Αφηρημένο

Ρυθμιστικές Τ κύτταρα (Tregs) διαδραματίζουν ουσιαστικό ρόλο στη διατήρηση αυτο-ανοχή και ανοσολογική ομοιόσταση. Παρά τις πολλές μελέτες για τη συσχέτιση μεταξύ της συσσώρευσης Tregs και την ηλικία, ή κακοήθειες, η σχετική μηχανισμός δεν έχει εξερευνηθεί. Για να μάθετε το μηχανισμό της συσσώρευσης Tregs σε ηλικιωμένους καρκίνο ουροδόχου κύστης, εξετάσαμε το νέο γονίδιο κυτταρική senesence

SENEX

και σχετική έκφραση του mRNA του γονιδίου της απόπτωσης σε ταξινομημένο CD4 + CD25

hi Tregs από ηλικίας δότες UBC, αξιολογήθηκαν προφίλ κυτοκινών στον ορό σχετίζονται με ανοσοπαθολογία όγκου και περαιτέρω διερεύνησε τη σχέση μεταξύ του

SENEX

έκκριση της έκφρασης, τη γονιδιακή έκφραση απόπτωση και κυτοκινών. Αφού σιγήσει κάτω έκφραση γονιδίου SENEX με παρεμβολή RNA, αξιολογήσαμε επίσης την κυτταρική απόπτωση των Tregs διαλέγεται από ηλικιωμένους ασθενείς UBC σε απόκριση H

2O

2 μεσολάβηση στρες. Τα στοιχεία μας έδειξαν ότι απορυθμίζεται

SENEX

έκφραση mRNA σε Tregs των ηλικιωμένων ασθενών UBC συσχετίστηκε με προ-αποπτωτικών γονιδιακή έκφραση και συγκέντρωση κυτοκινών. Φίμωση

SENEX

γονιδιακής έκφρασης αυξημένη κυτταρική απόπτωση και προ-αποπτωτικών γονιδίων έκφραση Tregs, σε απάντηση H

2O

2 μεσολάβηση του στρες. Προς τα πάνω ρυθμισμένη

SENEX

έκφραση mRNA μαζί με μειωμένη προ-αποπτωτικών γονιδιακή έκφραση και διαταραχές στη σύνθεση κυτοκίνες μπορεί να συμβάλλουν στον πολλαπλασιασμό Tregs και να προωθήσει την ογκογένεση και τη μετάσταση. Συνολικά, προς τα πάνω ρύθμιση του γονιδίου κυτταρικής γήρανσης

SENEX

, συνδέθηκε με ρυθμιστικές συσσώρευση Τ κυττάρων σε ηλικιωμένους καρκίνο της ουροδόχου κύστεως. Η μελέτη μας παρέχει μια νέα εικόνα για την κατανόηση της περιφερικής συσσώρευσης Tregs σε ηλικιωμένους κακοήθειες

Παράθεση:. Chen Τ, Wang Η, Zhang Ζ, Li Q, Yan Κ, Τάο Q, et al. (2014) A Novel κυτταρική γήρανση Gene,

SENEX

, συμμετέχει σε περιφερειακές ρυθμιστικά κύτταρα Τ Συσσώρευση σε Ηλικιωμένων καρκίνο της ουροδόχου κύστεως. PLoS ONE 9 (2): e87774. doi: 10.1371 /journal.pone.0087774

Επιμέλεια: Pranela Rameshwar, Rutgers – New Jersey Medical School, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 3 Σεπτεμβρίου 2013? Αποδεκτές: 30 Δεκέμβρη του 2013? Δημοσιεύθηκε: 5 Φεβρουαρίου, 2014

Copyright: © 2014 Chen et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτή η μελέτη υποστηρίχθηκε από το Εθνικό Ίδρυμα Φυσικών Επιστημών της Κίνας (Item No. 81141104, Αρ 81272259), και Ίδρυμα Φυσικών Επιστημών της επαρχίας Anhui (σημείο No.11010402168). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Ρυθμιστικές Τ κύτταρα (Tregs) διαδραματίζουν ουσιαστικό ρόλο στη διατήρηση αυτοανοχή και του ανοσοποιητικού ομοιόστασης καταστέλλοντας μια ευρεία ποικιλία των φυσιολογικών και παθολογικών ανοσολογικών αποκρίσεων έναντι εαυτού και nonself, καθώς και καρκινικά αντιγόνα οιονεί αυτο [1 ], [2]. Προσληφθεί σε ιστούς όγκων, Tregs επεκτείνουν και ενεργοποιούνται σε καρκινικούς ιστούς και στα λεμφογάγγλια παροχέτευσης, καταστέλλουν τα κατά του όγκου ανοσοαποκρίσεων [3]. Έχει βρεθεί ότι το περιφερικό αίμα CD4 + CD25 + Tregs συσσωρεύονται δραματικά σε υγιείς ηλικιωμένους ανθρώπους και τρωκτικά [4] – [5]. Η αύξηση των Tregs αναλογία συμβάλλει στη σχετιζόμενη με την ηλικία ανοσοκαταστολή, αυξάνει την ευαισθησία σε λοιμώδη νοσήματα και τον καρκίνο [6]. Περαιτέρω, αύξηση του αριθμού των Tregs έχουν παρατηρηθεί σε ασθενείς με καρκίνο ουροδόχου κύστης (UBC), με την έκφραση του όγκου του FoxP3, ενός δείκτη ειδικού Tregs, συσχετίζεται με κλινική πρόγνωση [7]. Η ενδονεοπλασματική συσσώρευση των Tregs έχουν επίσης παρατηρηθεί σε καρκίνο του παχέος εντέρου, γλοίωμα και ηπατοκυτταρικό καρκίνωμα [8] – [10]. Καταστολή της απόκρισης κατά του όγκου, αυτές οι συσσωρευμένες ενδοογκική Tregs βρέθηκε να σχετίζεται με φτωχή πρόγνωση [8] – [10]. Παρ ‘όλες τις παραπάνω ερευνητικές προσπάθειες, οι λεπτομερείς μηχανισμοί δεν έχουν καλά διευκρινιστεί. Μια πρόσφατη μελέτη προσεγγίζει συσσώρευση Tregs από μια νέα προοπτική, αναφέροντας ότι η κυτταρική απόπτωση εμπλέκεται σε συσσώρευση Tregs στη διαδικασία της γήρανσης. Μετά από 24 ώρες σε καλλιέργεια, Tregs από γηραιά ζώα πέθαναν σημαντικά μικρότερη κατά τη διάρκεια αυτής της δοκιμασίας από ό, τι Tregs από νεαρά ποντίκια, υποδηλώνοντας ότι Tregs από ηλικιωμένα ποντίκια είναι πιο ανθεκτικά σε απόπτωση [11]. Ωστόσο, δεν έχουν ακόμη διερευνηθεί οι μηχανισμοί που βρίσκονται πίσω την αντοχή τους σε απόπτωση σε ηλικιωμένους ανθρώπους, ειδικά σε ασθενείς με καρκίνο ηλικίας.

