Αφηρημένο

Ιστορικό

Ο σκοπός της εργασίας μας ήταν να εντοπίσει τα γονίδια ειδικά μεταβάλλεται σε αδενοκαρκίνωμα του παγκρέατος και ιδιαίτερα εκείνων που έχουν αλλοιωθεί νωρίς στην ανάπτυξη του καρκίνου.

Μεθοδολογία /Κύρια Ευρήματα

αριθμός αντιγράφων γονιδίων εκτιμήθηκε συστηματικά με υπερ-υψηλή ανάλυση CGH ολιγονουκλεοτιδίων μικροσυστοιχιών του DNA από δείγματα του καρκίνου του παγκρέατος. Παρατηρήθηκαν αρκετές νέες σχετίζονται με τον καρκίνο παραλλαγές. Στην εργασία αυτή επικεντρώθηκε σε ένα από αυτά, με τη συμμετοχή του

reg4

γονίδιο. κέρδους αριθμού αντιγράφων του γονιδίου του

reg4

γονιδίου επιβεβαιώθηκε με qPCR σε 14 δείγματα καρκίνου. Διαπιστώθηκε επίσης με αυξημένο αριθμό αντιγράφων στα περισσότερα δείγματα PanIN3. Το κέρδος σχέση betweena σε

reg4

αριθμός και ο καρκίνος ανάπτυξη γονίδιο αντίγραφο διερευνήθηκε για την ανθρώπινη παγκρεατική καρκινική κυτταρική γραμμή Mia-PaCa2 ξενομόσχευμα κάτω από το δέρμα γυμνών ποντικών. Όταν τα κύτταρα επιμολύνθηκαν με ένα φορέα έκφρασης reg4 επιτρέποντας, αυτοί δημιουργούνται όγκοι σχεδόν δύο φορές μεγαλύτερο σε μέγεθος. Επιπλέον, αυτοί οι όγκοι ήταν πιο ανθεκτικά στην θεραπεία γεμσιταβίνης από όγκους ελέγχου. Είναι ενδιαφέρον ότι, εβδομαδιαία ενδοπεριτοναϊκή χορήγηση ενός μονοκλωνικού αντισώματος να reg4 ήμισυ του μεγέθους των όγκων που παράγονται από κύτταρα Mia-PaCa2, υποδηλώνοντας ότι το αντίσωμα παρενέβαινε με ένα παρακρινή /αυτοκρινή μηχανισμό που περιλαμβάνει reg4 και την τόνωση της εξέλιξης του καρκίνου. Η προσθήκη της γεμσιταβίνης οδήγησε σε περαιτέρω μείωση, όγκοι γίνονται 5 φορές μικρότερη από τον έλεγχο. Η έκθεση σε αντίσωμα reg4 οδήγησε σε σημαντική μείωση στα επίπεδα ενδο-όγκου των pAkt, Bcl-XL, Bcl-2, survivin και κυκλίνης D1.

Συμπεράσματα /Σημασία

Το συμπέρασμα ήταν ότι η επικουρική θεραπείες που στοχεύουν reg4 θα μπορούσε να βελτιώσει την τυπική θεραπεία του καρκίνου του παγκρέατος με γεμσιταμπίνη

Παράθεση:. Legoffic Α, Calvo Ε, Cano C, Folch-Puy Ε, Barthet Μ, Delpero JR, et al. (2009) Η

reg4

Gene, ενισχυμένα κατά τα πρώτα στάδια του παγκρέατος ανάπτυξης του καρκίνου, είναι μια πολλά υποσχόμενη θεραπευτική Target. PLoS ONE 4 (10): e7495. doi: 10.1371 /journal.pone.0007495

Επιμέλεια: Χαρά Sturtevant, Πολιτειακό Πανεπιστήμιο της Λουιζιάνα, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 8 Ιουνίου του 2009? Αποδεκτές: 28 του Σεπτεμβρίου 2009? Δημοσιεύθηκε: 16 Οκτωβρίου 2009

Copyright: © 2009 Legoffic et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από επιχορηγήσεις από INSERM, Ligue Contre le Καρκίνος και INCA να JLI και από το έργο FIS PI081608, Acción Integrada HF2006-0092 και CIBERehd. CIBERehd χρηματοδοτείται από το Instituto de Salud Carlos III της EF-P και DC. EF-P είναι ο αποδέκτης μιας σύμβασης Ramón y Cajal από το ισπανικό Υπουργείο Παιδείας και Επιστημών και MF-M είναι ο αποδέκτης μιας PI050599 σύμβασης FIS-Instituto de Salud Carlos III. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Ο καρκίνος του παγκρέατος αντιπροσωπεύει το 2% όλων των νέων περιπτώσεων καρκίνου, αλλά οδηγεί σε 5% του συνόλου των θανάτων από καρκίνο, με ποσοστό πενταετούς επιβίωσης των μόλις 4% [1]. Η διάγνωση καθυστερεί λόγω της απουσίας των συμπτωμάτων και η έλλειψη ειδικών δεικτών επιτρέποντας την ανίχνευση σε μία δυνητικά θεραπευτική φάση. Στο γενικό πληθυσμό καρκίνου του παγκρέατος ενέχει τον κίνδυνο διάρκειας ζωής των περίπου 0,5-1% [2]. Γενετική προδιάθεση εμπλέκεται επειδή ο κίνδυνος διάρκεια ζωής του καρκίνου του παγκρέατος είναι 4,7% για τους συγγενείς πρώτου βαθμού των παγκρεατικών περιπτώσεων καρκίνου και τον κίνδυνο καρκίνου του παγκρέατος αυξάνει με κάθε επηρεαζόμενου μέλος της οικογένειας. Επιπλέον, μπορεί να κληρονομείται ως μέρος ενός συνδρόμου πολλαπλής καρκίνου, αλλά η συντριπτική πλειονότητα των καρκίνων του παγκρέατος είναι σποραδικές. Τέλος, το κάπνισμα και ασθένειες όπως ο διαβήτης και ειδικά χρόνια παγκρεατίτιδα καπνού προδιαθέτουν για καρκίνο του παγκρέατος και περίπου 10% των ασθενών με intrapapillary βλεννώδες νεοπλάσματα (IPMNs) θα αναπτύξουν αδενοκαρκίνωμα του παγκρέατος.

