PCR πραγματοποιήθηκε σε μία αντίδραση 25 μΐ που περιέχει Qiagen HotStart Taq μάστερ μιξ (Qiagen) χρησιμοποιώντας 1 μλ κατεργασμένο με όξινο θειώδες DNA (10 ng του ισοδυνάμων DNA). Για να μειωθεί το κόστος ανά δοκιμασία, το πρωτόκολλο ενίσχυσης αναπτύχθηκε χρησιμοποιώντας βιοτινυλιωμένο προσέγγιση καθολικό εκκινητή. Οι τελικές συγκεντρώσεις εκκινητή ήταν 10 ηΜ του εκκινητή ουρά με τον καθολικό εκκινητή, 100 ηΜ του untailed εκκινητή, και 90 ηΜ της καθολικής βιοτινυλιωμένου εκκινητή σε κάθε αντίδραση [19]. Η ενίσχυση διεξήχθη υπό τις ακόλουθες συνθήκες: μετουσίωση στους 95 ° C για 5 λεπτά, ακολουθούμενη από 45 κύκλους στους 95 ° C για 30 δευτερόλεπτα, 45 ° C (Sines) ή 53 ° C (γραμμές) για 1 λεπτό, 72 ° C για 45 δευτερόλεπτα, και μία τελική επέκταση στους 72 ° C για 7 λεπτά [19].

PyroMethA (PMA) και μεθυλίωση εκτίμηση

μετατροπή διθειώδους γονιδιακού DNA έγινε όπως αναφέρθηκε προηγουμένως [ ,,,0],19]. Εν συντομία, 0,5-1,0 μg γονιδιωματικού DNA υποβλήθηκε σε επεξεργασία χρησιμοποιώντας το κιτ CpGenome DNA τροποποίηση (Chemicon), συμπεριλαμβανομένων των σουλφόνωση DNA, απαμίνωση, η αφαλάτωση, αποσουλφόνωσης και την ανάκτηση. Κατεργασμένου με όξινο θειώδες DNA αποθηκεύτηκε στους -20 ° C μέχρι τη χρήση. PMA είναι ένα Pyrosequencing-based τεχνολογία που μπορεί να αναλύσει CpG μεθυλίωσης σε πολλαπλές τοποθεσίες σε μια μόνο ανάλυση. Μετά από μία PCR ενίσχυση χρησιμοποιώντας κατεργασία με όξινο θειώδες DNA, Pyrosequencing διεξήχθη χρησιμοποιώντας το σύστημα PSQ96HS (Biotage) σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή συμπεριλαμβανομένων των ενιαίων πρωτεΐνη δέσμευσης κλώνου (αντιδραστήρια PyroGold). Τα αποτελέσματα αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας λογισμικό Q-CpG (Biotage), η οποία υπολογίζει το ποσοστό μεθυλίωσης (

MC /(

mC + C)) για κάθε θέση CpG, επιτρέποντας ποσοτικές συγκρίσεις. Ο δείκτης μεθυλίωση (που ονομάζεται ΜΙ) υπολογίστηκε ως η μέση τιμή του

MC /(

mC + C) για όλες τις θέσεις που εξετάστηκαν CpG στην δοκιμασία. Σε γενικές γραμμές, υπήρξε πολύ καλή συμφωνία των επιπέδων μεθυλίωσης μεταξύ των μεμονωμένων CpG θέσεις στην ίδια δοκιμασία. Κατεργασμένου με όξινο θειώδες UM.L χρησιμοποιήθηκε ως καθολικά μεθυλιωμένο αναφοράς. Τα δεδομένα PMA για αυτές τις παγκόσμιες δοκιμασίες μεθυλίωσης αναφερθεί ως ποσοστό της αξίας μετουσιωμένο αναφοράς (PMR), ομαλοποίηση της MI κάθε δείγματος στο MI της καθολικά μετουσιωμένο αναφοράς (UM.L) DNA [25].