Πρόσφατες μελέτες κατέδειξαν ότι οι προς τα πάνω ρυθμισμένη κυτταρική senesence μπορεί να συνεισφέρει στην αντίσταση απόπτωση των γηρασμένων ανθρώπινων κυττάρων. Μια έρευνα έχει κάνει την ταυτοποίηση ενός νέου γονιδίου,

SENEX

, που ρυθμίζει προκαλείται από το άγχος πρόωρη γήρανση οδών (SIPS) σε ενδοθηλιακά κύτταρα (ECS) [12]. Είναι ενδιαφέρον ότι, αυτά τα γηρασμένα κύτταρα που επάγονται από

SENEX

είναι ανθεκτικά σε παράγοντα νέκρωσης όγκου (TNF-α) επαγόμενη απόπτωση [12]. Επιπλέον, υπό ορισμένες συνθήκες, ορισμένοι γηρασμένα κύτταρα θα μπορούσαν ακόμη και να αλλάξει φαινοτύπων τους σε αντίθετη καταγωγές. Νέο μηχανισμό αποκαλύπτει ότι η ανθρώπινη Tregs θα μπορούσε να προκαλέσει γήρανση αλλά όχι απόπτωση σε αποκριτικά αφελή και δραστικά Τ κύτταρα [13]. Αυτά τα γηρασμένα ανταπόκρισης Τ κυττάρων που επάγεται από Tregs αλλάξουν φαινοτύπους τους και τα προφίλ κυτοκίνης, και διαθέτουν ισχυρή κατασταλτική λειτουργία. Μεγάλη προσοχή έχει πρόσφατα δοθεί στην κυτταρική γήρανση, ωστόσο, ο πιθανός ρόλος της γονιδιακής έκφρασης γήρανση σε ασθενείς ηλικίας καρκίνο που εμπλέκονται στην συσσώρευση Tregs παραμένει σε μεγάλο βαθμό άγνωστη.

Για να αναλύσουμε την πιθανή συνεισφορά της έκφρασης γήρανση και γονιδίων της απόπτωσης σε περιφερειακές Tregs συσσώρευση σε ηλικιωμένους κακοήθειες, έχουμε κατ ‘αρχάς ταξινομημένο CD4 + CD25

hi Tregs σε ηλικιωμένους ασθενείς UBC, και στη συνέχεια εξέτασαν τα μεταγραφικά επίπεδα έκφρασης του mRNA σχετικών γονιδίων σε ταξινομημένο CD4 + CD25

hi Tregs. Επιπλέον, τα προφίλ κυτοκινών στον ορό σχετίζονται με ανοσοπαθολογία όγκου αξιολογήθηκαν ως έμμεση αξιολόγηση για τη λειτουργία των Τ κυττάρων. Εκτιμήσαμε επίσης τη σχέση μεταξύ γονιδίων γήρανση

SENEX

έκκριση έκφρασης mRNA και κυτοκινών. Στη συνέχεια, αξιολογήσαμε την κυτταρική απόπτωση των βραχυπρόθεσμων καλλιεργημένα Tregs από ηλικιωμένους ασθενείς UBC σε απόκριση H

2O

2 μεσολάβηση στρες μετά

SENEX

γονιδιακή έκφραση σίγησε με παρεμβολή RNA. Τα δεδομένα μας προσκόμισε αποδεικτικά στοιχεία που ρυθμίζεται προς τα πάνω

SENEX

έκφραση mRNA σε Tregs των ηλικιωμένων ασθενών UBC συσχετίστηκαν με τη συγκέντρωση κυτοκινών και έκφραση του γονιδίου προ-αποπτωτικών. Φίμωση

SENEX

γονιδιακής έκφρασης αυξημένη κυτταρική απόπτωση και η έκφραση προ-αποπτωτικών γονιδίων σε βραχυπρόθεσμη καλλιεργούνται Tregs, σε απάντηση H

2O

2 μεσολάβηση του στρες. Προς τα πάνω ρυθμισμένη

SENEX

έκφραση mRNA μαζί με μειωμένη προ-αποπτωτικών γονιδιακή έκφραση και διαταραχές στη σύνθεση των κυτοκινών μπορεί να ευθύνεται για τον πολλαπλασιασμό των Tregs και να προωθήσει την ογκογένεση και τη μετάσταση. Συμπερασματικά, η μελέτη μας παρέχει μια νέα εικόνα για την κατανόηση της περιφερικής συσσώρευσης Tregs σε ηλικιωμένα κακοήθειες.

Υλικά και Μέθοδοι

Ηθική Δήλωση

Όλοι οι συμμετέχοντες υπέγραψαν υπόμνημα γραπτών ενημέρωσε συγκατάθεση. Οι διαδικασίες που περιγράφονται σε αυτή τη μελέτη είχαν εγκριθεί από την επιτροπή δεοντολογίας του δεύτερου Νοσοκομείου Anhui Medical University.

Οι ασθενείς και υγιείς δότες

περιφερικού αίματος (PB) δείγματα από 38 ηλικίας ασθενείς UBC (62 έως 79 ετών, με μέσο όρο ηλικίας 70.13), 34 ηλικίας υγιείς μάρτυρες (60 έως 74 ετών, με μέσο όρο ηλικίας 68,72) και 37 νέους υγιείς μάρτυρες (22 έως 56 ετών, με μέσο όρο ηλικίας 43.25) εξετάστηκαν σε δεύτερο Νοσοκομείο Anhui Medical University 2010-2.013. Κανένας από τους ασθενείς έλαβαν αντικαρκινική θεραπεία πριν να είναι εγγεγραμμένοι. Σύμπτωση των αυτοάνοση νόσο, τον ιό της ανθρώπινης ανοσοανεπάρκειας (HIV) και σύφιλη αποκλείστηκε για όλα τα εγγεγραμμένα άτομα. Κλινική σταδιοποίηση έγινε μετά την προεγχειρητική ακτινολογική εξέταση και κλινικές παραμέτρους σε συνδυασμό με παθολογική εξέταση των δειγμάτων διουρηθρική εκτομή σύμφωνα με την ταξινόμηση ΤΝΜ του 1997 (Ένωση Internationale Contre Καρκίνου le).

