Αφηρημένο

Ο υποδοχέας ανδρογόνων (AR) είναι ο κύριος θεραπευτικός στόχος για τον καρκίνο του προστάτη. Για τα τελευταία 70 χρόνια, η θεραπεία στέρησης ανδρογόνων (ADT) υπήρξε η κύρια θεραπευτική εστίαση. Ωστόσο, ορισμένοι ασθενείς δεν επωφελούνται, και εκείνοι οι όγκοι που κάνουν αρχικά ανταποκρίνονται σε ADT τελικά πρόοδο. Ένα περιέγραψε πρόσφατα ο μηχανισμός των επιδράσεων αυτών είναι η ανάπτυξη και τα αποτελέσματα που προάγουν την επιβίωση της AR που ασκούνται ανεξάρτητα από το AR συνδέτες, τεστοστερόνη και διυδροτεστοστερόνη. Ωστόσο, ειδικός συνδετήρας-ανεξάρτητο γονιδίων στόχων AR που αντιπροσωπεύουν αυτό το αποτέλεσμα δεν ήταν καλά χαρακτηριστεί. Δείχνουμε εδώ ότι

c-myc,

η οποία είναι κύριος μεσολαβητής της ανάπτυξης καρκίνου του προστάτη ανεξάρτητη από συνδέτη, είναι ένα βασικό γονίδιο στόχος AR προσδέματος-ανεξάρτητη. Χρησιμοποιώντας την ανάλυση μικροσυστοιχίας, βρήκαμε ότι

c-Myc

και τα επίπεδα έκφρασης AR συσχετίζεται έντονα με το άλλο σε όγκους από ασθενείς με ευνουχισμό ανθεκτικά καρκίνου του προστάτη (CRPC) προχωρούν παρά ADT. Επιβεβαιώσαμε ότι AR ρυθμίζει άμεσα

c-Myc

μεταγραφή σε ένα συνδετήρα-ανεξάρτητο τρόπο, που

AR

και

c-Myc

καταστολή μειώνει συνδέτη-ανεξάρτητη ανάπτυξη του προστάτη των καρκινικών κυττάρων , και ότι η έκτοπη έκφραση του c-myc εξασθενεί τα αποτελέσματα αντι-αυξητικού καταστολής AR. Σημαντικά, η θεραπεία με το JQ1 αναστολέα bromodomain κατέστειλε λειτουργία c-Myc και κατέστειλε ανεξάρτητη συνδεσμικού επιβίωση καρκίνου του προστάτη κυττάρου. . Τα αποτελέσματά μας ορίσετε μία νέα σχέση μεταξύ των δύο κρίσιμες πρωτεΐνες στον καρκίνο του προστάτη – AR και c-Myc – και καταδεικνύουν τις δυνατότητες των AR και c-Myc-σκηνοθεσία θεραπείες για τη βελτίωση του ελέγχου του καρκίνου του προστάτη

Παράθεση: Gao L, Schwartzman J, Gibbs Α, Lisac R, Kleinschmidt R, Wilmot Β, et al. (2013) ανδρογόνων υποδοχέων Προωθεί ρίζας-Ανεξάρτητη Καρκίνος του προστάτη Πρόοδος μέσω c-Myc Η αναβάθμιση. PLoS ONE 8 (5): e63563. doi: 10.1371 /journal.pone.0063563

Επιμέλεια: Νατάσα Κυπριανού, Πανεπιστήμιο του Κεντάκι College of Medicine, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 30 Οκτωβρίου 2012? Αποδεκτές: 2 του Απρίλη 2013? Δημοσιεύθηκε: May 21, 2013

Copyright: © 2013 Gao et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Η παρούσα δημοσίευση έγινε δυνατή με την υποστήριξη του Όρεγκον Κλινική και Μεταγραφική Research Institute, χορηγεί αριθμό KL2 RR024141 από το Εθνικό Κέντρο Έρευνας Πόρων και του Εθνικού Κέντρου για την Προώθηση της Μεταγραφική Επιστημών του Εθνικού Ινστιτούτου Υγείας (JA). Το έργο αυτό υποστηρίζεται επίσης από το Pacific Northwest Καρκίνος του προστάτη SPORE /Εθνικό Ίδρυμα Καρκίνου (P50CA097186) (JA, PN, IC), το Υπουργείο Άμυνας (PC093509) (PSN), ένα Flight Attendant Ιατρικού Ερευνητικού Ινστιτούτου Νέων Κλινική βραβείο Επιστήμονας (JA ), ένα Wayne Δ Κούνι & amp? Joan Ε Κούνι Βραβείο Ιδρύματος Κούνι Μελετητής (JA), και ένα Βραβείο Νέου Ερευνητή του καρκίνου του προστάτη Ίδρυμα (JA). Με ιδιαίτερες ευχαριστίες προς Platt Electric, Bruce Burns και ο Μπερνς Ταμείο Οικογένεια του Ιδρύματος Όρεγκον Κοινότητα για τη φιλανθρωπική τους δράση αυτής της εργασίας. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

ο καρκίνος του προστάτη είναι η πιο κοινή μορφή καρκίνου στους άνδρες στις Ηνωμένες Πολιτείες με 241.740 νέες περιπτώσεις προβλέψει αυτή τη χρονιά [1]. Παρά έλεγχο και την έγκαιρη θεραπεία, ο καρκίνος του προστάτη συνήθως επαναλαμβάνεται, είναι και 28.170 άνδρες αναμένεται να πεθάνουν από καρκίνο του προστάτη το τρέχον έτος [1]. Σχεδόν όλες αυτές οι θάνατοι από καρκίνο του προστάτη οφείλονται σε μεταστατική, ο ευνουχισμός ανθεκτικό καρκίνο του προστάτη (CRPC) που έχει προχωρήσει παρά την θεραπεία αποστέρησης ανδρογόνων (ADT) -. Η πιο συνηθισμένη θεραπεία για ασθενείς με υποτροπιάζοντα ή προχωρημένο καρκίνο του προστάτη

ADT δρα με τη μείωση των επιπέδων του ισχυρού AR προσδέματα τεστοστερόνη και διυδροτεστοστερόνη (DHT) ή να παρεμβαίνει με σύνδεση συνδετήρων ανδρογόνων με τον υποδοχέα ανδρογόνων πρωτεΐνη (AR), τον κύριο θεραπευτικό στόχο στον καρκίνο του προστάτη [2]. Παρά ADT, συμπεριλαμβανομένων νέων και περισσότερο ισχυρές θεραπείες, όλοι οι καρκίνοι του προστάτη τελικά Progress [3], [4]. Σε εξέλιξη, το AR εκφράζεται παντού [5], [6].

