Αφηρημένο

Ιστορικό

Η πρωτεΐνη Ergp55 ανήκει στην οικογένεια των Ets παράγοντα μεταγραφής. Οι πρωτεΐνες Ets είναι εντόνως διατηρημένες σε τομέα δέσμευσης DNA τους και εμπλέκονται σε διάφορες διεργασίες ανάπτυξης και ρύθμιση του μεταβολισμού του καρκίνου. Για τη μελέτη της δομής και της DNA δεσμευτικό μηχανισμό αυτο-αναστολή της Ergp55 πρωτεΐνη, έχουμε παράγονται πλήρους μήκους και μικρότερα πολυπεπτίδια της Ergp55 πρωτεΐνης σε

E. coli

και χαρακτηρίζονται με τη χρήση διαφόρων βιοφυσικών τεχνικών.

Αποτελέσματα

Τα πολυπεπτίδια Ergp55 περιέχει μεγάλη ποσότητα α-έλικας και τυχαίου σπειράματος δομές όπως μετράται με φασματοσκοπία κυκλικού dichorism. Το πλήρες μήκος Ergp55 αποτελεί ένα ευέλικτο και επιμήκη μόριο όπως αποκαλύφθηκε από μοριακή μοντελοποίηση, δυναμική προσομοίωση και αλγορίθμων διαρθρωτικές πρόβλεψη. Οι αναλύσεις σύνδεσης πολυπεπτιδίων Ergp55 με αλληλουχίες DNA στόχο της Ε74 και CFOs υποστηρικτές δείχνουν ότι πλέον θραύσματα Ergp55 (πέρα από τον τομέα ETS) έδειξε την απόδειξη της αυτόματης αναστολής. Αυτή η μελέτη αποκάλυψε επίσης τα μέρη του Ergp55 πρωτεΐνης που μεσολαβούν αυτόματη αναστολή.

Σημασία

Η παρούσα μελέτη θα βοηθήσει στο σχεδιασμό των ενώσεων που σταθεροποιούν τη ανέστειλε μορφή Ergp55 και αναστέλλουν τη δέσμευση της να υποστηρικτής DNA. Θα συμβάλει στην ανάπτυξη φαρμάκων που στοχεύουν Ergp55 για τη θεραπεία του καρκίνου του προστάτη

Παράθεση:. Gangwar SP, Dey S, Saxena AK (2012) Διαρθρωτικά Μοντελοποίηση και DNA Binding αυτο-αναστολή Ανάλυση Ergp55, κρίσιμης Μεταγραφή Factor στην Καρκίνος του προστάτη. PLoS ONE 7 (6): e39850. doi: 10.1371 /journal.pone.0039850

Συντάκτης: Vladimir Ν Uversky, Πανεπιστήμιο της Νότιας Φλόριντα College of Medicine, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 5 του Μάη 2012? Αποδεκτές: 31η Μάη του 2012? Δημοσιεύθηκε: 28, Ιουνίου του 2012

Copyright: © 2012 Gangwar et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Το έργο υποστηρίχθηκε από επιχορήγηση από το Τμήμα Επιστήμης και Τεχνολογίας (DST) Νέο Δελχί, Ινδία (No-SR /SO /HS-05/2009). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Οι πρωτεΐνες της οικογένειας Ets μοιράζονται άκρως συντηρημένες φτερωτό τομέα και δεσμεύουν δέσμευσης του DNA-έλικα-στροφή-έλικα με ακολουθία πυρήνα συναίνεσης DNA 5′-GGA (Α /Τ) -3 ‘[1]. Οι πρωτεΐνες Erg ανήκουν στην οικογένεια των Ets παράγοντα μεταγραφής. γονίδιο Erg αναδιατάσσεται σε ανθρώπινα μυελοειδή λευχαιμία [2], και 5-10% των ασθενών με σάρκωμα Ewing [3]. Σε αμφότερες τις περιπτώσεις, χρωμοσωμικές μετατοπίσεις ως αποτέλεσμα την έκφραση των ογκογόνων πρωτεϊνών σύντηξης που αποτελούνται από Erg και μέλος της υποοικογένειας Tet πρωτεϊνών σύνδεσης RNA. Erg πρωτεΐνη είναι απαραίτητη για την οριστική αιμοποίηση, η λειτουργία ενηλίκων αιμοποιητικών βλαστικών κυττάρων και τη συντήρηση της κανονικής περιφερικού αριθμών αιμοπεταλίων [4]. Οι TMPRSS2-Erg μεταγραφές ογκογονίδιο σύντηξης που παρατηρείται σε καρκινικά κύτταρα του προστάτη που σχετίζεται σημαντικά με επιθετικό καρκίνο, μεταστατικό εξάπλωση και την αυξημένη πιθανότητα θανάτου [5].

Το γονίδιο κωδικοποιεί Erg πέντε πρωτεΐνες, Erg-1, Erg-2 , Ergp55, Ergp49 και Ergp38 ως αποτέλεσμα των διαφορετικών splicing, πολυαδενυλίωση ή κωδικόνιο έναρξης. Η ισομορφή Ergp55 περιέχει τέσσερα λειτουργικά πεδία, τα οποία εμπλέκονται στη σύνδεση DNA, μεταγραφική ενεργοποίηση και αρνητική ρύθμιση του διενεργοποίησης [6]. Οι μορφές πρωτεΐνης Ergp55 διμερές με τον εαυτό της και με δύο άλλες ισομορφές Ergp49 και Ergp38, μέσω PNT και τον τομέα Ets [7]. Η κεντρική περιοχή της Ergp55 συμπεριφέρεται ως ανασταλτικός τομέας για διμερισμό και την απομάκρυνση της ενισχύει το ακίνητο διενεργοποίηση (7). Τα κρίσιμα υπολείμματα Ets τομέα του Ergp55, που διαμεσολαβούν σχηματισμός Ergp55-Jun /Fos-DNA τριμερούς συμπλόκου, έχουν ταυτοποιηθεί και χαρακτηριστεί [8].

