Αφηρημένο

βήτα υποδοχέα θυρεοειδούς ορμόνης (

thrB

) γονίδιο συνήθως απελευθερωμένη σε καρκίνους και, όπως ενισχύθηκε από ζωικά μοντέλα, αξιωματική να παίξει ένα ρόλο όγκου-κατασταλτικό. προηγούμενες μελέτες μας έδειξαν αρνητική ρύθμιση του

thrB

με σαφείς καρκίνωμα νεφρικών κυττάρων (ccRCC), αλλά οι υπαίτια μηχανισμοί δεν έχουν πλήρως διευκρινιστεί. Δεδομένου επιγενετική ρύθμιση είναι ένας κοινός μηχανισμός που επηρεάζουν την έκφραση της καταστολείς όγκων, υποθέσαμε ότι μειορρύθμιση του

thrB

σε καρκίνο του νεφρού αποτελέσματα από επιγενετικές aberrances, συμπεριλαμβανομένων CpG μεθυλίωση και microRNA-εξαρτώμενη σίγηση. Η μελέτη μας έδειξε ότι ccRCC όγκοι εμφάνισαν μείωση κατά 56% στο

thrB

και μια αύξηση 37% στο DNA μεθυλοτρανσφεράση 1 (DNMT1) έκφραση σε σύγκριση με ζεύγη μη νεοπλασματικά δείγματα ελέγχου. Ωστόσο,

thrB

CpG ανάλυση μεθυλίωσης πραγματοποιείται με τη χρήση του BSP, στιγμιότυπο και MSP-PCR αποκάλυψε με συνέπεια καμία αλλαγή στα πρότυπα μεθυλίωσης μεταξύ αντίστοιχα δείγματα όγκου και ελέγχου.

Στο silico

ανάλυση οδήγησε στην ταυτοποίηση τεσσάρων microRNAs (miR-155, miR-425, miR-592 και miR-599) ως δυνητικά στόχευση

thrB

μεταγραφή. δοκιμασία λουσιφεράσης έδειξαν άμεση σύνδεση του miR-155 και miR-425 στην 3’UTR του

thrB,

και την επακόλουθη in vivo αναλύσεις αποκάλυψαν ότι η επιμόλυνση της κυτταρικής σειράς UOK171 με συνθετικό miR-155 ή miR-425 οδήγησε σε μείωση έκφραση των ενδογενών

TRHB

κατά 22% και 64%, αντίστοιχα. Τέλος, σε πραγματικό χρόνο ανάλυση PCR έδειξαν σημαντική προς τα πάνω ρύθμιση miR-155 (354%) και miR-425 (162%) σε ccRCC, σε σύγκριση με μάρτυρες. Επιπλέον, τα επίπεδα microRNA είχαν αρνητική συσχέτιση με την ποσότητα του

thrB

μεταγραφής σε δείγματα ιστού. Καταλήγουμε στο συμπέρασμα ότι η CpG μεθυλίωση δεν είναι ο κύριος μηχανισμός που συμβάλλει στη μειωμένη

thrB

έκφραση σε ccRCC. Σε αντίθεση,

thrB

απευθύνεται από microRNAs miR-155 και miR-425, των οποίων η αυξημένη έκφραση μπορεί να είναι υπεύθυνη για την ρύθμιση προς τα κάτω των

thrB

σε όγκους ccRCC

Αιτιολογική αναφορά.: Wojcicka Α, Piekielko-Witkowska Α, Κεντζιέρσκα Η, Rybicka Β, Poplawski P, Boguslawska J, et al. (2014) Επιγενετική κανονισμού της θυρεοειδικής ορμόνης βήτα υποδοχέα στον καρκίνο των νεφρών. PLoS ONE 9 (5): e97624. doi: 10.1371 /journal.pone.0097624

Επιμέλεια: Javier Σ Castresana, Πανεπιστήμιο της Ναβάρα, Ισπανία

Ελήφθη: 18, Δεκεμβρίου του 2013? Αποδεκτές: 23 του Απρίλη του 2014? Δημοσιεύθηκε: May 21, 2014

Copyright: © 2014 Wojcicka et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Η μελέτη υποστηρίχθηκε από το Εθνικό Κέντρο Επιστήμης χορηγεί NN401611940 και NN401047638 (σε AN), η UNESCO /FEBS Συνεργατική Πειραματική Υποτροφία για την Κεντρική & amp? Ανατολική Ευρώπη, το 2010 (για την AW), και το Εθνικό Κέντρο Διάδοσης Επιστημών Grant 2012/05 /Β /NZ5 /01541 (για να APW). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

υποδοχείς θυρεοειδούς ορμόνης (TRs): ΤΚα και ΤΡβ, είναι συνδέτη (3,5,3′-τριιωδοθυρονίνη, Τ3) -inducible παράγοντες μεταγραφής που μεσολαβούν στις κυτταρικές επιδράσεις των ορμονών του θυρεοειδούς, δηλαδή ενεργή μορφή της – T3 . Από Τ3-εξαρτώμενη γονίδια περιλαμβάνουν πολυάριθμα σημαντικοί ρυθμιστές του κυτταρικού κύκλου, όπως MDM2, ρ53 και του βλαστώματος του αμφιβληστροειδούς [1], [2], οι δράσεις των TR συμβάλλουν στη διατήρηση των βασικών κυτταρικών διεργασιών που συμπεριλαμβάνουν τον πολλαπλασιασμό, τη διαφοροποίηση, την απόπτωση και το μεταβολισμό [3]. TRs περιλαμβάνουν 3 λειτουργικές πρωτεΐνες: TRα1, TRβ1 και TRβ2, που κωδικοποιείται από