εμπορική καθολικά μεθυλιωμένο DNA (UM.C) και καθολικά μη μεθυλιωμένο DNA (U2M.C) (Chemicon) έχουν επίσης χρησιμοποιηθεί για να εκτελέσει αυτή την ανάλυση, και το αποτέλεσμα ήταν γραμμική (

r

= 0,983,

p

-τιμή & lt? 0,0005 για LINE-1? Σχήμα S1). Ωστόσο, εμπορικά διαθέσιμα U2M δεν ήταν εντελώς μη μεθυλιωμένα, δεδομένου ότι ένα καθαρό δείγμα U2M.C είχε υπολειμματική μεθυλίωση του 26% περίπου, διαφορετική από U2M.L παρασκευάστηκε στο εργαστήριο μας, η οποία είχε την αναμενόμενη 0% μεθυλίωσης. Ως εκ τούτου, χρησιμοποιείται το δικό μας καθολικά μη μεθυλιωμένο DNA (U2M.L) για όλες τις περαιτέρω μελέτες.

Ανίχνευση HPV16 Ε6 DNA και RNA E6 για να καθορίσει την κατάσταση του HPV

Ποσοτική πραγματικού χρόνου PCR διεξήχθη σε ανιχνεύουν είτε HPV16 Ε6 DNA ή Ε6 cDNA χρησιμοποιώντας την ίδια εκκινητών /ανιχνευτών που καθορίζονται για τα δύο. Οι εκκινητές σχεδιάστηκαν χρησιμοποιώντας την ορότυπο HPV16, η οποία αντιπροσωπεύει το ≥90% όλων των περιπτώσεων HNSCC HPV-θετικά [27]. Για τον έλεγχο για πιθανή μόλυνση γενωμικού DNA στο cDNA, συγκρίθηκαν επιμηκύνσεις του cDNA από DNAse επεξεργασμένο RNA που είχε παρασκευαστεί χρησιμοποιώντας το SuperScript First Strand Synthesis System (Invitrogen) με και χωρίς την προσθήκη αντίστροφης μεταγραφάσης. Η PCR πραγματοποιήθηκε σε ένα 25 μΙ αντίδρασης που περιέχει iQ κύριο Supermix μίγματος (Biorad) χρησιμοποιώντας 25 ng γενωμικού DNA ή 5 μΙ cDNA. Το ευθύ έναυσμα (5′-CTGCAATGTTTCAGGACCCA-3 ‘) και αντίστροφο εκκινητή (5′-TCATGTATAGTTGTTTGCAGCTCTGT-3′) προστέθηκαν σε μια τελική συγκέντρωση 200 ηΜ κάθε. Το Texas Red επισημασμένου ανιχνευτή σε πραγματικό χρόνο (5’-TR-AGGAGCGACCCAGAAAGTTACCACAGTT-3 ‘) προστέθηκε σε μια τελική συγκέντρωση 320 ηΜ. Φλουορεσκεΐνη προστέθηκε σε κάθε αντίδραση σε μια τελική συγκέντρωση των 10 ρΜ. Κάθε αντίδραση διεξήχθη εις τριπλούν. Η ενίσχυση διεξήχθη υπό τις ακόλουθες συνθήκες: μετουσίωση στους 95 ° C για 8.5 λεπτά, ακολουθούμενη από 50 κύκλους στους 95 ° C για 15 sec, 60 ° C για 1 λεπτό και αναλύονται σε πραγματικό χρόνο χρησιμοποιώντας μία μηχανή iCycler PCR και λογισμικού ( Biorad). Τα δείγματα τα οποία δεν ενίσχυσε βαθμολογήθηκαν ως αρνητικά, και όλα τα δείγματα ομαδοποιούνται σε 3 κατηγορίες με βάση αυτά τα αποτελέσματα: (+ /+), θετικά τόσο για Ε6 DNA και RNA Ε6? (+/-), Θετική για Ε6 DNA, αλλά μεταγραφικά σιωπηρό? και (- /-), αρνητικά για Ε6 DNA και RNA. κατάσταση HPV επιτυχώς προσδιορίστηκε για 24 από τα δείγματα HNSCC 26, και αυτά χρησιμοποιήθηκαν για επακόλουθες αναλύσεις χρησιμοποιώντας κατάσταση HPV.

