Abstract

θάνατος των καρκινικών κυττάρων ρυθμίζεται από μια ενδογενή οδό κυτταρικού θανάτου που ελέγχονται από τους προ- και αντι-αποπτωτικά μέλη της οικογένειας Bcl-2. Up-ρύθμιση των αντι-αποπτωτικά μέλη οικογένειας Bcl-2 έχει δειχθεί ότι καταστέλλουν τον κυτταρικό θάνατο σε προ-κλινικά μοντέλα του ανθρώπινου καρκίνου και εμπλέκεται στην εξέλιξη της ανθρώπινου όγκου. Προηγούμενες μελέτες κέρδος-of-λειτουργία στο μοντέλο RIP1-TaG2 παγκρεατικών νησιδίων καρκινογένεσης, που περιλαμβάνουν ομοιόμορφες ή εστιακή /χρονική υπερέκφραση του Bcl-x

L, έδειξαν ταχεία σχηματισμό όγκων και την ανάπτυξη. Για να αξιολογηθεί συγκεκριμένα ο ρόλος του ενδογενούς Bcl-x στη ρύθμιση της απόπτωσης και την εξέλιξη του όγκου σε αυτό το μοντέλο, θα κατασκευαστεί ένα παγκρεατικών β-κυττάρων ειδικών νοκ-άουτ από δύο αλληλόμορφα του

Bcl-x

χρησιμοποιώντας το σύστημα Cre-ΙοχΡ του ομόλογο ανασυνδυασμό. Παραδόξως, δεν υπήρχε σημαντική επίπτωση στα ποσοστά απόπτωσης των καρκινικών κυττάρων ή στην αύξηση του όγκου των

Bcl-x

knockout ποντικών. Άλλα αντι-αποπτωτικών Bcl-2 μέλη της οικογένειας εκφράζονται, αλλά όχι ουσιαστικά μεταβληθεί σε επίπεδο mRNA των

Bcl-x

-null όγκους, ενδεικτικά της απόλυσης χωρίς αντισταθμιστική μεταγραφική ρύθμιση προς τα πάνω. Είναι ενδιαφέρον ότι η συχνότητα εμφάνισης της διηθητικά καρκινώματα μειώθηκε, και τα καρκινικά κύτταρα που στερούνται Bcl-x ήταν εξασθενημένη σε εισβολή σε ένα δύο θαλάμων δοκιμασίας trans-καλά κάτω από συνθήκες που μιμούνται υποξία. Έτσι, ενώ η λειτουργία του Bcl-x στην καταστολή της απόπτωσης και ως εκ τούτου την προώθηση της ανάπτυξης των όγκων είναι προφανώς περιττές, η γενετική εκτομή εμπλέκει Bcl-x στη διευκόλυνση επιλεκτικά εισβολή, σύμφωνα με μια πρόσφατη έκθεση στην οποία τεκμηριώνεται μια φιλο-επεμβατική ικανότητα των Bcl-x

L μετά από εξωγενείς υπερέκφραση

Παράθεση:. Hager JH, Ulanet DB, Hennighausen L, Hanahan D (2009) Γενετική Κατάλυση της Bcl-x Εξασθενεί ικανότητα εισβολής χωρίς να επηρεάζουν απόπτωση ή την ανάπτυξη του όγκου σε ένα μοντέλο ποντικού του παγκρέατος Νευροενδοκρινής Καρκίνος. PLoS ONE 4 (2): e4455. doi: 10.1371 /journal.pone.0004455

Επιμέλεια: Jörg Hoheisel, Deutsches Krebsforschungszentrum, Γερμανία

Ελήφθη: 23, Αυγ 2008? Αποδεκτές: 26 Δεκέμβρη 2008? Δημοσιεύθηκε: 11 Φεβρουαρίου 2009

Copyright: © 2009 Hager et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτή η έρευνα υποστηρίχθηκε από το Ίδρυμα AP Giannini Ιατρικής Έρευνας (ΟΒϋ), το Εθνικό Ινστιτούτο διαβήτη και του πεπτικού και νεφρικά νοσήματα (ΝΙϋϋΚ) (LH), και επιχορηγήσεις από το Εθνικό Ίδρυμα Καρκίνου (DH? R01CA45234). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

για όλες τις καρκινικές βλάβες για την αύξηση της μάζας και της κακοήθους δυναμικού, τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων πρέπει να ξεπεράσει τον κυτταρικό θάνατο [1]. Για το σκοπό αυτό, οι ανθρώπινοι όγκοι εμπλοκή ή απεμπλοκή μία ποικιλία οδών διαφυγής ή ελαχιστοποίηση της απόπτωσης. Η ανάγκη για κάτω-ρυθμίζουν την απόπτωση οφείλεται επίσης στο γεγονός ότι η ενεργοποίηση μεταλλάξεων σε ογκογονίδια, όπως επίσης και η υπερέκφραση του ογκογονιδίου αλληλόμορφα άγριου τύπου, προκαλούν όχι μόνο υπερπολλαπλασιασμού, αλλά επίσης και κυτταρικό θάνατο [2] – [4]. Ένα σημαντικό σώμα της στοιχεία υποστηρίζουν την άποψη ότι, χωρίς κάποιο βαθμό καταστολής της απόπτωσης, τα κύτταρα ογκογονίδιο που εκφράζουν δεν μπορεί να προχωρήσει παρελθόν σχετικά μικρή, προ-κακοήθεις αλλοιώσεις πολλαπλασιαστική [1], [5].

Η πρώτη άμεση γενετική σύνδεση ανάμεσα στη διαμόρφωση της απόπτωσης και της ανάπτυξης του όγκου προήλθε από την ανακάλυψη ότι η έκφραση του

Bcl-2

γονίδιο απορρυθμισμένης μέσω χρωμοσωμική μετατόπιση στο οζώδες λέμφωμα, και ότι αυτό το γονίδιο είναι ομόλογο με το

