Αφηρημένο

Ιστορικό

Εμείς διερευνηθεί πώς το μέγεθος του σώματος και τη σωματική δραστηριότητα επηρεάζει τον κίνδυνο του ΚΚΕ νησιού methylator φαινότυπο (CIMP) σε καρκίνο του παχέος εντέρου (CRC).

μέθοδοι

στις Κάτω Χώρες μελέτη κοόρτης (n = 120852), παράγοντες κινδύνου αυτο-αναφερθεί κατά την έναρξη το 1986. Μετά από 7,3 χρόνια παρακολούθησης, 603 περιπτώσεις και 4.631 μέλη του υπο-ομάδα ήταν διαθέσιμα. κατάσταση CIMP σύμφωνα με τους δείκτες Weisenberger προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας μεθυλίωσης ειδική PCR του DNA από ενσωματωμένα σε παραφίνη ιστό όγκου. αναλογίες ποσοστό κινδύνου (HR) και 95% διαστήματα εμπιστοσύνης για CIMP (27,7%) και μη-CIMP (72,3%), οι όγκοι υπολογίστηκαν σύμφωνα με το ΔΜΣ, ο ΔΜΣ σε ηλικία 20 ετών, ο ΔΜΣ αλλαγή, παντελόνι /μέγεθος φούστα, το ύψος και τη σωματική δραστηριότητα .

Αποτελέσματα

ΔΜΣ πρότυπο ανά 5 kg /m

2 αύξηση αυτή συνδέεται τόσο με CIMP και μη CIMP όγκους, ωστόσο, HRs εξασθένησαν όταν επιπλέον προσαρμογή για παντελόνι /φούστα μέγεθος . μέγεθος παντελόνι /φούστα, ανά 2 αύξηση μεγέθους, συνδέθηκε με τους δύο υποτύπους όγκου, ακόμη και μετά την προσαρμογή ως προς το ΒΜΙ (CIMP HR: 1,20, 95% CI: 1,01 – 1,43? μη CIMP HR: 1,14, 95% CI: 01.04 – 01.28 ). Ύψος ανά 5 εκατοστά συνδέθηκε με δύο όγκους υπο-τύπους, αλλά HRs εξασθένησαν όταν ρυθμιστεί για το σωματικό βάρος. ΔΜΣ στην ηλικία των 20 ήταν θετικά που σχετίζονται με αυξημένο κίνδυνο όγκων CIMP και η συσχέτιση ήταν σημαντικά λιγότερο έντονη για όγκους μη CIMP (

P

-heterogeneity = 0,01). Η σωματική δραστηριότητα σχετίστηκε αντίστροφα με τους δύο υποτύπους, αλλά μια ένωση δόσης-απόκρισης παρατηρήθηκε μόνο για όγκους μη CIMP (

P

-trend = 0.02).

Συμπεράσματα

το μέγεθος του σώματος, ιδιαίτερα κεντρική παχυσαρκία, μπορεί να αυξήσει τον κίνδυνο τόσο CIMP και μη CIMP όγκων. Το σωματικό λίπος σε νεαρή ηλικία μπορεί να διαφορικά κίνδυνο επιρροή. Η σωματική δραστηριότητα φαίνεται να μειώνει τον κίνδυνο του CRC, ανεξάρτητα από αυτές τις μοριακές υποτύπων

Παράθεση:. Hughes LAE, Simons CCJM, van den Brandt PA, Goldbohm RA, de Goeij AF, de Bruïne AP, et al. (2011) Body Μέγεθος, τη Φυσική Δραστηριότητα και του κινδύνου καρκίνου του παχέος εντέρου, με ή χωρίς CpG νησί Methylator φαινότυπο (CIMP). PLoS ONE 6 (4): e18571. doi: 10.1371 /journal.pone.0018571

Επιμέλεια: Syed A. Αζίζ, Health Canada, Καναδάς

Ελήφθη: 15, Φεβρουαρίου 2011? Αποδεκτές: 4 Μαρτίου του 2011? Δημοσιεύθηκε: 5 Απρ, 2011

Copyright: © 2011 Hughes et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο χρηματοδοτήθηκε από το Παγκόσμιο Ταμείο καρκίνου Έρευνας (WCRF), να χορηγούν # 2007/54 με Μάτι Π Weijenberg. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

είναι ευρέως αποδεκτό ότι οι δείκτες του ενεργειακού ισοζυγίου επηρεάσουν τον κίνδυνο καρκίνου του παχέος εντέρου (CRC). Ένα υψηλό δείκτη μάζας σώματος (ΔΜΣ), η περίμετρος της μέσης και των ενηλίκων επιτευχθούν ύψος είναι σαφείς παράγοντες κινδύνου για CRC, ενώ η σωματική δραστηριότητα έχει αποδειχθεί ότι είναι προστατευτικά [1]. Αν και CRC είναι μια από τις καλύτερες που περιγράφονται καρκίνους από την άποψη της γενετικής και επιγενετικών γεγονότα που εμπλέκονται [2] – [5], λίγα είναι γνωστά σχετικά με το πώς τα μέτρα του ανθρωπομετρία και τη σωματική δραστηριότητα που σχετίζεται με διαφορετικά μοριακά υποσύνολα αυτής της ασθένειας. Διελεύκανση διαφορές δυναμικού κινδύνου μεταξύ μοριακού υποτύπων του CRC μπορεί να οδηγήσει σε καλύτερη κατανόηση του CRC, τη θεραπεία και την πρόληψη. Αυτό είναι ιδιαίτερα σημαντικό, καθώς η παγκόσμια εξάπλωση του υπέρβαρου και της παχυσαρκίας συνεχίζει να αυξάνεται.

Ένα ιδιαίτερο χαρακτηριστικό των επιγενετικών αστάθεια στη ΣΔΠ είναι η CpG νησί methylator φαινότυπο (CIMP), που χαρακτηρίζεται από πολλές υποστηρικτής νησί CpG υπερμεθυλίωση suppressor- όγκου και τα γονίδια επιδιόρθωσης του DNA [6] – [9]. Αυτό με τη σειρά του συνδέεται με μεταγραφική σίγηση της γονιδιακής έκφρασης [10]. Λίγες μελέτες έχουν διερευνήσει συσχετισμούς μεταξύ των δεικτών του ενεργειακού ισοζυγίου και την κατάσταση CIMP, και εκείνοι που έχουν, μόνο θεωρείται ΔΜΣ ως δείκτης του μεγέθους του σώματος. Σε ένα περιβάλλον case-control, Slattery

et al.