Μέχρι στιγμής, τριτοταγή δομή της οποιασδήποτε πρωτεΐνης Ets πλήρους μήκους είναι δεν είναι αποφασισμένη. Ωστόσο, οι δομές των τομέων δέσμευσης DNA αρκετών πρωτεϊνών Ets προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας κρυσταλλογραφία ακτίνων-Χ και οι τεχνικές πυρηνικού μαγνητικού συντονισμού [9] – [16]. Η ανάλυση gonome-πάνω από Ets-οικογένειας δέσμευσης DNA

in vitro

και

in vivo

έχει μελετηθεί πρόσφατα [17].

Ο ακριβής μηχανισμός με τον οποίο, Ergp55 πρωτεΐνη δρα επί της μεταγραφής δεν είναι κατανοητός. Να κατανοήσουν τη δομή και το DNA δεσμευτικό μηχανισμό αυτο-αναστολή της Ergp55, πραγματοποιήσαμε κυκλική dichorism, μοριακής μοντελοποίησης και θεωρητική ανάλυση των διαρθρωτικών πρόβλεψη για πολυπεπτίδια Ergp55. Για να κατανοήσουμε τον μηχανισμό αυτο-αναστολή δέσμευσης του DNA, οι μελέτες σύνδεσης πολυπεπτιδίων Ergp55 με αλληλουχίες DNA του Ε74 και CFOs υποστηρικτές πραγματοποιήθηκαν. Τα αποτελέσματά μας έδειξαν ότι τα πολυπεπτίδια (i) Ergp55 περιέχει υψηλό ποσοστό της α-έλικας και τυχαία δομές πηνίο (ii) σε όλο το μήκος Ergp55 είναι ένα ευέλικτο και επιμήκη μόριο (iii) πλέον θραύσματα πέρα ​​από την κανονική περιοχή Ets της Ergp55 έδειξαν τα στοιχεία της αυτο-αναστολή.

Υλικά και Μέθοδοι

Κατασκευή Ergp55 πλασμιδίων

Το πλήρες μήκος Erg

1-479 και Erg

112-399 γονίδια κλωνοποιήθηκαν σε ρΕΤ28α (+ ) φορέα. Η ERG

1 έως 399 και Erg

307 – 399 γονίδια κλωνοποιήθηκαν σε pRSETA και ρΕΤ21α (+) φορέα έκφρασης. Όλα τα γονίδια μεταλλάγματος διαγραφής ενισχύθηκαν από πλήρους μήκους Erg

1-479 πλασμίδιο χρησιμοποιώντας αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης.

(Α) που παρατίθεται, η αλληλουχίες αμινοξέων πλήρους μήκους Ergp55 χωρίς επισύναψη 6XHIS και θέση διάσπασης. Τα υπολείμματα επισημαίνονται ανάλογα με το μέγεθος της Ergp55 τομείς, NTD (κίτρινο), PNT (πράσινο), CAE /CD (μπλε /κυανό), ETS (κόκκινο) και CTD (μαύρο). (Β) που παρατίθεται, η κατασκευάσματα Ergp55 χρησιμοποιήθηκαν στα πειράματα (σχήμα χρωματισμό ίδιο όπως στο Σχ. 1Α). Τα επισημασμένα υπολείμματα καθορισμό της σειράς των αρχή και το τέλος του κατασκευασμάτων.

Aestericks

υποδηλώνουν τη θέση της ετικέτας 6xHis σε διάφορα Ergp55 κατασκευάσματα.

Η

Καθαρισμός πολυπεπτιδίων Ergp55

Η ERG

1-479, Erg

1 – 399, Erg

112-399 και Erg

307-399 πλασμίδια μετασχηματίστηκαν σε

Ε. coli

. BL21 (DE3) κύτταρα. Τα κύτταρα αναπτύχθηκαν σε 3 λίτρα Luria Bertani μέσα που περιέχουν τα κατάλληλα αντιβιοτικά στους 37 ° C, μέχρι OD

600 έφθασε στο 0,6. Το 0.125 mM IPTG επήχθη στους 37 ° C και καλλιέργεια ανακινήθηκε περαιτέρω για 4 ώρες σε 220 rpm. Τα κύτταρα συλλέχθηκαν με φυγοκέντρηση στα 6000x

g

για 10 ° λεπτά στους 4 ° C. Τα κύτταρα αιωρήθηκαν σε 50 ml ρυθμιστικού διαλύματος λύσης που περιέχει (25 mM Tris-HCl ρΗ 8,0, 300 mM NaCl, 1 mM βενζαμιδίνη-ΗΟΙ, 0.1% Triton Χ-100, 5% γλυκερόλη, 3 mM 2-μερκαπτοαιθανόλη, 1 mM φαινυλομεθυλοσουλφονυλοφθορίδιο φθόριο και 0,5 mg /ml λυσοζύμη) και διασπάστηκαν με υπερήχους στους 4 ° C. Το ακατέργαστο προϊόν λύσης φυγοκεντρήθηκε στα 25,000 χ

g

για 20 λεπτά στους 4 ° C. Το υπερκείμενο φορτώθηκε σε στήλη Νί-ΝΤΑ, προ-εξισορροπημένη με ρυθμιστικό σύνδεσης (25 mM Tris-HCl ρΗ 8,0, 300 mM NaCl, 1 mM βενζαμιδίνη-ΗΟΙ, 5% γλυκερίνη, 2 mM 2-μερκαπτοαιθανόλη, 1 mM φθοριούχο φαινυλμεθυλσουλφονύλιο και 10 mM ιμιδαζόλιο). Οι πρωτεΐνες εκλούστηκαν από την στήλη με ρυθμιστικό διάλυμα έκλουσης (25 mM Tris-HCl ρΗ 8,0, 300 mM NaCl, 1 mM βενζαμιδίνη-ΗΟΙ, 5% γλυκερόλη, 3 mM 2-μερκαπτοαιθανόλη, 1 mM φθοριούχο φαινυλμεθυλσουλφονύλιο και 250 mM ιμιδαζολίου). Τα εκλουσθέντα κλάσματα συνενώθηκαν, συμπυκνώθηκαν και φορτώθηκαν επί στήλης HR διήθηση πηκτής Sephacryl S-200 προ-εξισορροπημένη σε ρυθμιστικό διάλυμα (25 mM Tris-HCl ρΗ 8,0, 150 mM NaCl, 3 mM 2-μερκαπτοαιθανόλη και 5% γλυκερίνη). Οι καθαρισμένες πρωτεΐνες συμπυκνώθηκαν σε ml χρησιμοποιώντας Amicon ultra φυγοκεντρική διάταξη 10 mg /φίλτρο (Mw αποκοπής 10 kD). Η συγκέντρωση πρωτεΐνης μετρήθηκε με την υπεριώδη ακτινοβολία στα 280 nm με τη χρήση συντελεστή απόσβεσης που υπολογίζεται με λογισμικό ExPasy (https://us.expasy.org/tools/protparam.html).