C. elegans

ρυθμιστής του κυτταρικού θανάτου, ced-9 [6] – [9]. Bcl-2 αποδείχθηκε ότι είναι το πρωτότυπο μιας οικογένειας δομικώς σχετίζονται αποπτωτικών ρυθμιστών, διαιρείται σε δύο υπο-ομάδες που εναλλακτικά καταστέλλουν ή επάγουν απόπτωση [10]. Το αντι-αποπτωτικό βραχίονα της οικογένειας Bcl-2 περιλαμβάνει Bcl-2, Bcl-x (πολλαπλές παραλλαγές ματίσματος αντι-αποπτωτική), Bcl-w, Α1, Mcl-1 και Boo [10] – [12]. Η ενεργοποίηση της απόπτωσης σε απόκριση προς ογκογονίδιο προκαλούμενη υπερπολλαπλασιασμό έχει περιγραφεί σε μία ποικιλία γενετικά μοντέλα ποντικών του καρκίνου, και συγκεκριμένα σε δύο μοντέλα καρκίνου των κυττάρων των νησιδίων του παγκρέατος νευροενδοκρινείς. Σε ένα τέτοιο μοντέλο, RIP1-TaG2 [13], [14], SV40 Τ-αντιγόνα συστατικά εκφράζονται στα β-κύτταρα των ενδοκρινών παγκρέατος υπό τον έλεγχο του υποκινητή της ινσουλίνης αρουραίου, με αποτέλεσμα μια πολυβάθμια μονοπάτι σε διηθητικό καρκίνωμα που είναι στοχαστική στη φύση και χρονικά παρατεταμένη. Σε 2-3 εβδομάδες της ηλικίας, η κανονική μεταγεννητική αναπτυξιακή πολλαπλασιασμό των κυττάρων των νησιδίων λεπταίνει, και σε ενήλικα ποντίκια υπάρχει μια σχετικά αργή κύκλο εργασιών β-κυττάρων, με ένα χαμηλό ρυθμό πολλαπλασιασμού αντισταθμίζεται από ένα χαμηλό ποσοστό αποπτωτικών, η οποία οδηγεί σε μια πολύ μέτρια αύξηση της μάζας των β-κυττάρων με την ηλικία. Σε αντίθεση, τα β-κύτταρα του RIP1-TaG2 νησίδες αρχίζουν υπερπολλαπλασιαστικό σε 3-4 εβδομάδες της ηλικίας, μαζί με μια ταυτόχρονη ενεργοποίηση της απόπτωσης. Μια πρώιμη μελέτη ανέφερε ότι η απόπτωση κορυφώθηκε κατά το στάδιο αγγειογενετική νησιδίων αλλά ήταν σημαντικά κάτω διαμορφωμένου σε όγκους, γεγονός που υποδηλώνει ότι η αντίσταση σε κυτταρικό θάνατο ήταν ένα κρίσιμο βήμα της ανάπτυξης του όγκου από προδρόμους αγγειογενετική νησίδος [15]. Μια πιο πρόσφατη μελέτη από αυτό το μοντέλο έχει δείξει ότι κάτω διαμόρφωση δεν είναι πάντα η περίπτωση, από το ότι οι όγκοι όψιμη φάση (συμπεριλαμβανομένων διεισδυτικών καρκινωμάτων) στις τρέχουσες γενεές αναδιασταύρωσης τυπικά έχουν αποπτωτική ποσοστά παρόμοια με εκείνα του αγγειογόνου νησίδες, γεγονός που υποδηλώνει μια πιο λεπτή φαινόμενα στο παιχνίδι στην επεκτατική ανάπτυξη του όγκου (ref [16]). Δύο καλά καθορισμένα καταστολείς απόπτωσης έχουν εντοπιστεί σε αυτό το μοντέλο: λειτουργική απενεργοποίηση της ρ53 μέσω μεγάλου Τ-αντιγόνου έκφραση, και αυξητική ρύθμιση του παράγοντα επιβίωσης IGF-II [17], [18]. Γενετικές μελέτες που περιλαμβάνουν σταυρούς σε ένα ανενεργό αλληλόμορφο IGF-II έδειξε ότι σε μεγάλο βαθμό λειτουργεί ως παράγοντας επιβίωσης σε αυτό το μοντέλο, στο εν λόγω απουσία του IGF-II προκλητών πολύ αυξημένη (5 ×) αποπτωτικών τιμές στο υπερ-πολλαπλασιαστικές αλλοιώσεις, και οι μικροί όγκοι προκύπτουν είχε ένα λιγότερο κακοήθη κυτταρικό φαινότυπο? Συγκεκριμένα, ο ρυθμός πολλαπλασιασμού παρέμεινε αμετάβλητο [18], [19].

Μια επίδειξη ότι τα αντι-αποπτωτικά μέλη της οικογένειας Bcl-2 μπορούν να διαμορφώσουν κυτταρικό θάνατο στο μοντέλο αυτό προήλθε από την πειραματική υπερέκφραση του

Bcl-x

L

σε β-κύτταρα μέσω του προαγωγού ινσουλίνης αρουραίου (

RIP-Bcl-x

L

), η οποία οδήγησε σε κατέστειλε απόπτωση και την αύξηση του φορτίου του όγκου , μαζί με ένα γενικό «επιτάχυνση» της οδού του όγκου [15]. Πιο πρόσφατα, ο ίδιος RIP-

Bcl-x

L

διαγονίδιο έχει επίσης δειχθεί να καταστέλλει την απόπτωση σε ένα άλλο μοντέλο ποντικού καρκινώματος κυττάρων νησιδίων, στο οποίο ένα myc πρωτεΐνη σύντηξης, myc

Tam, εκφράστηκε στα β-κύτταρα υπό τον έλεγχο του προαγωγού ινσουλίνης αρουραίου [20]. Myc

TAM είναι ενεργό μόνο με την παρουσία της ταμοξιφαίνης, επιτρέποντας διεγέρσιμη και αναστρέψιμη γονιδιακής έκφρασης. Η μεταγεννητική αγωγή ποντικών με tamoxifen καταλήγει σε μία ταχεία επαγωγή του myc

ΤΑΜ ταυτόχρονη έκφραση με υπερ-πολλαπλασιασμού των β-κυττάρων. Είναι ενδιαφέρον, αυτό το υπερ-πολλαπλασιασμός συνοδεύτηκε από μαζικές β-κυττάρου απόπτωση που οδήγησε σε υποστροφή νησίδα μέσα σε 6-10 ημέρες. Υπερ-έκφραση του

Bcl-x

L

μέσω το ίδιο

RIP-Bcl-x

L

διαγονιδίου κατέστειλε αυτή την απόπτωση, με αποτέλεσμα την αύξηση της μάζας β-κυττάρων και μια ταχεία εξέλιξη σε διηθητικά καρκινώματα. Έτσι, σε δύο διαφορετικά διαγονιδιακά μοντέλα ποντικών του καρκινώματος κυττάρων νησιδίων, που προκαλείται από δύο λειτουργικά διακριτές ογκοπρωτεΐνες, υπερ-έκφραση του

Bcl-x

L

καταστέλλει την απόπτωση, με αποτέλεσμα τον σχηματισμό επιταχυνόμενη όγκου. Τα αποτελέσματα δείχνουν ότι η απόπτωση που παρατηρείται σε αυτούς τους τύπους όγκου είναι, τουλάχιστον εν μέρει, με τη μεσολάβηση της μιτοχονδριακής οδού θανάτου. Στην έκθεση αυτή, θα διερευνήσει το ρόλο που παίζει ενδογενές Bcl-x στη ρύθμιση της απόπτωσης και την ανάπτυξη του όγκου στο μοντέλο RIP1-TaG2 μέσω στοχευμένη διαγραφή του γονιδίου στα β-κύτταρα ογκογονίδιο που εκφράζουν τη χρήση του συστήματος Cre /ΙοχΡ.