Ανέφερε μια συσχέτιση μεταξύ υψηλού ΔΜΣ και CIMP χαμηλά, αλλά δεν CIMP υψηλής όγκους του παχέος εντέρου [11], και καμία συσχέτιση μεταξύ ΔΜΣ και CIMP κατάσταση στην πρωκτική όγκους [12 ]. Έντονη σωματική δραστηριότητα συνδέθηκε με δύο όγκους του παχέος εντέρου χαμηλή CIMP υψηλό και CIMP, αλλά όχι του ορθού όγκους [11], [12]. Έχει υποτεθεί ότι το DNA μεθυλίωση είναι μια συνέπεια της φλεγμονής [13], [14]. Κεντρική παχυσαρκία συνδέεται επίσης με χρόνια φλεγμονή [15]. Συνεπώς, λαμβάνοντας υπόψη περιφέρεια μέσης ως παράγοντας κινδύνου για CIMP επιπροσθέτως ΔΜΣ είναι σημαντική. Επιπλέον, η μεθυλίωση πιστεύεται ότι είναι ένα πρώιμο γεγονός στην CRC [16], έτσι ώστε λαμβάνοντας υπόψη το ύψος και το ΔΜΣ σε νεαρή ηλικία μπορεί επίσης να είναι κατατοπιστική, αυτές οι μεταβλητές είναι ενδεικτικά της

στη μήτρα

και τα ανοίγματα πρώτα χρόνια της ζωής [17] .

Χρησιμοποιώντας τον υποψήφιο Ολλανδία Cohort Study σχετικά με τη διατροφή και τον καρκίνο (NLCS), διερευνήθηκε η σχέση μεταξύ ΔΜΣ, το μέγεθος ρούχα (ως υποκατάστατο για περίμετρο μέσης) και τη φυσική δραστηριότητα και τον κίνδυνο της ανάπτυξης ενός όγκου χαρακτηρίζεται από CIMP . Επιπλέον, σε μια προσπάθεια να αποσαφηνιστεί εάν το χρονοδιάγραμμα της έκθεσης είναι σημαντική για τη διαμόρφωση αυτού του κινδύνου, ερευνήσαμε επίσης τις ενώσεις σύμφωνα με ΔΜΣ σε ηλικία 20 ετών, ο ΔΜΣ αλλαγή, και το ύψος των ενηλίκων-επιτευχθεί.

Αποτελέσματα

τα βασικά και τα μοριακά χαρακτηριστικά που περιγράφονται στον πίνακα 1. Αναλογικά, περιπτώσεις CIMP CRC είχαν περισσότερες πιθανότητες να είναι γυναίκες, έχουν έναν όγκο στο εγγύς παχέος εντέρου, και είναι ηλικίας άνω των περιπτώσεων μη CIMP.

η

Σύλλογοι μεταξύ τα μέτρα της ανθρωπομετρία, φυσική δραστηριότητα και CRC κινδύνου ανάλογα με την κατάσταση CIMP παρουσιάζονται στον πίνακα 2. Μετά από προσαρμογή για την ηλικία και το φύλο, BMI πρότυπο ανά 5 kg /m

2 αύξηση ήταν στατιστικά σημαντική συσχέτιση με CIMP όγκους (HR: 1,29, 95% CI: 1,01 – 1,66), και μια στατιστικά σημαντική σχέση δόσης-απόκρισης παρατηρήθηκε όταν μοντελοποίηση τεταρτημόρια του ΔΜΣ (

P

-trend = 0.02). Ωστόσο, όταν τα μοντέλα έγιναν αμοιβαία προσαρμογή για το μέγεθος του παντελονιού /φούστα, αυτές οι ενώσεις ήταν σημαντικά εξασθενημένο. ΔΜΣ ήταν επίσης θετικά, αν και όχι στατιστικά σημαντικά, που σχετίζονται με όγκους μη CIMP. Αυτά ήταν, επίσης, εξασθενημένα όταν αμοιβαία προσαρμογή για το μέγεθος του παντελονιού /φούστα. Οι HR για CIMP και μη CIMP όγκων δεν διέφερε σημαντικά από το ένα το άλλο (

P

-heterogeneity = 0,78). ΔΜΣ σε ηλικία 20 ετών διαμορφώθηκε ανά 5 kg /m

2 αύξηση συσχετίστηκε με αυξημένο κίνδυνο των δύο υποτύπων, αλλά HRs δεν ήταν στατιστικά σημαντική. Όταν ο ΔΜΣ σε ηλικία 20 ετών διαμορφώθηκε σε τεταρτημόρια, μια στατιστικά σημαντική τάση παρατηρήθηκε για όγκους CIMP (

P

= 0,03). Η τάση αυτή έγινε οριακά σημαντική όταν το μοντέλο προσαρμόστηκε για το μέγεθος του παντελονιού /φούστα (

P

-trend = 0,07). Η δοκιμή για την ετερογένεια μεταξύ των υποτύπων των όγκων ήταν στατιστικά σημαντική σε σχέση με ΔΜΣ σε ηλικία 20 ετών, ακόμα και μετά την προσαρμογή για το μέγεθος του παντελονιού /φούστα (

P

-heterogeneity = 0,01). Δεν παρατηρήθηκε στατιστικά σημαντική παρατηρήσεις παρατηρήθηκαν σε σχέση με ΔΜΣ αλλαγή

Η

μέγεθος παντελονιών /φούστα, διαμόρφωσε ανά 2 αυξήστε το μέγεθος της μονάδας, συνδέθηκε τόσο με CIMP (HR:. 1.20, 95% CI: 1,05 – 1,37 ) και οι όγκοι μη CIMP (HR: 1,14, 95% CI: 01.05 – 01.24) μετά από πολυμεταβλητή προσαρμογή, και αυτές οι ενώσεις παρέμεινε ακόμα και όταν μοντέλα αμοιβαία προσαρμογή για το ΔΜΣ. Όταν το μέγεθος του παντελονιού /φούστα θεωρήθηκε κατά προσέγγιση τεταρτημόρια, η δοκιμή για την τάση ήταν σημαντική για CIMP (p = 0.02) και οριακά σημαντική για μη CIMP (

P

= 0.06) όγκους, αν και αυτά ήταν εξασθενημένα όταν τα μοντέλα έγιναν αμοιβαία προσαρμογή για το ΔΜΣ. Σύλλογοι παρατηρήθηκε για CIMP και μη CIMP όγκοι δεν ήταν στατιστικά σημαντικά διαφορετική από κάθε άλλη (

P

-heterogeneity = 0,61).