Υπάρχουν αρκετές πιθανές εξηγήσεις για AR-εξαρτώμενοι μηχανισμοί της εξέλιξης, παρά την καταστολή ή παρεμβολή με συνδέτες ανδρογόνων. Αυτές περιλαμβάνουν ενδοογκική σύνθεση ανδρογόνων, η παραγωγή συστατικώς δραστικές παραλλαγές AR μεταγραφής, ενίσχυση γονιδίου AR, ενεργοποιώντας μεταλλάξεις AR, ή η ενεργοποίηση του AR από αυξητικούς παράγοντες [7] – [16]. Είναι επίσης σαφές ότι η πρωτεΐνη AR μπορεί να προωθήσει την ενεργοποίηση του AR προσδέματος-ανεξάρτητες οδούς διακρίνεται από κανονικών μονοπατιών συνδέτη ενεργοποιούνται AR στην CRPC [17]. Ωστόσο, κρίσιμο γονίδια προς τα κάτω στόχος AR αυτού του τύπου, που αντιπροσωπεύουν εξαρτώνται AR, συνδέτη ανεξάρτητη επιβίωση των κυττάρων του καρκίνου του προστάτη δεν έχουν πλήρως διευκρινιστεί. Η μελέτη αυτών των γονιδίων στόχων AR και μηχανισμούς με τους οποίους AR ρυθμίζει την έκφραση τους, θα βελτιώσει την κατανόηση των ευνουχισμού-αντίστασης και να οδηγήσει στην αναγνώριση των βασικών AR που εξαρτώνται από πρωτεΐνες των οποίων η δραστηριότητα μπορεί να ελέγχει την ανάπτυξη και την επιβίωση των CRPC κυττάρων. Τέτοιοι στόχοι και πορείες θα γίνει φυσικά υψηλές προτεραιότητες για την ανάπτυξη φαρμάκων.

Για να κατανοήσουμε τα γονίδια που θα μπορούσαν να ευθύνονται για το σκοπό αυτό, επικεντρωθήκαμε στο

c-Myc

. Αυτό συμβαίνει επειδή: 1)

c-Myc

υπερέκφραση προωθεί την ανάπτυξη του καρκίνου του προστάτη [18]? 2)

c-Myc

απορυθμίζεται σε ανδρογόνο εξαρτώμενη από συνδετήρα καρκίνο του προστάτη και περαιτέρω ρυθμίζεται αυξητικά σε CRPC [19], [20]? και 3) πριν από εκθέσεις έχουν δείξει ότι το c-myc, όπως AR, συμβάλλει στην ανάπτυξη καρκίνου του προστάτη κυττάρων ανεξάρτητη συνδεσμικού [21]. ανασκόπηση μας της προηγούμενης δεδομένα που εντοπίζεται AR θέσεις πρόσδεσης σε όλο το γονιδίωμα από χρωματίνη ανοσοκαταβύθιση (μάρκας) έδειξε ότι η AR εντοπίζεται σε ένα στοιχείο ενισχυτή του

c-Myc

γονίδιο [17]. Ωστόσο, δεν ήταν σαφές εάν

c-Myc

ήταν μια άμεση γονίδιο στόχο AR και αν συνδέτες ανδρογόνων ήταν αναγκαία για τη ρύθμιση AR του

c-Myc

έκφρασης.

Εμείς καθορίζεται ότι

c-Myc

αυξητική ρύθμιση στο ανθρώπινο CRPC όγκους συσχετίζεται με το

AR

ρύθμιση προς τα πάνω, και επιβεβαίωσε ότι

c-Myc

είναι άμεση γονίδιο στόχο AR χρησιμοποιώντας χρωματίνης ανοσοκατακρήμνισης (ChIP ) δοκιμασίες.

c-Myc

καταστολή επιτυγχάνει τις ίδιες συνολικές επιπτώσεις όπως

AR

καταστολή, και

c-Myc

υπερέκφραση εξασθενεί τα αποτελέσματα αντι-ανάπτυξης των

AR

κατάπνιξη. Ενώ AR προωθεί

c-Myc

έκφραση, η θεραπεία με συνδέτες ανδρογόνων δεν αυξάνουν

c-Myc

έκφρασης. Έτσι, AR προωθεί την έκφραση του

c-Myc

σε ένα συνδετήρα-ανεξάρτητο τρόπο, και

c-Myc

είναι ένα βασικό γονίδιο στόχο AR.

Τέλος, αντιμετωπίζεται κυττάρων καρκίνου του προστάτη με τον αναστολέα JQ1 ΒΕΤ bromodomain που καταστέλλει την έκφραση του c-Myc [22], [23]. Η θεραπεία με JQ1 επιτύχει το ίδιο συνολικό αποτέλεσμα ως

c-Myc

RNAi και μειωμένη προστάτη επιβίωση των καρκινικών κυττάρων σε ανδρογόνο συνθήκες συνδέτη-εξαντλημένο.

Οι μελέτες μας διευκρινιστεί ότι

c-Myc

είναι ένα βασικό ανδρογόνο γονίδιο στόχος AR προσδέματος-ανεξάρτητος, που συμβάλλει στην ανδρογόνο ανεξάρτητη συνδεσμικού αλλά AR-εξαρτώμενη κυτταρική επιβίωση καρκίνου του προστάτη. Τα αποτελέσματά μας δείχνουν, επίσης, τη δυνατότητα του AR-σκηνοθεσία θεραπείες ή c-Myc-σκηνοθεσία θεραπείες για τον καρκίνο του προστάτη, όπως προσθήκες στη ADT.

Αποτελέσματα

AR και

c-Myc

οι να συμπίπτει Εκφράζεται σε Μεταστατικό CRPC

τόσο AR και c-Myc είναι κρίσιμες οδούς επιβίωσης στον καρκίνο του προστάτη, και τα επίπεδα έκφρασης των δύο

AR

και

c-Myc

είναι συνήθως αυξημένη σε ανθρώπινους όγκους CRPC προχωρούν παρά ADT [24], [25]. Ωστόσο, ήταν άγνωστο αν η υπερέκφραση του

AR

και

c-Myc

συνδέθηκε με το άλλο στο ανθρώπινο CRPC όγκους. Επομένως, προσδιορίσαμε τα επίπεδα έκφρασης του

AR

και

c-Myc

χρησιμοποιώντας μικροσυστοιχίες γονιδιακής έκφρασης σε 140 ανθρώπινα CRPC όγκων έναντι 15 φυσιολογικά δείγματα προστάτη. Στη συνέχεια, εξετάσαμε τη συσχέτιση του

AR

ρύθμιση προς τα πάνω και

c-Myc

ρύθμιση προς τα πάνω στο ανθρώπινο CRPC όγκους.