Γονιδιωματική αλλαγές μπορούν να προκαλέσουν υπερ- ή επιχειρήσεις έκφραση γονιδίων, με σημαντικές συνέπειες όταν εμπλέκονται ογκογονίδια ή γονίδια καταστολής όγκου. Οι γενετικές ανωμαλίες που εμφανίζονται στα πρόδρομα βλαβών [3], καθώς και κατά τη διάρκεια της έναρξης και εξέλιξης του καρκίνου του παγκρέατος έχουν περιγραφεί εν μέρει [4] – [7]. Πράγματι, συγκριτική γονιδιωματική υβριδισμός (CGH) αναλύσεις εντοπιστεί συχνή κέρδη στα χρωμοσώματα 1 q, 3, 5, 7ρ, 8q, 11q, 12p, 17q, 19q και 20q, και οι απώλειες στα χρωμοσώματα 3p, 6, 8p, 9p, 10q, 13q, 15q, 17p και 18q [8] – [13]. Ο σκοπός της εργασίας μας ήταν να εντοπιστούν, χρησιμοποιώντας μια υπερ-υψηλή ανάλυση CGH ολιγονουκλεοτιδίων μικροσυστοιχιών, τα γονίδια τροποποιούνται ειδικά σε παγκρεατικά κύτταρα αδενοκαρκινώματος και ιδιαίτερα αυτές που έχουν αλλοιωθεί νωρίς στην ανάπτυξη του καρκίνου. Αρκετοί υποψήφιοι ταυτοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας αυτή την προσέγγιση, μεταξύ των οποίων και η

reg4

γονίδιο [14] έδειξε γονίδιο αύξηση του αριθμού αντιγράφων σε 14/14 δείγματα που αναλύθηκαν. Αυτό είναι σε γνώση μας η πρώτη έκθεση του

reg4

αύξηση αριθμού αντιγράφων γονιδίου για τον καρκίνο του παγκρέατος.

Στην εργασία αυτή αναφέρει ότι το

reg4

γονίδιο, το οποίο βρίσκεται στο χρωμόσωμα 1p13 0,1-ρ12, είναι παρούσα σε αυξημένο αριθμό αντιγράφων σε παγκρεατικά καρκινικά κύτταρα και στα τέλη προκαρκινικές αλλοιώσεις του παγκρέατος. Μελέτες σε ξενομόσχευμα παγκρεατικού καρκίνου κυτταρικής γραμμής έδειξαν ότι reg4 υπερέκφραση διεγείρει την ανάπτυξη του όγκου και, αντιστρόφως, ότι η παρεμπόδιση κυκλοφορούσα πρωτεΐνη reg4 με ένα ειδικό αντίσωμα αναστέλλει την ανάπτυξη του όγκου.

Αποτελέσματα

Ο

reg4

γονίδιο υπάρχει σε αυξημένο αριθμό αντιγράφων σε παγκρεατικά καρκινικά κύτταρα και PanIN 3 προκαρκινικές αλλοιώσεις

Χρησιμοποιώντας μια προσέγγιση σάρωση DNA μικροτσίπ που βασίζεται σε Affymetrix, εντοπίσαμε αρκετά γονίδια με παθολογικό αριθμό αντιγράφων του DNA από παγκρεατικά καρκινικά κύτταρα. Εστιάσαμε για πρώτη φορά γονίδια μεταβάλλονται σε όλα τα δείγματα 14 DNA και διαπίστωσε ότι

reg4

έδειξαν συστηματικά αυξημένο αριθμό αντιγράφων. Όλα τα δεδομένα μικροσυστοιχιών αναφέρονται στο χειρόγραφο περιγράφεται σύμφωνα με τις κατευθυντήριες γραμμές MIAME. Πλήρη στοιχεία που περιγράφουν άλλες ανωμαλίες του DNA θα δημοσιευθεί αλλού.

reg4

γονίδιο αυξημένο αριθμό αντιγράφων ήταν ιδιαίτερα ενδιαφέρουσα, επειδή η έκφραση του προηγουμένως συμμετείχε στην επιθετικότητα αρκετών καρκίνων [15] – [17], συμπεριλαμβανομένων πάγκρεας [18]. Το Σχήμα 1 δείχνει το ενισχυμένο τόπο, η οποία περιλαμβάνει την

reg4

γονιδίου, σε DNA από αυτούς τους ασθενείς. Παρακολουθήσαμε επίσης τον αριθμό αντιγράφων του

reg4

των παγκρεατικών προκαρκινικές αλλοιώσεις που ονομάζεται PanINs. Συνδυάζοντας μια προσέγγιση σύλληψης λέιζερ και μια μέθοδο qPCR, μετρήσαμε τον αριθμό των αντιγράφων reg4 στις τρεις τάξεις του PanIN βλαβών και βρήκε αυξημένο αριθμό αντιγράφων του

reg4

σε 0/6, 1/7 και 6/7 του PanIN1, PanIN2 και PanIN3 βλάβες, αντίστοιχα (Σχήμα 2). Ως έλεγχος, να αντιγράψετε αριθμούς των

TERT

(ανάστροφη μεταγραφάση τελομεράσης) και

γονίδια RPP21

(πρωτεΐνη p21 RNaseP) αξιολογήθηκαν στα ίδια δείγματα DNA και δύο αντίγραφα ήταν πάντα βρεθεί (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται) . Συνολικά, τα στοιχεία αυτά δείχνουν ότι το

reg4

αριθμού αντιγράφων γονιδίου είναι συχνά αυξημένη σε καρκίνο του παγκρέατος και στο τελευταίο στάδιο των προκαρκινικών αλλοιώσεων (PanIN3), αλλά σπάνια σε προηγούμενα στάδια (PanIN1 και PanIN2).

αναλογίες τα αλληλόμορφα υπολογίστηκαν με την Partek Γονιδιωματική Σουίτα, έκδοση 6.4. HapMap (270 δείγματα) χρησιμοποιήθηκε για τη δημιουργία βασικής γραμμής αριθμού αντιγράφων. Γονιδιωματικής κατάτμησης χρησιμοποιήθηκε για την ανίχνευση αύξηση του αριθμού αντιγράφων ή ζημία. Περιοχές ανιχνεύθηκαν χρησιμοποιώντας τις ακόλουθες παραμέτρους κατάτμησης: τουλάχιστον 10 γονιδιωματικής δεικτών? όριο p-value κατάτμησης μικρότερη από 0.001? ένα σήμα προς θόρυβο ίσος με 0,3. Α Σχηματική αναπαράσταση του

reg4

τόπο. Οι θέσεις των 7 γονίδια που υπάρχουν σε αυτόν τον τόπο που αναφέρεται: από αριστερά προς τα righ:

ZNF697

,

PHGDH

,

HMGCS2

,

REG4

,

NBPF7

,

ADAM30

και

Notch2

. Β Θέση του αριθμού αντιγράφων τμήμα κέρδος που βρέθηκαν σε όλα τα δείγματα DNA από 14 καρκίνο του παγκρέατος, η οποία περιλαμβάνει την

reg4

γονίδιο. Γ Γονιδιωματική αλλαγές στο ενισχυμένο τμήμα του

reg4

τόπο, που καθορίζεται από την Affymetrix Genome-Wide Ανθρωπίνων SNP Array 6,0 ανάλυσης στα 14 του παγκρέατος δείγματα καρκίνου. Οι γενετικές κέρδη εμφανίζονται ως κόκκινες γραμμές και τις απώλειες ως μπλε γραμμές, γκρι μπάρες που αντιστοιχούν σε 2 αντίγραφα, όπως αναφέρεται στην κλίμακα που φαίνεται από κάτω. Σημειώστε την επικράτηση των κερδών (κόκκινο) στο

reg4

περιοχή. Δ Λεπτομέρεια των κερδών /ζημιών στο

reg4

γονίδιο και πλευρικές περιοχές της για όλα τα 14 δείγματα που αναλύθηκαν.