Το χρωματογράφημα του (Α) πλήρης μήκος Erg

1 έως 479 (Β) Erg

1 έως 399 (C) Erg

112-399 και (Δ) Erg είναι

307-399 πολυπεπτίδια εμφανίζονται. Η ανάλυση SDS-PAGE και υπολογισμένο μοριακό βάρος της κάθε πρωτεΐνης υποδηλώνονται σε κάθε χρωματογράφημα.

Η

Ν-τερματική αλληλούχιση πρωτεΐνης και φασματομετρία μάζας ψεκασμού ιόντων επιβεβαίωσε την ταυτότητα και την καθαρότητα των πολυπεπτιδίων Ergp55. Η συγκέντρωση πρωτεΐνης προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας απορρόφηση στα 280 nm. Coomassie brilliant blue χρωματισμένο SDS-PAGE ανάλυση έδειξε ότι όλα τα πολυπεπτίδια Ergp55 καθαρίστηκαν μεγαλύτερη από 95% καθαρότητα. Όλες οι πρωτεΐνες φυλάχθηκαν στους -20 ° C.

πείραμα συντονισμού επιφανειακών πλασμονίων

μελέτες

Biosensor διεξήχθησαν χρησιμοποιώντας BIAcore 2000 (Pharmacia Biosensor Biacore ΑΒ, Uppsala Sweeden) εξοπλισμός [18]. Όλα τα πειράματα πραγματοποιήθηκαν στους 25 ° C σε HBS-ρυθμιστικό που περιέχει [10 mM HEPES ρυθμιστικό ρΗ 7,4, 150 mM NaCl, 50 mM EDTA, 0.005% Ρ20 ως επιφανειοδραστικό). Δεδομένου ότι όλα τα πολυπεπτίδια Ergp55 περιέχουν επισύναψη 6XHIS είτε στο Ν- ή Ο-τερματικό, το τσιπ του αισθητήρα που περιέχει υψηλή πυκνότητα ακινητοποιημένου Νί-ΝΤΑ είναι ένα ιδανικό ετικέτα να ακινητοποιήσει αυτές τις πρωτεΐνες. Αρχικά, τα κύτταρα ροής του τσιπ ενεργοποιήθηκαν με πέρασμα διαλύματος χλωριούχου νικελίου πάνω του. 40 ul κάθε πολυπεπτιδίου Ergp55

π.χ.

., Erg

1-479 (0,14 μg /ul), Erg

1 έως 399 (0,19 μg /ul), Erg

112-399 (0,92 ug /ul) και Erg

307 έως 399 (0,17 ug /ul) ενέθηκαν σε διαφορετικά κύτταρα ροής Νί-ΝΤΑ τσιπ σε ρυθμό ροής 10 ul /λεπτό.

στα σχήματα (Α ) Erg

1-479 (Β) Erg

1-399 (C) Erg

112-399 και (Δ) Erg

307 – 399 πολυπεπτίδια ακινητοποιήθηκαν σε Νί-ΝΤΑ τσιπ. Τρεις συγκέντρωση (1, 2, 3 μΜ) της αλληλουχία DNA του προαγωγού Ε74 εγχέεται σε κάθε ακινητοποιημένο πολυπεπτίδιο Ergp55.

Η

σε διαφορετικά κύτταρα ροής Νί-ΝΤΑ τσιπ, ακολουθώντας μονάδα RU εκάστου πολυπεπτιδίου Ergp55 είχε ακινητοποιημένο

π.χ.

., Erg

1-479 (2904 RU), Erg

1-399 (2848 RU), Erg

112-399 (2825 RU) και Erg

307 έως 399 (247 RU), όπου το 1 RU αντιστοιχεί σε ακινητοποιημένη πρωτεΐνη της συγκέντρωσης ~ 1 pg /mm. Πειράματα δέσμευσης εκτελέστηκαν με τρία διαφορετικά συγκέντρωση [1, 2, 3 μΜ) του DNA αλληλουχία του υποκινητή Ε74 (5 ‘TACCGGAAGT 3’) σε HBS-ρυθμιστικό διάλυμα και ενέθηκαν πάνω ακινητοποιημένα πολυπεπτίδια Ergp55 σε ρυθμό ροής 10 μΐ /λεπτό. Παρόμοιο πείραμα πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας αλληλουχία DNA αλληλουχίας CFOs υποκινητή (5 ‘GACAGGATGTG 3’). Η sensogram επιτρέπεται να τρέξει για έναν άλλο 4 λεπτά. Η αναγέννηση του επιφάνεια του βιοαισθητήρα έγινε χρησιμοποιώντας 30 s παλμού 1 mM NaOH με ρυθμό ροής 10 μΐ /λεπτό. Συνεργάτης και διάστασης κινητικές σταθερές υπολογίστηκαν από BIAeveluation 3,0 λογισμικού με τη χρήση απλών 1:01 Langmuir μοντέλο με την υπόθεση, ότι η πυκνότητα των πολυπεπτιδίων Ergp55 στο τσιπ αισθητήρα δεν ήταν αρκετά υψηλή για να στηρίξει δισθενούς δέσμευσης του DNA.