thrA

και

thrB

γονίδια. Οι TRα1 και TRβ1 υποδοχείς που εκφράζονται σε σχεδόν όλους τους ιστούς, αλλά τα επίπεδα έκφρασης τους και τη λειτουργικότητα εξαρτάται από τον τύπο του κυττάρου και αναπτυξιακό στάδιο ενός οργανισμού. Disturbed δραστηριότητα των TR, που προκύπτει από aberrances στην έκφραση ή αλληλουχίες γονιδίων που κωδικοποιούν TRs είναι ένα κοινό φαινόμενο σε ανθρώπινους καρκίνους. Οδηγεί σε διαταραχθεί η έκφραση της Τ3 που εξαρτώνται από τα γονίδια και, κατά συνέπεια, σε σοβαρή βλάβη στην κυτταρική ομοιόσταση. Οι παρατηρήσεις αυτές οδήγησαν στην υπόθεση σχετικά με το κατασταλτικό όγκου ρόλο του ΤΡβ, επιβεβαιώθηκε περαιτέρω σε διάφορες κομψό μελέτες που διεξήχθησαν σε κυτταρικές σειρές και τα μοντέλα ποντικού [4], [5].

Ένας από τους καρκίνους στους οποίους aberrances σε λειτουργία ΤΡβ παρατηρούνται συχνά, είναι ο πιο κοινός τύπος των νεφρικών όγκων – διαυγοκυτταρικό νεφροκυτταρικό καρκίνωμα (ccRCC). Το πιο ενδιαφέρον,

thrB

γονίδιο κατοικεί μέσα 3p21-25 χρωμοσωμική περιοχή, που είναι γνωστή ως hot spot για μεταλλάξεις σε γονίδια που εμπλέκονται στην παθογένεια ccRCC [6]. Οι υπαίτια μηχανισμοί έχουν εντοπιστεί μέχρι στιγμής περιλαμβάνουν μεταλλάξεις, παρεκκλίνουσα έκφραση και την απορύθμιση μάτισμα [7], [8], [9].

Έχει αποδειχθεί ότι ccRCC συνοδεύεται από επιγενετικές aberrances που μπορούν να συμβάλλουν άμεσα στην ογκογόνο διαδικασία , που δρουν σε πρώιμο και προκαρκινικών φάση του πολυσταδιακή νεφρική ογκογένεση [10]. Πολλές πρόσφατες μελέτες δείχνουν ότι επιγενετικές απορρύθμιση είναι μεταξύ των κύριων αιτιών της εκτροχιάστηκε δράσεων καταστολείς των όγκων σε καρκίνους, και πιο συχνά εντοπίζονται μηχανισμοί περιλαμβάνουν μεθυλίωση του DNA και microRNAs. Μεθυλίωσης του DNA συνίσταται στην προσθήκη μίας ομάδας μεθυλίου σε κυτοσίνη προηγείται γουανίνης (CpG) σε αλληλουχία DNA, και καταλύεται από μεθυλοτρανσφεράσες DNA (DNMTs): DNMT1, Dnmt3a και DNMT3B. Dnmt3a και DNMT3B είναι

de novo

μεθυλτρανσφεράσες, που εκφράζεται κατά κύριο λόγο κατά τα πρώτα στάδια της ανάπτυξης [11] ότι η διατήρηση της γονικής μοτίβα μεθυλίωσης. DNMT1 αναφέρεται ως το μεθυλοτρανσφεράσης συντήρηση, καθώς είναι υπεύθυνη για τη διατήρηση προτύπων μεθυλίωσης κατά τη διάρκεια της αντιγραφής του DNA [12]. Παρεκκλίνουσα μεθυλίωση του καρκίνου προκαλείται από διαταραχή της έκφρασης και λειτουργίας των DNMTs. Τα καρκινικά κύτταρα συνήθως εμφανίζουν συνολική γονιδιωματική υπομεθυλίωση, οδηγώντας σε αστάθεια μικροδορυφόρου και ενεργοποίηση των γονιδίων που εμπλέκονται σε μεταστατικό αλλαγές [13], [14]. Ταυτόχρονα, σοβαρή υπερμεθυλίωση ρυθμιστικές περιοχές supressors όγκου, την επιδιόρθωση του DNA και τα γονίδια ελέγχου κυτταρικού κύκλου οδηγεί στην εξέλιξη του καρκίνου [15]. Για ccRCC φάνηκε ότι πολυάριθμες περιπτώσεις μειωτικά έκφρασης VHL ογκοκατασταλτικών, αδρανοποιημένο σε περ. 50% των ασθενών ccRCC, προκύπτουν από υπερμεθυλίωση προαγωγέα του γονιδίου [16].

Τα microRNAs (miRNAs) είναι σύντομες RNAs που αναστέλλουν την έκφραση των γονιδίων που κωδικοποιούν πρωτεΐνες με σύνδεση προς συμπληρωματικές αλληλουχίες σε 3’UTRs (αμετάφραστες περιοχές ) των αντιγράφων τους. Η αλληλουχία υπεύθυνη για αυτή την αναγνώριση περικλείει τα νουκλεοτίδια 2-8 της miRNA και πρέπει να είναι πλήρως συμπληρωματική με την αλληλουχία στόχο στο mRNA [17]. Πολυάριθμες καρκίνοι εμφανίζουν ανώμαλη έκφραση του microRNAs, οδηγώντας σε σοβαρές αλλαγές στο μεταγραφικό και πρωτέωμα ενός καρκινικού κυττάρου. Για ccRCC, ένας αριθμός microRNAs δείχθηκαν να απελευθερωθεί στον όγκο [18] – [21]. Τόσο η μεθυλίωση του DNA και microRNA εξαρτώμενη ρύθμιση έφεραν πρόσφατα την προσοχή ως δύο μηχανισμός με μεγαλύτερο δυναμικό για πιθανές θεραπευτικές παρεμβάσεις [22]. Δείχθηκε ότι ογκοκατασταλτικών γονιδίων, σιγήσει λόγω DNA υπερμεθυλίωση, μπορεί να επανενεργοποιηθεί με παράγοντες απομεθυλίωσης. Επιπλέον, microRNA μιμείται και αναστολείς σήμερα αξιολογούνται ως θεραπευτικά μόρια που δείχνουν υπόσχεση στην εξατομικευμένη αντικαρκινικό φάρμακο [23].