AR

επίπεδα mRNA σε CRPC δείγματα συνδέονται στενά με τα επίπεδα του

c-Myc

mRNA (Pearson συσχέτιση = 0.3698, 95% Διάστημα Εμπιστοσύνης: 0,2172 – 0,5048, δίπλευρη τιμή p & lt? 0,0001 ) (Σχήμα 1Α). Υπολογίσαμε επίσης το ποσοστό πιθανότητας για

c-Myc

και

AR

ρύθμιση προς τα πάνω σε αυτά τα CRPC δείγματα. Υπήρξε μια στατιστικά σημαντική συσχέτιση με το

AR

ρύθμιση προς τα πάνω και

c-Myc

ρύθμιση προς τα πάνω (OR = 3.528, 95% Διάστημα Εμπιστοσύνης: 1,347 – 9,240, p-value: 0,0108 με την ακριβή δοκιμή του Fisher) (Εικόνα 1Β).

Α) Ζ-βαθμολογίες (σε κανονική δείγματα προστάτη) του

AR

έναντι

c-Myc

mRNA έκφραση σε όλη 140 ανθρώπινα CRPC μεταστάσεις. Ο συντελεστής συσχέτισης Pearson, γραμμική παλινδρόμηση, και F τεστ για σημαντικά μη-μηδενική κλίση πραγματοποιήθηκαν για κάθε ζεύγος γονιδίων. Β) ακριβής αναλογία δοκιμής και τις αποδόσεις του Fisher στο τραπέζι έκτακτης ανάλυση της συν-εμφάνισης των όγκων με

AR

ή

c-Myc

z-score μεγαλύτερο από 2.

Η

AR καταστολή μειώνει την ανάπτυξη των AR εξαρτώμενη από συνδετήρα και AR ρίζας-ανεξάρτητο Ευνουχισμός ανθεκτικά καρκινικά κύτταρα του προστάτη

κατασταλεί η έκφραση του

AR

με RNAi στα καρκινικά κύτταρα του προστάτη που αναπτύσσονται σε απογυμνωμένο με ενεργό άνθρακα, ανδρογόνα συνδετήρα-εξαντλημένο ορό.

AR

RNAi μειωμένη ανάπτυξη των κυττάρων και των δύο ανδρογόνο εξαρτώμενη από συνδετήρα κύτταρα LNCaP και τα παράγωγά τους, που ονομάζεται CRPC LNCaP-abl (Σχήμα 2Α). Αξίζει να σημειωθεί ότι δύο από αυτά τα κύτταρα εκφράζουν μόνο το AR μεταγραφής πλήρους μήκους.

AR

καταστολή με RNAi στην κυτταρική σειρά 22RV1 CRPC που εκφράζει τόσο πλήρους μήκους AR και μια παραλλαγή AR μεταγραφή επιτευχθεί το ίδιο αποτέλεσμα (Εικόνα 2Α). Σε όλες τις κυτταρικές σειρές, η καταστολή AR μειωμένη ανάπτυξη των κυττάρων χωρίς να επάγουν απόπτωση (τα δεδομένα δεν φαίνονται), γεγονός που υποδηλώνει ένα ελάττωμα στον πολλαπλασιασμό. Έτσι, παρά την εξάντληση συνδέτη ανδρογόνων,

AR

καταστολή μειώνει περαιτέρω την ανάπτυξη του καρκίνου του προστάτη κυττάρων.

Α) LNCaP, ABL και 22RV1 κύτταρα επιμολυσμένα με 50 nM των μη στοχευμένων ελέγχου (NTC) ή

AR

RNAi ολιγονουκλεοτίδια. Τα κύτταρα μεταφέρθηκαν σε απογυμνωμένο με ενεργό άνθρακα ορό την ημέρα της διαμολύνσεως. Η κυτταρική ανάπτυξη προσδιορίστηκε 5 ημέρες αργότερα για LNCaP και 6 ημέρες αργότερα για abl και CRPC 22RV1 με τη μέθοδο αποκλεισμό trypan blue. Β) ανοσοκηλίδας για την έκφραση AR. Οι χαμηλότερες ζώνες στην ανοσοαποτύπωση AR σε κύτταρα 22RV1 αντανακλούν την παρουσία μιας παραλλαγής AR μεταγραφή [7]. Β) LNCaP, abl και 22RV1 κύτταρα επιμολύνθηκαν με 50 ηΜ NTC ή

c-Myc

RNAi ολιγονουκλεοτίδια. Τα κύτταρα μεταφέρθηκαν σε απογυμνωμένο με ενεργό άνθρακα ορό την ημέρα της διαμολύνσεως. Η κυτταρική ανάπτυξη προσδιορίστηκε 5 ημέρες αργότερα για τα κύτταρα LNCaP και 6 ημέρες αργότερα για ABL και 22RV1 με τη μέθοδο αποκλεισμό trypan blue. Ανοσοκηλίδας για έκφραση πρωτεΐνης c-Myc. Γ) LNCaP κυττάρων με σταθερή υπερέκφραση κενό φορέα (EV) ή c-Myc παρήχθησαν. Αυτά τα κύτταρα διαμολύνθηκαν με 50 ηΜ μη-στοχευμένων ελέγχου (NTC) ή AR siRNA ολιγονουκλεοτίδια. Η ανάπτυξη των κυττάρων προσδιορίστηκε 6 ημέρες αργότερα με τη μέθοδο αποκλεισμού trypan blue. Ανοσοστύπωμα για AR και c-Myc έκφραση πρωτεΐνης. Οι υψηλότερες ζώνες στο ανοσοστύπωμα c-Myc στα c-Myc-κύτταρα που υπερεκφράζουν αντιπροσωπεύουν το εκτοπικά-εκφράζονται c-Myc. * Υποδηλώνει p & lt?. 0.05 σε σύγκριση με το NTC

Η

c-Myc καταστολή ανακεφαλαιώνει την επίδραση του AR καταστολή, και c-Myc υπερέκφραση μειώνει την αντι-όγκου των AR καταστολή

Για να καθοριστεί εάν το c-Myc επηρεάζεται επίσης καρκίνου του προστάτη κυτταρική ανάπτυξη ανεξάρτητο συνδεσμικών ανδρογόνων, θα κατασταλεί

c-Myc

χρήση RNAi. Όπως

AR

μειορύθμιση,

ο-Μγο

κάτω ρύθμιση κατέστειλε συνδέτη ανεξάρτητη ανάπτυξη του LNCaP, abl, και 22RV1 κύτταρα (Σχήμα 2Β). Περαιτέρω, έχουμε ταυτόχρονα καταστέλλεται

AR

και

c-Myc

με RNAi. Συν-καταστολής και των δύο πρωτεϊνών δεν μείωσε την κυτταρική ανάπτυξη πάνω από την καταστολή της είτε

AR

ή

c-Myc

από μόνη της (Σχήμα S1).