Η

Ομογενής πληθυσμούς κυττάρων προσεκτικά μικροτομή χρησιμοποιώντας ένα σύστημα λέιζερ Capture μικροανατομίας. PanINs βαθμολογήθηκαν 1 έως 3 ως συνάρτηση της σημασίας της αρχιτεκτονικής και κυτταρολογικές ανωμαλίες. DNA από τα παγκρεατικά καρκινικά δείγματα που λαμβάνονται από ενδοσκοπικός υπέρηχος (EUS) -guided λεπτή βελόνη χρησιμοποιήθηκε. DNA από λευκοκύτταρα του αίματος χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος.

αριθμός reg4

αντιγράφου γονιδίου προσδιορίστηκε με qPCR διεξήχθη εις τριπλούν και τα αποτελέσματα αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας το λογισμικό RealQuant.

Η

reg4 υπερέκφραση διεγείρει την ανάπτυξη των κυττάρων και αυξάνει την αντίσταση στη θεραπεία gemcitabine σε κύτταρα MIAPaCa2

in vitro

Η

έχει προηγουμένως δειχθεί ότι αναγκάζονται reg4 υπερέκφραση

in vitro

αυξάνει το ρυθμό ανάπτυξης των κυττάρων και την αντίσταση σε προγραμματισμένο κυτταρικό θάνατο σε μη-παγκρεατικό καρκίνο προερχόμενα κύτταρα. Λάβαμε κύτταρα Mia-PaCa2 υπερεκφράζουν reg4 πρωτεΐνη (Mia-PaCa2 /reg4) με μεταγωγή ενός ανασυνδυασμένου ρετροϊού (Σχήμα 3) και αναλύθηκαν ικανότητα τους να αναπτύσσονται και να αντισταθεί στην αντικαρκινική gemcitabine φάρμακο

in vitro

. Παρατηρήσαμε ότι τα κύτταρα που εκφράζουν reg4 αυξήθηκαν περίπου 50% πιο γρήγορα από ό, τι Mia-PaCa2 /κενά κελιά. Επιβεβαιώσαμε ότι η αυξημένη κυτταρική ανάπτυξη οφειλόταν σε reg4 υπερέκφραση με knockingdown reg4 με ένα συγκεκριμένο διαμόλυνσης siRNA και βρήκε μια απώλεια αυτής της ικανότητας, όπως φαίνεται στο Σχήμα 4. Παρομοίως, όταν τα κύτταρα Mia-PaCa2 υποβλήθηκαν σε θεραπεία με 50 μΜ gemcitabine για 48 ώρες, η αντίσταση στο φάρμακο αυξήθηκε σε κύτταρα που υπερεκφράζουν reg4, σε σύγκριση με τον έλεγχο, αλλά έχασε σε κύτταρα τελικά διαμολυσμένα με siRNA κατά reg4 (Σχήμα 4). Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι reg4 εμπλέκεται στην κυτταρική ανάπτυξη και την αντίσταση σε αντικαρκινικά φάρμακα στο πάγκρεας καρκίνος προερχόμενα κύτταρα όπως προηγουμένως προταθεί σε μη παγκρεατικά κύτταρα.

Η πλήρης κωδικοποιητική αλληλουχία του cDNA reg4 υποκλωνοποιήθηκε εντός του ρετροϊικού pLPCX διάνυσμα. κύτταρα συσκευασίας Phoenix Αμφοτροπικά επιμολύνθηκαν με τον ρετροϊικό πλασμίδιο για να ληφθεί το υπερκείμενο που περιέχει σωματίδια ρετροϊού. Κύτταρα στόχοι Mia-PaCa2 απλώθηκαν σε παρουσία του υπερκειμένου που περιέχει σωματίδια ρετροϊού όπως περιγράφεται στο Υλικά και Μέθοδοι τμήμα. Οι πληθυσμοί των reg4 εκφράζουν Mia-PaCa2 (Mia-PaCa2 /reg4) και κύτταρα ελέγχου (Mia-PaCa2 /κενό), μολύνονται με τον κενό φορέα, απομονώθηκαν με επιλογή πουρομυκίνης. Η έκφραση του REG4 μετρήθηκε με κηλίδα western για κυτταρικά εκχυλίσματα, με τη χρήση του αντι-reg4 μονοκλωνικό αντίσωμα. Μετά την ανάπτυξη, η μεμβράνη απογυμνώνεται και επανα-διερευνήθηκαν για β-ακτίνη.

Η

Mia-PaCa2 /reg4 και Mia-PaCa2 /κενά κύτταρα επιμολύνθηκαν με ένα ειδικό siRNA κατά reg4 (Α) ή επωάστηκαν υπό την παρουσία ενός αντι-REG4 μονοκλωνικό αντίσωμα (Β) και την ανάπτυξή τους και την αντοχή τους σε gemcitabine αγωγή μετρήθηκε με τη δοκιμασία MTS. Τα αποτελέσματα εκφράστηκαν ως επί τοις εκατό του μη επεξεργασμένου Mia-PaCa2 κενά κύτταρα /.

Η

REG4 είναι μία εκκριτική πρωτεΐνη 16 kDa. Για να ελεγχθεί αν επιδράσεις της REG4 στην κυτταρική ανάπτυξη και την αντίσταση στη θεραπεία γεμσιταβίνη οφείλονταν σε ενδοκρινική λειτουργία του παρακρινή /σε παγκρεατικά κύτταρα, προσθέσαμε ένα ειδικό μονοκλωνικό αντίσωμα έναντι της πρωτεΐνης REG4 στο μέσο καλλιέργειας, για να εμποδίσει τη δράση του. Σε αυτές τις συνθήκες, οι επιπτώσεις της reg4 υπερέκφραση εξαφανίστηκε σχεδόν εντελώς, όπως φαίνεται στο σχήμα 4. Τα αποτελέσματα αυτά δείχνουν ότι REG4 επιδρά στην κυτταρική ανάπτυξη και την αντίσταση σε gemcitabine μέσω ενδοκρινή /παρακρινής τρόπο.