Ο ρόλος των επιγενετικών αλλαγών στο

thrB

διαταραχές στον καρκίνο έχει διερευνηθεί σε ένα λίγες μελέτες. Ο πιθανός ρόλος των microRNA-εξαρτώμενη ρύθμιση στο

thrB

αποσιώπηση προτάθηκε για ccRCC [9] και αποδεδειγμένη για θηλώδες καρκίνωμα του θυρεοειδούς [24]. Αρκετές άλλες μελέτες πρότειναν DNA υπερμεθυλίωση ως μηχανισμός που συμβάλλει στην

thrB

αποσιώπηση στη λευχαιμία και ο καρκίνος του μαστού, του πνεύμονα και του θυρεοειδούς [25] – [30]

Οι μελέτες αυτές, καθώς και συχνές. επιγενετικές απορρυθμίσεις που παρατηρείται σε ccRCC [31], μας ώθησε να αναλύσει τις πιθανές επιπτώσεις της μεθυλίωσης του DNA και microRNA-εξαρτώμενη ρύθμιση στο

thrB

έκφρασης σε καρκίνο του νεφρού.

Υλικά και Μέθοδοι

Υλικό

δείγματα ιστών λήφθηκαν με την άδεια της Επιτροπής Βιοηθικής του Κέντρου Μεταπτυχιακών Ιατρικής Εκπαίδευσης στη Βαρσοβία από ασθενείς με καρκίνωμα σαφή κυττάρων νεφρικών κυττάρων (ccRCC) (Πίνακας S1). Γραπτή συγκατάθεση λήφθηκε από όλους τους ασθενείς. Τα δείγματα χωρίστηκαν σε δύο ομάδες: καρκινικούς ιστούς (n = 35, Τ) και τους ιστούς ελέγχου (ζεύγη φυσιολογικό ιστό από τον αντίθετο πόλο του κακοήθους νεφρού (& gt? 5 cm από όγκο) χωρίς ιστολογικές ενδείξεις όγκου? N = 35 , C). ccRCC διαγνώστηκε με ιστολογία, σύμφωνα με τα κριτήρια του ΠΟΥ [32]

Οι ακόλουθες κυτταρικές σειρές χρησιμοποιήθηκαν στην μελέτη:. 1) ΗΚ-2 (ATCC Νο .: CRL-2190), ένα εγγύς σωληνοειδές κυτταρική γραμμή που λαμβάνεται από φυσιολογικό νεφρό, αθανατοποιημένα με μεταγωγή με τον ιό του ανθρώπινου θηλώματος 16 (HPV-16) γονίδια Ε6 /Ε7. 2) UOK171 (UOB όγκου κυτταρική γραμμή Repository, που παρέχονται από το Δρ W Marston Linehan, ΝΙΗ, NCI, Bethesda, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής, δίπλωμα ευρεσιτεχνίας E-033-2010 /0): προέρχεται από το στάδιο IV ccRCC όγκου, αυθόρμητα απαθανάτισε. 3) HeLa (ΑΤΤΟ nr αδενοκαρκίνωμα CCL-τραχήλου. Όλες οι κυτταρικές σειρές καλλιεργήθηκαν σύμφωνα με τις οδηγίες του προμηθευτή.

Real-time PCR

RNA απομονώθηκε και αντίστροφη μεταγραφή όπως περιγράφηκε προηγουμένως [33]. 200 ng RNA χρησιμοποιήθηκε για ανάστροφη μεταγραφή Real-time PCR πραγματοποιήθηκε όπως περιγράφηκε προηγουμένως [33] χρησιμοποιώντας εκκινητές ειδικούς για μεταγραφές

thrB

(thrB-RT-F:. GAACAGTCGTCGCCACATC και thrB-RT-R: GCTCGTCCTTGTCTAAGTAAC) και

DNMT1

(DNMT1-RT-F: TTATCCGAGGAGGGCTAC και DNMT1-RT-R:. GGCTTCACTTCTTGCTTG) αντίστροφη μεταγραφή και PCR πραγματικού χρόνου της microRNAs διεξήχθη όπως περιγράφηκε προηγουμένως [34] με χρήση ανιχνευτών Taq-man ειδικά για HSA-miR-155 (Life Technologies, Carlsbad, CA, USA, αρ. κατ. 002623) και HSA-miR-425 (Life Technologies, Carlsbad, CA, USA, αρ. κατ. 001516). Σχετική ποσοτικοποίηση κάθε εκφραζόμενα miRNA υπολογίστηκε χρησιμοποιώντας την πρότυπη μέθοδο 2-ΔΟΙ σύνδεσης μεταξύ της microRNA και

thrB

έκφραση σε δείγματα ιστού υπολογίσθηκε με τη χρήση του R περιβάλλον [35], καθώς και την ανάλυση πολλαπλής συσχέτισης σύμφωνα με τον τύπο:.

5-αζα-2’δεοξυκυτιδίνη Θεραπεία

Κομμουνισμού-171 κύτταρα σπάρθηκαν επί πλακών 12 φρεατίων (Corning, ΝΥ, USA) σε ποσότητα 5 × 10∧4 ανά φρεάτιο. Τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν 24 ώρες σε πρότυπες συνθήκες, που ακολουθείται από προσθήκη 100 mM ή 10 mM 5-αζα-2’δεοξυκυτιδίνη (5-αζα-dC) (Sigma-Aldrich, Saint Louis, ΜΟ, USA). Μετά από 24 ώρες τα κύτταρα πλύθηκαν με PBS και χρησιμοποιήθηκαν για την απομόνωση του RNA.