Στα σχήματα ( Α) Erg

1-479 (Β) Erg

1-399 (C) Erg

112-399 και (Δ) Erg είναι

307-399 πολυπεπτίδια ακινητοποιημένα επί Νί-ΝΤΑ τσιπ. Τρεις διαφορετικές συγκεντρώσεις (1, 2, 3 μΜ) της αλληλουχίας του DNA των Οικονομικών Διευθυντών υποστηρικτής ένεση σε κάθε ακινητοποιημένο πολυπεπτίδιο Ergp55.

Η

Εγκύκλιος dichorism

μετρήσεις CD καταγράφηκαν χρησιμοποιώντας Chirascan

TM CD φασματοπολωσίμετρο (Applied Photophysics) με ένα λουτρό νερού για να διατηρηθεί η σταθερή θερμοκρασία. Τα πολυπεπτίδια Ergp55 αραιώθηκαν σε 0.2 mg /ml σε 10 mM ρυθμιστικό φωσφορικού νατρίου, ρΗ 8.0 και φορτώθηκε επί 0,1 cm κυψελίδα χαλαζία. Το κενό της όλα τα πειράματα ήταν 10 mM ρυθμιστικό φωσφορικού νατρίου, ρΗ 8.0. Το τελικό φάσμα ήταν κατά μέσο όρο τρεις διαδοχικές σάρωσης.

(Α) φάσματα CD του Erg

1-479, Erg

1-399, Erg

112 – 399 και Erg

307 – 399 πολυπεπτίδια που καταγράφονται από 200 nm έως 260 nm. (Β) Θερμοκρασία προκαλούμενη ξεδίπλωμα της πλήρους μήκους Ergp55 πρωτεΐνη. Το οικόπεδο (εσωτερικό) που περιέχει μέση ελλειπτικότητα υπολείμματος έναντι της θερμοκρασίας υποδεικνύει την μετουσίωση του α-έλικες του διπλωμένου πλήρους μήκους Ergp55.

Η

Για τη μελέτη θερμική μετουσίωση του πλήρους μήκους Ergp55, τα φάσματα CD καταγράφηκαν στους 10 ° C προσαύξηση αρχίζει από 10 ° C έως 90 ° C. Πριν από τη μέτρηση, η κυψελίδα δείγμα εξισορροπήθηκε σε κάθε θερμοκρασία. αναγνώσεις θερμοκρασίας ελήφθησαν στο πλαίσιο κάτοχος κυψελίδα συμφώνησε με τη θερμοκρασία του λουτρού νερού. Όλα τα δεδομένα CD μετατράπηκαν σημαίνει υπόλειμμα ελλειπτικότητα (μοίρες. Cm

2 /dmol). Ο διακομιστής Dichroweb [19] χρησιμοποιήθηκε για τον υπολογισμό του ποσού της δευτερογενούς δομής σε πολυπεπτίδια Ergp55 από τα φάσματα CD.

Δευτεροβάθμια δομή πρόβλεψη

Η SOPMA [20], ΓΟΠ [21] και PSIPRED [ ,,,0],22] αλγόριθμοι χρησιμοποιούνται για να προβλέψουν τις δευτερογενείς περιεχόμενα δομή σε όλο το μήκος Ergp55, η οποία έδειξε -21% α-έλικα, 12-15% β-φύλλου και 65-69% δομών τυχαία σπείρα.

(Α) PSIPRED ανάλυση πρόγραμμα πλήρους μήκους Ergp55. (Β) Διαρθρωτικά μοντέλο πλήρους μήκους Ergp55 μετά από ανάλυση μοριακής μοντελοποίησης και της δυναμικής προσομοίωσης με τη χρήση του προγράμματος GROMACS (Γ) Η διαταραγμένη πρόβλεψη από DISOPRED για (α), NTD (β), PNT (γ), CAE /CD (δ), ETS και (ε), οι περιοχές CTD της Ergp55.

η

Μοντελοποίηση των πολυπεπτιδίων Ergp55

Phyre του server [23] χρησιμοποιήθηκε για να ληφθεί η δομή του πλήρους μήκους Ergp55 πρωτεΐνη (1-479 υπολείμματα). Ο διακομιστής απέδωσε τη δομή του PNT τομέα (95 έως 221 υπολείμματα) του Ergp55 χρησιμοποιώντας το πρότυπο ΠΠ-2YTU (δομή λύση των SAM-PNT τομέα του μεταγραφικού παράγοντα ανθρώπινο φίλος ένταξη της λευχαιμίας παράγοντα-1, δεν έχει ακόμη δημοσιευθεί). Η δομή λύση NMR του PNT τομέα (108-201 υπολείμματα) ελήφθη από την τράπεζα δεδομένων πρωτεϊνών (ΠΠ-1SVO) [24]. Ο διακομιστής Phyre απέδωσε επίσης τη δομή του Ets τομέα (284-412 υπολείμματα) της Ergp55 χρησιμοποιώντας το πρότυπο ΠΠ-2NNY (κανονισμός του μεταγραφικού παράγοντα Ets-1 από DNA ομοδιμερισμό μεσολάβηση) [13]. Η δομή NMR του ETS τομέα της Fli1 (306-403 υπολείμματα) ελήφθη από την τράπεζα δεδομένων πρωτεϊνών (ΠΠ-1FliA) [25]. Η δομική μοντελοποίηση του τερματικού Ν- (1-94 υπολείμματα), κεντρικό τομέα (222 έως 283 κατάλοιπα) και τερματικό C- (413-479 υπολείμματα) της Ergp55 δεν προσπάθησε λόγω έλλειψης μοντέλου εισροών.