Ύψος, διαμόρφωσε ανά 5 cm αύξηση συνδέθηκε τόσο με CIMP ( HR: 1,16, 95% CI: 1,01 – 1,33) και μη-CIMP (HR: όγκοι μετά από πολυπαραγοντική προσαρμογή 1,00 – 1,21): 1,10, 95% CI. Μια οριακά στατιστικά σημαντική τάση που παρατηρήθηκε για τον κίνδυνο της μη CIMP όγκους όταν το ύψος θεωρήθηκε σε τεταρτημόρια (υψηλότερη έναντι χαμηλότερου τεταρτημορίου HR: 1,45, 95% CI: 01/03 – 02/06?

P

= 0,06) (p- ετερογένεια = 0,98). Οι ενώσεις αυτές εξασθένησαν όταν το μοντέλο αμοιβαία προσαρμοσμένο για το σωματικό βάρος.

Με χαμηλή φυσική δραστηριότητα ως κατηγορία αναφοράς, δεν υπήρχε καμία συσχέτιση αντίστροφη δόσης-απόκρισης μεταξύ φυσικής δραστηριότητας και οι όγκοι CIMP, αν και το HR για τις ενδιάμεσες φυσικές δραστηριότητα ήταν στατιστικά σημαντική (HR: 0,50, 95% CI: 0,30 – 0,82) (Πίνακας 3). Μια αντίστροφη συσχέτιση παρατηρήθηκε με τρόπο δόσης-απόκρισης για μη CIMP όγκους (ενδιάμεσο HR φυσική δραστηριότητα: 0.80, 95% CI: 0,61 – 1,04? Υψηλή φυσική δραστηριότητα HR: 0,69, 95% CI: 0,47 – 0,96?

P

-trend = 0.02), ωστόσο, οι ενώσεις με CIMP και μη CIMP όγκοι δεν διέφεραν σημαντικά μεταξύ τους (

P

-heterogeneity = 0,33).

Η

οι Ενώσεις για ένα δείκτη μεθυλίωση του όγκου σε σχέση με ανθρωπομετρικά παραγόντων κινδύνου και τη σωματική δραστηριότητα παρουσιάζονται στον πίνακα 4. δεν υπήρχε σαφής τάση σε σχέση με το βαθμό της μεθυλίωσης, ωστόσο, όταν το πρότυπο ανά 2 μονάδα αύξηση μεγέθους, το μέγεθος του παντελονιού /φούστα συσχετίστηκε με έναν τρόπο δόσης-απόκρισης με όγκους που παρουσιάζουν το υψηλότερο επίπεδο μεθυλίωσης (4-7 γονίδια μεθυλιωμένο HR: 1,29, 95% CI: 1,06 – 1,58?

P

-trend = 0,08)

Συζήτηση

Αυτά τα δεδομένα υποδεικνύουν ότι το σωματικό λίπος των ενηλίκων και το ύψος μπορεί να αυξήσει τον κίνδυνο του CRC, αλλά δεν διαφορικά συνδέονται με CIMP και μη CIMP όγκων. Αντίθετα, ο ΔΜΣ στην ηλικία των 20 μπορεί να είναι ένα ισχυρότερο παράγοντα κινδύνου για όγκους CIMP +. Baseline σωματική δραστηριότητα φαίνεται να μειώνει τον κίνδυνο του CRC ανεξάρτητα από την κατάσταση CIMP.

Ένα μεγάλο πλεονέκτημα αυτής της μελέτης είναι ότι ερευνήσαμε τις ενώσεις σε μια προοπτική ρύθμιση ομάδα. Η NLCS έχει σχεδόν πλήρη διακρίβωση καρκίνο του παχέος εντέρου και πολύ μικρή απώλεια για την παρακολούθηση. Παρά το γεγονός ότι ο αριθμός των συνολικών CRC μετά από 7,3 χρόνια παρακολούθησης στο NLCS ήταν σημαντική, ο αριθμός των κρουσμάτων με τον φαινότυπο CIMP ήταν μικρή. Με περιορισμένη ισχύ για την ανίχνευση ενώσεων, είναι πιθανό ότι ορισμένα ευρήματα προέκυψαν από την τύχη. Ένας άλλος πιθανός περιορισμός της μελέτης είναι ότι οι ανθρωπομετρικές μεταβλητές ελήφθησαν από την αυτο-έκθεση. Ωστόσο, υπάρχουν πολλά παραδείγματα στη βιβλιογραφία που δείχνουν ότι η μέθοδος αυτή είναι ένα έγκυρο και αξιόπιστο εργαλείο για την αξιολόγηση του σωματικού βάρους και του ύψους σε μελέτες κοόρτης [18] – [21].

Για τις γνώσεις μας, τις ενώσεις μεταξύ των δεικτών της ενεργειακή ισορροπία και CIMP κατάσταση των όγκων παχέος εντέρου έχουν αναφερθεί μόνο από Slattery

et al.

σε περίπτωση ελέγχου ρύθμισης [11], [12]. Εκτός από το σχεδιασμό της μελέτης, υπάρχουν διαφορές μεταξύ των μελετών μας, η οποία θα πρέπει να λαμβάνονται υπόψη κατά τη σύγκριση των αποτελεσμάτων.

Η NLCS χρησιμοποιηθεί ο πίνακας Weisenberger των γονιδίων να καθορίσει CIMP (

CACNA1G, IGF2, NEUROG1, RUNX3

και

SOCS1

), ενώ η μελέτη των Slattery

et al.