αυξήσεις reg4 υπερέκφραση ογκογονικότητα και αντίσταση στην θεραπεία γεμσιταβίνης

Συγκρίναμε τις ικανότητες των Mia-PaCa2 /κενών και Mia-PaCa2 /reg4 κύτταρα να σχηματίζουν όγκους μετά από υποδόρια ένεση σε γυμνά ποντίκια. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 5, οι όγκοι που σχηματίστηκαν από τα κύτταρα που υπερεκφράζουν πρωτεΐνη reg4 αυξήθηκε ταχύτερα από ό, τι τα κύτταρα που δεν εκφράζουν το γονίδιο. όγκος του όγκου ήταν 70% μεγαλύτερες κατά τη χρήση κυττάρων Mia-PaCa2 /reg4 ό, τι με τον έλεγχο των κυττάρων Mia-PaCa2. Είναι ενδιαφέρον ότι, όταν τα ποντίκια υποβλήθηκαν σε αγωγή με γεμσιταβίνη, οι όγκοι υπερεκφράζουν πρωτεΐνη reg4 επέδειξαν αυξημένη αντίσταση στη θεραπεία, σε σύγκριση με τους όγκους που σχηματίζονται με Mia-PaCa2 /κενά κελιά. Ενώ ο όγκος των όγκων που δημιουργούνται με τα κύτταρα Mia-PaCa2 μειώνεται κατά 60% μετά από θεραπεία γεμσιταβίνης, ο όγκος των κυττάρων reg4 εκφράζουν μειώθηκε κατά 20% μόνο. ​​

Περίπου 2 × 10

6 Mia-PaCa- 2 κύτταρα εμβολιάστηκαν υποδορίως με 0.1 ml του Matrigel σε γυμνούς ποντικούς. Η γεμσιταβίνη (100 mg /kg) εγχύθηκε ενδοπεριτοναϊκά δύο φορές την εβδομάδα. Οι διαστάσεις του όγκου μετρήθηκαν μία φορά την εβδομάδα και ο όγκος όγκοι υπολογίζονται με τον τύπο μήκος Χ πλάτος Χ βάθος × 0,5236. Οι τιμές εκφράζονται ως μέσος όρος +/- SE έξι μετρήσεων.

Η

Η συστηματική θεραπεία με ένα αντίσωμα έναντι reg4 μειώνει ογκογονικότητα

Το επόμενο βήμα ήταν να αναλύσουμε την επίδραση της παρεμπόδισης reg4 με ένα ειδικό μονοκλωνικό αντίσωμα για την ανάπτυξη των όγκων που επάγεται με υποδόρια ένεση κυττάρων Mia-PaCa2. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 6, η θεραπεία με το αντίσωμα reg4 μειώθηκε ανάπτυξη του όγκου κατά περίπου 50%. Επιπλέον, ο συνδυασμός της θεραπείας αντισώματος reg4 με γεμσιταβίνη οδήγησε σε περαιτέρω μείωση του όγκου του όγκου. Συνολικά, αυτά τα αποτελέσματα υποδεικνύουν ότι η στόχευση της πρωτεΐνης reg4 θα μπορούσε να χρησιμοποιηθεί σε συνεργασία με γεμσιταβίνη για τη θεραπεία του καρκίνου του παγκρέατος.

Περίπου 2 × 10

6 Mia-PaCa-2 κύτταρα εμβολιάστηκαν υποδορίως με 0.1 ml του Matrigel να γυμνούς ποντικούς. Μία ημέρα πριν από τον εμβολιασμό καρκινικών κυττάρων, η ομάδα ελέγχου έλαβε μια ενδοπεριτοναϊκή ένεση 150 μΙ PBS, ενώ η ομάδα δοκιμασίας έλαβε 0,25 mg του reg4 μονοκλωνικού αντισώματος σε 150 μΐ PBS. ρυθμιστικό οχήματος ή αντι-reg4 αντίσωμα εγχύθηκε σε εβδομαδιαία βάση σε ζώα. Οι διαστάσεις του όγκου μετρήθηκαν μία φορά την εβδομάδα και ο όγκος όγκοι υπολογίζονται με τον τύπο μήκος Χ πλάτος Χ βάθος × 0,5236. Η γεμσιταβίνη (100 mg /kg) εγχύθηκε ενδοπεριτοναϊκά δύο φορές την εβδομάδα. Οι τιμές εκφράζονται ως μέση τιμή +/- SE (η = 6).

Η

Ενδοπεριτοναϊκή ένεση του αντισώματος reg4 μειώνει τα επίπεδα της antiapototic πρωτεϊνών και πρωτεϊνών κύκλου που σχετίζεται με κύτταρο στο Mia-PaCa2 επαγόμενη όγκους

Επειδή συστηματική αγωγή με το αντίσωμα μειώνει την ανάπτυξη του όγκου και αυξάνει την ευαισθησία στην θεραπεία gemcitabine, χρησιμοποιήσαμε ανάλυση κηλίδος western για την παρακολούθηση σε όγκους την επίδραση της θεραπείας reg4 αντισώματος επί των ενδοκυτταρικών επιπέδων των πρωτεϊνών που σχετίζονται με την απόπτωση (φωσφορυλιωμένη ΑΚΤ, Bcl- 2, Bcl-xL και survivin), και του κυτταρικού κύκλου (κυκλίνη D1). Όπως ήταν αναμενόμενο τα επίπεδα φωσφορυλιωμένου ΑΚΤ, Bcl-2, Bcl-xL και survivin ήταν σημαντικά μειωμένες σε όγκους από ποντικούς που υπέστησαν αγωγή με το αντίσωμα reg4 σύγκριση με τον έλεγχο. Επίπεδο της κυκλίνης D1 βρέθηκε επίσης μειωμένη σε ποντίκια αντίσωμα επεξεργασμένο reg4 (Σχήμα 7). Αυτά τα ευρήματα πιθανώς εξηγεί την παρατηρούμενη μειωμένο συντελεστή μεγέθυνσης.

δείγματα καρκινικού ιστού λύθηκαν σε ένα ρυθμιστικό διάλυμα ομογενοποίησης που περιείχε ένα κοκτέιλ από αντιπρωτεάσες. Τα κυτταρικά θραύσματα και τα αδιάλυτα υλικά απομακρύνθηκαν με φυγοκέντρηση και διαλυτά κλάσματα φορτώθηκαν σε ρυθμιστικό Laemmli επί μιας 12,5% γέλης SDS-πολυακρυλαμιδίου. Οι πρωτεΐνες μεταφέρθηκαν σε μεμβράνη νιτροκυτταρίνης και η μεμβράνη επωάστηκε με το αντι φωσφορυλιωμένη ΑΚΤ (φωσφο-Ser473), αντι-ΑΚΤ τηγάνι, αντι-ΒοΙ-2, αντι-ΒοΙ-χΕ, αντι-survivin ή αντι-κυκλίνης D1 αντισώματα. Μετά την ανάπτυξη, η μεμβράνη αφαιρέθηκε και ξαναϊχνηθετούνται για την β-ακτίνη.