Αποτελέσματα

Bcl-x έκφραση σε RIP1-TaG2 κυττάρων των νησιδίων καρκινογένεση

In situ υβριδισμού με ένα παν-ισομορφή ανιχνευτής για τμήματα παγκρεατικού ιστού από ποντίκια RIP1-TaG2 στο παρελθόν πρότεινε ότι

Bcl-x

mRNA ήταν μετρίως τα πάνω ρυθμισμένη σε όγκους σε σχέση με πρόδρομες βλάβες [15]. Για να επιβεβαιώσετε ότι η Bcl-x είναι αισθητά εκφράζεται στο επίπεδο της πρωτεΐνης κατά τη διάρκεια της ογκογένεσης νησάκι, πήγαμε για να αξιολογήσει τα επίπεδα των Bcl-x πρωτεΐνης με Western αποτύπωση χρησιμοποιώντας λύματα από την κανονική νησίδες και από τα διακριτά στάδια του παγκρέατος ογκογένεσης νησίδα στην RIP1-TaG2 ποντίκια. Όπως υποδεικνύεται στο Σχήμα 1, μια ζώνη που μεταναστεύει στα 27 kDa συνεπής με την Bcl-x

L ισομορφή ανιχνεύθηκε σε παρόμοια επίπεδα σε φυσιολογικά νησίδια και στα τρία στάδια νεοπλασματικών. Επιπλέον, ένα ελαφρώς ταχύτερη μεταναστευτική ζώνη, πιθανώς αντιστοιχεί στο εναλλακτικό παραλλαγή ματίσματος Bcl-x

β [21], [22], ανιχνεύθηκε στο νησιδίων και όγκου στάδιο αγγειογενετική αλλά όχι φυσιολογικά νησίδια ή το στάδιο υπερπλαστική νησιδίων. Έτσι τα συνολικά επίπεδα των Bcl-x πρωτεΐνης μετρίως αυξημένα στα στάδια αγγειογόνο νησιδίων και του όγκου.

εκχυλίσματα πρωτεΐνης από δεξαμενές κανονικά, μη διαγονιδιακά νησίδες (Ν), υπερπλαστικό νησίδες (H), αγγειογενετική νησίδες ( Α), και όγκων (Τ) από ποντίκια RIP1-TaG2 ανοσοστυπώθηκαν με αντισώματα προς Bcl-x και β-ακτίνη ως έλεγχος φόρτωσης. Η kDa ζώνη 27 αντιπροσωπεύει Bcl-x

L? η ταχύτερη μεταναστευτική ζώνη παρούσα σε εκχυλίσματα αγγειογενετική νησάκι και του όγκου μπορεί να αντιπροσωπεύει την εναλλακτική παραλλαγή ματίσματος, Bcl-x

β.

Η

Δημιουργία ενός β-κυττάρου ειδικό γονίδιο νοκ-άουτ του bcl-x

Για να αξιολογηθεί ο λειτουργικός ρόλος του Bcl-x σε RIP1-TaG2 ογκογένεση, εμείς απενεργοποίησε την-x Bcl

γονίδιο

στα β-κύτταρα του παγκρέατος ενδοκρινών χρησιμοποιώντας το σύστημα Cre /ΙοχΡ του ομόλογου ανασυνδυασμού. Η γραμμή RIP-Cre απασχολούνται εκφράζει Cre σε περίπου 82% των β-κυττάρων, μεσολαβώντας αποτελεσματική ανασυνδυασμού στις θέσεις ΙοχΡ [23], [24]. Το «floxed» αλληλόμορφο του

Bcl-x

,

Bcl x-

fl /fl

, στην οποία τα εξόνια 1 και 2 πλαισιώνονται από θέσεις ΙοχΡ, έχει αποδειχθεί ότι είναι μια αποδοτική υπόστρωμα για την ανασυνδυάση Cre, παράγοντας ένα ανενεργό αλληλόμορφο εξής ανασυνδυασμό σε άλλους ιστούς [23] – [25]. Πρώτα δημιουργείται

RIP-Cre

,

Bcl-x

fl /fl

ποντίκια (και διάφορα γονότυπους ελέγχου) λείπει το ογκογονίδιο, και να τους ηλικίας έξω για να & gt? 12 εβδ για την αξιολόγηση πιθανές επιπτώσεις στην ανάπτυξη β κυττάρων και την ομοιόσταση.

RIP-Cre

?

Bcl-x

fl /fl

και

Bcl-x

fl /fl

ποντίκια γεννήθηκαν στην αναμενόμενη Μέντελ αναλογίες, και έφτασε στην ενηλικίωση χωρίς πρώιμη θνησιμότητα ή εμφανή παθολογία. Εξετάσαμε H & amp? Ε χρώση παγκρεατικών τομών από

RIP-Cre: Bcl-x

fl /fl

, και

Cre

-αρνητικοί ποντίκια ελέγχου χρησιμοποιώντας οπτικό μικροσκόπιο. Αριθ προφανής διαφορά στο μέγεθος των νησιδίων, διανομή, ή τον αριθμό παρατηρήθηκε σε μια διπλή τυφλή εξέταση αυτών των τμημάτων (Εικόνα 2Α). Τα αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι η ανάπτυξη β-κυττάρων και τη μορφογένεση των νησιδίων ήταν ουσιαστικά φυσιολογικό στην απουσία της λειτουργίας του Bcl-x, αν και ανεπαίσθητες φυσιολογικές επιδράσεις δεν μπορούν να αποκλειστούν από την ανάλυση αυτή. Μια εναλλακτική εξήγηση για την έλλειψη εμφανούς φαινοτύπου σε

RIP-Cre

?

Bcl-x

fl /fl

ποντίκια θα ήταν ότι οι β-κυττάρων με διαγράφεται

Bcl-x

πέθανε, και έτσι οι κανονικές νησίδες που παρατηρήθηκαν προήλθαν από μη-ανασυνδυάζεται, » Escaper «β-κύτταρα που δεν εκφράζουν το διαγονίδιο που προέρχεται Cre. Για να εκτιμηθεί αυτή η δυνατότητα, απομονώσαμε γονιδιακού DNA από τις πισίνες των νησιδίων που απομονώνονται από

RIP-Cre

?