, χρησιμοποίησε το κλασικό πίνακα (

MINT1, MINT2, MINT31, p16 και hMLH1

) , καθώς και διάφορες cut-οφ για να καθορίσουν CIMP σε όγκους [22], [23]. Το «δικαίωμα» ορισμό της CIMP εξακολουθεί να είναι ένα πολύ συζητημένο θέμα, όπως είναι η ιδανική πάνελ γονιδίων και η κατάλληλη μέθοδος ανίχνευσης μεθυλίωσης [12], [24]. Ενώ ο πίνακας Weisenberger έχει επικυρωθεί, διαφορετικοί δείκτες της μεθυλίωσης μπορεί να είναι περισσότερο ή λιγότερο κατατοπιστική σε σχέση με τη μελέτη διαφορετικές εκθέσεις. Η επικράτηση του CIMP στον πληθυσμό NLCS είναι υψηλότερη από ό, τι στη μελέτη από Slattery

et al

. (27% έναντι 11%) [12]. Ωστόσο, μία διαφορά στο σχεδιασμό εκκινητή και τις συνθήκες της PCR μπορεί να αλλάξει σημαντικά την ευαισθησία και την εξειδίκευση ενός συγκεκριμένου δείκτη για την ανίχνευση CIMP σε CRC [25]. Ως εκ τούτου, είναι πιθανό ότι οι διαφορές στην επικράτηση δεν οφείλονται στις διαφορετικές μεθόδους per se, αλλά μάλλον μια διαφορά στην επιλογή εκκινητών. Η MSP αναλύσεις που έχουν διεξαχθεί σε οι NLCS έχουν ένα σήμα υψηλής ανίχνευσης, και στη συνέχεια, μια υψηλότερη επικράτηση της CIMP έχει παρατηρηθεί. Στην παρούσα μελέτη, προσπαθήσαμε να αποσαφηνίσει τις παρατηρήσεις μας με την κατασκευή ενός δείκτη μεθυλίωση με διαφορετικά σημεία αποκοπής που περιλαμβάνονται επτά γονίδια μεθυλιώνονται συνήθως σε CRC.

Στην παρούσα μελέτη εξετάσαμε του παχέος εντέρου και του ορθού όγκους μαζί για να αυξήσουν στατιστική ισχύ. Μια ανάλυση ευαισθησίας αποκάλυψε ότι αυτό δεν προκατάληψη ευρήματά μας (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Επιπλέον, προτείνουμε ότι η ιδέα του συνδυασμού υπο-εντοπίσεις όγκων μπορεί να είναι αποδεκτό κατά τη μελέτη μοριακών παραμέτρων, γιατί αυτό μπορεί να βοηθήσει να εξηγήσει τις διαφορές στην αιτιολογία σύμφωνα με την υπο-εντοπισμού.

Παρατηρήσαμε ότι ο ΔΜΣ συσχετίστηκε με τόσο όγκο CIMP και μη CIMP όγκων? Ωστόσο, μετά την προσαρμογή για το μέγεθος ρούχα, αυτές οι ενώσεις εξαφανίστηκαν. Αυτό έρχεται σε αντίθεση με τα δεδομένα νομολογία κοόρτη που υποδηλώνει ότι ΔΜΣ σχετίζεται μόνο με CIMP όγκους αρνητικό παχέος εντέρου και του ορθού όχι με όγκους [11], [12]. Στη μελέτη μας, το μέγεθος του παντελονιού /φούστα φαίνεται να είναι ένα ισχυρό, ανεξάρτητο προγνωστικό παράγοντα και των δύο υποτύπων των όγκων, ακόμα και μετά την προσαρμογή ως προς το ΒΜΙ. Αυτό είναι λογικό, γιατί η περίμετρος της μέσης, ένας δείκτης κεντρική παχυσαρκία, είναι ένα ισχυρότερο προγνωστικό δείκτη της CRC από BMI [1], [26]. Όταν θεωρείται ενώσεις σύμφωνα με ένα δείκτη μεθυλίωση, εμείς δεν παρατηρούμε σαφή ενώσεων σε σχέση με το ΔΜΣ και το βαθμό της μεθυλίωσης υποκινητή, όμως, δεν είχαμε παρατηρήσει ότι το μέγεθος του παντελονιού /φούστα συνδέθηκε με το υψηλότερο επίπεδο της μεθυλίωσης. Αυτό που παρατηρήσαμε συσχετίσεις μεταξύ παντελονιού /μεγέθους φούστα και τόσο CIMP και μη CIMP όγκων υποδηλώνει ότι η κεντρική παχυσαρκία μπορεί να επηρεάσει CRC κίνδυνο τόσο μέσω ενός μεθυλίωσης και ένα μονοπάτι μη-μεθυλίωσης.

Παρά το γεγονός ότι πολύ λίγες μελέτες έχουν εξετάσει τις ενώσεις μεταξύ ΔΜΣ και CIMP, ένας αριθμός που θεωρείται τελικά σημεία στην ίδια οδό όπως CIMP. Καρκίνο του παχέος εντέρου έχει ξεχωριστή μοριακή υποσύνολα, τα οποία εξελίσσονται μέσω διαφορετικών οδών [16]. Η πορεία προς την οδοντωτή αδενοκαρκίνωμα φαίνεται να λάβει μία από τις δύο κύριες οδούς: η παραδοσιακή οδοντωτή οδός ή η άμισχα οδοντωτή οδός [27]. Η άμισχα οδοντωτό οδός χαρακτηρίζεται από υψηλό βαθμό CIMP,

BRAF

μεταλλάξεις V600E, και εξελίσσεται τελικά σε μικροδορυφορικού αστάθεια (MSI) [27]. MSI μπορεί να χρησιμεύσει ως δείκτης για CIMP ή άλλα μοριακά γεγονότα στην CRC [28], ως εκ τούτου, μπορεί να είναι κατατοπιστική για να εξετάσει τα ευρήματα της παρούσας μελέτης, στο πλαίσιο της εν λόγω έρευνας. Δύο μελέτες ασθενών-μαρτύρων ανέφεραν ότι ΔΜΣ φαίνεται να σχετίζεται με μικροδορυφόρων σταθερή (MSS) όγκους, και λιγότερο με την MSI όγκους [29], [30]. Ούτε μελέτη ανέφερε ενώσεις σύμφωνα με την περίμετρο της μέσης. Σε μια πρόσφατη συγκεντρωτική ανάλυση των NLCS και τα δεδομένα από την Cohort Study Melbourne Collaborative, παρατηρήσαμε παρόμοιες ενώσεις, αν και η δοκιμή για την ετερογένεια μεταξύ των υποτύπων του όγκου δεν ήταν στατιστικά σημαντική (Hughes

et al.