η Modeler [26] και LOMETS threading [27] προγράμματα χρησιμοποιήθηκαν για την κατασκευή της δομής της πλήρους μήκους Ergp55 χρησιμοποιώντας εξής εισόδους (i) διαρθρωτικό μοντέλο της PNT τομέα (95-221 κατάλοιπα) του Ergp55 (ii) διαρθρωτικό μοντέλο της περιοχής Ets ( 284 έως 412 υπολείμματα) του Ergp55 (iii) δομή NMR της PNT τομέα (108-201 υπολείμματα) του Ergp55 και (iv) δομή NMR του ETS τομέα (306-403 υπολείμματα) του Fli1. Ελαχιστοποίηση ενέργειας πραγματοποιήθηκε σε πρότυπο Ergp55 χρησιμοποιώντας Gromacs πρόγραμμα έκδοση 4.0.5 [28]. 100 βήματα πιο απότομη αξιοπρεπή και 500 βήματα των αλγορίθμων συζευγμένο κλίση χρησιμοποιήθηκαν στον υπολογισμό της ενεργειακής ελαχιστοποίησης.

προσομοιώσεις μοριακής δυναμικής

Το 10 ns μοριακής δυναμικής (MD) προσομοίωση πραγματοποιήθηκε για να ελαχιστοποιείται το μοντέλο Ergp55 χρησιμοποιώντας πρόγραμμα GROMACS (έκδοση 4.0.5) με πεδίο ισχύος Gromacs43a2 [28]. Το μοντέλο Ergp55 βυθίσθηκε σε ένα κυβικό κιβώτιο που εκτείνεται 0,5 nm από την επιφάνεια της πρωτεΐνης και επιδιαλυτωμένη με ρητή μόρια νερού SPC. χλωριούχα ιόντα και νατρίου προστέθηκαν για την εξουδετέρωση των συστημάτων, τα οποία στη συνέχεια προσομοιώνεται με περιοδικές οριακές συνθήκες. Η διαλυτωμένη μοντέλο Ergp55 αποτελείται από 4832 άτομα πρωτεΐνης που περιβάλλεται από ~390, 000 μόρια νερού. Πριν από την εκτέλεση της προσομοίωσης, ολόκληρο το σύστημα ήταν ενέργεια ελαχιστοποιείται για 200 επαναλήψεις των πιο απότομη καταβάσεις και αφήνεται να ισορροπήσει για 20 ps άτομα πρωτεΐνη τήρηση συγκρατημένη. Όλα τα υποστηρίγματα απομακρύνθηκαν από την πρωτεΐνη και η θερμοκρασία βαθμιαία αυξήθηκε σε 10 διακριτά βήματα των 5 προσομοιώσεις ps καθένα.

Σύζευξη

Berendsen χρησιμοποιήθηκε για να διατηρήσει μια σταθερή θερμοκρασία 300 Κ με σταθερά σύζευξης τ 0,1 ps. Van der Waals αλληλεπιδράσεις μοντελοποιηθεί χρησιμοποιώντας 6-12 Lennard-Jones δυναμικό με 1 nm αποκοπής. Η Coulomb αποκοπεί ήταν 1,0. Το χρονικό βήμα που χρησιμοποιήθηκε ήταν 2 fs και συντεταγμένες σώθηκαν κάθε 5 ps για την ανάλυση της MD τροχιές.

Η στερεοχημεία προσομοίωση μοντέλο Ergp55 ελέγχθηκε από το πρόγραμμα PROCHECK της CCP4 σουίτα [29]. Δευτερεύουσα σύνθεση δομή μετρήθηκε από το πρόγραμμα dSsp [30] και την οπτικοποίηση δομή του προγράμματος PyMOL [31].

Αποτελέσματα

Καθαρισμός των ανασυνδυασμένων πολυπεπτιδίων Ergp55

Εμείς που παράγεται σε όλο το μήκος και μικρότερα πολυπεπτίδια (που περιέχει υποσύνολο των προβλεπόμενων τομέων) της Ergp55 στο

Ε. coli

και καθαρίστηκε χρησιμοποιώντας πρότυπες χρωματογραφικές τεχνικές (Εικ. 1Α-Β). Κατά τη διάρκεια χρωματογραφία αποκλεισμού μεγέθους, το καθαρισμένο Erg

1-479, Erg

1-399, Erg

112-399 και Erg

307 – 399 πολυπεπτίδια εκλούεται σε όγκους που αντιστοιχούν σε μοριακά βάρη τους (Εικ. 2A-D). Το πλήρες μήκος Erg

1-479 εκλούεται στο μέγεθος των 53,8 kD, Erg

1-399 πολυπεπτίδιο εκλούεται σε 51,1 kD, Erg

112-399 εκλούεται σε 44,9 kD και Erg

112-399 εκλούεται σε 15,1 kD. Η ERG

1-479 και Erg

1-399 πολυπεπτίδια έχουν την τάση να υποβαθμίσει εάν διατηρούνται για 7 ημέρες στους 4 ° C. Η ERG

112-399 και Erg

307-399 πολυπεπτίδια δεν υποβαθμίζουν την πάροδο του χρόνου και πιο σταθερή από ό, τι Erg

1 έως 479 και Erg

1-399 πολυπεπτιδίων.

DNA μελέτες πρόσδεσης χρησιμοποιώντας αλληλουχίες προαγωγού Ε74 και CFOs

Η λειτουργικότητα καθαρισμένα πολυπεπτίδια Ergp55 εκτιμήθηκε με δέσμευση DNA πείραμα χρησιμοποιώντας την τεχνική συντονισμού επιφανειακών πλασμονίων. Η παρατηρούμενη

K

D

αξία των πολυπεπτιδίων Ergp55 με αλληλουχία DNA του Ε74 υποστηρικτής ήταν

π.χ.

., Erg

1-479 ~ 704 nM, Erg

1- 399 ~ 217 nM, Erg

112-399 ~ 115 nm και Erg

307 – 399 ~ 65 nM (Εικ. 3Α-D). Αυτά τα αποτελέσματα έδειξαν ότι Ets τομέα του Ergp55 (ERG

307-399) έχει την υψηλότερη συγγένεια για αλληλουχία DNA προαγωγέα Ε74. Η συγγένεια δέσμευσης του DNA μειώνεται ~ 2 φορές για Erg

112-399 πολυπεπτίδιο, ~ 3 φορές για Erg

1-399 πολυπεπτίδιο και περίπου 10 φορές για full-length Erg

1-479, σε σύγκριση με Erg

307 – 399 πολυπεπτίδιο (ETS τομέα). Αυτά τα αποτελέσματα υποδεικνύουν ότι οι Ν- όσο και C- τερματικές περιοχές σε σχέση με τον τομέα Ets εμπλέκονται σε αυτο-αναστολή της σύνδεσης DNA για Ergp55 πρωτεΐνη.