Bcl-x

fl /fl

ποντίκια και διεξάγεται ανάλυση PCR με εκκινητές που θα ενισχύουν και να διακρίνει μια ανασυνδυάζονται αλληλόμορφο από ένα μη-ανασυνδυαστεί αλληλόμορφο (Σχήμα 2Β). Αποτελεσματική ανασυνδυασμός ανιχνεύθηκε σε

RIP-Cre

?

Bcl-x

fl /fl

νησίδες. Όπως ήταν αναμενόμενο, ο ανασυνδυαστεί αλληλόμορφο δεν ανιχνεύτηκε σε ελέγχους έλλειψη του διαγονιδίου RIP-Cre (ή σε σπλήνα από

RIP-Cre

?

Bcl-x

fl /fl

ποντίκια, όπου Cre δεν εκφράζεται)

(Α) Η &? Ε χρώση παγκρεατικών τομών από 12 εβδομάδων ποντικούς των ακόλουθων γονοτύπων:.

Bcl-x

+ /+

?

RIP-Cre? Bcl-x

+ /+

?

και RIP-Cre? Bcl-x

fl /fll

. Εξετάστηκαν πολλαπλά τμήματα καθενός από τα ζώα που απεικονίζονται σε μικροφωτογραφίες. (Β) Γονιδιωματικό DNA από συνενώσεις παγκρεατικών νησίδων απομονώθηκε από ποντικούς διακριτών γονοτύπων. PCR διεξήχθη με τη χρήση ενός εκκινητή που δεσμεύεται ανάντη των 5 ‘θέση ΙοχΡ και ένα άλλο εκκινητή που δεσμεύεται 3’ προς την κατάντη θέση ΙοχΡ. Το PCR θραύσμα του μη ανασυνδυασθεί αλληλόμορφο και το ανασυνδυασθεί αλληλόμορφο είναι 2.9 kb και 150 bp, αντίστοιχα. Παγκρεατικά νησίδια απομονώθηκαν (Υλικά και Μέθοδοι) 4 με 6 ζώα κάθε γονότυπο και συγκεντρώνονται.

Η

Η αξιολόγηση του λειτουργικού ρόλου των Bcl-x σε RIP1-TaG2 ογκογένεση

Για να διερευνήσουν ο ρόλος των Bcl-x στην ρύθμιση της απόπτωσης κατά τη διάρκεια RIP1-TaG2 ογκογένεση, δημιουργήσαμε ένωση ποντίκια που ήταν ομόζυγα για το

Bcl-x

fl /fl

αλληλόμορφο και είτε διεξάγεται τόσο το RIP1-TaG2 και η RIP-Cre διαγονιδίων, ή απλά το διαγονίδιο RIP1-TaG2. Συμπληρωματικούς ελέγχους περιλαμβάνονται τα ποντίκια που έφεραν το διαγονίδιο RIP1-TaG2, και είτε

Bcl-x

+ /+ ή Bcl-x

fl /+

αλληλόμορφα. Εμείς ηλικίας από ομάδες αυτών των ποντικών έως 13 εβδομάδων, και να ποσοτικοποιηθεί τόσο φορτίο του όγκου (όγκος) και τον αριθμό των όγκων. Η στοχευμένη knockout του

Bcl-x

δεν είχε ως αποτέλεσμα μία σημαντική διαφορά στο φορτίο του όγκου (Σχήμα 3Α). Αυτό ουσιαστικά «άγριου-τύπου» φορτίο όγκου στα ζώα knockout συνοδευόταν από μείωση κατά περίπου 40% σε αριθμό όγκων? Ωστόσο, το αποτέλεσμα αυτό δεν ήταν στατιστικά σημαντική (Σχήμα 3Β). Για να προσδιορίσετε αν αυτή η έλλειψη εμφανούς φαινοτυπική επίδραση στην ανάπτυξη του όγκου ήταν επίσης αντανακλάται στο αποπτωτικό ρυθμό, πραγματοποιήσαμε αναλύσεις TUNEL σε φορμόλη σταθερές τομές παραφίνης από το

RIP1-TaG2

?

RIP-Cre

?

Bcl-x

fl /fl

και

RIP1-TaG2

?

Bcl-x

fl /fl

ζώα. Όπως προτείνεται από τα δεδομένα φορτίο του όγκου και τον αριθμό των όγκων, δεν υπήρχε σημαντική διαφορά στο ποσοστό αποπτωτικών σε όγκους από «knockout» έναντι των ζώων ελέγχου (Εικόνα 3C).

(Α και Β) Σύγκριση του μεγέθους του όγκου και αριθμός. Μακροσκοπικά αποκόπηκαν ορατό όγκους από 13 εβδομάδες παλαιά ζώα, επισυνάπτεται εξωκρινείς ιστού που έχει αφαιρεθεί και να μετρηθεί με χάρακα. Ο όγκος του όγκου υπολογίστηκε χρησιμοποιώντας τον τύπο V = (x * y

2) × 0,52. Τα δεδομένα αντιπροσωπεύουν μέση τιμή ± SEM? + /+ Και FL /+: n = 7? FL /FL: n = 24? RIP-Cre? Fl /Fl: n = 22. Η στατιστική σημαντικότητα προσδιορίστηκε με μη-παραμετρική T-test (Mann-Whitney). P = 0,98 ποσοστό (D) αποπτωτικά. Τα αποπτωτικά κύτταρα ποσοτικοποιούνται με την επισήμανση TUNEL των παγκρεατικών τομών από 13 εβδομάδες παλαιά ζώα. Δεδομένα αντιπροσωπεύουν μέση τιμή ± SEM (η = 5 ποντικοί /ομάδα). Το ποσοστό ΤΟΥΝΕΛ

+ κυττάρων υπολογίστηκε από τα τμήματα των 16-17 μεμονωμένων όγκων /ομάδα. Η στατιστική σημαντικότητα προσδιορίζεται με μη-παραμετρική T-test (Mann-Whitney). . P = 0,98

Η

Για να βεβαιωθείτε ότι

Bcl-x

ήταν αποτελεσματικά διαγραφεί στους όγκους που προκύπτουν σε

RIP1-TaG2

?

RIP-Cre

?