Δείξαμε επίσης ότι

c-Myc

υπερέκφραση ανατίθενται συνδέτη-ανεξάρτητη ανάπτυξη σε κύτταρα LNCaP εξαρτώμενη από συνδετήρα πολλαπλασιάζονται μακροπρόθεσμα σε συνθήκες ευνουχισμού, η οποία είναι σύμφωνη με προηγούμενη έκθεση (Σχήμα S2) [21]. Στη συνέχεια, καταστέλλεται

AR

με RNAi σε κύτταρα LNCaP που υπερεκφράζουν άδειο φορέα ή

c-Myc

και ποσοτικά την ανάπτυξη των κυττάρων.

c-Myc

υπερέκφραση ήταν προστατευτική ενάντια στις επιδράσεις καταστολής της ανάπτυξης του

AR

RNAi (Σχήμα 2C). Αυτό αποδεικνύει ότι

c-Myc

συμβάλλει τουλάχιστον εν μέρει στις επιδράσεις AR για την προαγωγή ανεξάρτητη συνδεσμικού επιβίωση καρκίνου του προστάτη κυττάρου.

AR αλλά όχι ανδρογόνα Προώθηση c-Myc Έκφραση

Η

c-Myc

ογκογονίδιο συνήθως ρυθμίζεται αυξητικά στον καρκίνο του προστάτη, και

c-Myc

αυξητική ρύθμιση προωθεί ανεξάρτητη συνδεσμικού καρκίνου του προστάτη κύτταρο επιβίωσης [21]. Ωστόσο, η εξάρτηση του

c-Myc

έκφραση στο AR δεν είχε τεκμηριωθεί. Κατά συνέπεια, εξετάσαμε προηγουμένως δημοσιευθέντα δεδομένα μικροσυστοιχιών τσιπ που εντοπίζεται AR σε όλο το γονιδίωμα του ανδρογόνου εξαρτώμενη από συνδετήρα κύτταρα LNCaP και τα παράγωγά Abl CRPC τους [17]. AR αναφέρθηκε να δεσμεύεται σε ένα στοιχείο ενισχυτή του

c-Myc

γονίδιο και στις δύο αυτές κυτταρικές σειρές. Ως εκ τούτου, θα χρησιμοποιηθούν για την επόμενη τσιπ για να επιβεβαιώσουν αυτά τα αποτελέσματα.

Κατ ‘αρχάς, μεγαλώσαμε κύτταρα σε απογυμνωμένο με ενεργό άνθρακα, ανδρογόνα συνδέτη-εξαντλημένο ορού και προσδιορίζεται η επίδραση της θεραπείας με το συνδετήρα ανδρογόνων R1881 για AR πληρότητα και την ακετυλίωση των ιστονών, ένα σημάδι της ενεργού μεταγραφής, στο

c-Myc

στοιχείο ενισχυτή χρησιμοποιώντας chip. Μετρήσαμε επίσης τα αποτελέσματα της θεραπείας R1881 στο καλά περιγραφεί, συνδετήρα-ενεργοποιημένο γονίδιο

KLK3

. AR και υψηλά επίπεδα ακετυλίωσης ιστόνης ήταν παρόντες στο

c-Myc

ενισχυτή ακόμη και όταν τα κύτταρα αναπτύχθηκαν σε ορό συνδετήρα-εξαντλημένο (Σχήμα 3Α). Περαιτέρω, η προσθήκη του R1881 σε καλλιέργεια δεν ενίσχυσε AR πληρότητας ή ακετυλίωση ιστονών σε

c-Myc

(Σχήμα 3Α). Αυτό έρχεται σε αντίθεση με την επίδραση των R1881 σε το

αυξήθηκε KLK3

γονίδιο enhancer- εμπλουτισμό των AR και ακετυλίωση των ιστονών (Εικόνα 3Α).

LNCaP, Abl, και 22RV1 κύτταρα αναπτύχθηκαν σε απογυμνωμένο με ενεργό άνθρακα ορό για 72 ώρες και στη συνέχεια υποβλήθηκε σε επεξεργασία με 10 ηΜ R1881 (ή όχημα αιθανόλη) για 4 ώρες. Α) χρωματίνης ανοσοκαταβύθιση διεξήχθη για να προσδιοριστεί ο εμπλουτισμός των AR και ιστόνης Η3 ακετυλίωση (AcH3) στο

c-Myc

και

KLK3

στοιχεία ενισχυτή. Β) QRT-PCR πραγματοποιήθηκε για τον προσδιορισμό των επιπέδων mRNA του

KLK3

και

c-Myc

σχέση με ακτίνη. C) Ανοσοκηλίδωση διεξήχθη για τον προσδιορισμό των επιπέδων πρωτεΐνης του AR, c-Myc, και ακτίνη. * Υποδηλώνει p & lt? 0,05 σε σύγκριση με το όχημα

Η

Είμαστε δίπλα προσδιοριστεί η επίδραση της θεραπείας R1881 στην έκφραση του

c-Myc

ή

KLK3

.. επεξεργασία R1881 αυξηθεί

KLK3

έκφρασης (Εικόνα 3Β). Ωστόσο, η θεραπεία R1881 δεν αυξάνει

c-Myc

έκφρασης. Εικόνα 3Β, C).

Στη συνέχεια, θα αντιμετωπίζονται κύτταρα καρκίνου προστάτη με MDV3100, ένα ισχυρό, νέο ανδρογόνο ανταγωνιστής [26]. επεξεργασία MDV3100 κατασταλεί η έκφραση του

KLK3

αλλά δεν επηρέασε την έκφραση του

c-Myc

. (Σχήμα S3). Αυτά τα αποτελέσματα υποστηρίζουν περαιτέρω την ιδέα ότι ανδρογόνων συνδέτες δεν προωθούν την έκφραση του

c-Myc

.