Ανάλυση του

thrB

μεθυλίωση

Για την ανάλυση μεθυλίωσης, χρησιμοποιήσαμε την αλληλουχία του δημοσιευθεί προηγουμένως

thrB

υποκινητή [36], GenBank Acc. όχι. S37458.1), ενημερώνεται σύμφωνα με την αλληλουχία του χρωμοσώματος 3 γενωμικού contig (GenBank Acc. Νο. NT_022517.18). Λόγω disconcordance μεταξύ των δύο αλληλουχιών κατατεθεί, κλωνοποιήσαμε και άμεσα η αλληλουχία DNA περιοχής που περιλαμβάνει

thrB

υποκινητή.

Για να επιτευχθεί αυτό, γονιδιακό DNA απομονώνεται από ένα μη-νεοπλασματική δείγμα νεφρού όπως περιγράφεται προηγουμένως [37]. Η περιοχή που περιέχει

thrB

προαγωγός ενισχύθηκε χρησιμοποιώντας τους εκκινητές thrB-HindIII-PromU (CGTAAAGCTTCATATGGGTAACACTGAGGGCATAGC) και thrB-HindIII-PromL (CGTAAAGCTTACTCCTTGGGCGAAGAGAGGC) και Hot Start Perpetual OptiTaq (EURx, Γκντανσκ, Πολωνία), υπό τις ακόλουθες προϋποθέσεις: . 95 ° C-10 λεπτά, 5 κύκλοι: [96 ° C-35 s, 62 ° C-30 s, 73 ° C-80 s], 40 κύκλοι: [96 ° C-40 s, 59 ° C-30 s, 72 ° C-80 s], τελική επιμήκυνση: 72 ° C, 10 min. Το ληφθέν προϊόν της PCR κλωνοποιήθηκε σε φορέα ρΟΕΜ-Τ (Promega, Madison, WI, USA) και η αλληλουχία τους. Η ληφθείσα ακολουθία κατατέθηκε στην GenBank (Acc όχι. KF669869).

Για την αναγνώριση νησίδες CpG, χρησιμοποιήσαμε

in silico

ανάλυση με τη χρήση CpG Οικόπεδο [38] και CpG νησί Searcher [39], CpG περιοχή πλούσια ανιχνεύθηκε σε μια αλληλουχία που περιλαμβάνει τον υποκινητή και 5 ‘UTR (εξόνιο 1) του ΤΡβ μεταγραφής.

Για να αναλυθεί η μεθυλίωση του

thrB

νησίδες CpG, 800 ng γενωμικού DNA ήταν όξινο θειώδες, μετατρέπονται χρησιμοποιώντας Αποτύπωμα DNA Τροποποίηση Kit (Sigma-Aldrich, Saint Louis, MO, USA) σύμφωνα με τις οδηγίες manufecturer του. Να προβλέψει τις νουκλεοτιδικές αλλαγές που προκύπτουν από όξινο θειώδες μετατροπή,

thrB

ακολουθία ήταν

in silico

μετατρέπονται χρησιμοποιώντας Φίδι γόης (https://insilico.ehu.es/restriction/two_seq/snake_charmer.html) και να χρησιμοποιηθούν για το σχεδιασμό των εκκινητών.

για να εκτελέσετε Bisulfite-αλληλουχίας PCR (BSP), 100 ng του όξινου θειώδους-μετατραπεί DNA χρησιμοποιήθηκε μαζί με Perpetual Taq HOT START (EURx, Γκντανσκ, Πολωνία) πολυμεράσης και εκκινητών δίνονται στον πίνακα S2, υπό τις ακόλουθες συνθήκες: αρχική μετουσίωση: 95 ° C, 10 λεπτά, 38 κύκλοι: [μετουσίωση: 95 ° C-15 s, ανασύνδεση: 56 ° C ή 57 ° C-15 s, επιμήκυνση: 68 ° C -30 s], τελική επιμήκυνση: 75 ° C, 15 min, τελική επώαση: 4 ° C. Η θερμοκρασία ανόπτησης κυμαίνεται από 56 ° C έως 67 ° C, ανάλογα με τα χρησιμοποιούμενα αρχικά τεμάχια (Πίνακας S2). Τα ληφθέντα προϊόντα PCR απευθείας αλληλουχήθηκαν με μια εμπορική υπηρεσία (Genomed, Βαρσοβία, Πολωνία).

μεθυλίωσης-ειδική PCR (MSP-PCR) πραγματοποιήθηκε όπως περιγράφηκε προηγουμένως [26]. Οι αλληλουχίες των εκκινητών δίδεται στον Πίνακα S3.

ανάλυση στιγμιότυπο διεξήχθη χρησιμοποιώντας στιγμιότυπο Multiplex Kit (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) και εκκινητές δίδονται στον Πίνακα S3 σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Τα προϊόντα αναλύθηκαν με μια εμπορική υπηρεσία (Biote21, Κρακοβία, Πολωνία).

Η ειδικότητα των εκκινητών που χρησιμοποιούνται για την ανάλυση μεθυλίωσης αναλύθηκε χρησιμοποιώντας MethPrimer [40].

Ανάλυση των microRNAs Στόχευση

thrB

Απομαγνητοφώνηση

microRNAs δυνητικά δεσμευτικός

thrB

3’ΙΙΤΡ είχαν προβλεφθεί χρησιμοποιώντας miRecords και DIANA-mirPath [41], [42] (Πίνακας S4). Στη συνέχεια, PubMed αναζητήθηκε για να βρείτε πληροφορίες σχετικά με την έκφραση των προβλεπόμενων microRNAs στο ccRCC. Μόνο microRNAs με τόσο αναφερθεί αυξημένη έκφραση σε νεφρική όγκους και, ενδεχομένως, με στόχο την

thrB

μεταγραφή ελήφθησαν για περαιτέρω ανάλυση.