Η

Συζήτηση

Σε αυτή τη μελέτη, την υπόθεσή μας ήταν ότι η έγκαιρη γονιδιωματικής ανωμαλίες συμβαίνουν σε παγκρεατικά καρκινικά κύτταρα είναι υπεύθυνα για την κακή πρόγνωση των ασθενών και για την έλλειψη επαρκών απόκριση σε αντικαρκινικά φάρμακα, συμπεριλαμβανομένων των gemcitabine. Αρκετές περιοχές του DNA με αλλαγμένη αριθμού αντιγράφων γονιδίου πράγματι παρατηρήθηκε σε όγκους από ασθενείς χωρίς ανιχνεύσιμη μεταστάσεις κατά τον χρόνο της μελέτης. Στην παρούσα εργασία, εστιάσαμε την προσοχή μας στην περιοχή του χρωμοσώματος που περιέχει το

reg4

γονίδιο γιατί έδειξε αυξημένο αριθμό αντιγράφων σε όλους τους 14 ασθενείς που αναλύθηκαν. Επιπλέον, ένας αυξημένος αριθμός αντιγράφου αυτής της περιοχής βρέθηκε επίσης σε όλες σχεδόν τις PanIN3, το τελευταίο στάδιο των προκαρκινικών αλλοιώσεων του παγκρέατος, γεγονός που υποδηλώνει ότι

reg4

ενισχύσεως γονιδίων είναι ένα πρώιμο γεγονός στην ανάπτυξη του καρκίνου του παγκρέατος. reg4 είναι μια μικρή εκκρινόμενη πρωτεΐνη που περιέχει ένα μόνο καλά συντηρημένη περιοχή υδατάνθρακα αναγνώρισης [14], [15]. reg4 είναι μέλος μιας πολυγονιδιακή οικογένεια που ονομάζεται

reg

(αναθεωρηθούν 19). Στους ανθρώπους, οι πέντε δομικά σχετιζόμενα μέλη έχουν ταυτοποιηθεί μέχρι σήμερα και ομαδοποιούνται σε τρεις υποκατηγορίες με βάση τις πρωτογενείς δομές των πρωτεϊνών που κωδικοποιούνται δηλαδή REG1A και REG1B (Τύπου 1), REG3A και REG3G (Τύπος 3) και REG4 (τύπος 4). Σε αντίθεση με

reg1A

,

reg1B

,

reg3A

και

reg3G

γονίδια, τα οποία βρίσκονται στο χρωμόσωμα 2p12,

reg4

είναι σε χρωμόσωμα 1p13.1-P12. Πολλές αναφορές στη βιβλιογραφία δείχνουν σημαντικό ρόλο για REG4 στον καρκίνο. Για παράδειγμα, η έκφραση REG4 φαίνεται να είναι υπεύθυνη για την αντοχή των κυττάρων σε αντικαρκινικά φάρμακα όπως το 5-fluouracil και μεθοτρεξάτη [15], [20], προωθεί φωσφορυλίωση ΑΚΤ και την υπερ-έκφραση των αντιαποπτωτικών πρωτεϊνών Bcl-2, Bcl-xL και survivin [21], [22], ενεργοποιεί τον υποδοχέα EGF /Akt /ΑΡ1 μονοπάτι σηματοδότησης [21] και η έκφρασή του συσχετίζεται με αυξημένη περιτοναϊκή μετάσταση στα γαστρικά καρκινώματα [22], [23]. Είναι συστηματικά υπερεκφράζεται σε καρκινικούς ιστούς που προέρχονται από κόλον [15], [24], το στομάχι [16], του προστάτη [25] και το πάγκρεας [18] και σε ασθένειες που προδιαθέτουν για καρκίνο του παχέος εντέρου όπως η ελκώδης κολίτιδα [14], [26] , νόσο του Crohn [14] και ορθοκολικού αδενώματος [24]. Η πρώιμη ενίσχυση των γονιδίων του σε καρκίνο του παγκρέατος που περιγράφονται σε αυτή τη μελέτη (Εικόνες 1 και 2) και την ογκογόνο δράση του που αναφέρονται στη βιβλιογραφία μας ώθησε να μελετήσουμε περαιτέρω το ρόλο της REG4 σε παγκρεατικά ογκογονικότητα και στην αντίσταση του καρκίνου του παγκρέατος σε θεραπεία γεμσιταβίνης. Η πρώτη παρατήρηση ήταν ότι ο καρκίνος του παγκρέατος προερχόμενα κύτταρα που υπερεκφράζουν REG4 πρωτεΐνη αυξήθηκε ταχύτερα και ήταν πιο ανθεκτικά στην θεραπεία γεμσιταβίνη (Σχήμα 4). Η δεύτερη, πιο σημαντική παρατήρηση ήταν ότι, σε ένα μοντέλο ξενομοσχεύματος, όγκους που επάγεται με κύτταρα Mia-PaCa2 εκφράζουν reg4 αυξήθηκε ταχύτερα από όγκους ελέγχου, που λαμβάνεται με φυσική Mia-PaCa2 κύτταρα (Σχήμα 5). Επιπλέον, βρήκαμε ότι οι όγκοι που προκαλούνται από κύτταρα Mia-PaCa2 εκφράζουν reg4 ήταν πιο ανθεκτικά στην γεμσιταβίνη μεταχείριση από τους όγκους ελέγχου, σε συμφωνία με το