Για να προσδιορίσετε αν το AR ήταν σε θέση να ρυθμίζουν

c-Myc

σε ένα συνδέτη ανεξάρτητο τρόπο, χρησιμοποιήσαμε RNAi να καταστείλει την έκφραση του

AR

και μετράται

ο-Μγο

έκφρασης. Μεσολάβηση RNAi καταστολή

AR

μειωμένη c-Myc mRNA και η πρωτεΐνη έκφρασης (Σχήμα 4Α, Β). Πραγματοποιήσαμε αναλύσεις chip και επιβεβαίωσε ότι

AR

RNAi μειωμένη AR και ακετυλίωση ιστονών από το

c-Myc

ενισχυτή (Σχήμα 4C). Αυτή ήταν η πιο σημαντική στην 22RV1 κυτταρική γραμμή, παρότι ισχυρές τάσεις παρατηρήθηκαν επίσης στα κύτταρα LNCaP και Abl. Έτσι,

c-Myc

είναι ένας άμεσος γονίδιο στόχος AR, και

AR

RNAi καταστέλλει

c-Myc

έκφραση τουλάχιστον εν μέρει μέσω εξάντληση των AR και ακετυλίωση ιστονών από η

c-Myc

ενισχυτή. Μπορούμε επίσης υπερεκφράζονται AR στην κυτταρική σειρά καρκίνου του προστάτη M12 που κανονικά δεν εκφράζουν AR. AR υπερέκφραση αυξημένη c-Myc mRNA και έκφρασης πρωτεΐνης (Εικόνα S4). Αυτό υποστηρίζει περαιτέρω την ιδέα ότι AR ενεργοποιεί

c-Myc

έκφραση σε ένα συνδετήρα-ανεξάρτητο τρόπο.

LNCaP, ABL και 22RV1 κύτταρα επιμολυσμένα με 50 nM των μη στοχευμένων ελέγχου (NTC) ή AR RNAi ολιγονουκλεοτίδια. Τα κύτταρα στη συνέχεια αναπτύχθηκαν σε απογυμνωμένο με ενεργό άνθρακα ορό για 96 ώρες. Στο τέλος της θεραπείας, τα κύτταρα συλλέχθηκαν για την εκχύλιση mRNA και πρωτεΐνης. Α) QRT-PCR πραγματοποιήθηκε για τον προσδιορισμό των επιπέδων

c-Myc

σχέση με

ακτίνης

. Β) Ανοσοκηλίδωση διεξήχθη για να προσδιοριστούν τα επίπεδα του AR, c-Myc και ακτίνης. Γ) Παράλληλες θεραπείες διεξήχθησαν και τα κύτταρα διασυνδεδεμένη και υποβάλλονται σε επεξεργασία για τον προσδιορισμό τσιπ για AR και ιστόνης Η3 ακετυλίωση εμπλουτισμού (AcH3) στο

ο-Μγο

ενισχυτή. * Υποδηλώνει p & lt? 0,05 σε σύγκριση με το NTC

Η

AR καταστολή ανακεφαλαιώνει την επίδραση του c-myc καταστολή

επόμενο καθοριστεί αν μεσολάβηση RNAi καταστολή των

AR

. ανακεφαλαίωσε την επίδραση της μεσολάβηση RNAi καταστολή

c-Myc

επί της έκφρασης του καλά-περιγράφονται

c-Myc

γονιδίων στόχων (Εικόνα 5) [27], [28]. Τόσο

c-Myc

RNAi και

AR RNAi

μειωμένη έκφραση του

c-Myc

-ενεργοποιημένου γονίδιο

E2F1

? αντιστρόφως,

c-Myc

και

AR

RNAi τόσο αυξημένη έκφραση του

c-Myc

-repressed γονίδιο

CDKN1A

(Σχήμα 5). Πρόσφατες εκθέσεις αποδεικνύουν ότι μιτωτική γονίδια, συμπεριλαμβανομένων των

KIF11

,

AURKB

, και

TPX2

, αποτελούν βασικά γονίδια στόχους c-Myc [29] – [31].

AR

RNAi ανακεφαλαίωσε την επίδραση της C

Myc έχει

RNAi και επίσης μειωμένη έκφραση των γονιδίων αυτών (Σχήμα 5). Αυτό δείχνει ότι η καταστολή AR διαταράσσει τη λειτουργία c-Myc και την έκφραση των καθιερωμένων γονιδίων στόχων c-Myc.

LNCaP και ABL κύτταρα επιμολυσμένα με 50 nM των μη στοχευμένων ελέγχου (NTC) και είτε Α)

AR

ή Β)

c-Myc

RNAi ολιγονουκλεοτίδια. Τα κύτταρα μεταφέρθηκαν σε απογυμνωμένο με ενεργό άνθρακα ορό την ημέρα της επιμόλυνσης και συγκομίζονται 96 ώρες αργότερα. QRT-PCR διεξήχθη για να προσδιοριστούν τα επίπεδα των υποδεικνυόμενων

c-Myc

γονιδίων-στόχων σε σχέση με

ακτίνης

. * Υποδηλώνει p & lt? 0,05 σε σύγκριση με το NTC

Η

Το στοίχημα Bromodomain αναστολέας JQ1 Καταστέλλει c-Myc λειτουργία και μειώνει την AR ρίζας-ανεξάρτητο καρκίνο του προστάτη Επιβίωση κυττάρων

Τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι

c-Myc

είναι ένα σημαντικό γονίδιο στόχο AR, αλλά ότι

έκφραση c-Myc

‘s δεν έχει ενεργοποιηθεί από ανδρογόνο συνδέτες. Επί του παρόντος, οι θεραπείες για την καταστολή της έκφρασης AR δεν είναι ακόμα διαθέσιμα. Ωστόσο, πρόσφατες εργασίες δείχνουν ότι ένας αναστολέας της ΒΕΤ bromodomain ονομάζεται JQ1 καταστέλλει έκφραση c-Myc και λειτουργία c-Myc επειδή

c-Myc

είναι ένα γονίδιο στόχος bromodomain [22], [23]. Ως εκ τούτου, είμαστε αντιμετωπίζονται τα καρκινικά κύτταρα του προστάτη με JQ1. θεραπεία JQ1 μειωμένη mRNA και τα επίπεδα πρωτεΐνης του c-myc (Σχήμα 6Α, Β) και κατέστειλε c-Myc λειτουργία, όπως μετράται με την έκφραση του γονιδίου-στόχου c-Myc (Σχήμα 6Β). Τέλος, όπως

c-Myc

RNAi, θεραπεία JQ1 με νανομοριακές συγκεντρώσεις μειωμένη ανεξάρτητη συνδεσμικού επιβίωση των κυττάρων καρκίνου του προστάτη (Σχήμα 6C).