Για να αναλυθεί η επίδραση των microRNAs για τους αυτόχθονες

thrB

έκφρασης , UOK171 κύτταρα σπάρθηκαν επί πλακών 12 φρεατίων (Corning, ΝΥ, USA) χρησιμοποιώντας 5 × 10∧4 κύτταρα ανά φρεάτιο και επιμολύνθηκαν 24 ώρες αργότερα. μίγμα Μορφομετατροπή παρασκευάστηκε ως εξής: 1) 2 μΙ Lipofectamine 2000 (Invitrogen /Life Technologies, Carlsbad, CA, USA) αναμίχθηκαν με 125 μΐ Opti-ΜΕΜ (Gibco /Life Technologies, Carlsbad, CA, USA), και 2) 50 pmol microRNA μιμείται ή αναστολέων (Ambion /Life Technologies, Foster City, CA, USA, Πίνακας S5) αναμίχθηκαν με 125 μΐ Opti-MEM. Μετά από 10 επώαση λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου τα διαλύματα συνενώθηκαν, επωάστηκαν για επιπλέον 10 λεπτά, και προστέθηκαν στα φρεάτια. Μετά από 6 ώρες μίγματα διαμόλυνσης αντικαταστάθηκαν με πλήρη μέσο. Μετά από 24 ώρες, τα κύτταρα συλλέχθηκαν για την απομόνωση του RNA.

Για λουσιφεράσης προσδιορισμούς ρεπόρτερ, HeLa επιλέχθηκαν λόγω της χαμηλής έκφρασης ενδογενούς του microRNAs (Σχήμα S1). Τα κύτταρα σπάρθηκαν επί πλακών 12 φρεατίων (Corning, ΝΥ, USA) χρησιμοποιώντας 5 × 10∧4 κύτταρα ανά φρεάτιο και επιμολύνθηκαν 24 ώρες αργότερα. Η επιμόλυνση μίγμα παρασκευάστηκε ως εξής: 1) 4 μl ΡΕΙ 1 μg /μl (πολυαιθυλενοϊμίνης, Polysciences, Warrington, ΡΑ, USA) αναμίχθηκαν με 125 μΐ Opti-Mem, και 2) 1 μg pGL3-Luc-3’UTR-thrB πλασμίδιο (Jazdzewski et al., 2011) αναμίχθηκε με 125 μλ Opti-Mem. Για το πλασμίδιο αναφοράς, τα ακόλουθα μίγματα παρασκευάστηκαν: 1) 2 μl ΡΕΙ με 62,5 μΐ Opti-Mem, και 2) 100 ng ρΡΙ_-ΤΚ πλασμίδιο (Promega, Madison, WI, USA) με 62.5 μΙ Opti-Mem. Μετά από 20 επώαση λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου τα διαλύματα συνενώθηκαν, επωάστηκαν για επιπλέον 20 λεπτά και προστέθηκαν σε φρεάτια καλλιέργειας που περιέχει 700 μΙ μέσου χωρίς FBS. Μετά από 6 ώρες, το μέσο αντικαταστάθηκε με μίγματα επιμόλυνσης που περιείχε microRNA mimics- παρασκευάστηκε όπως περιγράφεται παραπάνω. Πληροφορίες σχετικά με μιμείται microRNA και αναστολείς δίνεται στον Πίνακα S5. Μετά από 6 ώρες, τα μίγματα διαμόλυνσης αντικαταστάθηκαν με πλήρες μέσο? κύτταρα λύθηκαν μετά από 24 ώρες και αναλύθηκαν σε διπλή δοκιμασία λουσιφεράσης Reporter (Promega, Madison, WI, USA) χρησιμοποιώντας Synergy 2 φωτόμετρο (BioTek, Winooski, VT, USA).

Αποτελέσματα

Η έκφραση του

thrB

και

DNMT1

αλλάζει με καρκίνο του νεφρού

σε πραγματικό χρόνο ανάλυση να πραγματοποιηθεί στο ccRCC και ζεύγη δειγμάτων μη-νεοπλασματικές ελέγχου PCR αποκάλυψε σημαντικές αλλαγές στο

thrB

έκφραση mRNA (Σχήμα 1). Η έκφραση του

thrB

μειώθηκε κατά 56% (p & lt? 0.0001) στον όγκο, σε σύγκριση με τα δείγματα ελέγχου. Η μείωση της έκφρασης βρέθηκε σε 32 από τα 35 (91,4%) που αναλύθηκαν ζεύγη δειγμάτων.

Α.

thrB

και

DNMT1

mRNA έκφραση σε δείγματα ιστού: μη νεοπλασματική ελέγχου (C, n = 35) και σε συνδυασμό δείγματα ccRCC (Τ, n = 35). Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως επί τοις εκατό του ελέγχου (C). Real-time PCR για κάθε δείγμα έγινε εις τριπλούν. Η στατιστική ανάλυση έγινε με τη χρήση Wilcoxon τεστ ζεύγος. **** P & lt? 0,0001. B. Η έκφραση του

thrB

και

DNMT1

mRNA σε κυτταρικές σειρές: HK2: εγγύς σωληνοειδή γραμμή κυττάρων που προέρχονται από φυσιολογικό νεφρό, UOK171: κυτταρική σειρά ccRCC που προέρχεται από το στάδιο IV του όγκου, αυθόρμητα απαθανάτισε. Οι γραφικές παραστάσεις δείχνουν τα αποτελέσματα των πέντε ανεξάρτητων βιολογικά πειράματα, μετρήθηκε εις τριπλούν. Η στατιστική ανάλυση πραγματοποιήθηκε με τη χρήση t-test. ** P & lt?. 0.01

Η

Σε πραγματικό χρόνο ανάλυση PCR πραγματοποιήθηκε σε cDNA από νεφρικών κυττάρων γραμμές επιβεβαίωσε μειωμένη έκφραση του

thrB

στον καρκίνο του νεφρού.

thrB

έκφραση ήταν 63% (p = 0.0036) χαμηλότερο σε κυτταρική σειρά ccRCC UOK171 σε σύγκριση με μη-καρκινικά κύτταρα ΚΘ2 (Σχήμα 1).