Bcl-x

fl /fl

ποντίκια, παρακολουθήσαμε ανασυνδυασμό χρησιμοποιώντας δοκιμασία που βασίζεται στην PCR επί γενωμικού DNA από 12 τυχαία επιλεγμένα όγκους (εύρος 5,2 mm

3-229 mm

3) : 10/12 όγκοι εμφάνισαν πλήρη ανασυνδυασμού, 1/12 έδειξε μερική ανασυνδυασμό, και 1/12 είχαν καμία ανασυνδυασμού (Σχήμα 4Α και τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Λαμβάνοντας υπόψη το γεγονός ότι το διαγονίδιο Cre δεν αποτελεσματικά εκφράζεται σε 10-20% των β-κυττάρων, και σημειώνοντας ότι ο λόγος των όγκων με ανασυνδυασμένους έναντι μη ανασυνδυάζονται

Bcl-x

αλληλόμορφα ήταν επίσης -10 %, καταλήγουμε στο συμπέρασμα ότι δεν υπάρχει επιλεκτικό πλεονέκτημα ανάπτυξης των

Bcl-x

+ /+

κύτταρα που εκδηλώθηκε στην κλωνική απόφυση των β-κυττάρων που φιλοξενούν μη ανασυνδυάζονται αλληλόμορφα, σε αντίθεση με την κατάσταση με άλλα γονίδια που έχουν κρίσιμους ρόλους στην RIP1-TaG2 ογκογένεση (π.χ. VEGF [26]). Αξίζει να σημειωθεί ότι, μερικά από τα μεγαλύτερα καρκινώματα εμφάνισαν πλήρη ανασυνδυασμού, υποστηρίζοντας και πάλι την άποψη ότι η απώλεια της λειτουργίας του Bcl-x δεν αλλοιώνοντας την ανάπτυξη του όγκου. Ως άλλο μέτρο της αποδοτικότητας ανασυνδυασμού, αξιολογήσαμε

Bcl-x

έκφραση με ποσοτική RT-PCR (Taqman) κατά την πρώτη έλικα cDNA που προέρχεται από 10 ανεξάρτητους

RIP1-TaG2

?

RIP-Cre

?

Bcl-x

fl /fl

όγκους και 10

RIP1-TaG2

?

Bcl-x

fl /fl

ελέγχους (Σχήματα 4Β και S1). Υπήρξε μια σημαντική μείωση στο

Bcl-x

έκφραση στο 9/10 του

RIP1-TaG2

?

RIP-Cre

?

Bcl-x

fl /fl

όγκους σε σύγκριση με το

RIP1-TaG2

?

Bcl-x

fl /fl

ελέγχων, υποδεικνύοντας ότι

Bcl-x

διαγράφηκε στην πλειονότητα των β-κυττάρων σε αυτούς τους όγκους. Ωστόσο, ένας όγκος εκφράζεται επίπεδα άγριου τύπου

Bcl-x

, υποδηλώνοντας ότι προέκυψε από ένα β-κυττάρων που δεν εκφράζουν Cre, και έτσι στέγαζε ένα μη-ανασυνδυάζονται αλληλόμορφο. Η πρόβλεψη αυτή επιβεβαιώθηκε από την εξέταση όλων των 10 του

RIP1-TaG2

?

RIP-Cre

?

Bcl-x

fl /fl

όγκους για έκφραση Cre, και όπως αναμενόταν αυτή η εξαιρετική του όγκου δεν εκφράζουν Cre, σε αντίθεση με τα 9 όγκους που παρουσίασαν πολύ μειωμένη

Bcl-x

έκφρασης (Σχήμα 4C). Εξαιρουμένου του Cre-αρνητικό, Bcl-x-θετική «Escaper» όγκου από την ανάλυση, η μέση

Bcl-x

έκφραση σε όγκους «ΚΟ» ήταν 9,5-φορές χαμηλότερη από εκείνη των ελέγχων. Έτσι, η διαγραφή της

Bcl-x

στο διαμέρισμα β-κυττάρων των όγκων αυτών είχε ως αποτέλεσμα μια μείωση -90% των

Bcl-x

έκφραση, επιβεβαιώνοντας έτσι ότι η επικράτηση του

bcl-x

έκφραση σε όγκους RIP1-TaG2 είναι β-κυττάρων προέλευσης και ότι Cre ήταν αποτελεσματικά διαγραφή

bcl-x

χωρίς προφανή φαινοτυπική συνέπεια. Το υπολειμματικό

Bcl-x

έκφραση πιθανόν προέρχεται από το συστατικό στρωματικά των αλλοιώσεων (κυρίως αγγειακές και το ανοσοποιητικό τους τύπους κυττάρων), αν και δεν μπορούμε να αποκλείσουμε τυπικά την πιθανότητα ότι αυτοί οι όγκοι είναι ολιγο-κλωνικά, και ότι ορισμένες από το απομένον

Bcl-x

mRNA προέρχεται από σχετικά σπάνια β-κύτταρα που φιλοξενούν μη ανασυνδυάζονται

Bcl-x

αλληλόμορφα. Για να καθοριστεί αν η σημαντική μείωση του

Bcl-x

mRNA που παρατηρείται σε bcl-x όγκων «KO» οδήγησε σε ανάλογη μείωση των επιπέδων Bcl-x πρωτεΐνη, θα πραγματοποιηθεί ανάλυση Western Blot για λύματα από 5 ανεξάρτητες

RIP1-TaG2? RIP-Cre

?

Bcl-x

fl /fl

όγκους. Σε συμφωνία με την PCR με βάση την ανάλυση του ανασυνδυασμού και την ποσοτική ανάλυση RT-PCR του

Bcl-x

επίπεδα mRNA, τα επίπεδα της πρωτεΐνης Bcl-x ήταν σημαντικά μειωμένες σε σύγκριση με το αγρίου τύπου (wt) όγκους (Σχήμα 4D) , υποδεικνύοντας Cre μεσολάβηση διαγραφή του

Bcl-x

θέση στη συντριπτική πλειονότητα των β-κυττάρων του

RIP1-TaG2? RIP-Cre

?

Bcl-x

fl /fl

όγκους. Επιπλέον, αυτό το αποτέλεσμα επιβεβαιώνει ότι οι ανοσοαντιδραστικές ζώνες ανιχνεύθηκαν σε φυσιολογικά νησίδια και RIP1-TaG2 βλάβες (Σχήμα 1) ήταν στην πραγματικότητα προέρχονται από

Bcl-x

. Μαζί, τα δεδομένα υποστηρίζουν το συμπέρασμα ότι Bcl-x δεν έχει κεντρικό ρόλο στη ρύθμιση της απόπτωσης όγκου σε αυτή την οδό, και ότι η λειτουργία του είναι είτε μη ουσιώδη, περιττή, ή /και εύκολα αντισταθμίζεται από άλλα γονίδια, όπως άλλα αντι-αποπτωτικά μέλη της οικογένειας Bcl-2

(Α) αποτελεσματική ανασυνδυασμού του

Bcl-x

στο

RIP1-TaG2

.?

RIP-Cre

?

Bcl-x

fl /fl

όγκους. Γονιδιωματικό DNA απομονώθηκε από μεμονωμένες όγκους από

RIP1-TaG2

?