in vitro

δεδομένων και προηγούμενες εκθέσεις προτείνοντας την εμπλοκή των REG4 σε κύτταρο ανθεκτικότητα σε αντικαρκινικά φάρμακα [15], [20] και την αντιμετώπιση της χημειοραδιοθεραπεία [27]. Η τρίτη, πολύ συναρπαστικό αποτέλεσμα ελήφθη όταν οι ποντικοί με Mia-PaCa2 επαγόμενη όγκοι υποβλήθηκαν σε αγωγή με συστηματική χορήγηση ενός ειδικού αντι-reg4 αντίσωμα (Σχήμα 6). Παρατηρήσαμε μια σημαντική μείωση του μεγέθους του όγκου και μία αυξημένη ευαισθησία σε θεραπεία gemcitabine σε ποντικούς χορηγείται μία φορά την εβδομάδα αντι-reg4 αντίσωμα. Επειδή η περιορισμένη αποτελεσματικότητα των παγκρεατικών θεραπείας του καρκίνου με γεμσιταβίνη μπορεί να οφείλεται στην παρουσία στρώματος σε όγκους [28], εξετάσαμε αν reg4 υπερέκφραση επηρέασε την έκταση του σχηματισμού στρώματος σε υποδόρια ξενομοσχευμένο κύτταρα Mia-PaCa2. Ημι-ποσοτική ανάλυση δεν αποκάλυψε σημαντική διαφορά μεταξύ όγκων που υπερεκφράζουν είτε όχι REG4, ή υποβάλλεται σε επεξεργασία με αντίσωμα REG4, όλοι τους δείχνουν πολύ περιορισμένη στρώμα (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Ωστόσο, τα αποτελέσματα μας θα μπορούσε να εξηγηθεί, τουλάχιστον εν μέρει, από το γεγονός ότι τα επίπεδα των αντιαποπτωτικών που σχετίζονται πρωτεΐνες όπως ενεργοποιημένο ΑΚΤ, Bcl-2, Bcl-xL και επιβιώνουν, καθώς και από τον κυτταρικό κύκλο πρωτεΐνη που συνδέεται με την κυκλίνη D1 , μειώθηκαν έντονα (Σχήμα 7) υποδεικνύει ότι η απόπτωση και κυτταρικό κύκλο ρυθμίζονται από reg4. Επειδή τα αντισώματα δεν μπορούσαν να διεισδύσουν κύτταρα όγκου σε μεγάλες ποσότητες, θα πρέπει να θεωρηθεί ως αυτοκρινή ή παρακρινή επίδραση. Μετά την έκκριση από κύτταρα όγκου, θα μπορούσε να ενεργοποιήσει reg4, πιθανώς μέσω ειδικών υποδοχέων, ενδοκυτταρικά μονοπάτια που ευνοούν την πρόοδο του καρκίνου. Τα στοιχεία αυτά είναι σε συμφωνία με τα κατά του παχέος εντέρου και του γαστρικού καρκίνου κύτταρα αποτελέσματα

in vitro

[21], [22]. Συνολικά, αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι η υπερέκφραση της πρωτεΐνης REG4, που προκαλείται από νωρίς το κέρδος του σε αριθμό αντιγράφων γονιδίου, παίζει σημαντικό ρόλο στην ανάπτυξη των όγκων του παγκρέατος και την αντίσταση σε αντικαρκινικά φάρμακα. Στόχευση κυκλοφορούσα πρωτεΐνη REG4 εμφανίζεται ως μια πολλά υποσχόμενη ανοσοενισχυτικό με τις τρέχουσες θεραπείες του παγκρέατος αδενοκαρκίνωμα, βασίζεται στην χορήγηση γεμσιταβίνης.

Υλικά και Μέθοδοι

Μελέτη του

reg4

αριθμού αντιγράφων γονιδίου σε καρκίνο του παγκρέατος

Δεκατέσσερις διαδοχικά δείγματα καρκίνου του παγκρέατος ελήφθησαν από ενδοσκοπικός υπέρηχος (EUS) -guided λεπτή κυτταρολογία βελόνη μεταξύ Ιουνίου 2007 και του Σεπτεμβρίου 2007 το νοσοκομείο Nord, Μασσαλία. Γραπτή συγκατάθεση λήφθηκε από όλους τους συμμετέχοντες. Έξι δείγματα ελήφθησαν από ασθενείς χωρίς ανιχνεύσιμη μετάσταση, ενώ 8 παρουσιάζονται με μεταστάσεις κατά τη στιγμή της παρακέντηση. DNA εκχυλίζεται, ενισχύεται και υβριδοποιήθηκε επί Affymetrix γονιδιώματος σε επίπεδο ανθρώπινης συστοιχία SNP 6.0 σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή (Affymetrix Inc.). Η Affymetrix Genome-Wide Ανθρώπινα Array SNP 6.0 διαθέτει περισσότερα από 1,8 εκατομμύρια δείκτες της γενετικής παραλλαγής, συμπεριλαμβανομένων περισσότερων από 906.600 πολυμορφισμών μονού νουκλεοτιδίου (SNPs) και πάνω από 946.000 ανιχνευτές για την ανίχνευση της μεταβολής αριθμού αντιγράφων. Η μέση απόσταση μεταξύ δείκτη αναλάβει όλα τα 1,8 εκατομμύρια SNP και να αντιγράψετε τον αριθμό δεικτών σε συνδυασμό είναι 696 βάσεις. Η σειρά περιλαμβάνει επίσης 202.000 ανιχνευτές που στοχεύουν 5677 γνωστή περιοχές του αντιγράφου παραλλαγή αριθμό, την επίλυση σε 3.182 διακριτές, μη-επικαλυπτόμενα τμήματα, από τη βάση δεδομένων Τορόντο του Γονιδιωματική παραλλαγές. Υβριδισμό, πλύσιμο, βαφή, και το chip σάρωσης εκτελέστηκαν από το Core διευκόλυνση των μικροσυστοιχιών CRCHUL χρησιμοποιώντας υλικά και μεθόδους που παρέχονται από τον κατασκευαστή (Affymetrix Inc.).

Η συνολική ποιότητα υβριδοποίηση εκτιμήθηκε από το δείκτη συντελεστής που λαμβάνεται από GeneChip γονοτυπική Λογισμικό Ανάλυσης (GTYPE, ο αλγόριθμος birdseed χρησιμοποιώντας τις προεπιλεγμένες ρυθμίσεις παραμέτρων). Αλληλόμορφες αναλογίες υπολογίστηκαν με την Partek Γονιδιωματική Σουίτα, έκδοση 6.4 (Partek Inc., St. Louis, ΜΟ) χρησιμοποιώντας τις αποκλειστικές προεπιλεγμένες παραμέτρους. 270 HapMap δείγματα χρησιμοποιήθηκε για τη δημιουργία αριθμού αντιγράφων από την αρχική τιμή. Γονιδιακό κατάτμηση χρησιμοποιήθηκε ως μέθοδος για την ανίχνευση του αριθμού αντιγράφων αλλοιώσεις. Περιοχές ανιχνεύθηκαν χρησιμοποιώντας τις ακόλουθες παραμέτρους κατάτμησης: τουλάχιστον 10 γονιδιωματικής δεικτών? όριο p-value κατάτμησης μικρότερη από 0.001? και ένα σήμα στο θόρυβο ισούται με 0,3. Χρησιμοποιώντας αυτές τις παραμέτρους, 10263 τμήματα ανιχνεύθηκαν. Επιλεγμένα τμήματα οπτικοποιήθηκαν σε μία γονιδιωματική πλαίσιο με τη Partek® Genomics Suite.