Προηγούμενες μελέτες αναλύοντας την έκφραση του DNA μεθυλοτρανσφεράση 1 (DNMT1) σε καρκίνο του νεφρού έφερε αντικρουόμενα αποτελέσματα [43] – [45]. Ως εκ τούτου, αποφασίσαμε να αναλύσουμε

DNMT1

έκφρασης στη μελέτη μας. επίπεδα DNMT1 mRNA αυξήθηκαν σε 22 από τα 35 δείγματα που αναλύθηκαν ccRCC όταν συγκρίνονται με αντίστοιχους μάρτυρες (Σχήμα 1). Η μέση DNMT1 έκφραση σε ιστούς όγκων αυξήθηκε κατά 38% σε σύγκριση με ζευγαρωμένα δείγματα ιστού ελέγχου (ρ = 0.0098). Σε κυτταρικές σειρές, η έκφραση DNMT1 αυξήθηκε κατά 27% σε UOK171 σε σύγκριση με τους μη ογκογόνους ΚΘ2 γραμμή κυττάρων (p = 0,0059).

Αυτά τα αποτελέσματα έδειξαν ότι η αυξημένη

DNMT1

επίπεδα σε δείγματα ccRCC θα μπορούσε ενδεχομένως να οδηγήσει σε αυξημένη μεθυλίωση CpG οδηγεί σε ελάττωση του

thrB

έκφρασης.

Ανάλυση του

thrB

CpG μεθυλίωση σε καρκίνο του νεφρού

για να ελέγξετε αν η μειώθηκε

thrB

έκφραση θα μπορούσαν να προκύψουν από CpG υπερμεθυλίωση, UOK171 κύτταρα καλλιεργήθηκαν παρουσία ή απουσία αναστολέα DNMT1, 5-αζα-dC. Η θεραπεία με 5-αζα-dC οδήγησε σε στατιστικά σημαντική (p = 0,0124), 37% αύξηση του

thrB

έκφραση όταν συγκρίθηκαν με τον έλεγχο, τα μη επεξεργασμένα κύτταρα (Σχήμα 2Α).

A. Η επίδραση της δεοξυκυτιδίνης 5-αζα-2 ‘(5-αζα-dC) στο

thrB

έκφραση mRNA σε κυτταρική γραμμή UOK171. Τα αποτελέσματα παρουσιάζονται ως επί τοις εκατό του ελέγχου (τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν χωρίς συμπλήρωση 5-αζα-dC). Το διάγραμμα δείχνει τα αποτελέσματα τριών ανεξάρτητων βιολογικά πειράματα, μετρήθηκε εις τριπλούν. Η στατιστική ανάλυση πραγματοποιήθηκε με τη χρήση t-test. * P & lt? 0,05. B. Η αλληλουχία του

thrB

γονίδιο με την περιοχή υποκινητή (GenBank Acc.no. KF669869). νησί CpG, που περιλαμβάνει τον υποκινητή και 1

ου εξόνιο (περιοχή -873 έως 355) είναι σκιασμένο μπλε. ΤΑΤΑ είναι με έντονα γράμματα. Τα CpG δινουκλεοτίδια σκιασμένο γκρι. Πεζά γράμματα δείχνουν 1

ου εξόνιο της μεταγραφής ΤΡβ. Γ Εκπρόσωπος ηλεκτροφορητική ανάλυση των MSP-PCR. Τα προϊόντα PCR που λαμβάνονται με εκκινητές ειδικούς για να μη μεθυλιωμένες ακολουθία?: U M: Τα προϊόντα PCR που λήφθηκαν με εκκινητές ειδικούς για μεθυλιωμένο αλληλουχία. C: δείγματα ελέγχου, Τ:. Δείγματα όγκων

Η

Για να προσδιορίσετε αν η αποκατάσταση της

thrB

έκφρασης σε καρκίνο του νεφρού είναι άμεσα ρυθμίζεται από τη μεθυλίωση προαγωγού,

thrB

ακολουθίες αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας CpG οικοπέδου και CpG νησί Searcher. Και τα δύο προγράμματα προέβλεπαν CpG-πλούσια περιοχή εντός του υποκινητή και 5’UTR του

thrB

γονίδιο, που περιλαμβάνει τα νουκλεοτίδια -873 έως 355 (Εικόνα 2Β). Στη συνέχεια, η προβλεπόμενη περιοχή αναλύθηκε χρησιμοποιώντας όξινου θειώδους αλληλούχισης PCR (BSP). Για το σκοπό αυτό, δείγματα DNA από 15 ζεύγη ιστών ccRCC και αντίστοιχα μη οιδηματώδης δείγματα νεφρών ελέγχου ήταν διθειώδους-μετατραπέν και άμεσα η αλληλουχία του. Αποτελεσματική διθειώδους μετατροπή επιβεβαιώθηκε σε αντιδράσεις PCR με τη χρήση των εκκινητών σχεδιασμένων να στοχεύουν μητρική