Η παρατηρούμενη

K

D

αξία των πολυπεπτιδίων Ergp55 με ακολουθία CFOs υποκινητή ήταν

π.χ.

., Erg

1 – 479 ~ 232 μΜ, Erg

1-399 ~ 196 μΜ, Erg

112 – 399 ~ 38 μΜ και Erg

307-399 ~ 0,45 μΜ (Σχ. 4Α-D). Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν επίσης ότι Ets τομέας έχει την υψηλότερη συγγένεια για αλληλουχίες DNA των CFOs υποκινητή. Και οι δύο Ν- και C- τερματικές περιοχές σε σχέση με τον τομέα Ets εμπλέκονται στην αναστολή των Οικονομικών Διευθυντών δέσμευσης του DNA για να Ergp55 πρωτεΐνη.

μετρήσεις CD πολυπεπτιδίων Ergp55

Για την αναγνώριση των περιεχομένων δευτερεύουσα δομή στο Ergp55 πολυπεπτίδια, χρησιμοποιήθηκε η φασματοσκοπία CD άπω-υν (Εικ. 5Α). Τα δεδομένα CD ήταν de-περίπλοκη τη χρήση DICHROWEB web server [19] και το ποσοστό των α-έλικα, β-φύλλο και τυχαία δομές σπείρας εκτιμήθηκαν. Τα φάσματα CD του πλήρους μήκους Erg

1-479 (Σχ. 5Α) έδειξε δύο ελάχιστα γύρω 208 nm και 222 nm, ένα χαρακτηριστικό του α-ελικοειδή δομή. Αποσυνέλιξη των δεδομένων προβλέπει -35% α-έλικα, 15% β-φύλλου και το 49% των δομών τυχαία σπείρα σε όλο το μήκος Ergp55. Τα δεδομένα CD της Erg

1-399 πολυπεπτίδιο προβλέπει -25% α-έλικα, 17% β-φύλλο και το 57% των δομών τυχαία σπείρα, η οποία δείχνει λιγότερο α-έλικας και τη δομή β-φύλλου σε σύγκριση με όλο το μήκος Erg

1-479 δομή.

Σε περίπτωση Erg

112 – 399 πολυπεπτίδιο, τα δεδομένα CD εκτιμά -29% α-έλικα, 15% β-φύλλο και το 55% των δομών τυχαίου σπειράματος. Αυτό το πολυπεπτίδιο περιέχει λιγότερο α-έλικα, όμοια δομή β-φύλλου σε σύγκριση με το πλήρες μήκος Erg

1-479. Για Erg

307-399 πολυπεπτίδιο, τα δεδομένα CD εκτιμά -31% α-έλικα, 10% β-φύλλο και το 59% των δομών τυχαία σπείρα, η οποία έχει λιγότερο α-έλικας και τη δομή β-φύλλου σε σύγκριση με όλο το μήκος Erg

1 έως 479 δομή. Ωστόσο, αυτές οι τιμές είναι κοντά σε δευτερεύουσα περιεχόμενο δομή στην κρυσταλλική δομή του Ets περιοχής της Fli-1 (35,7% α-έλικα, 4,1% β-φύλλου, 60,2% τυχαία σπείρα). Ο τομέας Ets της Fli-1 είναι το πιο κοντινό ομόλογο με Ets τομέα της Ergp55 [32].

θερμοσταθερότητα της πλήρους μήκους Ergp55

Για να εκτιμηθεί η θερμική πλήρους μήκους Ergp55, μια πολύ UV- CD φάσμα της πρωτεΐνης μετρήθηκε από 10 έως 90 ° C (Σχ. 5Β). Είναι σαφές από τα φάσματα που δευτερεύουσα δομή της Ergp55 μετουσιώνει καθώς η θερμοκρασία αυξάνεται. Όταν μέση ελλειπτικότητα καταλοίπου στα 222 nm παριστάνεται γραφικώς έναντι της θερμοκρασίας, το σημείο καμπής της σιγμοειδής καμπύλη δεικνύει την Τ

m 45 ± 2 ° C σε όλο το μήκος του Ergp55.

Μοριακή μοντελοποίηση και δυναμική προσομοίωση του πλήρους μήκους Ergp55

Η πρόβλεψη δευτερογενούς δομής σε όλο το μήκος Ergp55 χρησιμοποιώντας PSIPRED προγράμματος εμφανίζεται στο (Σχ. 6Α). Τα προγράμματα Modeler και αυτόματη σπείρωμα LOMETS χρησιμοποιήθηκαν για την κατασκευή πλήρους μήκους Ergp55 μοντέλο χρησιμοποιώντας (i) τη δομή του 95 με 221 κατάλοιπα Ergp55 χρησιμοποιώντας το πρότυπο ΠΠ-2YTU (δεν έχει δημοσιευθεί) έχουν 57% ταυτότητα αλληλουχίας (ii) τη δομή των 284- 412 κατάλοιπα Ergp55 χρησιμοποιώντας το πρότυπο ΠΣΠ-2NNY [13] που έχει 40% ταυτότητα αλληλουχίας και (iii) δομή NMR του 108-201 υπολείμματα Ergp55 και (iv) δομή NMR της 306 έως 403 υπολείμματα του Ets περιοχής του Fli-1 που έχει 90 % ταυτότητα αλληλουχίας. Ελαχιστοποίηση ενέργειας και η ανάλυση της δυναμικής προσομοιώσεις εκτελέστηκαν σε κατασκευάστηκαν Ergp55 μοντέλο, το οποίο απέδωσε ένα εύκαμπτο και επίμηκες δομή (Εικ. 6Β). Η δομή Ergp55 παρέμεινε πολύ σταθερή σε όλη τη διάρκεια του χρόνου προσομοίωσης, όπως επιβεβαιώνεται από όλους τους δείκτες που χρησιμοποιούνται συνήθως για την ανάλυση προσομοίωσης MD.