, Που υποβλήθηκε).

υπάρχουν στοιχεία που δείχνουν ότι τα ανοίγματα σε πρώιμη παιδική ηλικία επηρεάζουν επιγενετικών μηχανισμών που σχετίζονται με τον κίνδυνο των ενηλίκων της νόσου [31], [32]. Ως εκ τούτου, ερευνήσαμε επίσης συσχετίσεις μεταξύ ΔΜΣ σε ηλικία 20 ετών, ο ΔΜΣ αλλαγή, το ύψος και το καθεστώς CIMP. Ύψος είναι ένας δείκτης των συγκεντρωτική εμπειρία του εμβρύου και την παιδική ηλικία, και μπορεί να θεωρηθεί ένα μέτρο μεσολάβησης για σημαντική διατροφική ανοίγματα, που επηρεάζουν διάφορες ορμονικές και μεταβολικές άξονες [17]. Στα NLCS, έχουμε παρατηρήσει ότι η παιδική ηλικία και εφηβική περιορισμός ενέργεια σχετίζεται με μειωμένο κίνδυνο CRC αργότερα στη ζωή [33], [34], το οποίο υποστηρίζεται από άλλες μελέτες που βασίζονται πληθυσμού [35] – [37]. Έχουμε επίσης πρόσφατα ανέφερε ότι η έκθεση σε σοβαρή ενεργειακή περιορισμό κατά την παιδική και εφηβική ηλικία σχετίστηκε με χαμηλό κίνδυνο εμφάνισης όγκων CIMP [32]. Επιπλέον, συγκεντρωτικά δεδομένα δείχνουν ότι ψηλότερο άτομα διατρέχουν μεγαλύτερο κίνδυνο να αναπτύξουν έναν όγκο MSI (Hughes

et al

. Υποβληθεί). Σύμφωνα με την παρούσα μελέτη, το ύψος δεν είναι διαφορικά σχετίζεται με τον κίνδυνο των όγκων, ωστόσο, δεν είχαμε παρατηρήσει σημαντική ετερογένεια σε σχέση με ΔΜΣ σε ηλικία 20 ετών και όγκου υποτύπους. Στο σύνολό τους, τα ευρήματά μας δείχνουν ότι το μέγεθος του σώματος μπορεί να επηρεάσει διαφορετικά την κατάσταση CIMP κατά τη διάρκεια διαφορετικών περιόδων της ζωής, που ενδεχομένως επηρεάζουν αργότερα CRC κίνδυνο. Η συσχέτιση μεταξύ του ΔΜΣ σε ηλικία 20 ετών και οι όγκοι CIMP ήταν ισχυρότερη από ό, τι με μη CIMP όγκων, η οποία είναι σύμφωνη με τα προηγούμενα ευρήματα για σοβαρές ενέργειας περιορισμό κατά την παιδική ηλικία και την εφηβεία. Αν και η μέθοδος bootstrapping μας είναι αρκετά συντηρητική, εμείς δεν παρατηρούμε μια σαφή συσχέτιση σε σχέση με ΔΜΣ σε ηλικία 20 ετών και ο δείκτης μεθυλίωση και ως εκ τούτου, δεν μπορούμε να αποκλείσουμε ότι η διαφορική σύνδεση με την κατάσταση CIMP είναι ένα τυχαίο εύρημα. Η υπόθεση ότι η χρονική στιγμή της έκθεσης μπορεί να επηρεάσει επιγενετικών μηχανισμών απαιτεί περαιτέρω διερεύνηση.

Αυτό δεν παρατηρήσαμε καμία σαφή συσχέτιση μεταξύ της αλλαγής του ΔΜΣ και του κινδύνου των όγκων ήταν έκπληξη. Αυτό μπορεί να υποδεικνύει ότι οι μεταβολικές αλλαγές στο λίπος μπορεί να είναι πιο σημαντικό για τη διαμόρφωση κίνδυνο την πάροδο του χρόνου, παρά ΔΜΣ. Εναλλακτικά, θεωρώντας άνδρες και γυναίκες μαζί μπορεί να έχουν εξασθενημένο αυτές τις παρατηρήσεις. Campbell

et al.

Αναφέρουν ότι αύξηση του σωματικού βάρους των ενηλίκων σχετίστηκε με CRC στους άνδρες, αλλά όχι στις γυναίκες, και μόνο σε σχέση με τα άτομα που πήραν περισσότερα από 21 κιλά από την ηλικία των 20 ετών [29]. Τέλος, λαμβάνοντας υπόψη μόνο τα δύο χρονικά σημεία μπορεί να μην είναι ενδεικτική της πραγματικής αλλαγής ΔΜΣ.

Τα ευρήματά μας σε σχέση με τη σωματική δραστηριότητα υποστήριξη εκείνων των Slattery

et al.

[11], και δείχνουν ότι η υψηλή τα επίπεδα της καθημερινής άσκησης που συνδέεται με μειωμένο κίνδυνο τόσο CIMP και μη CIMP όγκων. Παρατηρήσεις σε σχέση με το δείκτη μεθυλίωση μας δείχνουν ότι η σωματική δραστηριότητα μπορεί να είναι πιο προστατευτικά των όγκων με την αύξηση της μεθυλίωσης, αλλά απαιτείται περισσότερη έρευνα πριν μπορούν να εξαχθούν ασφαλή συμπεράσματα.

Τα προκαταρκτικά στοιχεία δείχνουν ότι μοριακών δεικτών μπορεί να χρησιμοποιηθεί για να ταξινομήσει του παχέος εντέρου σε διακριτούς υποτύπους, που έχουν επιπτώσεις τόσο για την αιτιολογία και πρόληψη [28]. Λιγότερα όγκοι προκύπτουν από την άμισχα οδοντωτή οδό σε σύγκριση με την παραδοσιακή οδό αδένωμα [27], [38]. Όπως το υπερβολικό βάρος και η παχυσαρκία είναι τόσο ισχυρή παράγοντες κινδύνου για CRC, υπάρχει μια πιθανότητα ότι οι όροι αυτοί μπορεί να διαφορικά κίνδυνο επιρροή μέσω μονοπατιών και μοριακούς μηχανισμούς, εκτός από αυτό που διερευνώνται εδώ. Απαιτείται περισσότερη έρευνα για να διευκρινιστεί η σχέση μεταξύ των δεικτών του ενεργειακού ισοζυγίου και επιγενετικών μηχανισμών που οδηγούν σε CRC? κατά προτίμηση σε μια προοπτική ρύθμιση ομάδα, με πολλές περιπτώσεις [39]. Επιπλέον, όπως στον τομέα της μοριακής επιδημιολογίας παθολογικών [40] συνεχίζει να εξελίσσεται, την τυποποίηση των μεθόδων και των ορισμών των μοριακών παραμέτρων θα πρέπει να αντιμετωπιστούν. Αυτό θα γίνει ιδιαίτερα κρίσιμη καθώς περισσότερες ευκαιρίες για τη συγκέντρωση προκύψουν στοιχεία.