10K SNPChip LOH ανάλυση

HNSCC γενωμικά DNAs εκχυλίστηκαν χρησιμοποιώντας το πρότυπο TriZol- πρωτόκολλο εκχύλισης? αυτοί καθαρίστηκαν περαιτέρω με καταβύθιση με αιθανόλη πριν και μετά την ενίσχυση ολόκληρο το γονιδίωμα χρησιμοποιώντας το κιτ GenomiPhi (GE Healthcare). Η Affymetrix 10K

Xba

131 σειρά περιέχει περίπου 11.500 SNPs με μέση απόσταση των 210 kb. Τυπική πρωτόκολλα Affymetrix παρακολουθήθηκαν για αυτές τις δοκιμασίες. Εν συντομία, περίπου 250 ng γονιδιωματικού DNA υποβλήθηκε σε πέψη με

Xba

Ι και κατόπιν συνδέθηκε προς προσαρμογείς. Στη συνέχεια, η ενίσχυση ενός εκκινητή διεξήχθη χρησιμοποιώντας τον GeneAmp PCR System 9700 (Applied Biosystems). Μετά από καθαρισμό με Qiagen MinElute 96 UF, ένα σύνολο περίπου 20 μα PCR προϊόντος ήταν κατακερματισμένη και σημασμένο με βιοτίνη. Ο υβριδισμός διεξήχθη στην Affymetrix GeneChip Hybridization φούρνο στους 48 ° C για 16-18 ώρες. Συστοιχίες πλύθηκαν και χρωματίστηκαν με το Fludics Station Affymetrix GeneChip 400 και σαρώθηκαν με τη Affymetrix GeneArray 2500 Scanner. επεξεργασία εικόνας έγινε με GCOS 1.0 του λογισμικού και γονότυπους παρήχθησαν με GTYPE 2.0 ή νεότερη έκδοση του λογισμικού.

Η στατιστική ανάλυση

Για να εκτιμηθεί η συσχέτιση μεταξύ των επιπέδων της μεθυλίωσης και των επιπέδων του ιού HPV φορτίου (α παρόμοια ανάλυση χρησιμοποιήθηκε επίσης για να εκτιμηθεί η συσχέτιση μεταξύ των επιπέδων μεθυλίωσης και το στάδιο TNM), προχωρήσαμε ως ακολούθως. Όλες οι τιμές μεθυλίωση του δείγματος μετατράπηκαν σε τάξεις. Μια τιμή που λείπει για τη δοκιμασία LINE1-1, για το δείγμα Ρ2, καταλογίστηκε χρησιμοποιώντας την τιμή P2 από το LINE1-3 (συσχέτιση μεταξύ της LINE1-1 και αναλύσεις LINE1-3 είναι 0,98). Αυτές οι τάξεις στη συνέχεια κλίμακα (σταθμισμένο) με HPV φορτίου, με βάρη από 0, 1 και 2 για – /-, +/- και + /+, αντίστοιχα. Η τελική ένωση «βαθμολογία» ήταν το άθροισμα αυτών των σταθμισμένο τάξεις. Η μηδενική κατανομή για αυτό το αποτέλεσμα εκτιμήθηκε με προσομοιώσεις στις οποίες επανειλημμένα διατίθενται δείγματα σε ομάδες HPV τυχαία. Τρέξαμε ένα εκατομμύριο προσομοιώσεις, καθώς και τους ορισμούς μας

σ

-τιμή ως δύο φορές το ποσοστό των περιπτώσεων στις οποίες το σκορ προσομοίωση ήταν τόσο μεγάλη ή μεγαλύτερη από αυτή που πραγματικά είδαν. προσομοίωση

p μας

-τιμή ήταν 0.011.

Υποστήριξη Πληροφορίες

Πίνακα S1.

Κλινική και μοριακά χαρακτηριστικά των δειγμάτων HNSCC

doi:. 10.1371 /journal.pone.0004941.s001

(0,12 MB DOC)

Εικόνα S1.

Δυναμική σειρά PMA LINE-1 και Alu δοκιμασίες. Ανάμιξη πειράματα για να καθοριστούν τα επίπεδα μεθυλίωσης PMA μετράται με ποικίλες αναλογίες καθολικά μεθυλιωμένων και μη μεθυλιωμένου DNA. UM.C και U2M.C αντιπροσωπεύουν εμπορικά διαθέσιμο (Chemicon) καθολικά μεθυλιωμένων και μη μεθυλιωμένων DNA, αντίστοιχα. UM.L και U2M.L παρήχθησαν από το ίδιο DNA με in vitro τροποποίηση στο εργαστήριο μας

doi:. 10.1371 /journal.pone.0004941.s002

(0,10 MB ΔΕΘ)

Εικόνα S2.

ανάλυση συσχέτισης των δοκιμασιών παγκόσμιας μεθυλίωσης ΣΙΝΕ και LINE.