Αντισώματα και κυτταρομετρία ροής

Τα ακόλουθα μονοκλωνικά αντισώματα (mAbs) ειδικά για επιφανειακά αντιγόνα του ανθρώπου αγοράστηκαν από την Beckman Coulter-Immunotech (Marseille, France): φυκοερυθρίνη (ΡΕ) αντισώματα αντι-CD4 (κλώνος 13B8.2)? ισοθειοκυανική φλουορεσκεΐνη (FITC), συζευγμένης αντι-CD25 (κλώνος B1.49.9)? Peridinin χλωροφύλλη Πρωτεΐνη-Cychrome5.5 (PerCP-Cy5.5) συζευγμένο αντι-CD127 (SK3 κλώνος)? κιτ αντιδραστηρίου τρίχρωμο για Tregs περιέχουν από ΡΕ-συζευγμένο αντι-CD4, FITC-συζευγμένο αντι-CD25, και PerCP-Cy5.5-συζευγμένο αντι-127 (UCHT1, 13B8.2 και B911 κλώνος)? και αντίσωμα ελέγχου ισοτύπου του. BU-αννεξίνης V-FITC Apoptosis Detection Kit (Biouniquer Nanjing, Κίνα) χρησιμοποιήθηκαν για την εκτίμηση Treg κυτταρική απόπτωση. Τα κύτταρα αναλύονται και ταξινομούνται χρησιμοποιώντας ροής Coulter Epics XL κυτταρομετρητή (FCM) με το λογισμικό του συστήματος ΙΙ και COULTER EPICS ALTRA HyPerSortTM Σύστημα με expo 32 multicomp Λογισμικού (Beckman Coulter, Miami, FL, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής).

Εξέταση των Περιφερειακών CD4 + CD25 + CD127

χαμηλή κύτταρα

Περίπου 2-5 ml από ΡΒ συλλέχθηκαν. Όλα τα δείγματα υποβλήθηκαν σε αντιπηκτική θεραπεία με ηπαρίνη και εξετάστηκαν μέσα σε 4 ώρες. Περίπου 100 μΐ αντι-πηγμένο αίμα επωάστηκε στους 25 ° C για 15 λεπτά με 5 μΙ FITC-συζευγμένο CD25-ειδικό mAb, 5 ul ΡΕ-συζευγμένο CD4-ειδικό mAb, 5 ul PerCP-Cy5.5-συζευγμένο αντι-127 mAb και οι κατάλληλοι έλεγχοι ισοτύπου τους. Μετά την επώαση, τα ερυθρά αιμοσφαίρια υπέστησαν λύση και πλύθηκαν σε PBS δυο φορές. Βιτρώ κύτταρα γρήγορα ανιχνεύεται με τη χρήση του FCM και αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας το σύστημα ii λογισμικού. Όπως περιγράφηκε προηγουμένως [14], η συχνότητα των κυττάρων CD4 + CD25 + CD127

χαμηλή Tregs εκφράστηκε ως ποσοστό των CD4 + Τ κυττάρων με διαδοχική περίφραξη σε λεμφοκύτταρα και CD4 + Τ κύτταρα.

Απομόνωση των CD4 + CD25

υψηλή και CD4 + CD25- κύτταρα

Περίπου 15-20 ml του PB συλλέχθηκαν για την κυτταρική διαλογή. Μονοπυρηνικά κύτταρα περιφερικού αίματος (PBMCs) απομονώθηκαν με διαχωρισμό βαθμίδας πυκνότητας χρησιμοποιώντας ΟΑΡΡΕΕ LSM Lymphocyte Separation Medium (ΜΡ Biomedicals, Solon, ΟΗ). Απομονωμένα PBMCs πλύθηκαν 3 φορές με PBS. Περίπου 1 χ 10

7 PBMCs ήταν επιφάνεια χρωματίστηκαν με ΡΕ-συζευγμένο αντι-CD4 και ΡΙΤΟ-συζευγμένο αντι-CD25. Στη συνέχεια CD4 + CD25

υψηλή και CD4 + CD25- κύτταρα ταξινομήθηκαν χρησιμοποιώντας τις πύλες σε ένα Becton Μετρητής ροής κυτταρομετρίας κυττάρων-διαλογέα (ALTRA HyPerSortTM System). Όπως περιγράφηκε προηγουμένως [15], συνάδει καθαρότητα & gt? 93% λήφθηκε για τα δύο CD4 + CD25

κλάσματα υψηλού Τ κυττάρων και CD4 + CD25-κυττάρου

Κυτταροκαλλιέργεια και θεραπεία

Η κυτταρομετρία ροής ταξινομημένο CD4 + Tregs CD25high και CD4 + CD25- Teffs απλώθηκαν σε πλάκες 24 φρεατίων (Wuxi Nest Biotechnology Co, Ltd, Wuxi, Κίνα), και καλλιεργήθηκαν σε RPMI-1640 (Hyclone) που περιέχει 10% FBS ( Gibco) και αντιβιοτικά για 24 ώρες. Στη συνέχεια, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με ένα subcytotoxic συγκεντρώσεις H

2O

2 (100 μΜ) για 2 ώρες σαν ένα επαγωγέα στρες. Όλα τα κύτταρα επωάστηκαν στους 37 ° C σε υγροποιημένη 5% CO

2 ατμόσφαιρα επωαστήρα.

siRNA Επιμόλυνση

ταξινόμηση CD4 + CD25

υψηλή και CD4 + CD25- κύτταρα από ηλικίας ασθενείς UBC και υγιείς δότες επιμολύνθηκαν με siRNA με τη χρήση λιποφεκταμίνης 2000 (Invitrogen) σύμφωνα με τα πρωτόκολλα του κατασκευαστή. Η τελική συγκέντρωση του siRNA ήταν 33 ηΜ. Οι μεζονέτες του siRNA που στοχεύει

SENEX

mRNA (οι ακολουθίες που αναφέρονται στο Tab 1) και τον έλεγχο siRNA (ομελέτα ακολουθίας) συντέθηκαν από Invitrogen (Σαγκάη, Κίνα).

Η

Εξέταση της Κυτταρικής Η απόπτωση

Η κυτταρομετρία ροής ταξινομημένο CD4 + CD25

υψηλή Tregs και CD4 + CD25- Teffs βάφτηκαν με Annexin ισοθειοκυανική V-φλουορεσκεΐνη (Αννεξίνη V-FITC) και ιωδιούχο προπίδιο (ΡΙ, Biouniquer, Nanjing, Κίνα) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Τα κύτταρα στη συνέχεια επωάστηκαν για 15 λεπτά σε σκοτάδι, πριν να υπόκειται σε ανάλυση σε ένα κυτταρόμετρο ροής (FACSCalibur, Becton Dickinson).