LNCaP, abl, και 22RV1 κύτταρα αναπτύχθηκαν σε charcoal- απογυμνωμένο ορό και υποβλήθηκε σε επεξεργασία με όχημα, 50 ηΜ, 250 ηΜ ή 500 ηΜ JQ1 κάθε 24 ώρες για 72 ώρες. Α) Ανοσοκηλίδωση διεξήχθη για να προσδιορίσει τα επίπεδα πρωτεΐνης του c-myc. Β) QRT-PCR διεξήχθη για να προσδιοριστεί το επίπεδο του mRNA της

c-Myc

και c-Myc στοχεύει γονίδια

KIF11, CDKN1A, TPX2

, και

AURKB

σε σχέση με

ακτίνης

. * Υποδηλώνει p & lt? 0,05 σε σύγκριση με το όχημα. C) Cell βιωσιμότητα προσδιορίστηκε στο τέλος της θεραπείας με τη μέθοδο αποκλεισμό trypan blue. p & lt?. 0.01 για 250 nM και 500 nM δόσεις εναντίον του οχήματος σε όλες τις τρεις κυτταρικές σειρές

Η

Συζήτηση

Είναι καλά κατανοητό ότι το AR είναι ένα κρίσιμο οδηγός του προστάτη επιβίωση των κυττάρων του καρκίνου και ότι οι λογαριασμοί AR για εξέλιξη σε θανατηφόρα CRPC παρά τη θεραπεία με ADT [24]. Σε πολλές περιπτώσεις, τα ανδρογόνα επιμένουν ενδοκυτταρικά εντός CRPC όγκων παρά ευνουχισμού επίπεδα ανδρογόνων [24], [32] του ορού. Ωστόσο, έχουν ανδρογόνων συνδέτη-ανεξάρτητη, αλλά AR που εξαρτώνται από τους μηχανισμούς που προωθούν επίσης την επιβίωση των CRPC κύτταρα έχουν αναφερθεί. Αυτές περιλαμβάνουν την ενεργοποίηση του AR από την IL-6, ενίσχυση γονιδίου AR, και AR παραλλαγές μεταγραφής που δεν έχουν την περιοχή δέσμευσης συνδέτη ανδρογόνων [7] – [9], [15]. Όλοι αυτοί οι μηχανισμοί μπορούν να συμβάλουν στην εξέλιξη του καρκίνου του προστάτη παρά ADT αφού κανένας στοχεύουν άμεσα με ADT.

Πρόσφατα, δείχθηκε ότι η πρωτεΐνη AR προάγει την έκφραση ενός προγράμματος γονιδίου διακριτή από κανονική ανδρογόνων συνδετήρα-κατευθυνόμενη του στόχους σε CRPC κύτταρα [17]. Ένα τέτοιο παράδειγμα είναι το γονίδιο στόχος AR

UBE2C

που προωθεί ανεξάρτητη συνδεσμικού πολλαπλασιασμό του καρκίνου του προστάτη [17]. Ποια από τα άλλα προϊόντα AR-επαγόμενη γονίδιο είναι κρίσιμη για την επιβίωση των κυττάρων καρκίνου του προστάτη ανεξάρτητη συνδεσμικού ήταν ασαφής. Η εργασία μας δείχνει ότι η

c-Myc

ογκογονίδιο είναι ένα τέτοιο γονίδιο στόχος AR προσδέματος-ανεξάρτητη.

c-Myc

συνήθως ρυθμίζεται αυξητικά στον καρκίνο του προστάτη, και

c-Myc

υπερέκφραση μετατρέπει την κανονική επιθηλιακά κύτταρα του προστάτη σε γενετικά μοντέλα ποντικών του καρκίνου του προστάτη και παρέχει ανεξάρτητη συνδεσμικού επιβίωση καρκίνου του προστάτη των κυττάρων, αλλά η εξάρτηση του

c-Myc

έκφρασης στο AR ήταν ασαφής [18], [20], [21], [33]. Δείχνουμε εδώ ότι

AR

και

c-Myc

συνήθως ρυθμίζεται προς τα πάνω σε CRPC, και επιβεβαίωσε ότι

AR

και

c-Myc

αυξητική ρύθμιση έντονα συσχετίζεται με το άλλο σε μια μεγάλη σειρά των μεταστατικών όγκων CRPC ασθενή (Σχήμα 1).

Επιβεβαιώσαμε ότι

AR

καταστολή οδηγεί σε απώλεια της έκφρασης c-Myc σε κυτταρικές σειρές καρκίνου του προστάτη που εκφράζουν την πλήρη η αρχαιότητα AR (LNCaP και Abl) και σε μια άλλη CRPC 22RV1 κυτταρική γραμμή που εκφράζει τόσο πλήρους μήκους AR και μια παραλλαγή AR μεταγραφή. Αν και δεν μπορούμε να αποκλείσουμε ένα ρόλο για την παραλλαγή AR μεταγραφή στην προωθεί επίσης

c-Myc

έκφρασης, τα αποτελέσματά μας με AR RNAi σε LNCaP και Abl και τα αποτελέσματά μας με AR υπερέκφραση σε κύτταρα Μ12 αποδεικνύουν ότι πλήρους μήκους AR είναι ικανή ενεργοποίησης

c-Myc

έκφρασης (Εικόνα 4, Εικόνα S4).

Όπως

AR

RNAi,

c-Myc

RNAi μειωμένη καρκίνου του προστάτη επιβίωση των κυττάρων σε ανδρογόνο συνθήκες συνδετήρα-εξαντλημένο ενώ συν-καταστολή του

AR

και

c-Myc

δεν ήταν περισσότερο αποτελεσματική από την καταστολή της πρωτεΐνης είτε μόνο του (Σχήμα 2, Εικόνα S1).

c-Myc

υπερέκφραση προσδίδει ανεξάρτητη συνδεσμικού επιβίωση σε κύτταρα καρκίνου του προστάτη (Σχήμα S2), το οποίο αντιστοιχεί σε ένα προηγούμενη έκθεση [21]. Δείξαμε επίσης ότι

c-Myc

υπερέκφραση εξασθένησε την αντικαρκινική δραστικότητα του

AR

καταστολή με RNAi (Σχήμα 2C). Έτσι, ο-Μγο συμβάλλει επιδράσεις AR για την προαγωγή ανεξάρτητη συνδεσμικού επιβίωση καρκίνου του προστάτη κυττάρου.