Εν κατακλείδι, τα ευρήματά μας υποδεικνύουν ότι τα μέτρα της ανθρωπομετρία αντανακλούν ένα μεγάλο μέγεθος του σώματος αυξάνει τον κίνδυνο τόσο CIMP και μη CIMP όγκων, και ότι το σωματικό λίπος σε νεαρή ηλικία μπορεί να διαφορικά κίνδυνο επιρροή. Η σωματική δραστηριότητα φαίνεται να μειώνουν τον κίνδυνο της CRC ανεξάρτητα από αυτές τις μοριακές υποτύπους. Οι παρατηρήσεις μας επαναλαμβάνουν τη σημασία ενός υγιούς σωματικού βάρους σε σχέση με την γενική πρόληψη της CRC.

Υλικά και Μέθοδοι

πληθυσμούς Μελέτη και σχεδιασμός

Το NLCS είναι μια προοπτική μελέτη κοόρτης ότι ξεκίνησε το 1986 για να ερευνήσει τη σχέση μεταξύ της διατροφής και της ανάπτυξης του καρκίνου. Περιλαμβάνει 58.279 άνδρες και 62.573 γυναίκες μεταξύ των ηλικιών 55-69 ετών κατά την έναρξη οι οποίοι συμπλήρωσαν ένα αυτοσυμπληρούμενο ερωτηματολόγιο συχνότητας κατανάλωσης τροφίμων που περιλαμβάνει 150 είδη διατροφής, καθώς και ζητήματα σχετικά με τις διατροφικές συνήθειες, τον τρόπο ζωής, την υγεία, και τα δημογραφικά στοιχεία. Δημοτικό μητρώα από όλη την Ολλανδία είχαν χρησιμοποιηθεί για να αποτελέσουν ένα αποτελεσματικό πλαίσιο δειγματοληψίας. Η NLCS χρησιμοποιεί μια υπόθεση – προσέγγιση ομάδα για την επεξεργασία και ανάλυση των δεδομένων? υποκείμενα περίπτωση προήλθαν από το σύνολο της κοόρτης, και ο αριθμός του ατόμου-χρόνου σε κίνδυνο για το σύνολο της κοόρτης εκτιμήθηκε από μια υπο κοόρτη 5000 άνδρες και γυναίκες που είχαν τυχαία δείγματα από την πλήρη κοόρτη στη βασική γραμμή. Όλα τα επιμέρους μέλη της ομάδας που αναφέρθηκε καρκίνο επικρατεί (με εξαίρεση τον καρκίνο του δέρματος) κατά την έναρξη αποκλείστηκαν από τις αναλύσεις, αφήνοντας 4654. Περαιτέρω λεπτομέρειες του σχεδιασμού NLCS έχουν περιγραφεί [41] – [43].

περιπτώσεις περιστατικών CRC ήταν που προσδιορίζονται από ετήσια εγγραφή σύνδεση με εννέα περιφερειακά μητρώα καρκίνου και σε εθνική βάση δεδομένων παθολογίας (PALGA) [44]. Η πληρότητα του καρκίνου παρακολούθησης είναι σχεδόν 100% [45]. Παραφίνη ενσωματωμένο υλικό όγκου από ασθενείς με CRC ανακτήθηκε, όπως περιγράφηκε προηγουμένως [46]. Συνολικά, 734 περιστατικό ασθενείς CRC προσδιορίστηκαν από μια περίοδο παρακολούθησης 7,3 χρόνια μετά την έναρξη της μελέτης, με εξαίρεση τα 2 πρώτα χρόνια της παρακολούθησης, εκ των οποίων μια έκθεση PALGA της βλάβης, καθώς και επαρκή DNA ήταν διαθέσιμο [46].

το πρωτόκολλο της μελέτης εγκρίθηκε από τις επιτροπές Ηθικής Ιατρικής του Πανεπιστημιακού Νοσοκομείου του Μάαστριχτ και TNO Nutrition. Για τις προσλήψεις, οι συμμετέχοντες ενημερώθηκαν εγγράφως για τα στοιχεία της μελέτης και των στόχων της. Σύμφωνα με τους κανονισμούς εκείνη τη στιγμή, γραπτή συγκατάθεση λήφθηκε όταν οι συμμετέχοντες επέστρεψαν το συμπληρωμένο ερωτηματολόγιο βασικής γραμμής. υλικό όγκου συλλέχθηκαν μετά από έγκριση από τις ηθικές συμβούλια αναθεώρηση του Πανεπιστημίου του Μάαστριχτ, το Εθνικό Μητρώο Καρκίνου, και PALGA.

Διαπίστωση των παραγόντων κινδύνου

Ανθρωπομετρικές μεταβλητές.