πραγματικού χρόνου ποσοτική PCR ανάλυση

Το ολικό RNA απομονώθηκε χρησιμοποιώντας RNeasy κιτ (Qiagen). cDNA συντέθηκε με τη SuperScript III (Invitrogen) ανάστροφης μεταγραφάσης κιτ σύνθεσης. Ποσοτική πραγματικού χρόνου PCR πραγματοποιήθηκε στις 7000 Real-Time PCR System (Applied Biosystems) χρησιμοποιώντας το Mesagreen qPCR Master Mix Plus για Δοκιμασία SYBR (Takara). Οι εκκινητές που χρησιμοποιήθηκαν και οι αλληλουχίες τους παρατίθενται στον Πίνακα 1.

Serum κυτοκίνες

Δείγματα ορού από ασθενείς UBC και υγιείς μάρτυρες συλλέχθηκαν. Η συγκέντρωση της IL-2, IL-10, IL-17, TNF-α και ΤΟΡ-β προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας ενζυμο-συνδεδεμένη ανοσορροφητική δοκιμασία κιτ (ELISA) (eBioscience) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή.

Στατιστική αναλύσεις

η στατιστική ανάλυση έγινε με τη χρήση του λογισμικού SPSS 15.0 (SPSS Inc., Chicago, IL). Η στατιστική σημαντικότητα των διαφορών προσδιορίστηκε με τη μη παραμετρική αταίριαστο Mann-Whitney

U-test

και

t

δοκιμή των παραμετρικών Student για ζεύγη ή αταίριαστο δείγματα, όταν χρειάζεται. Οι συσχετίσεις αξιολογήθηκαν χρησιμοποιώντας τεστ συντελεστής της κατά Pearson. Οι διαφορές θεωρήθηκαν σημαντικές για p-τιμές μικρότερες από 0.05.

Αποτελέσματα και Συζήτηση

σημαντικά αυξημένη CD4 + CD25 + CD127

χαμηλή Treg Συχνότητα και Transcription Factor FoxP3 mRNA έκφραση σε Ηλικιωμένων UBC ασθενείς

Εν όψει του κρίσιμου ρόλου των περιφερειακών συσσώρευσης Tregs σε ηλικιωμένους κακοήθειες, η CD4 + CD25 + CD127

χαμηλής συχνότητας Treg εξετάστηκε στο περιφερικό αίμα των ηλικιωμένων ασθενών UBC, ηλικίας υγιείς μάρτυρες και τους νέους υγιείς μάρτυρες. Σύμφωνα με προηγούμενες μελέτες, η αύξηση της συχνότητας Treg παρατηρήθηκε σε δύο ασθενείς ηλικίας UBC και ηλικίας υγιείς μάρτυρες, σε σύγκριση με τους νέους υγιείς μάρτυρες. Εν τω μεταξύ, Tregs συχνότητα ήταν σημαντικά υψηλότερη σε ηλικιωμένους ασθενείς UBC ό, τι στην ηλικία μάρτυρες (Σχήμα 1). Αυξημένη συχνότητα Tregs συμβάλλει στη σχετιζόμενη με την ηλικία ανοσοκαταστολή, αυξάνει τη συχνότητα εμφάνισης της λοίμωξης και καρκίνου, και προκαλεί νοσηρότητα και θνησιμότητα σε ηλικιωμένους [4] – [6]. Μια μελέτη έδειξε μια εξαρτώμενη από την ηλικία ελαττωματική εκκαθάριση του όγκου, η οποία συσχετίστηκε με Tregs ανύψωση [16]. Είναι σημαντικό, CD25-εξάντληση οδήγησε στην κάθαρση του όγκου, γεγονός που υποδηλώνει ότι η αντικαρκινική ανοσία ηλικίας όριο Tregs [16].

συχνότητα Treg ανιχνεύτηκε χρησιμοποιώντας κυτταρομετρία ροής. Μια αύξησαν τα CD4 + CD25 + 127

χαμηλής συχνότητας Tregs (10.67 ± 0.58%) παρατηρήθηκε σε Ηλικιωμένων UBC ασθενείς σε σύγκριση με υγιείς μάρτυρες Ηλικιωμένων (7,14 ± 0,41%) και Νέων υγιείς μάρτυρες (5,09 ± 0,37%). Εκφράζονται ως μέσος όρος ± SD, τα δεδομένα αναλύθηκαν με t-test των παραμετρικών Student. ▴ εναντίον Νέοι υγιείς μάρτυρες, P & lt? 0,05? △ vs. Ηλικίας υγιείς μάρτυρες, P & lt?. 0.05

Η

Ο μεταγραφικός παράγοντας FoxP3 διαδραματίζει ζωτικό ρόλο στη διατήρηση της αυτο-ανοχή και την έκφραση υψηλής FoxP3 απαιτείται για τη λειτουργία κατασταλτική σε ανθρώπινα CD4 + Tregs [17] – [19]. Σε αυτή τη μελέτη, εξετάστηκε η έκφραση του mRNA FoxP3 τόσο ηλικιωμένους ασθενείς UBC και υγιή άτομα. Όπως ήταν αναμενόμενο, τα επίπεδα FoxP3 mRNA αυξήθηκε σημαντικά σε CD4 + CD25

hi Tregs ταξινομημένο από ηλικιωμένους ασθενείς UBC και ηλικίας υγιείς μάρτυρες, σε σύγκριση με νέους υγιείς μάρτυρες. Ωστόσο, δεν υπήρξε σημαντική διαφορά στην έκφραση του mRNA μεταξύ FoxP3 Tregs από ηλικιωμένους ασθενείς UBC και ηλικίας υγιή δείγματα αναφοράς (Σχήμα 2). Η διαφορά μεταξύ της συχνότητας Tregs και της έκφρασης Foxp3 mRNA μπορεί να έχει προκληθεί από λειτουργικές διαφορές, καθώς προηγούμενες μελέτες αποδείκνυεται ότι FoxP3 + Τ κυττάρων σε ανθρώπους είναι λειτουργικά ετερογενή [1]. Υπερέκφραση FoxP3 mRNA, σε συνδυασμό με την αυξημένη συχνότητα Tregs, μπορεί να αυξήσει τους όγκους ξεφύγει, ανοσοκαταστολή και να οδηγήσει σε αναποτελεσματική κάθαρση του όγκου σε ασθενείς ηλικίας UBC.