thrB

υποκινητή και δεν ενισχύουν διθειώδους μετατραπέντα DNA. αντιδράσεων ενίσχυσης του ελέγχου πραγματοποιείται σε όξινο θειώδες μετατρέπεται DNA που παράγεται κανένα προϊόν ενίσχυσης (οι ακολουθίες εκκινητή μάρτυρα δίνονται στον Πίνακα S2). Αυτή η ανάλυση αποκάλυψε έλλειψη διαφορές στα πρότυπα μεθυλίωσης μεταξύ ζευγαρωμένα δείγματα ελέγχου και όγκου από τον ίδιο ασθενή (Σχήμα S2). Να επαληθεύσουν τα αποτελέσματα των BSP, το όξινο θειώδες μετατρέπεται DNA ήταν επιπλέον αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας στιγμιότυπο και MSP-PCR, μια ιδιαίτερα ευαίσθητη μέθοδος που επιτρέπει την ανίχνευση του 0,1% μεθυλιωμένων αλληλόμορφα ενός δεδομένου CpG νησί τόπο [46] (Σχήμα 2C). Αυτές οι αναλύσεις επιβεβαίωσαν ότι δεν υπήρχαν αλλαγές στα πρότυπα μεθυλίωσης CpG σε δείγματα ccRCC σε σύγκριση με ζεύγη δειγμάτων ελέγχου. Είναι ενδιαφέρον ότι, τα αποτελέσματα MSP-PCR πρότεινε ότι προτύπων μεθυλίωσης ποικίλει μεταξύ διαφορετικών ασθενών, επειδή είναι μάλλον ειδικά για τον ασθενή από επηρεάζεται από την κατάσταση της ασθένειας.

Συμπερασματικά, αυτά τα αποτελέσματα έδειξαν ότι αν και οι αλλαγές σε δραστηριότητα DNMT1 μπορεί να συνεισφέρει σε μεταβολές του

thrB

έκφραση σε καλλιέργειες κυττάρων, η διαταραγμένη έκφραση του

thrB

σε δείγματα ιστών ccRCC είναι μάλλον δεν είναι αποτέλεσμα της ανώμαλης, όγκου-ειδικά υπερμεθυλίωση του υποκινητή του γονιδίου.

microRNAs miR-155 και miR-425 Άμεσα στόχος

thrB

3’ΙΙΤΡ

Για την πρόβλεψη microRNAs δυνητικά επηρεάζουν

thrB

έκφρασης σε καρκίνο του νεφρού, έγινε ανάλυση σε δύο στάδια. Πρώτον, βιοπληροφορική ανάλυση χρησιμοποιώντας miRecords (ένας πόρος που συνδυάζει 11 βιοπληροφορικής προγράμματα) και Diana-mirPath προβλέψει σχεδόν 600 microRNAs δυνητικά στόχευση

thrB

3’ΙΙΤΡ. Ωστόσο, με βάση την υπόθεση ότι η φίμωση της αποτελεσματικότητας είναι η υψηλότερη για τα microRNAs που βρίσκονται μέσα στην πλησιέστερη απόσταση από κάθε άκρο του 3’UTR [47] θα επικεντρωθεί ειδικά στην microRNAs που συμμορφώθηκαν με τον κανόνα αυτό. Μεταγενέστερες αναζήτηση σε PubMed επιτρέπεται για την επιλογή των microRNAs που αναφέρθηκαν ως υπερεκφράζεται σε καρκίνο του νεφρού [18] – [21]. Χρησιμοποιώντας την προσέγγιση σε δύο στάδια, τέσσερα microRNAs (miR-155, miR-425, miR-592 και miR-599) επιλέχθηκαν για περαιτέρω ανάλυση.

Για να βρείτε αν οι επιλεγμένες microRNAs δεσμεύσει πράγματι η 3’UTR του

thrB

, κύτταρα HeLa επιμολύνθηκαν χρησιμοποιώντας συνθετικά microRNAs και μια κατασκευή αναφοράς pGL3-Luc-3’UTR-

thrB

(Σχήμα 3). κύτταρα HeLa επιλέχθηκαν για την ανάλυση αυτή οφείλεται στη χαμηλή ενδογενή έκφραση του

thrB

και αναλύονται microRNAs. Η επιμόλυνση των κυττάρων με προ-miR-155 ή προ-miR-425 είχε ως αποτέλεσμα 32% ή 17% μείωση της δραστηριότητας της λουσιφεράσης, αντίστοιχα, σε σύγκριση με μιμείται miRNA ελέγχου (ρ & lt? 0.001). Δεν υπάρχουν αλλαγές σε δραστικότητα λουσιφεράσης παρατηρήθηκαν σε κύτταρα επιμολυσμένα με προ-miR-592 ή προ-miR-599. Προ-miR-221, έχουν αναφερθεί στο παρελθόν για τη στόχευση

thrB

3’UTR [25] χρησιμοποιήθηκε ως θετικός έλεγχος και επιβεβαίωσε την αποτελεσματικότητα των miRNA μεσολάβηση σίγηση (Σχήμα 3).

A. Η επίδραση της μιμείται microRNA επί της δραστικότητας λουσιφεράσης που εκφράζεται από ένα πλασμίδιο ανταποκριτή pGL3-Luc-3’UTR-thrB. κύτταρα HeLa επιμολύνθηκαν χρησιμοποιώντας το πλασμίδιο αναφοράς και των αντίστοιχων μιμείται microRNA: προ-miR-155, προ-miR-425, προ-miR-599, ή προ-miR-221. Τα αποτελέσματα παρουσιάζονται ως ποσοστό του ελέγχου (Ctrl, κύτταρα επιμολυσμένα με μη στόχευση προ-miR). Το διάγραμμα δείχνει τα αποτελέσματα τριών ανεξάρτητων βιολογικά πειράματα, μετρήθηκε εις τριπλούν. Η σχετική δραστικότητα της λουσιφεράσης Firefly κανονικοποιήθηκε προς Renilla δραστικότητα λουσιφεράσης. Η στατιστική ανάλυση πραγματοποιήθηκε με τη χρήση ANOVA ακολουθούμενο από το τεστ πολλαπλής σύγκρισης του Dunnett. *** P & lt? 0.001. B. Η επίδραση του miR-155 και miR-425 στην ενδογενή

thrB

έκφραση στα νεφρικά καρκινικά κύτταρα. UOK171 κύτταρα μορφομετατράπηκαν χρησιμοποιώντας τους αντίστοιχους μιμείται microRNA (pre-Mirs) ή αναστολείς (αντι-Mirs), και