RIP-Cre

?

Bcl-x

fl /fl

και

RIP1-TaG2

?

Bcl-x

fl /f

l

ποντίκια. PCR διεξήχθη με τη χρήση ενός εκκινητή που δεσμεύεται ανάντη των 5 ‘θέση ΙοχΡ και ένα άλλο εκκινητή που δεσμεύεται 3’ προς την κατάντη θέση ΙοχΡ. Το PCR θραύσμα του μη ανασυνδυασθεί αλληλόμορφο και το ανασυνδυασθεί αλληλόμορφο είναι 2.9 kb και 150 bp, αντίστοιχα. (Β)

Bcl-x

έκφραση μειώνεται σημαντικά σε

BclX

-KO όγκους. Ποσοτική RT-PCR (Taqman) διεξήχθη στις 1

cDNA st σκέλος συντίθεται από RNA που απομονώθηκε από μεμονωμένους όγκους από

RIP1-TaG2

?

RIP-Cre

?

Bcl-x

fl /fl

και

RIP1-TaG2

?

Bcl-x

fl /fl

. Μια εκτείνονται καθετήρα που ανιχνεύονται όλες τις σημαντικές παραλλαγές ματίσματος αντι-αποπτωτική χρησιμοποιήθηκε. Η γονιδιακή έκφραση κανονικοποιήθηκε προς και παρίσταται ως συνάρτηση της έκφρασης GAPDH. (Δ) Η διαγονιδίου RIP-Cre δεν εκφράζεται στο

RIP1-TaG2

?

RIP-Cre

?

Bcl-x

fl /fl

όγκους που διατηρούν

Bcl-x

έκφρασης. έκφραση Cre mRNA παρακολουθήθηκε με RT-PCR σε 1

cDNA κλώνο st συντέθηκε από RNA που απομονώνεται από άτομο όγκους από

RIP1-TaG2

?

RIP-Cre

?

Bcl-x

fl /fl

και

RIP1-TaG2

?

Bcl-x

fl /fl

ποντίκια. Μετά 27 κύκλους PCR, το cDNA κλασματοποιήθηκε σε πηκτώματα αγαρόζης και οπτικοποιήθηκαν με χρώση βρωμιούχου αιθιδίου. Το προϊόν PCR είναι 520 bp. * Μη ανασυνδυάζονται, Cre-αρνητικών όγκων. (δ) Τα επίπεδα της πρωτεΐνης Bcl-x μείωσε σημαντικά σε

Bcl-x

-KO όγκων, όπως αποκαλύπτεται από κηλίδωση Western όπως στο σχήμα 1. β-ακτίνη χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης.

Έκφραση προφίλ άλλων Bcl-2 μελών της οικογένειας στο νησάκι ογκογένεση

στη συνέχεια, προσπάθησαν να προσδιορίσουν κατά πόσον οι 5 άλλες γνωστές αντι-αποπτωτικά μέλη της οικογένειας Bcl-2 μπορεί να εκφράζονται κατά τη διάρκεια RIP1-TaG2 ογκογένεση , έτσι δυνητικά αντισταθμίζοντας την απουσία Bcl-x. Εμείς ποσοτικά

Bcl-2

,

Bcl-w

,

Α1

,

Mcl-1

και

Boo

επίπεδα mRNA χρησιμοποιώντας ποσοτική ανάλυση RT-PCR (Taqman) επί 1

st κλώνο cDNA από φυσιολογικά νησίδια (που απομονώθηκε από μη διαγονιδιακά ποντίκια), υπερπλαστική νησίδες, αγγειογενετική νησίδες, και οι όγκοι από ποντικούς RIP1-TaG2. Όπως φαίνεται στα Σχήματα 5 και S2, τέσσερα από τα γονίδια εκφράστηκαν? η πέμπτη,

Boo

, δεν ανιχνεύθηκε σε μερικές από δειγμάτων και ήταν εξαιρετικά μεταβλητή σε επαναληπτικές δοκιμασίες, σύμφωνα με την έκφραση του περιορίζεται στην αρσενικά και θηλυκά αναπαραγωγικά όργανα [27] σε μεγάλο βαθμό. Μεταξύ των τεσσάρων εκφρασμένα μέλη, μόνο

Bcl-w

εκφράστηκε σε επίπεδα συγκρίσιμα με

Bcl-x

. Τα επίπεδα έκφρασης παρουσιάζονται σε σχέση με το γονίδιο ελέγχου, GAPDH, που επέδειξε το λιγότερο ποικιλότητας της έκφρασης σε σύγκριση με L19 και Gus μεταξύ φυσιολογικά νησίδια και τα διάφορα νησιδίων αλλοιώσεις νεοπλασματικών (Σχήμα S3). Για να προσδιοριστεί εάν ένα ή περισσότερα από τα αντι-αποπτωτικά μέλη της οικογένειας Bcl-2 ήταν γονιδιακή τα πάνω ρυθμισμένη εν απουσία Bcl-x και επομένως δυνητικά λειτουργικά παράγωγα για την «νοκ-άουτ»

Bcl-x

, εκτελέσαμε ποσοτική ανάλυση RT-PCR για το ίδιο 10 ανεξάρτητα

RIP1-TaG2

?

RIP-Cre

?

Bcl-x

fl /fl

και 10

RIP1-TaG2

?

Bcl-x

fl /fl

όγκους στο οποίο

Bcl-x

έκφραση ποσοτικοποιήθηκε (στην Εικόνα 4Β). αποδείχθηκε ότι είναι καμία σημαντική διαφορά στα επίπεδα έκφρασης του mRNA από αυτά τα 5 γονίδια (σχήματα 6 και S4) εκεί. Επιπλέον, Taqman ανάλυση των ίδιων cDNAs όγκου για αυξητική ρύθμιση των μελών της κατηγορίας ΙΑΡ των αντι-αποπτωτικών πρωτεϊνών (CIAP1, CIAP2, Survivin, ΧΙΑΡ, και BRUCE) ομοίως απέτυχε να αποκαλύψει καμία σημαντική μεταγραφική αυξητική ρύθμιση αυτών των γονιδίων σε η

Bcl-x

-KO όγκων (δεν παρουσιάζονται τα δεδομένα).

Τα επίπεδα mRNA του προ-επιβίωσης μέλη οικογένειας Bcl-2

Bcl-x

, em

Bcl-2

,

Bcl-w

,

Α1

,

Mcl-1

και

Boo

αξιολογήθηκαν με τη χρήση ποσοτικής RT-PCR (Taqman) για πρώτου κλώνου cDNA συντίθεται από συνολικό πισίνες RNA (4-6 ζώα ανά ομάδα) της κανονικής, μη διαγονιδιακά νησίδες, και της υπερπλασίας νησίδων, αγγειογενετική νησίδες, και όγκους από τα ποντίκια RIP1-TaG2. Η γονιδιακή έκφραση κανονικοποιήθηκε προς και απεικονίζονται ως ποσοστό της έκφρασης GAPDH.