Tregs ταξινομήθηκαν με FACS, επίπεδο FoxP3 mRNA ανιχνεύθηκε από τον πραγματικό χρόνου ποσοτική PCR. έκφραση FoxP3 mRNA αυξήθηκε σε Tregs τόσο των ασθενών ηλικίας UBC (2

– △△ CT = 0.0272 ± 0.0081) και ηλικίας υγιείς μάρτυρες (0,0184 ± 0,0059) σε σύγκριση με νέα υγιή Controls (0,0097 ± 0,0039) (p = 0.035 , 0.021 αντίστοιχα). Καμία διαφορά εντοπίστηκε στην έκφραση Tregs FoxP3 mRNA μεταξύ Ηλικιωμένων UBC Οι ασθενείς και οι ηλικιωμένοι υγιείς μάρτυρες. Εκφράζονται ως μέσος όρος ± SD, η ημερομηνία αναλύθηκαν με το Mann-Whitney

U

-test. ▴ εναντίον Tregs ταξινομημένο από Young υγιείς μάρτυρες, P & lt?. 0.05

Η

απορυθμίζεται

SENEX

έκφραση mRNA και μειωτικά Gene Expression του

Ρ53

,

P16

,

P21

και

κασπάσης-3

σε CD4 + CD25

hi Tregs των Ηλικιωμένων UBC ασθενείς

για να αξιολογηθεί η πιθανή συμβολή στην περιφερειακή συσσώρευση Tregs,

SENEX

mRNA έκφραση των CD4 + CD25

hi κυττάρων CD4 + CD25- τελεστή T (Teff) Tregs και εξετάστηκε. Σημαντική αύξηση σε ποσοστό

SENEX

έκφραση του mRNA ανιχνεύθηκε σε CD4 + CD25

hi Tregs σε σύγκριση με τα CD4 + CD25- Teffs σε ηλικιωμένους ασθενείς UBC, και η αύξηση αυτή δεν παρατηρήθηκε σε άλλες ομάδες. Εν τω μεταξύ,

SENEX

έκφραση του mRNA των Tregs σε ηλικιωμένους ασθενείς UBC ήταν signicantly υψηλότερες από εκείνες σε ηλικιωμένους και νέους υγιείς μάρτυρες (Σχήμα 3). Επιπλέον, τα επίπεδα του mRNA της απόπτωσης ρυθμιστικού γονιδίου κασπάσης-3, Ρ53, Ρ16 και Ρ21 (2

– △△ CT = 1183,42 ± 321,17, 15,66 ± 4,83, 23,06 ± 4,59 και 2415,85 ± 863,72, αντίστοιχα) μειώθηκαν σημαντικά σε CD4 + CD25

hi Tregs ταξινομημένο από ηλικιωμένους ασθενείς UBC, σε σύγκριση με τα CD4 + CD25- Teffs (Σχήμα 4). Δεν παρατηρήθηκαν σημαντικές διαφορές της έκφρασης της απόπτωσης ρυθμιστικών γονιδίων ανιχνεύθηκαν σε CD4 + CD25

hi Tregs ταξινομημένο από ηλικίας και νεαρούς υγιείς μάρτυρες, σε σύγκριση με Teffs.

Tregs ταξινομήθηκαν με FACS,

SENEX

επίπεδο mRNA ανιχνεύθηκε με πραγματικού χρόνου ποσοτική PCR. Μια σημαντική αύξηση των

SENEX

έκφραση του mRNA ανιχνεύθηκε σε CD4 + CD25

hi Tregs (2

– △△ CT = 0,8532 ± 0,1078) σε σύγκριση με τα CD4 + CD25- Teffs (0,1564 ± 0,0731 ) σε ηλικιωμένους ασθενείς UBC (

σ

= 0.027), και αυτή η αύξηση δεν παρατηρήθηκε σε άλλες ομάδες. Tregs

SENEX

έκφραση mRNA σε ηλικιωμένους ασθενείς UBC ήταν signicantly υψηλότερες από εκείνες στο Ηλικιωμένων υγιείς μάρτυρες (0,0923 ± 0,0519) και Νέοι υγιείς μάρτυρες (0,1455 ± 0,0792) (p & lt? 0,05 για κάθε Mann-Whitney

U

-τεστ). Τα δεδομένα εκφράστηκαν ως η μέση τιμή ± SD. ▴ εναντίον Teffs ταξινομημένο από ηλικιωμένους ασθενείς UBC, P & lt? 0,05? △ vs. Tregs σε Ηλικιωμένων υγιείς μάρτυρες και Νέοι υγιείς μάρτυρες, P & lt?. 0.05

Η

Tregs ταξινομήθηκαν με FACS, τα επίπεδα mRNA εντοπίστηκαν με πραγματικού χρόνου ποσοτική PCR. Σε Ηλικιωμένων UBC Patiens, απόπτωση ρυθμιστικά γονίδια της κασπάσης-3, Ρ53, Ρ16 και την έκφραση του mRNA P21 (2

– △△ CT = 1183,42 ± 321,17, 15,66 ± 4,83, 23,06 ± 4,59 και 2415,85 ± 863,72, αντίστοιχα) μειώθηκε σε Tregs της ηλικίας των ασθενών UBC (

σ

& lt? 0,05 για κάθε Mann-Whitney U Test). Τα δεδομένα εκφράστηκαν ως η μέση τιμή ± SD. ▴ εναντίον Teffs ταξινομημένο από ηλικιωμένους ασθενείς UBC, P & lt?. 0.05

Η

SENEX

γονιδίου έχει αποδειχθεί για να παρέχουν μια μοναδική λειτουργία φύλακα στα SIPS και μονοπάτια απόπτωσης σε EC [12 ]. Πάνω από έκφραση του

SENEX

γονίδιο θα μπορούσε να προκαλέσει ECs γήρανση, και αυτά

SENEX

επαγόμενη γηρασμένα κύτταρα ήταν ανθεκτικά σε παράγοντα νέκρωσης όγκων (TNF-α) απόπτωση που επάγεται όταν ECs εκτέθηκαν σε συγκεντρώσεις subcytotoxic H

2O

2. Επιπλέον,

SENEX

υπερέκφραση προκάλεσε αύξηση τόσο στο mRNA και τα επίπεδα πρωτεΐνης για ρ16 και υπήρχε μια μείωση στην πρωτεΐνη έκφραση του υπερφωσφορυλιωμένη Rb. Αυτά τα αποτελέσματα έδειξαν ότι

SENEX

ενεργοποιείται το p16 /pRb μονοπάτι [12]. Παρά το γεγονός ότι τον κρίσιμο ρόλο του

SENEX

γονίδιο για την προστασία των ECs κατά την κυτταρική απόπτωση έχει επίσης αποδειχθεί, η έκφραση του