DNA από PanIN βλάβες

επτά τμήματα micron από, ενσωματωμένα σε παραφίνη τμήματα ιστού σταθεροποιημένα με φορμαλίνη χρωματίστηκαν με αιματοξυλίνη και ηωσίνη. Ομοιογενείς πληθυσμοί κυττάρων μικροτομή προσεκτικά χρησιμοποιώντας ένα σύστημα καταγραφής μικροανατομίας PixCell II Laser (Αρκτούρος, Mountain View, CA) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. PanINs βαθμολογήθηκαν 1 έως 3 σύμφωνα με τις τρέχουσες συστάσεις (https://pathology.jhu.edu/pancreas_panin/και [29]) ως συνάρτηση της σημασίας της αρχιτεκτονικής και κυτταρολογικές ανωμαλίες. Επτά ανθρώπινης παγκρεατικής δείγματα αναλύθηκαν στο οποίο βρήκαμε συστηματικά PanIN2 και PanIN3 βλάβες αλλά PanIN1 αλλοιώσεις βρέθηκαν μόνο σε 6 από αυτά. Συνολικά & gt? 300 κύτταρα συλλέχθηκαν για κάθε κατηγορία από διαδοχικές τομές ιστού. Συνολικές κύτταρα μεταφέρθηκαν σε ένα σωλήνα Eppendorf και επαναιωρήθηκαν σε 20-50 μΙ ρυθμιστικού διαλύματος λύσης που περιέχει 10 mM Tris, 1 mM EDTA, 0,5% Tween 20 (ρΗ 8.3), και 5 μΐ πρωτεϊνάσης Κ (20 mg /ml). Τα δείγματα επωάστηκαν 24 ώρες στους 55 ° C ακολουθούμενο από ζέση για 10 λεπτά για την αδρανοποίηση της πρωτεϊνάσης Κ DNeasy Tissue Kit (Qiagen) χρησιμοποιήθηκε για την εκχύλιση του DNA σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. Εκχυλισμένο DNA προσδιορίστηκε ποσοτικά χρησιμοποιώντας ένα NanoDrop ND-1000 φασματοφωτόμετρο (Nano-Drop Technologies, Wilmington, DE).

reg4

γονίδιο εκτίμηση του αριθμού αντιγράφων από την Real-Time PCR

reg4

αριθμού αντιγράφων γονιδίου προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας το hreg4-F: 5′-TTTACTCCCTGTGGTCTGGG-3 ‘και hreg4-R: 5′-CTCTTTTCTCCAGCAAGGCA-3’ εκκινητές. Διεξήχθη ενίσχυση σε LigthCycler 480 (Roche Diagnostic) χρησιμοποιώντας το ακόλουθο χρονοδιάγραμμα: 10 s μετουσίωση στους 95 ° C, 45 κύκλοι 8 s μετουσίωση στους 95 ° C, 7 s ανόπτηση στους 60,5 ° C και 14 s επέκτασης στους 72 ° ΝΤΟ. Τήξη καμπύλη ελήφθη με θέρμανση στους 20 ° C /s στους 95 ° C, ψύξη στους 20 ° C /s στους 65 ° C και θέρμανση στους 0,1 ° C /s στους 95 ° C με τη συλλογή δεδομένων φθορισμού σε διαστήματα 0,1 ° C. Πρότυπες καμπύλες παράχθηκαν χρησιμοποιώντας ένα 10-πλάσια σειρά αραίωσης που κυμαίνονται από 0,1 ng έως 100 ng. Πραγματοποιήσαμε qPCR για κάθε εις τριπλούν και προσδιορίζεται το κανονικοποιημένο σχετικό αριθμό αντιγράφων με τη δημιουργία μιας πρότυπης καμπύλης και ομαλοποίηση απέναντι δείγματα. Αποτελέσματα PCR αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας το λογισμικό RealQuant (Roche Diagnostic). Τα ίδια 14 δείγματα DNA από καρκίνο του παγκρέατος που χρησιμοποιούνται για υβριδισμό για την Affymetrix γονιδιώματος σε επίπεδο ανθρώπινης συστοιχία SNP 6.0 χρησιμοποιήθηκαν για qPCR. DNA από λευκοκύτταρα του αίματος που λαμβάνεται από φαινομενικά υγιή άτομα χρησιμοποιήθηκαν ως έλεγχος.

ρετροϊικού φορέα και μεσολάβηση ρετροϊών γονίδιο μεταφορά

Η πλήρης κωδικοποιητική αλληλουχία του cDNA reg4 ενισχύθηκε με PCR χρησιμοποιώντας το ζεύγος εκκινητών 5 «-GGGAATTCATGGCTTCCAGAAGCATGCGG-3 ‘(προς τα εμπρός) και 5′-GGCTCGAGCTATGGTCGGTACTTGCACAGG-3’ (αντίστροφος), που περιείχαν θέσεις περιορισμού EcoRI και XhoI (υπογραμμισμένη). Το προϊόν υποκλωνοποιήθηκε σε EcoRI-XhoI θέσεων περιορισμού του φορέα ρετροϊικής pLPCX που λαμβάνεται από S. Lowe (Cold Spring Harbor Laboratory, ΝΥ). Φοίνιξ αμφίτροπα κύτταρα πακεταρίσματος (10

6) τοποθετήθηκαν σε μια έξι-φρεατίων, επωάστηκαν για 24 ώρες και επιμολύνθηκαν με πολυαιθυλενοϊμίνη με 5 μg του ρετροϊικού πλασμιδίου. Σαράντα οκτώ ώρες αργότερα, το μέσο που περιέχει τον ιό διηθήθηκε (0.45 μm φίλτρο, Millipore) ώστε να ληφθεί το πρώτο υπερκείμενο. Στόχου Mia-PaCa2 απλώθηκαν σε 2 × 10

5 κύτταρα ανά 35 mm πιάτο και επωάζονται όλη τη νύχτα. Για τη μόλυνση, το μέσο καλλιέργειας αντικαταστάθηκε από ένα κατάλληλο μείγμα του πρώτου υπερκείμενου και μέσου καλλιέργειας (ν /ν), συμπληρωμένο με 4 g /ml polybrene (Sigma), και τα κύτταρα επωάστηκαν στους 37 ° C. Ο πληθυσμός του reg4 εκφράζουν Mia-PaCa2 (Mia-PaCa2 /reg4) απομονώθηκε με επιλογή με την παρουσία πουρομυκίνης (1 mg /ml). Mia-PaCa2 μολυνθεί με τον κενό φορέα (Mia-PaCa2 /κενό) χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος.

in vitro μελέτες

συνθήκες καλλιέργειας κυττάρων και siRNA επιμόλυνση.