Η

Τα επίπεδα mRNA του

Bcl-x

,

Bcl-2

,

Bcl-w

,

Α1

,

Mcl-1

και

Boo

αξιολογήθηκαν χρησιμοποιώντας ποσοτική RT-PCR (Taqman) κατά την πρώτη έλικα cDNA συνετέθη από το συνολικό RNA απομονωθεί από μεμονωμένους όγκους από

RIP1-TaG2

?

RIP-Cre

?

Bcl x-

fl /fl

(n = 9 όγκους από 5 ποντίκια? 1 όγκου διαπιστώθηκε ότι δεν εκφράζουν Cre και εμφανίζουν επίπεδα άγριου τύπου του

Bcl-x

εξαιρούνται από αυτές τις δεδομένων) και

RIP1-TaG2

?

Bcl-x

fl /fl

ποντικών (η = 10 όγκους από 5 επιμέρους ποντίκια). Σχετική έκφραση γονιδίου κανονικοποιήθηκε προς και παρουσιάζονται ως ποσοστό της έκφρασης GAPDH. Δεδομένα αντιπροσωπεύουν μέση τιμή ± SEM. Η στατιστική σημαντικότητα προσδιορίζεται με μη-παραμετρική T-test (Mann-Whitney). P & lt? 0,05 θεωρείται σημαντική

Η

Ο ρόλος της Bcl-x στην διαμόρφωση εισβολή στο RIP1-TaG2 tumorignesis

Εκτός από τη ρύθμιση της απόπτωσης σε καρκινικά κύτταρα, υπήρξαν αναφορές ότι Bcl-. 2 μέλη της οικογένειας μπορούν επιπροσθέτως να προωθήσει την καρκινογένεση μέσω αποτελέσματα επί των κυττάρων του όγκου εισβολή [28] – [31]. Σε μια αναφορά, ένα διαχωρισμό μεταξύ της ικανότητας του Bcl-x

L για να διαμορφώνει απόπτωση και διηθητικότητα των ανθρώπινων κυττάρων γλοιώματος παρατηρήθηκε [29]. Πιο πρόσφατα, τα πάνω ρύθμιση του Bcl-x

L δια σωματικής μεταφοράς γονιδίου κατά την διάρκεια RIP1-TaG2 ογκογένεση έχει αναφερθεί ότι αυξάνει τη διεισδυτικότητα, χωρίς να μειώνουν απόπτωση [32]. Παρακινημένος από αυτά τα αποτελέσματα, και από την προφανή έλλειψη επίδραση της απώλειας των Bcl-x στη συνολική RIP1-TaG2 απόπτωση των καρκινικών κυττάρων και το φορτίο του όγκου, ένα δυναμικό ρόλο για την Bcl-x στην εισβολή του όγκου εκτιμήθηκε. Όγκοι από

RIP1-TaG2

?

Bcl-x

fl /fl

και

RIP1-TaG2

?

RIP-Cre

?

Bcl-x

fl /fl

ποντίκια βαθμολογήθηκαν ως μη επεμβατική, έγκλειστα όγκους (IT) ή διηθητικά καρκινώματα (IC1-μικροεπεμβατική? IC2-πολύ επεμβατική) σύμφωνα με τα κριτήρια του Lopez και Hanahan [ ,,,0],16]. Είναι ενδιαφέρον, υπήρχε ένα σημαντικά υψηλότερο ποσοστό των έγκλειστα, μη επεμβατική όγκων σε

RIP1-TaG2

?

RIP-Cre

?

Bcl-x

fl /fl

ποντίκια σε σύγκριση με το

RIP1-TaG2

?

Bcl-x

fl /fl

ποντίκια (22,8% έναντι 4,3%? P & lt? 0,02) (Σχήματα 7 και S5)

Οι όγκοι στην H & amp?. Ε-τομές από 13 εβδ

RIP1-TaG2

?

Bcl-x

fl /fl

(n = 46 όγκους από 5 ποντίκια) και

RIP1-TaG2

?

RIP-Cre

?

Bcl-x

fl /fl

ποντίκια (n = 35 όγκους από 5 ποντίκια) βαθμολογήθηκαν είτε ως μη επεμβατική νησάκι όγκους /αδενώματα (IT) ή διηθητικά καρκινώματα (είτε IC1 ή IC2) και η αναλογία όγκων σε κάθε τάξη υπολογίστηκε. Κατανομή των τύπων όγκων συγκρίθηκε μεταξύ των δύο ομάδων χρησιμοποιώντας το ακριβές τεστ του Fisher. p = 0,017.

Η

Για να τεκμηριώνουν την επίδραση της απώλειας των Bcl-x για εισβολή καρκινικών κυττάρων με άγριου τύπου ή διαγράφεται

Bcl-x

(βTC-Bcl-x- κβ ή βΤΟ-Bcl-x-knockout [ΚΟ]) δημιουργήθηκαν με απορρέουν κυτταρικές σειρές β-όγκου ( «βΤΟ») από όγκους του

RIP1-TaG2

?

Bcl-x

fl /fl

ποντίκια, και μόλυνση των κυττάρων με αδενοϊούς που κάνουν ή δεν εκφράζουν Cre (Ad-Cre-GFP ή Ad-GFP). Δύο εβδομάδες μετά την μόλυνση με Ad-Cre-GFP, τα επίπεδα της πρωτεΐνης Bcl-x εντός του πληθυσμού κυττάρων μειώθηκαν κατά περίπου 75-80% (Σχήμα 8Α), πιθανόν αντανακλώντας ανασυνδυασμό του

Bcl-x

γονίδιο στην πλειονότητα των κυττάρων? κύτταρα στερούνται ορού +/- Cre σπάρθηκαν στα ανώτερα τμήματα του πορώδους ένθετα μεταξύ φρεατίων είτε μη επιχρισμένα ή επικαλυμμένα με Matrigel για να εκτιμηθεί η επίδραση της απώλειας του