Παρά το γεγονός ότι AR προάγει έκφραση του

c-Myc

, η θεραπεία με ανδρογόνα συνδέτη δεν αυξάνουν

c-Myc

έκφρασης (Σχήμα 3). Επιπλέον, η θεραπεία με συνδετήρες ανδρογόνων δεν ενίσχυσε AR πληρότητας στο

c-Myc

ενισχυτή (Σχήμα 3). Αυτό έρχεται σε αντίθεση με τις επιδράσεις του ανδρογόνων διέγερση επί της εκφράσεως του

KLK3

γονίδιο, ένα καλά-περιγράφονται γονίδιο ανδρογόνου ενεργοποιούνται, και AR πληρότητα στο

KLK3

ενισχυτή (Σχήμα 3). Για την περαιτέρω επιβεβαίωση ότι η AR προωθεί την έκφραση του

c-Myc

σε ένα συνδετήρα-ανεξάρτητο τρόπο, θα αντιμετωπίζονται τα καρκινικά κύτταρα του προστάτη με το νέο, ισχυρό ανδρόγυνο ανταγωνιστής MDV3100 [26]. Η θεραπεία με MDV3100 σε μια πρόσφατη τυχαιοποιημένη, κλινική μελέτη ελεγχόμενη με εικονικό φάρμακο μελέτη φάσης ΙΙΙ βελτιωμένη συνολική επιβίωση των ασθενών με CRPC [34]. Ωστόσο, σε μερικούς ασθενείς, δεν υπάρχει ανταπόκριση του όγκου, και σε εξέλιξη το AR παραμένει στον πυρήνα [3], [6], [34]. Ενώ η θεραπεία MDV3100 μειωμένη έκφραση του

KLK3

, θεραπεία MDV3100 δεν είχε καμία επίδραση στο

c-Myc

έκφρασης (Σχήμα S3). Αυτά τα δεδομένα υποστηρίζουν περαιτέρω την ιδέα ότι AR προωθεί

c-Myc

έκφραση σε ένα συνδετήρα-ανεξάρτητο τρόπο.

c-Myc

είναι ένας κρίσιμος παράγοντας για την ανεξάρτητη από πρόσδεμα εξέλιξης του καρκίνου του προστάτη (Σχήμα 2, Εικόνα S2) [21]. Ως εκ τούτου, στο μέλλον, θα είναι σημαντικό να μετρηθεί

c-Myc

έκφρασης και λειτουργίας σε CRPC όγκους ασθενών προχωρούν παρά πληρέστερη ανδρογόνων παρεμβολή με φάρμακα όπως MDV3100.

Λόγω της σημασίας του

c-Myc

μεταγενέστερος συνεισφέρων επιδράσεις AR για επιβίωση κυττάρων καρκίνου του προστάτη ανεξάρτητη από συνδέτη, υποβάλλαμε σε αγωγή καρκινικά κύτταρα του προστάτη με την JQ1 αναστολέα ΒΕΤ bromodomain, ένα φάρμακο που είναι γνωστό ότι καταστέλλει την έκφραση των γονιδίων στόχων bromodomain? κυρίως μεταξύ των οποίων ήταν

c-Myc

[22], [23]. Σε προηγούμενες μελέτες, η θεραπεία JQ1 in vitro και in vivo κατέστειλε την έκφραση c-Myc και λειτουργίας και κατέστειλε την ανάπτυξη του όγκου χωρίς αξιόλογη τοξικότητα [22], [23].

επιβεβαιώθηκε ότι η αγωγή JQ1 κυττάρων καρκίνου του προστάτη χρησιμοποιώντας nanomolar συγκεντρώσεις που επιτυγχάνονται τα ίδια αποτελέσματα με τη συνολική μεσολάβηση RNAi καταστολή

c-Myc

– c-Myc mRNA και εξάντληση πρωτεΐνη, καταστολή της λειτουργίας του c-myc, και η καταστολή της επιβίωσης των κυττάρων καρκίνου του προστάτη ανεξάρτητη από συνδέτη (Σχήμα 6 ). Υπό το φως της συμμετοχής των

c-Myc

σε κρίσιμες φυσιολογικές διαδικασίες, στόχευση της πρωτεΐνης c-Myc γενικά σε πολλούς τύπους κυττάρων μέσω μακροχρόνια χορήγηση θα μπορούσε να είναι ανεπιθύμητη [35], [36]. Οι κλινικές δοκιμές θα είναι αναγκαίο να προσδιοριστεί η ασφάλεια του bromodomain αναστολής. Ωστόσο, τα αποτελέσματα μέχρι σήμερα, συμπεριλαμβανομένης και της δικής μας, δείχνουν ότι πρόκειται για μια πολλά υποσχόμενη στρατηγική για την καταπολέμηση των όγκων για τη θεραπεία της CRPC (Σχήμα 6) [22], [23].

Τέλος, ότι οι έλεγχοι AR έκφραση των γονιδίων στόχων του, όπως

c-Myc

σε έναν ιστό ειδικό τρόπο υποδηλώνει ότι το ιδανικό μέσο για την καταστολή του

c-Myc

έκφραση σε κύτταρα καρκίνου του προστάτη μπορεί να εστιαστεί ειδικά AR, η ίδια. Πράγματι, οι μελέτες μας διευκρινίσει ότι ανδρογόνο ανεξάρτητη συνδεσμικού αλλά AR-εξαρτώμενη

c-Myc

γονίδιο προς τα άνω ρύθμιση είναι ένας μηχανισμός με τον οποίο η πρωτεΐνη AR προωθεί ανεξάρτητη από συνδέτη επιβίωση των καρκινικών κυττάρων του προστάτη. Οι μελέτες μας υποστηρίζουν την αξία των προσπαθειών για να καταστείλει τη λειτουργία ανεξάρτητη συνδεσμικού AR και έκφραση σημαντικών ανεξάρτητη συνδεσμικού γονίδια στόχους AR όπως

c-Myc

(Σχήμα 7). Φάρμακα ικανά να καταστέλλουν την έκφραση AR μόλις τώρα αρχίζουν να εισέλθουν δοκιμές. Αυτά τα φάρμακα περιλαμβάνουν επιλεκτική αποικοδομήσεως Ar και Ar ολιγονουκλεοτίδια αντι-νόημα [37] – [40]. Αναμένουμε τα αποτελέσματα αυτών των κλινικών μελετών για τον προσδιορισμό της ασφάλειας, την ειδικότητα, και η αποτελεσματικότητα αυτών των παραγόντων σε άνδρες με προχωρημένο καρκίνο του προστάτη.