SENEX

γονιδίου σε Tregs παραμένει σε μεγάλο βαθμό άγνωστη. Στην παρούσα μελέτη,

SENEX

έκφραση του mRNA του γονιδίου βρέθηκε να υπερεκφράζεται σημαντικά σε περιφερειακές CD4 + CD25

hi Tregs ταξινομημένο από ηλικιωμένους ασθενείς UBC, σε σύγκριση με Teffs. Το up-ρύθμιση

SENEX

γονίδιο μπορεί να διαδραματίσει έναν παρόμοιο ρόλο πρόκλησης Tregs senescenc και την προστασία τους από την κυτταρική απόπτωση. Προηγούμενες μελέτες έχουν δείξει ότι η σύλληψη του γηρασμένου ανάπτυξη δημιουργείται και διατηρείται από το ρ53 /ρ21 ή /και ρ16 /pRB οδοί ογκοκατασταλτικό [20] – [22]. Είναι γνωστό ότι πρωτεΐνη ρ53 άγριου τύπου μπορεί να επάγει απόπτωση των κυττάρων [23]. Κασπάσης 3 είναι μεταγενέστερος πρωτεάση τελεστή κυστεΐνης στην αποπτωτικό μονοπάτι, και θεωρείται ως ένας από τους κύριους εκτελεστές της απόπτωσης [24]. γονίδιο Ρ16 και Ρ21 γονίδιο μπορούν να αναστείλουν εξαρτώμενες από κυκλίνη κινάσες (CDK) και επάγουν διακοπή του κυτταρικού κύκλου σε φάση G0-G1 [25] – [26]. Εμείς αιτιολογημένη ότι ρυθμιστικά μόρια κυτταρικού κύκλου, συμπεριλαμβανομένων των p53, p21 και p16 μπορεί να εμπλέκεται στη συσσώρευση Tregs σε ηλικιωμένους ασθενείς UBC. Τα αποτελέσματά μας έδειξαν ότι η έκφραση των ρυθμιστικών γονιδίων της απόπτωσης

Ρ53

,

P16

,

P21

και

κασπάσης-3

, το οποίο θα μπορούσε να προωθήσει την κυτταρική απόπτωση ως περιγράφηκε προηγουμένως [23] – [26], προς τα κάτω σε Tregs των ηλικιωμένων ασθενών UBC. Το επάνω ρυθμισμένη

SENEX

γονίδιο μαζί με προ-αποπτωτικών γονιδίων κάτω-ρυθμιζόμενη μπορεί να οδηγήσει σε μειωμένη απόπτωση σε Tregs, και συσσώρευση Tregs στην ανάπτυξη και πρόοδο της ηλικίας καρκίνο της ουροδόχου κύστεως.

Αυξημένη Επίπεδα του ΤΟΡ-β1, IL-10, IL-17 και ΤΝΡ-Συγκέντρωση α ορού και μειωμένα επίπεδα της IL-2 σε συγκέντρωση στον ορό Ηλικιωμένων UBC ασθενείς

για μια έμμεση εκτίμηση για τη λειτουργία των Τ κυττάρων, αξιολογήσαμε ορού προφίλ κυτοκινών που σχετίζονται με ανοσοπαθολογία όγκου. Σε σύγκριση με τους υγιείς μάρτυρες ηλικίας και νεαρούς υγιείς μάρτυρες (

ρ

& lt? 0,05 για κάθε T Test), όταν υπήρχε προφανής αύξηση στη συγκέντρωση της IL-10 (13,03 ± 2,16 pg /ml), IL-17 ( 18,29 ± 3,45 pg /ml), TGF-β1 (16,22 ± 3,35 ng /ml) και ΤΝΡ-α (25,18 ± 5,74 pg /ml) στον ορό του ηλικιωμένους ασθενείς UBC. Εν τω μεταξύ, υπήρξε μια μείωση στις IL-2 συγκέντρωση στον ορό τόσο σε ηλικιωμένους ασθενείς UBC (165,29 ± 26,45 pg /ml) και ηλικίας υγιείς μάρτυρες (196.69 ± 32.38 pg /ml), όπως, σε σύγκριση με νεαρούς υγιείς μάρτυρες (409.24 ± 90.81) . Ωστόσο, καμία στατιστικώς σημαντική διαφορά στην IL-2 συγκέντρωση ορού παρατηρήθηκε μεταξύ των ασθενών ηλικίας UBC και ηλικίας υγιή δείγματα αναφοράς (ρ = 0,243) (Σχήμα 5).

εκφράζονται ως μέσος όρος ± SD, τα δεδομένα αναλύθηκαν με το δοκιμή Τ παραμετρική του Student. ▴ εναντίον Ηλικιωμένων υγιείς μάρτυρες και Νέοι υγιείς μάρτυρες, P & lt? 0,05? △ vs. Νέοι υγιείς μάρτυρες, Ρ & lt?. 0.05

Η

ως κύρια πηγή του ΤΟΡ-β1 και IL-10 για τη διατήρηση της αυτο-ανοχής και την ομοιόσταση των Τ-κυττάρων, ρυθμιστικά Τ κύτταρα αναστέλλει δραστικά Τ κύτταρα πρωτίστως μέσω της παραγωγής κυτοκινών, όπως ΤΟΡ-β1 και IL-10 [27]. Αυτή η μελέτη δείχνει ότι οι συγκεντρώσεις και των δύο ΤΟΡ-β1 και IL-10 στον ορό αυξήθηκαν σημαντικά σε ηλικιωμένους ασθενείς UBC. Αυξημένα επίπεδα του ΤΟΡ-β1 και IL-10 δείχνουν ότι το συσσωρευμένο Tregs σε ηλικιωμένους ασθενείς UBC μπορεί να διαθέτουν υψηλή ικανότητα κατασταλτικός, αναστέλλουν κατά του όγκου ανοσοαποκρίσεων και προώθηση ογκοάνοση διαφυγής. ΤΝΡ-α είναι η πρωτότυπη προφλεγμονώδης κυτοκίνη. Αν και αρχικά φαίνεται να είναι τοξική για τα κύτταρα όγκου σε υψηλές δόσεις, ο TNF-α έχει αποδειχθεί ότι έχει τη λειτουργία προαγωγής όγκων [28]. Ομοίως, Cytokine IL-17, που εκκρίνεται από τα κύτταρα Th17, γενικά είναι προτιμότερο στην παραγωγή αντικαρκινικής ανοσίας Τ-κυττάρων, αλλά αυτές οι επιδράσεις επισκιάζεται από τους ρόλους τους στην ανάπτυξη των όγκων [29]. Στην παρούσα μελέτη, τα υψηλά επίπεδα του TNF-α και IL-17 σε ηλικιωμένους ασθενείς UBC μπορεί να προάγει την ογκογένεση, ως προηγούμενη μελέτη είχε δείξει ότι θα μπορούσαν να προάγουν την αγγειογένεση του όγκου.