Οι 93% υπολείμματα των Egp55 μοντέλο βρίσκονται σε πιο μειονεκτική περιφέρεια της οικόπεδο Ramachandran και Prosa Z- βαθμολογία -4.87. DISOPRED [33] ανάλυση με το μοντέλο Ergp55 έδειξε ότι η Ν-τερματικό (1-118 υπολείμματα) και C-τερματικού (397-479 υπολείμματα) είναι σε μεγάλο βαθμό διαταραγμένη (εκτός Ν-τερματική 4-23 υπολείμματα) και απομένουν δομή Ergp55 (119-396 υπολείμματα) διατάχθηκαν (Εικ. 6C). Η δομημένη περιοχή PNT περιέχει τριτοβάθμια διάταξη των τεσσάρων α-έλικες, χαρακτηριστικό της μεγάλης ομάδας SAM τομέα [34]. Ο τομέας Ets αποτελείται από τέσσερις α-έλικες και fourβ-φύλλα, ένα χαρακτηριστικό των πρωτεϊνών της οικογένειας ETS. Σε Ν-τερματικό πεδίο, 15 υπόλειμμα τέντωμα προβλέπεται να σχηματίζει α-έλικα και 3 κατάλοιπο μακρά έλικα (219-221 υπολείμματα) παρατηρούνται στο CAE τομέας /CD του Ergp55. Οι επιμηκύνσεις υπολειμμάτων σε C-τελική περιοχή του Ergp55 προβλέπεται να έχει μόνο τυχαία δομή σπείρας.

Το τερματικό Ν- και C-τερματικού τομέα του Ergp55 είναι τοποθετημένα μακριά από τον τομέα Ets. Η αύλακα δέσμευσης του DNA του τομέα Ets είναι εκτεθειμένη σε διαλύτη και ελεύθερη να δεσμεύσει αλληλουχίες προαγωγέα DNA. Ο τομέας CAE /CD είναι τοποθετημένο μεταξύ PNT και τον τομέα Ets να ρυθμίζουν τη δραστηριότητα του Ergp55. Οι τερματικές Ν- και C-τελικές περιοχές του Ergp55 τοποθετημένο σε μια περιοχή που δεν εμποδίζουν την δραστικότητα δέσμευσης του DNA του τομέα Ets και παίζουν ρόλο στην μεταγραφική ενεργοποίηση και τον εντοπισμό του Ergp55.

Συζήτηση

στην παρούσα μελέτη, έχουμε εκφράσει σε όλο το μήκος και μικρότερα πολυπεπτίδια Ergp55 στο

Ε. coli

. Οι συνδυασμοί δύο στάδια χρωματογραφίας (Νί-ΝΤΑ συγγένεια και χρωματογραφία αποκλεισμού μεγέθους) απέδωσαν περισσότερο από 95% καθαρά πολυπεπτίδια Ergp55 βασίζεται σε φασματομετρία μάζας και η ανάλυση SDS-PAGE. Πριν από δομικές μελέτες, η δραστικότητα των καθαρισμένων πολυπεπτιδίων Ergp55 ελέγχθηκαν με μελέτες δέσμευσης χρησιμοποιώντας αλληλουχίες DNA από Ε74 και CFOs προαγωγούς. Η τεχνική συντονισμού επιφανειακών πλασμονίων χρησιμοποιήθηκε για ανάλυση δέσμευσης. Αυτά τα αποτελέσματα έδειξαν ότι τα πολυπεπτίδια που παράγονται σε Ergp55

E. coli

ήταν σε καλή διάπλαση και συνδέονται ειδικά αλληλουχίες DNA του Ε74 και cFos υποστηρικτές με διαφορετικές συγγένειες.

δεσμευτική αυτο-αναστολή της Ergp55 DNA.

Σε περίπτωση Ε74 αλληλουχία του υποκινητή, μετά από

K

D τιμές

παρατηρήθηκαν για Ergp55 πολυπεπτίδια (i) Erg

307 έως 399, 65 nM (ii) Erg

112 έως 399, 115 nM (iii) Erg

1 έως 399, 217 nm και (iv) σε όλο το μήκος της ERG

1-479, 704 nM. Σύγκριση (i) και (ii) έδειξε ότι η Ν-τερματική περιοχή (περιοχές PNT + CAE /CD) που προηγείται με τον τομέα Ets αναστέλλουν σύνδεση προς τον τομέα Ets το DNA Ε74. Σύγκριση (ii) και (iii) έδειξε την απόδειξη της αυξημένης αναστολής δέσμευσης του DNA έχοντας τομέα NTD σε Erg

1 έως 399 του πολυπεπτιδίου. Σύγκριση του (iii) και (iv) δείχνουν ότι η προσθήκη του τομέα ΚΤΕ στην Erg

1-399 πολυπεπτίδιο έδειξαν αυξημένη αναστολή σε DNA δεσμευτική για τον τομέα ΣΕΔΕ. Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι η Ε74 DNA δεσμευτική για Ergp55 επηρεάζεται αρνητικά από CAE /CD, PNT και τους τομείς NTD που βρίσκεται στο Ν-τελικό και C-τερματική περιοχή τομέας βρίσκεται CTD σε Ergp55.

Με την ακολουθία DNA CFOs υποκινητή, μετά από

K

D τιμές

ελήφθησαν για Ergp55 πολυπεπτίδια (i) Erg

307-399, 0,4 μΜ (ii) Erg

112-399, 37 μΜ (iii) Erg

1 – 399, 196 μΜ και (iv) σε όλο το μήκος Erg

1-479, 232 μΜ. Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι προσδένονται αλληλουχία CFOs προαγωγέα με διαφορετική χημική συγγένεια για πολυπεπτίδια Ergp55 από αλληλουχία προαγωγού Ε74, ωστόσο μηχανισμός αναστολής δέσμευσης του DNA ήταν παρόμοια όπως παρατηρήθηκε στην περίπτωση της αλληλουχίας DNA προαγωγέα Ε74.