Ύψος ( cm), το σωματικό βάρος (kg), και το σωματικό βάρος σε ηλικία 20 ετών (kg) ήταν αυτο-αναφερόμενη στο ερωτηματολόγιο βασικής γραμμής. Από αυτές τις μεταβλητές, ΔΜΣ και ΔΜΣ σε ηλικία 20 ετών, και ο ΔΜΣ αλλαγής στη συνέχεια υπολογίστηκε. Κατά την έναρξη, τα άτομα κλήθηκαν επίσης να αναφέρουν κάτω μέρος του σώματος τους (παντελόνι ή φούστα) μέγεθος ρούχα από την ετικέτα ρούχα τους (ολλανδική μεγέθη). μέγεθος παντελόνι /φούστα έχει αποδειχθεί ότι είναι ένα κατάλληλο μέτρο μεσολάβησης για περίμετρο μέσης κατά την πρόβλεψη του κινδύνου καρκίνου στο NLCS, και λεπτομέρειες για το πώς μέγεθος ρούχα αντιστοιχεί σε μετρήσεις της μέσης στους άνδρες και τις γυναίκες σε αυτή ολλανδικού πληθυσμού έχει δημοσιευθεί [47]. ΔΜΣ, ο ΔΜΣ σε ηλικία 20 ετών, φούστα /μέγεθος του παντελονιού, και το ύψος κατηγοριοποιήθηκαν σε περίπου φύλο τεταρτημόρια. Όπως και στις προηγούμενες NLCS αναλύσεις, BMI αλλαγή κατηγοριοποιούνται ως εξής: » Η αναφερόμενη χρόνος που δαπανάται ανά ημέρα ήταν κατηγοριοποιούνται σε ≤10, » Η απάντηση δυνατότητες δεν ήταν ποτέ, & lt? 1 ώρα την εβδομάδα, 1-2 ώρες την εβδομάδα και & gt? 2 ώρες την εβδομάδα. Ο χρόνος που δαπανάται για αυτές τις δραστηριότητες και τα λεπτά που δαπανάται ανά ημέρα για το περπάτημα ή το ποδήλατο για να εργαστούν, να πάτε για ψώνια ή για να πάρουν το σκυλί ήταν αθροίζονται για να αποκτήσουν μια συνολική μέτρηση της βασικής γραμμής μη-επαγγελματική φυσική δραστηριότητα, με τις κατηγορίες & lt? 30, & gt ? 30-60, & gt? 60-90 και & gt? 90 λεπτά ανά ημέρα. Χαμηλή σωματική δραστηριότητα ορίζεται ως & lt? 30 λεπτά /ημέρα, ενδιάμεσα όπως 30-90 λεπτά /ημέρα, και πιο ψηλά & gt? 90 λεπτά /ημέρα

Ανάδοχος Αναλύσεις μεθυλίωσης

CIMP στον όγκο. ιστό των περιπτώσεων CRC ορίστηκε από CpG υπερμεθυλίωση νησί υποστηρικτής τουλάχιστον 3 από τα 5 δεικτών μεθυλίωσης (

CACNA1G, IGF2, NEUROG1, RUNX3

και

SOCS1

), όπως προτείνεται από Weisenberger

et al.

[9] προσδιορίστηκαν με όξινο θειώδες τροποποίηση των 500 ng γονιδιωματικού DNA χρησιμοποιώντας ένα εμπορικά διαθέσιμο κιτ (Zymo Research), και επακόλουθη μεθυλίωση ειδική PCR (MSP) [50], [51]. Επιλέξαμε να χρησιμοποιήσουμε MSP ως μέθοδο επειδή είναι αποτελεσματικό, συγκεκριμένο και δεν απαιτεί ειδικό εξοπλισμό. Έχει αποδειχθεί ότι τα αποτελέσματα από MSP είναι σύμφωνα με άλλες τεχνολογίες, όπως MethyLight [52]. Επιπλέον, η κατάσταση μεθυλίωσης των δύο άλλων γονιδίων,

APC

και

MLH1

, προσδιορίστηκαν και εμείς τους προστίθενται στα δείκτες CIMP για να δημιουργήσετε ένα ευρετήριο μεθυλίωση των επτά γονιδίων.

για να διευκολυνθεί η ανάλυση MSP επί του DNA ανακτάται από σταθεροποιημένο με φορμαλίνη, εγκλεισμένο σε παραφίνη ιστό, ΟΝΑ ενισχύθηκε πρώτα με συνοδευτικά εκκινητών PCR που ενισχύουν διθειώδες-τροποποιημένο DNA, αλλά δεν ενισχύουν επιλεκτικά μεθυλιωμένο ή μη μεθυλιωμένο DNA. Το προκύπτον θραύσμα χρησιμοποιήθηκε ως μήτρα για την αντίδραση MSP. Όλες οι PCR διεξήχθησαν με ελέγχους για μη μεθυλιωμένων αλληλίων (DNA από φυσιολογικά λεμφοκύτταρα), μεθυλιωμένα αλλήλια [κανονικό DNA λεμφοκυττάρων αντιμετωπίζονται

in vitro

με

Sss

Ι μεθυλοτρανσφεράση (New England Biolabs, Ipswich, ΜΑ )] και ένας έλεγχος χωρίς DNA. Δέκα μικρόλιτρα κάθε αντίδρασης MSP άμεσα φορτωμένο σε μη μετουσιωτικά πηκτώματα πολυακρυλαμιδίου 6% που βάφτηκε με βρωμιούχο αιθίδιο και έγινε ορατό κάτω από φωτισμό UV. Οι αναλύσεις MSP ήταν επιτυχής για το 81%, 79%, 79%, 90%, 83%, 93% και 93% από τις 734 υποθέσεις για

CACNA1G, IGF2, NEUROG1, RUNX3, SOCS1

,

MLH1

, και

APC

αντίστοιχα.

Στατιστικές αναλύσεις

τα δεδομένα αναλύθηκαν με Stata (version 10, StataCorp, College Station, TX, USA). Cox ανάλυση αναλογικών κινδύνων χρησιμοποιώντας την προσέγγιση νομολογία ομάδα χρησιμοποιήθηκε για την απόκτηση αναλογίες κινδύνου (HR) και τα διαστήματα εμπιστοσύνης 95% (CI) για τη σύνδεση μεταξύ των μέτρων του σωματομετρήσεις και στην φυσική δραστηριότητα και CRC χαρακτηρίζεται από το καθεστώς CIMP. Για τη βελτίωση της στατιστικής ισχύος, θεωρήσαμε άνδρες και γυναίκες μαζί. Δοκιμές για την τροποποίηση επίδραση του φύλου δεν ήταν στατιστικά σημαντικές. Η υπόθεση αναλογικών κινδύνων ελέγχθηκε με τη χρήση των κλιμακωθεί κατάλοιπα Schoenfeld και οπτική επιθεώρηση των καμπυλών κινδύνου. Για να ληφθεί υπόψη για την πρόσθετη διακύμανσης που θεσπίστηκε με δειγματοληψία του subcohort από ολόκληρη την ομάδα, τα τυπικά σφάλματα υπολογίστηκαν χρησιμοποιώντας την ισχυρή επιλογή. Η στατιστική σημαντικότητα ελέγχθηκε στο επίπεδο 0.05.