Bcl-x

έκφραση για τη μετανάστευση και την εισβολή, αντίστοιχα. Να λαμβάνονται υπόψη οποιεσδήποτε πιθανές διαφορές στην ανάπτυξη των κυττάρων μεταξύ βΤΟ-Bcl-x-wt ή βΤΟ-Bcl-x-KO κύτταρα κατά τη χρονική πορεία των δοκιμασιών μετανάστευσης /εισβολής, ίσοι αριθμοί κυττάρων καλλιεργήθηκαν εις τριπλούν, και το συνολικό αριθμό των κυττάρων προσδιορίζεται μετά από μία επώαση 48 ωρών. Κατά τη διάρκεια αυτής της χρονικής περιόδου, δεν υπήρχε εμφανής διαφορά στην κυτταρική ανάπτυξη μεταξύ άγριου τύπου και των κυττάρων Bcl-x-ΚΟ (Σχήμα 8Β). Αυτό ήταν σύμφωνο με την έλλειψη επίδρασης του απώλεια της λειτουργίας του Bcl-x στην ανάπτυξη του όγκου και απόπτωση in vivo. Επιπλέον, δεν υπήρχε σημαντική διαφορά στον αριθμό των μεταναστεύουν ή εισβάλλοντα κύτταρα κατά μήκος μιας κλίσης ορού (Εικόνα 8C, D). Ωστόσο, τα κύτταρα βΤΟ ήταν ελάχιστα επεμβατική σε αυτές τις ex vivo δοκιμασίες, όπως αναφέρθηκε προηγουμένως [32], σε αντίθεση με την κοινή εμφάνιση του διηθητικού καρκίνου κυττάρων κατά τη διάρκεια της προόδου του όγκου. Αναρωτηθήκαμε, ως εκ τούτου, αν οι τυπικές συνθήκες καλλιέργειας κυττάρων μπορεί να μην υπόδειγμα σωστά το μικροπεριβάλλον εισβολή επαγωγής in vivo. Αξίζει να σημειωθεί ότι, διάφορες εκθέσεις, συμπεριλαμβανομένων προηγούμενες μελέτες στο μοντέλο RIP1-TaG2, έχουν καταδείξει ένα ρόλο για υποξίας στην τόνωση της εισβολής του όγκου [33] – [36]. Ως εκ τούτου, επαναλαμβανόμενες τους προσδιορισμούς μετανάστευσης /εισβολής σε συνθήκες που μιμούνται υποξία, με την ενσωμάτωση χλωριούχο κοβάλτιο (COCI

2), η οποία έχει δειχθεί ότι επάγει βιοχημικές αποκρίσεις παρόμοιες με εκείνες που παρατηρήθηκαν υπό συνθήκες χαμηλού οξυγόνου [37], [38]. Σε αυτή την κατάσταση, η συνολική επιβίωση των κυττάρων μειώθηκε (Σχήμα 8Β) αν και τα κύτταρα άγριου τύπου αποδεικνύεται μια 2-πλάσια αύξηση στον αριθμό των μεταναστευτικών κυττάρων (p = 0.006), και ένα 1,5-πλάσια αύξηση στην εισβάλλοντα κύτταρα (p = 0.07 ) (Σχήμα 8C, D) σε σχέση με το συνολικό αριθμό των κυττάρων που επιβιώνουν. Μια παρόμοια αύξηση στη μετανάστευση παρατηρήθηκε σε απάντηση CoCl

2 κατεργασία των κυττάρων βΤΟ-Bcl-x-ΚΟ (ρ = 0,02) (Σχήμα 8C)? Σε αντίθεση, τα κύτταρα αυτά δεν παρουσιάζουν αυξημένη εισβολή υπό αυτές τις ψευδο-υποξικές συνθήκες, και σε σύγκριση με τα κύτταρα φυσικού τύπου παρουσίασαν μέτρια ακόμη σημαντική μείωση (45%? p = 0,005) στον σχετικό αριθμό της εισβολής κυττάρων (Σχήμα 8D) . Αυτά τα δεδομένα, σύμφωνα με την in vivo ανάλυση, δείχνουν ότι ενώ η έκφραση του πολλαπλών μελών της οικογένειας Bcl-2 μπορούν να καταστήσουν Bcl-x λειτουργικά περιττές όσον αφορά τις επιπτώσεις επί των κυττάρων του όγκου απόπτωση, Bcl-x μπορεί να παρουσιάζουν μη περιττών και διακριτές λειτουργίες σε σχέση για εισβολή όγκου.

βTC-

Bcl-x

fl /fl

καρκινικά κύτταρα μολύνθηκαν με αδενοϊό που εκφράζει Cre ή ελέγχουν GFP και καλλιεργήθηκαν εις τριπλούν με την παρουσία ή απουσία χλωριούχου κοβαλτίου να εκτιμηθεί η επίδραση της μειωμένης έκφρασης Bcl-x για τη μετανάστευση των κυττάρων και εισβολή. (Α) Western blot των επιπέδων Bcl-x και πρωτεΐνη ακτίνη σε βTC-

Bcl-x

fl /fl κύτταρα επεξεργασμένα +/- Cre την στιγμή δοκιμασίες μετανάστευσης /εισβολής. (Β) Η ανάπτυξη των κυττάρων. 2 × 10

5 βTC-

Bcl-x

fl /fl

κύτταρα +/- CRE απλώθηκαν σε παρουσία ή απουσία CoCl

2 και τα κύτταρα μετρήθηκαν μετά από 48 ώρες. (Γ και Δ) μετανάστευση των κυττάρων και εισβολή δοκιμασίες. Τα κύτταρα τοποθετούνται σε ένθετα ελέγχου trans-φρεατίων (C) ή επικαλυμμένα με Matrigel ένθετα (D). Για τη δοκιμασία της μετανάστευσης, τα αποτελέσματα αποτυπώνονται ως ο μέσος αριθμός των κυττάρων που μεταναστεύουν /10 × πεδίου (8 πεδία /μεμβράνης μετρήθηκαν), ενώ για την εισβολή προσδιορισμούς το συνολικό αριθμό των εισβάλλοντα κύτταρα /μεμβράνης χαράσσονται. CoCl

2 θεραπεία οδήγησε σε σημαντική μείωση στην εισβολή των κυττάρων βΤΟ-Bcl-x-ΚΟ σε σύγκριση με κύτταρα άγριου τύπου (Ρ = 0,005). Τα αποτελέσματα που παρουσιάζονται αντιπροσωπεύουν το μέσο ± SEM από τα αποτελέσματα από τρία ανεξάρτητα πειράματα που πραγματοποιήθηκαν εις τριπλούν και διορθώνονται για μεταβολές του συνολικού αριθμού των κυττάρων (από Β) σε σύγκριση με κύτταρα ελέγχου (-Cre,-COCl

2).

Συζήτηση

σε αυτή τη μελέτη, επιδιώξαμε να καθοριστεί αν η γενετική διαγραφή ένας εξέχων αντι-αποπτωτικό μέλος της οικογένειας Bcl-2, Bcl-x, θα επηρεάσει την ογκογένεση.