Η ιντερλευκίνη-2 παράγεται κυρίως από CD4 + T βοηθητικά κύτταρα και CD8 + Τ κυττάρων σε δευτερογενή λεμφοειδή όργανα, και η παραγωγή IL-2 είναι έντονα προκαλείται μετά την ενεργοποίηση από το αντιγόνο [30]. Ικανός να ενεργοποιούν πολλαπλούς υποσύνολα ανοσο-κυττάρων, συμπεριλαμβανομένων των Τ κυττάρων, της ιντερλευκίνης-2 είναι απαραίτητη για την ανάπτυξη, την επιβίωση και τη λειτουργία των κυττάρων Treg [30] – [31]. Σημαντική μείωση σε IL-2 με την ηλικία έχει περιγραφεί, κυρίως με βάση την ex vivo δοκιμασίες, στις οποίες η παραγωγή των κυττάρων Τ IL-2 φαίνεται να είναι ανεπαρκή [6]. IL-2 δρα επί κυττάρων που εκφράζουν είτε την υψηλή συγγένεια τριμερές IL-2R ή το χαμηλής συγγένειας διμερή IL-2R. Τα υψηλά επίπεδα της τριμερές IL-2R παροδικά εκφράζεται από κύτταρα CD4 + και CD8 + Τ μετά από ενεργοποίηση TCR κύτταρα whileTreg ιδιοσυστατικά εκφράζουν υψηλά επίπεδα rimeric IL-2R [30]. Στη μελέτη μας, παρατηρήθηκε μια προφανής μείωση σε IL-2 συγκέντρωση στον ορό τόσο σε ηλικιωμένους ασθενείς UBC και ηλικίας υγιή δείγματα αναφοράς. Χαμηλές συγκεντρώσεις της IL-2 μπορεί κατά προτίμηση διεγείρουν τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων Treg μέσω της υψηλής συνάφειας τριμερές IL-2R, και να συμβάλλει στην περιφερειακή συσσώρευση Tregs στον ηλικιωμένο πληθυσμό.

SENEX

έκφραση συσχετίζεται με P53, TGF-β1 και την έκφραση της IL-2 σε Ηλικιωμένων UBC ασθενείς

Εμείς διερευνηθεί περαιτέρω την πιθανή σχέση μεταξύ γονιδίων γήρανση

SENEX

mRNA προφίλ επίπεδο και κυτταροκινών στον ορό ή mRNA ρυθμιστικού γονιδίου απόπτωσης έκφρασης . Χρησιμοποιώντας την ανάλυση συσχέτισης Pearson, τα δεδομένα μας έδειξαν ότι

SENEX

έκφραση του mRNA ήταν αρνητική συσχέτιση με την έκφραση του mRNA Ρ53 (p = 0,012) και IL-2 συγκέντρωσης (p = 0,026), ενώ θετική συσχέτιση μεταξύ

SENEX

έκφραση mRNA και TGF-β1 συγκέντρωση (p = 0.001) ήταν υπολόγισα σε Ηλικιωμένων UBC ασθενείς.

SENEX

γονιδιακή έκφραση σχετίστηκε αρνητικά με το

έκφραση Ρ53

mRNA (Εικόνα 6Α), πράγμα που σημαίνει ότι

SENEX

γονίδιο μπορεί να προβλέπει ειδική λειτουργία της από τα κάτω ρύθμιση της προ-αποπτωτικών γονίδιο

P53

έκφρασης. Επιπλέον,

SENEX

γονιδιακή έκφραση συσχετίστηκε θετικά με το επίπεδο ΤΟΡ-β1 (Σχήμα 6Β), υποδηλώνοντας ότι το επάνω ρυθμισμένη έκφραση του

SENEX

γονίδιο μπορεί να ευθύνεται για την υψηλή κατασταλτική ικανότητα των συσσωρευμένων Tregs σε ηλικιωμένους ασθενείς UBC. Τέλος,

SENEX

γονίδιο συσχετίζεται αρνητικά με IL-2 συγκέντρωσης στον ορό (Σχήμα 6C). Ο πολλαπλασιασμός των Tregs μπορεί άκρως καταστέλλουν τα βοηθητικά κύτταρα Τ CD4 + και CD8 + Τ κύτταρα, και αναστέλλουν την έκκριση της IL-2 σε ασθενείς ηλικίας UBC.

Χρησιμοποιώντας δοκιμή συντελεστή κατά Pearson,

SENEX

έκφραση ήταν συσχετίζεται αρνητικά με (Α) mRNA έκφραση Ρ53 (Pearson συντελεστής συσχέτισης = -0,405, ρ = 0,012) και (Β) η συγκέντρωση της IL-2 (Pearson συντελεστής συσχέτισης = -0,362, ρ = 0,026) σε Ηλικιωμένων UBC ασθενείς. (Γ) θετική συσχέτιση μεταξύ

SENEX

έκφραση και συγκέντρωση TGF-β1 (συντελεστής συσχέτισης Pearson = 0,507, p = 0,001) ήταν υπολόγισα με δοκιμή συντελεστή κατά Pearson.

Η

Σίγαση Down

SENEX

Gene Expression Αυξημένη Tregs απόπτωση σε απόκριση H

2O

2 μεσολάβηση στρες In vitro

παραπάνω στοιχεία μας πρότεινε ότι η υπερέκφραση του γονιδίου SENEX σχετίστηκε αρνητικά με το

mRNA έκφραση Ρ53

σε CD4 + CD25

υψηλή Tregs, η οποία άφησε να εννοηθεί ότι

SENEX

γονίδιο μπορεί να αναστείλουν Tregs κυτταρικής απόπτωσης από τα κάτω ρύθμιση της γονιδιακής έκφρασης προ-αποπτωτικών. Για να διερευνηθεί κατά πόσο Tregs από ηλικιωμένους ασθενείς UBC έχουν χαμηλότερη αναλογία κυτταρικής απόπτωσης, CD4 + CD25

υψηλή Tregs και CD4 + CD25- Teffs ταξινομήθηκαν, που ακολουθείται από ανάλυση κυτταρομετρίας ροής μετά από χρώση με Annexin V-FITC και ΡΙ. Annexin V συνδέεται ειδικά με την εκτεθειμένη φωσφατιδυλοσερίνη επί της αποπτωτικής κυτταρική επιφάνεια, ενώ PI μπορούν να διεισδύσουν σε νεκρά κύτταρα και παρενθέτει με νουκλεϊκό οξύ [32]. Τα δεδομένα μας ανέφερε ότι Tregs από ηλικιωμένους ασθενείς UBC είχαν λιγότερα αννεξίνης V + αποπτωτικά κύτταρα (0,84 ± 0,34%) σε σύγκριση με Teffs (9,27 ± 3,66%) (Σχήμα S1). Αυτό είναι σύμφωνο με την προηγούμενη μελέτη [11], γεγονός που υποδηλώνει ότι Tregs από ηλικιωμένους ασθενείς UBC είναι πιο ανθεκτικά στην απόπτωση.