Ένα συνεργατικά ενεργεί DNA αναστέλλοντας περιοχή ( 468 – 510 υπολείμματα) ταυτοποιήθηκε στο C-τερματικό του ETS-1 παράγοντα μεταγραφής [34]. Σε περίπτωση ERM και μεταγραφή PEA3 παράγοντες, δύο κύριες περιοχές που βρίσκονται στο Ν- και C-τερματικού σε σχέση με τον τομέα ETS-τους αναστέλλοντας συγγένεια σύνδεσης DNA [35] – [38]. Ένας τομέας αντιστοιχεί στο κατάλοιπο 280-360 υπολείμματα του μεταγραφικού παράγοντα του ΜΣΙ, που εμπλέκονται στην αναστολή της ικανότητας δέσμευσης του ΜΣΙ DNA. Αυτοί οι τομείς είναι πλούσια σε υπολείμματα προλίνης γενικά στερείται α-ελικοειδείς δομές. Ο μηχανισμός με τον οποίο δύο περιοχές συνεργατικά αναστέλλουν σύνδεση ERM DNA είναι διαφορετικό από αυτά που παρατηρήθηκαν στην περίπτωση του ETS-1 παράγοντα μεταγραφής. Η δραστικότητα δέσμευσης του DNA του τομέα Ets εξαρτάται μονάδα autoinhibitory [39]. Η συγγένεια πρόσδεσης του τομέα Ets Ergp55 να Ε74 και CFOs υποστηρικτής του DNA ήταν συνεπής με την παρατήρηση που λαμβάνονται σε περίπτωση παραπάνω παράγοντες μεταγραφής.

Εγκύκλιος ανάλυση dichorism πολυπεπτιδίων Ergp55.

Η εγκύκλιος τεχνική dichorism ήταν χρησιμοποιείται για να προσδιορίσει τις δευτερογενείς και τριτογενείς δομές των πολυπεπτιδίων Ergp55. Το πλήρες μήκος και μικρότερα πολυπεπτίδια Ergp55 περιέχουν υψηλά α-έλικας και τυχαίου δομές σπείρας. Τα δεδομένα CD εκτιμά το 35% α-έλικα και το 49% των δομών τυχαία σπείρα σε όλο το μήκος Ergp55 πρωτεΐνη. Εξετάσεις της θερμικής σταθερότητας και της επίδρασης της θερμοκρασίας στη πλήρους μήκους Ergp55 πρωτεΐνης έδειξε ότι η πρωτεΐνη υποβλήθηκε σε μια αλλαγή της δευτερογενούς δομής κατά τη θέρμανση. Η δευτερεύουσα δομή επανακτάται μετά την ψύξη της πρωτεΐνης από 80 ° C έως 20 ° C. Σύντομη αλλαγή της θερμοκρασίας είναι απίθανο να έχει οποιαδήποτε επίδραση στην δευτερογενή δομή της πρωτεΐνης Ergp55.

Μοντελοποίηση και δυναμική προσομοίωση του πλήρους μήκους Ergp55.

Η μοντελοποίηση και η δυναμική προσομοίωση ανάλυση μοριακής έδειξε ότι σε όλο το μήκος Ergp55 αποκτά ένα ευέλικτο και πολύ επιμήκη δομή. Μόνο PNT και Ets τομείς δομημένο σε πρωτεΐνες και μακρύ εύκαμπτο περιοχές παρατηρούνται σε Ν- και C- τελικό άκρο της Ergp55. Η δομή του PNT τομέα της Ergp55 αποτελείται από δέσμη τεσσάρων ελίκων Sam όπως δομή (34). Ο τομέας Ets της Ergp55 είναι δομημένη σε ένα φτερωτό έλικα-στροφή-έλικα με σύστημα α

1β

1β

2α

2α

3β

3β

4α

4 [40] – [41]. Οι κεντρικές CAE τομείς /CD περιέχει μια μικρή έλικα στη θέση 220. Η δευτεροβάθμια και διαταραγμένο ανάλυση πρόβλεψη για Ergp55 υποστήριξε επίσης τη διαπίστωση που παρατηρήθηκε στην μοντελοποίηση και προσομοίωση της δυναμικής μελέτες Ergp55. Όλες αυτές οι παρατηρήσεις υποστήριξε την ευέλικτη, μη globularity και εξαιρετικά επιμήκη δομή της Ergp55 πρωτεΐνης.

Εν κατακλείδι, έχουμε χαρακτηρίσει την ανασυνδυασμένη πλήρους μήκους και μικρότερα πολυπεπτίδια Ergp55 παράγονται σε

Ε. coli

. Τα πολυπεπτίδια Ergp55 καθαρίστηκαν καθαρότητα μεγαλύτερη από 95% όπως προσδιορίζεται με φασματοσκοπία μάζης και ανάλυση SDS-PAGE. Τα δομικά στοιχεία που παρουσιάζονται εδώ έδειξαν τα στοιχεία της ευέλικτο και πολύ επιμήκη δομή του πλήρους μήκους Ergp55 πρωτεΐνη. Η ανάλυση δέσμευσης χρησιμοποιώντας ακολουθίες DNA του Ε74 και CFOs υποστηρικτές δείχνουν ότι πλέον θραύσματα Ergp55 (πέρα από το κανονικό τομέα ETS) έδειξε την απόδειξη της αυτο-αναστολή.

Ευχαριστίες

Οι συγγραφείς ευχαριστήσω Sita R. Meena και Pratibha για τις προτάσεις τους στο τρέχον έργο. Αναγνωρίζουμε τη βοήθεια από εγκατάσταση προηγμένων οργάνων έρευνας (AIRF) και εγκατάσταση κεντρικών οργάνων (CIF) από Πανεπιστήμιο Jawaharlal Nehru για μας επιτρέπει να διεξάγει το πείραμα CD. Οι συγγραφείς ευχαριστήσω SPR εγκατάσταση εξοπλισμού AIIMS, το Δελχί για μας επιτρέπει να διεξάγουν πειράματα δέσμευσης του DNA.