Οι παγκρεατικού καρκίνου κυτταρικές γραμμές Mia-PaCa2 /reg4 και Mia-PaCa2 /κενών αναπτύχθηκαν σε τροποποιημένο μέσο Dulbecco Eagle (ϋΜΕΜ) συμπληρωμένο με 10% εμβρυϊκό βόειο ορό και 2 mM L-γλουταμίνη σε μία υγροποιημένη 5% CO

2 ατμόσφαιρα. Την ημέρα πριν την επιμόλυνση siRNA, τα κύτταρα επιστρώθηκαν σε πλάκες 6 φρεατίων για να δώσουν τελικά 30-50% συρροή. Μετά την απομάκρυνση του μέσου, τα κύτταρα πλύθηκαν μία φορά με μέσο και διαμόλυνση άνευ ορού έγινε σε μέσο χωρίς ορό με την προσθήκη ενός μίγματος που αποτελείται από 10 μΐ αντιδραστηρίου Oligofectamine (Invitrogen) και 200 ​​pmoles siRNA (siRNA reg4 [5’CTTCAGGAAGCTGAGGAAC3 ‘ ] ή ελέγχου siRNA [5’AATTCTCCGAACGTGTCACGT3 ‘] στοχευμένες αλληλουχίες) αραιώνεται σε 240 μΐ μέσου χωρίς ορό. Μετά από μια περίοδο επώασης 4 ωρών στους 37 ° C, το μέσο επιμόλυνσης που περιείχε siRNAs αντικαταστάθηκε με φρέσκο ​​μέσο.

Η ανάπτυξη των κυττάρων και gemcitabine θεραπεία.

10

4 κύτταρα /φρεάτιο σπάρθηκαν σε πλάκες 96 φρεατίων σε 100 μΐ μέσου καλλιέργειας. Την επόμενη ημέρα, γεμσιταβίνη (αγοράστηκε από την Eli Lilly) προστέθηκε σε 100 μΐ μέσου σε μια τελική συγκέντρωση 50 μΜ με την παρουσία ή όχι του 1 μα μονοκλωνικού αντισώματος reg4. Μετά από 48 ώρες, 20 μΙ MTS ([3- (4,5-διμεθυλθειαζολ-2-υλ) -5- (3-καρβοξυμεθοξυφαινυλ) -2- (4-σουλφοφαινυλ) -2Η-τετραζόλιο] αντιδραστήριο που λαμβάνεται από την Promega) προστέθηκε , οι πλάκες επωάστηκαν στους 37 ° C για 30 λεπτά, και η απορρόφηση αναγνώστηκε στα 490 nm.

in vivo μελέτες

Αξιολόγηση της

in vivo

ανάπτυξη του όγκου.

Θεσμικό κατευθυντήριες γραμμές για την σωστή και ανθρώπινη χρήση στην έρευνα ακολούθησαν. Περίπου 2 × 10

6 Mia-PaCa-2 κύτταρα εμβολιάστηκαν υποδορίως με 0.1 ml του Matrigel (BD Biosciences Discovery Labware) έως 6-εβδομάδων αρσενικούς γυμνούς ποντικούς. Μία ημέρα πριν από τον εμβολιασμό καρκινικών κυττάρων, η ομάδα ελέγχου έλαβε μια ενδοπεριτοναϊκή ένεση 150 μΙ PBS (όχημα), ενώ η ομάδα δοκιμασίας έλαβε 0,25 mg του reg4 μονοκλωνικού αντισώματος σε 150 μΐ PBS. ρυθμιστικό οχήματος ή αντι-reg4 αντίσωμα εγχύθηκε σε εβδομαδιαία βάση σε ζώα. Οι διαστάσεις του όγκου μετρήθηκαν μία φορά την εβδομάδα και ο όγκος όγκοι υπολογίζονται με τον τύπο μήκος Χ πλάτος Χ βάθος × 0,5236 όπως αναφέρθηκε προηγουμένως [30]. Η γεμσιταβίνη (100 mg /kg) εγχύθηκε ενδοπεριτοναϊκά δύο φορές την εβδομάδα. Όλες οι μελέτες πραγματοποιήθηκαν σύμφωνα με τους κανονισμούς της Ευρωπαϊκής Ένωσης για τα πειράματα σε ζώα. Τα πειράματα που εγκρίθηκε από την επιτροπή δεοντολογίας του Πανεπιστημίου της Μασσαλίας.

ανάλυση Western blot.

κύτταρα Mia-PaCa2 και τα δείγματα καρκινικού ιστού λύθηκαν σε ένα ρυθμιστικό διάλυμα ομογενοποίησης που περιέχει pepstatin (1,45 mM), λευπεπτίνη (2,1 mM), DTT, τριαιθανολαμίνη (50 mM) και EDTA /EGTA (0,1 mM). Τα κυτταρικά θραύσματα και τα αδιάλυτα υλικά απομακρύνθηκαν με φυγοκέντρηση (14.000 g, 30 λεπτά στους 4 ° C) και διαλυτά κλάσματα είτε αμέσως δοκιμάστηκαν ή αποθηκεύονται στους -80 ° C μέχρι τη χρήση. Η συνολική πρωτεΐνη (50 μg) φορτώθηκε σε ρυθμιστικό Laemmli επί μιας 12,5% γέλης SDS-πολυακρυλαμιδίου σε ένα Mini Κυττάρων (Bio-Rad). Οι πρωτεΐνες μεταφέρθηκαν σε μεμβράνες νιτροκυτταρίνης για 1 ώρα χρησιμοποιώντας ένα Mini Trans-Blot ηλεκτροφορητική μεταφορά κυττάρων (Bio-Rad). Η μεμβράνη αποκλείστηκε σε 1χ PBS /0.05% Tween 20/5% άπαχο ξηρό γάλα για όλη τη νύχτα στους 4 ° C. Μετά από δύο εκπλύσεις σε 1 χ PBS /0.005% Tween 20, πρωτογενή αντισώματα προστέθηκαν για 1-2 ώρες. Μετά από τρεις ακόμα εκπλύσεις, το δευτερεύον αντίσωμα προστέθηκε για 1.5 ώρα. Η μεμβράνη αναπτύχθηκε με τη χρήση της ενισχυμένης χημειοφωταύγειας (ECL) κιτ (Amersham Life Science) σε φιλμ Kodak στο σκοτεινό δωμάτιο. Η μεμβράνη στη συνέχεια απογυμνώνεται και ξαναϊχνηθετούνται για β-ακτίνη χρησιμοποιώντας το πρωτόκολλο που περιγράφεται στο κιτ ECL

Αντισώματα

Αντι-ανθρώπινο reg4 μονοκλωνικό αντίσωμα (Κλώνος 200214) αγοράστηκε από την R & amp..? D Systems? Bcl-2 (C21), Bcl-xL (Η-62), survivin (FL-142), η κυκλίνη D1 (C20) και β-ακτίνη (Ν-21) πολυκλωνικά κουνελιού αντισώματα ήταν από την Santa Cruz Biotechnology? φωσφορυλιωμένη ΑΚΤ (φωσφο-Ser473) πολύκλωνο αντίσωμα ήταν από την Upstate Biotechnology Inc?