Επί του παρόντος, ανδρογόνων θεραπείες στέρηση που παρεμβαίνουν με την ενεργοποίηση συνδέτη ανδρογόνων του AR χρησιμοποιούνται κυρίως για τη θεραπεία αυτής της ασθένειας. Αυτές οι θεραπείες καταστέλλουν τη λειτουργία των ανδρογόνων εξαρτώμενη από συνδετήρα AR και καταστέλλει την έκφραση των γονιδίων-στόχων των ανδρογόνων (AD) AR συνδέτη-εξαρτώμενη. Ωστόσο, παρά τις επεξεργασίες αυτές προστάτη εξέλιξη του καρκίνου είναι αναπόφευκτη. Η AR προωθεί επίσης την έκφραση του ανδρογόνου ανεξάρτητη συνδεσμικού οδούς όπως

c-Myc

. Η

c-Myc

γονίδιο συνήθως ρυθμίζεται αυξητικά στον καρκίνο του προστάτη και συμβάλλει στην ανδρογόνο ανεξάρτητη συνδεσμικού εξέλιξης του καρκίνου του προστάτη. Το μοντέλο αυτό υποδηλώνει σαφώς ότι AR ή c-Myc-σκηνοθεσία θεραπειών θα συμπληρώσει τις τρέχουσες στρατηγικές στέρησης ανδρογόνων.

Η

Μέθοδοι

Cell Culture

LNCaP και 22RV1 κύτταρα αγοράστηκαν από την American Type Culture Collection (ATCC) και αναπτύχθηκαν σε 10% απογυμνωμένο με ενεργό άνθρακα εμβρυϊκό βόειο ορό για όλα τα πειράματα. Abl κύτταρα, μια CRPC παράγωγο του LNCaP, ήταν ένα είδος δώρο από Zoran Culig, PhD και αναπτύχθηκαν σε RPMI με 10% απογυμνωμένο με ενεργό άνθρακα εμβρυϊκό βόειο ορό. M12 καρκίνου του προστάτη κύτταρα που εκφράζουν άδειο φορέα ή AR ήταν ένα είδος δώρου από τον Stephen R. Plymate, PhD, και αναπτύχθηκαν όπως περιγράφηκε προηγουμένως [9].

Για πειράματα RNAi, LNCaP και abl κύτταρα επιμολύνθηκαν με RNAi ολιγονουκλεοτίδια (

AR

: 5′-GACCUACCGAGGAGCUUUCUU-3 ‘, και

c-Myc

: 5′-GAGCUAAAACGGAGCUUUUdTdT-3′) χρησιμοποιώντας DharmaFECT 3 (Dharmacon) αντιδραστήριο διαμόλυνσης για μια τελική συγκέντρωση 50 ηΜ [41]. 22RV1 κύτταρα επιμολύνθηκαν με siRNA ολιγονουκλεοτίδια χρησιμοποιώντας Lipofectamine2000 (Life Technologies) αντιδραστήριο επιμόλυνσης για μια τελική συγκέντρωση 50 ηΜ. Τα κύτταρα συλλέχθηκαν σε υποδεικνυόμενα χρονικά σημεία μετά την επιμόλυνση.

R1881 (Sigma) επαναιωρήθηκε σε 100% αιθανόλη. MDV3100 αγοράστηκε (Selleckchem) και επαναιωρήθηκαν σε DMSO. JQ1 αγοράστηκε από την Sigma και επαναιωρήθηκαν σε DMSO. Η ανάπτυξη των κυττάρων προσδιορίστηκε στο τέλος της θεραπείας με το μπλε της τρυπάνης μέθοδο αποκλεισμού (Life Technologies) ακολουθώντας τις οδηγίες των κατασκευαστών. Όλα τα πειράματα καλλιέργειας κυττάρων διεξήχθησαν με δείγματα βιολογικού τριπλούν και επιβεβαιώθηκε σε πειράματα επανάληψης.

LNCaP κύτταρα με σταθερή υπερέκφραση του c-myc ή κενό φορέα παρήχθησαν με επιμόλυνση κυττάρων LNCaP με pCDNA-DEST40-

C-

myc (ευγενώς από Rosalie Sears, PhD) ή pCMV6-AN-His (ΟηΟεηε) και επιλέγοντας με G418.

Colony-σχηματισμό Δοκιμασία

200.000 LNCaP κύτταρα με σταθερή υπερέκφραση της κενό φορέα (EV), ή

c-Myc

απλώθηκαν σε δίσκους των 10 cm. RPMI με 10% απογυμνωμένο με ενεργό άνθρακα εμβρυϊκό βόειο ορό συμπληρωμένο με 300 μg /ml G418 και 10 μg /ml βικαλουταμίδη αγωγή προστέθηκε στα κύτταρα κάθε δεύτερη ημέρα επί 14 ημέρες. Στη συνέχεια, τα κύτταρα μονιμοποιήθηκαν με 4% φορμαλδεΰδη και χρωματίστηκαν με syto60 (Invitrogen). Εικόνες ελήφθησαν με σύστημα απεικόνισης Licor Οδύσσεια.

ανοσοαποτύπωσης

πειράματα ανοσοστύπωσης έγιναν όπως περιγράφηκε προηγουμένως [42]. Τελικές εικόνες ελήφθησαν με σύστημα απεικόνισης Licor Οδύσσεια. Πρωτογενή αντισώματα που χρησιμοποιήθηκαν ήταν: AR (Ν-20, Santa Cruz)? ακτίνης (Sigma) και c-Myc (Epitomics). Δευτερεύοντα αντισώματα αγοράστηκαν από Licor.

QRT-PCR

RNA εκχυλίστηκε από κυτταρικά σφαιρίδια αποθηκεύονται σε αντιδραστήριο RNAlater (Life Technologies) χρησιμοποιώντας κιτ MagMAX Ολικό RNA Απομόνωση (Life Technologies) ή ΤπζοΙ ( Invitrogen) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Η συγκέντρωση του RNA προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας ένα φασματοφωτόμετρο NanoDrop ND-1000 (NanoDrop). 250 ng-1 μα RNA (κανονικοποιήθηκε για κάθε πείραμα) μεταγράφηκε αντίστροφα χρησιμοποιώντας ένα υψηλής χωρητικότητας cDNA Reverse Transcription Kit (Life Technologies) με τυχαία εναύσματα. Realtime (QRT) -PCR διεξήχθη χρησιμοποιώντας 7.500 Fast θερμοκυκλοποιητή (Life Technologies) με το ακόλουθο πρόγραμμα ποδηλασίας: 50 ° C για 2 λεπτά, 95 ° C για 10 λεπτά, 40 κύκλοι των 95 ° C για 15 sec διαστάσεως, 60 ° C για 1 λεπτό ανόπτηση /επέκταση /διαβάσει. 10 μί singleplex αντιδράσεις RTPCR περιείχε 1Χ Taqman παγκόσμιο πρότυπο βασικού μείγματος, 1Χ Taqman ανιχνευτή υδρόλυσης, και 10 ng RNA ισοδύναμου προτύπου cDNA. Ανθρώπινη βήτα-ακτίνης (# 4326315E) χρησιμοποιήθηκε ως ένα ενδογενές ελέγχου. Primer πληροφορίες περιλαμβάνονται στον πίνακα S1.