Για να μελετήσει περαιτέρω το δυναμικό ρόλο του

SENEX

γονιδίων σε Tregs απόπτωση σε ηλικιωμένους ασθενείς UBC, θα σιγήσει πατημένο το

SENEX

γονιδιακής έκφρασης με παρεμβολή RNA στα βραχυπρόθεσμα καλλιεργούνται Tregs σε απάντηση H

2O

2 που προκαλείται από το οξειδωτικό στρες. H

2O

2 είναι ένας γνωστός επαγωγέας του οξειδωτικού στρες, όταν παραδίδονται σε subcytotoxic δόση [33]. Στην παρούσα μελέτη, ταξινομημένα CD4 + CD25

υψηλή Tregs και CD4 + CD25- Teffs εκτέθηκαν σε subcytotoxic συγκεντρώσεις H

2O

2 (100 μΜ) για 2 ώρες. Τα αποτελέσματά μας έδειξαν ότι 100 μΜ H

2O

2 θεραπεία αυξήθηκε αννεξίνης V + αποπτωτικών κυττάρων και στις δύο CD4 + CD25

υψηλή Tregs (11,2 ± 2,6%) και CD4 + CD25- Teffs (13,1 ± 4,3%), και δεν παρατηρήθηκε σημαντική διαφορά στην H

2O

2 που προκαλείται κυτταρική απόπτωση μεταξύ Tregs και Teffs. Φίμωση κάτω

SENEX

γονίδιο από siRNA πισίνα επιμόλυνσης για 24 ώρες, ακολουθούμενο από 100 μΜ H

2O

2 θεραπεία για 2 ώρες, αυξημένη αννεξίνη V + αποπτωτικών κυττάρων σε CD4 + CD25

υψηλή Tregs ( 21,5 ± 3,4%), αλλά υποβάλλονται τις ίδιες διαδικασίες, αποπτωτικά κύτταρα αννεξίνης V + δεν βρέθηκαν να αυξάνουν σε CD4 + CD25-Teffs (13.9 ± 3.1%) (Σχήμα 7). Επιπλέον, δεν παρατηρήθηκε σημαντική διαφορά στην κυτταρική απόπτωση τόσο Tregs και Teffs όταν τα κύτταρα μόνο σε επεξεργασία με siRNA διαμόλυνση χωρίς H

2O

2 θεραπεία (Σχήμα 7). Επιπλέον, φίμωση κάτω Tregs

SENEX

έκφραση του γονιδίου οδήγησε σε αυξητική ρύθμιση των προ-αποπτωτικών γονιδίων

Ρ53

,

P16

,

P21

και

κασπάσης -3

έκφραση mRNA σε απόκριση στο στρες (Σχήμα 8). Η αποτελεσματικότητα της επιμόλυνσης ήταν 45 ± 7,2%, γεγονός που επιβεβαιώθηκε με φθορισμό σημασμένο FAM-siRNA. Οι

SENEX

ποσοστό αναστολής της έκφρασης mRNA ήταν περισσότερο από 90%, σε σύγκριση με μη-κωδικοποίησης RNA (ncRNA) (Εικόνα S2).

Κατάταξη σύμφωνα CD4 + CD25

υψηλή Tregs βάφτηκαν με Annexin V -FITC πριν την ανάλυση κυτταρομετρίας ροής. απόπτωση των κυττάρων ανιχνεύθηκαν ως αννεξίνης V + αποπτωτικά κύτταρα. 100 μΜ H

2O

2 θεραπεία για 2 ώρες αυξημένη αποπτωτικά κύτταρα τόσο Tregs (11,2 ± 2,6%) και Teffs (13,1 ± 4,3%), χωρίς σημαντική διαφορά που παρατηρείται στην H

2O

2 απόπτωση που επάγεται μεταξύ Tregs και Teffs. Φίμωση κάτω

SENEX

γονίδιο με παρεμβολή RNA (RNAi) για 24 ώρες, ακολουθούμενο από H

2O

2 θεραπεία για 2 ώρες, αυξημένη αποπτωτικών κυττάρων σε Tregs (21,5 ± 3,4%), αλλά υφίσταται η ίδιες διαδικασίες, αποπτωτικά κύτταρα δεν βρέθηκε να αυξάνει σε Teffs (13,9 ± 3,1%). Δεν παρατηρήθηκε διαφορά στην κυτταρική απόπτωση μεταξύ Tregs και Teffs όταν τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία μόνο με siRNA διαμόλυνση.

Η

επίπεδα Gene mRNA ανιχνεύθηκαν με πραγματικού χρόνου ποσοτική PCR. Μετά από

SENEX

γονίδιο σίγησε τα κάτω για 24 ώρες, ακολουθούμενη από H

2O

2 θεραπεία για 2 ώρες, η απόπτωση ρυθμιστικά γονίδια

κασπάσης-3

,

P53

,

P1

6 και

έκφραση P21

mRNA (2

– △△ CT = 6705,73 ± 1124,07, 253,08 ± 16,01, 154,58 ± 35,12 και 5135,79 ± 985,47, αντίστοιχα) ρυθμίζεται προς τα πάνω σε CD4 + CD25

hi Tregs (

σ

& lt? 0,05 για κάθε Mann-Whitney U Test). Τα δεδομένα εκφράζονται ως μέσος όρος ± SD. ▴ εναντίον H

2O

2-επεξεργασμένα κύτταρα, P & lt?. 0.05

Η

Προηγούμενη μελέτη έδειξε ότι

SENEX

γονίδιο συνέβαλε στην αντίσταση απόπτωση των ανθρώπινων ECs [ ,,,0],12]. Στην παρούσα μελέτη, φίμωση κάτω

SENEX

γονιδιακής έκφρασης αυξήθηκε Tregs απόπτωση σε απόκριση H

2O

2 που προκαλείται από το οξειδωτικό στρες.