Για όλες τις ανθρωπομετρικές μεταβλητές αυτές, θεωρήθηκαν τρία μοντέλα. Η πρώτη προσαρμόστηκε μόνο για την ηλικία και το φύλο. Η δεύτερη πρόσθετη προσαρμογή ως προς τις μεταβλητές που προσδιορίζονται ως συνδεόμενα με τόσο CRC και ενεργειακό ισοζύγιο από την προηγούμενη βιβλιογραφία. Αυτά περιλαμβάνονται το οικογενειακό ιστορικό CRC (ναι /όχι), το κάπνισμα (ποτέ καπνιστής, πρώην καπνιστής, καπνιστής), κοινωνικοοικονομική θέση (επίπεδο εκπαίδευσης: το δημοτικό σχολείο, γυμνάσιο, λύκειο, ανώτερη επαγγελματική σχολή, ή το πανεπιστήμιο ), η συνολική πρόσληψη ενέργειας (kcal /ημέρα), η κατανάλωση αλκοόλ (0, 0,1-4, 5-14, 15-29, ≥30 g /ημέρα), η σωματική δραστηριότητα (χαμηλή, μεσαία, υψηλή όπως περιγράφηκε προηγουμένως), και την κατανάλωση κόκκινο κρέας, τα φρούτα, τα λαχανικά, και τα δημητριακά (g /ημέρα). Τέλος, τα μοντέλα ήταν αμοιβαία προσαρμογή για άλλες ανθρωπομετρικές μεταβλητές. Μοντέλα, συμπεριλαμβανομένων ΔΜΣ και ΔΜΣ σε ηλικία 20 ετών ήταν αμοιβαία προσαρμογή για το μέγεθος φούστα /παντελόνι, BMI αλλαγή προσαρμόστηκε για ΔΜΣ σε ηλικία 20 ετών, το μέγεθος του παντελονιού /φούστα προσαρμόστηκε ως προς το ΒΜΙ, και το ύψος προσαρμόστηκε για το σωματικό βάρος.

έχουμε πρότυπο σωματική δραστηριότητα προσαρμοστεί για την ηλικία και το φύλο, και επιπλέον προσαρμοσμένο για παντελονιού /μέγεθος φούστα, οικογενειακό ιστορικό CRC (ναι /όχι), το κάπνισμα κατάσταση (ποτέ καπνιστής, πρώην καπνιστής, καπνιστής), κοινωνικοοικονομική θέση (επίπεδο εκπαίδευσης: δημοτικό σχολείο, γυμνάσιο, λύκειο, ανώτερη επαγγελματική σχολή, ή το πανεπιστήμιο), η συνολική πρόσληψη ενέργειας (kcal /ημέρα), η κατανάλωση αλκοόλ (0, 0,1-4, 5-14, 15-29, ≥30 g /ημέρα ), το μέγεθος ρούχα, και την κατανάλωση κόκκινου κρέατος, φρούτα, λαχανικά και φυτικές ίνες (g /ημέρα).

Για να αξιολογήσει πώς τα μέτρα της σωματομετρήσεις και στην φυσική δραστηριότητα συνδέθηκαν με την έκταση της μεθυλίωσης προαγωγού στους όγκους CRC , χρησιμοποιήσαμε το προαναφερόμενο δείκτη μεθυλίωση για την κατηγοριοποίηση των περιπτώσεων σε μία από τις τρεις ομάδες: «0-1 γονίδια μεθυλιωμένο ‘,’ 2-3 γονίδια μεθυλιωμένο», ή «4-7 γονίδια μεθυλιωμένο». Από τις 734 περιπτώσεις, 556 είχαν επαρκείς πληροφορίες για να ταξινομηθεί σε μία από τις τρεις κατηγορίες. Μοντέλα συμπεριλαμβανομένων ανθρωπομετρικές μεταβλητές προσαρμόστηκαν ως προς την ηλικία, το φύλο, και αμοιβαία προσαρμογή για άλλες ανθρωπομετρικές μεταβλητές όπως περιγράφηκε προηγουμένως, και το μοντέλο για τη σωματική δραστηριότητα ρυθμίστηκε για την ηλικία και το φύλο.

Οι δοκιμές για την ετερογένεια έγιναν για την αξιολόγηση των διαφορών μεταξύ των υποτύπων των όγκων (π.χ.,

CIMP εναντίον μη CIMP

) χρησιμοποιώντας την ανταγωνιστική διαδικασία κινδύνους στο STATA. Ωστόσο, η SE για τη διαφορά των δεικτών log-κινδύνου από τη διαδικασία αυτή προϋποθέτει την ανεξαρτησία των δύο εκτιμάται αναλογίες κινδύνου, η οποία θα υπερεκτιμούν ότι SE και έτσι υπερεκτιμούν τις

P

τιμές για τη διαφορά τους. Ως εκ τούτου, αυτά τα

P

αξίες και τις συναφείς διαστήματα εμπιστοσύνης υπολογίστηκαν με βάση μια μέθοδο bootstrapping που αναπτύχθηκε για το σχεδιασμό υπόθεση-ομάδα, όπως περιγράφηκε προηγουμένως [53]. Κάθε bootstrap ανάλυση βασίστηκε σε 1000 επαναλήψεις.

Ευχαριστίες

Είμαστε υπόχρεοι στους συμμετέχοντες της μελέτης αυτής και να ευχαριστήσω τα μητρώα καρκίνου (ΙΚΑ, IKL, IKMN, IKN, IKO, IKR, IKST , IKW, IKZ, και VIKC) και η Ολλανδία Nationwide Μητρώο Παθολογίας (PALGA). Μπορούμε επίσης να ευχαριστήσω S van de Crommert και J Nelissen για τη βοήθειά τους με την εισαγωγή δεδομένων και τη διαχείριση των δεδομένων? Ένα Volovics και Α Kester για στατιστικούς συμβουλές? L Schouten, C de Zwart, Μ Moll, W van Dijk, Μ Jansen και Α Pisters για βοήθεια? και H van Montfort, Τ van Moergastel, L van den Bosch, και R Schmeitz για τον προγραμματισμό? Κ Wouters, S Hulsmans και Α Spiertz για εργαστηριακή υποστήριξη.