thrB

έκφραση mRNA αναλύθηκε χρησιμοποιώντας PCR πραγματικού χρόνου. Τα αποτελέσματα παρουσιάζονται ως επί τοις εκατό του ελέγχου (τα κύτταρα επιμολυσμένα με μη στόχευση προ-miR). Τα οικόπεδα δείχνει αποτελέσματα από τρία ανεξάρτητα πειράματα βιολογικού μετρήθηκε εις τριπλούν. Η στατιστική ανάλυση πραγματοποιήθηκε με τη χρήση ANOVA ακολουθούμενο από το τεστ πολλαπλής σύγκρισης του Dunnett. * P & lt? 0,05, *** p & lt? 0.001. C. Η έκφραση του miR-155 και miR-425 σε nontumorous ελέγχους (C, n = 35) και αντιστοιχισμένο ccRCC δείγματα ιστού (Τ, n = 35). Τα αποτελέσματα παρουσιάζονται ως επί τοις εκατό του ελέγχου. Real-time PCR για κάθε δείγμα έγινε εις τριπλούν. Η στατιστική ανάλυση έγινε με τη χρήση Wilcoxon τεστ ζεύγος. * P & lt? 0,05, ** p & lt? 0,01

Η

miR-155 και miR-452 Επιρροή

thrB

Έκφραση σε νεφρικά κύτταρα του καρκίνου

Για να αναλύσουμε στη συνέχεια το. επίδραση του miR-155 και miR-425 στην ενδογενή

thrB

έκφραση, νεφρικό καρκίνο που προέρχεται από κυτταρική σειρά UOK171 επιμολύνθηκε χρησιμοποιώντας είτε μιμείται microRNA (pre-miR-155 ή προ-miR-425) αναστολείς ή microRNA ( αντι-miR-155 ή αντι-miR-425) (Σχήμα 3). Επιμόλυνση οδήγησε σε στατιστικά σημαντική μείωση στο

thrB

έκφρασης κατά 22% για προ-miR-155, σ & lt? 0,05, και κατά 64% για προ-miR-425, σ & lt? 0.001, σε σύγκριση με το microRNA ελέγχου (Σχήμα 3). Η διαμόλυνση των κυτταρικών σειρών με αναστολείς microRNA δεν οδήγησε σε στατιστικά σημαντική μεταβολή του

thrB

έκφρασης, αν και μια τάση για αυξημένη έκφραση παρατηρήθηκε (Σχήμα 3). Αυτή η παρατήρηση μπορεί να προκύψει από το γεγονός ότι τα επίπεδα του miR-155 και miR-425 είναι ιδιαίτερα αυξημένα σε κυτταρική γραμμή UOK171, έτσι παρόλη πολυάριθμων συγκεντρώσεις που δοκιμάστηκαν, η ποσότητα των αναστολέων microRNA θα μπορούσε να είναι ανεπαρκής για την αποτελεσματική παρεμπόδιση της δραστηριότητας microRNA.

Οι μελέτες πρότειναν ότι το miR-155 και miR-425 επηρεάζουν άμεσα

thrB

έκφραση στα νεφρικά καρκινικά κύτταρα.

Η έκφραση του miR-155 και miR-425 είναι αυξημένη στον καρκίνο των νεφρών και συσχετίζεται με μειωμένη έκφραση του

thrB

Η

για να ελέγξετε αν όγκου συγκεκριμένες αλλαγές του miR-155 και miR-425 θα μπορούσε να επηρεάσει

thrB

έκφραση σε όγκους ccRCC, η έκφραση και των δύο microRNAs αναλύθηκε σε 25 δείγματα ιστού ccRCC και 25 αντίστοιχα μη οιδηματώδης δείγματα νεφρού (Σχήμα 3). Η έκφραση και των δύο microRNAs ήταν στατιστικά σημαντικά αυξημένη (κατά 354%, ρ = 0,0072 για miR-155 και κατά 62%, ρ = 0,041 για miR-425). Ταυτόχρονα, η έκφραση και των δύο Mirs σχετίστηκε αρνητικά με την έκφραση του

thrB

. Παρά το γεγονός ότι ο συντελεστής συσχέτισης ήταν αδύναμη (R = 0,245, p = 0,0075) σε δείγματα ελέγχου, η συσχέτιση ήταν σημαντικά ισχυρότερη σε όγκους (R = 0,469, p = 0,0225). Ταυτόχρονα, υπήρξε επίσης μια σημαντική συσχέτιση μεταξύ της αναλογίας Τ /Ν του miRNA και

thrB

έκφρασης (R = 0.396, p = 0.002). Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι

thrB

επίπεδα έκφρασης εξαρτάται από το miR-155 και miR-425 έκφρασης και η απορρύθμιση των Mirs συνδέεται με μειωμένη

thrB

επίπεδα ccRCC (Σχήμα S3).

Συζήτηση

σε αυτή τη μελέτη, χρησιμοποιώντας τρεις διαφορετικές μεθόδους, δείξαμε ότι στα δείγματα που αναλύθηκαν του καρκίνου του νεφρού ανώμαλης

thrB

έκφραση δεν προκύπτει από τον όγκο συγκεκριμένες αλλαγές στο DNA μεθυλίωση της

thrB

περιοχή του υποκινητή. Αντίθετα, η έκφραση του

thrB

στο ccRCC επηρεάζεται από microRNAs, miR-155 και miR-425 που συνδέουν άμεσα με

thrB

3’ΙΙΤΡ, όπως προτείνεται από την παρατήρηση ότι η αυξημένη έκφραση του αυτά τα microRNAs στο ccRCC συνοδεύεται από ρύθμιση προς τα κάτω του

thrB

.

η υπερμεθυλίωση του

thrB

υποστηρικτής αναφέρθηκε σε διάφορα νεοπλάσματα, συμπεριλαμβανομένων του μαστού, του θυρεοειδούς και καρκίνους του πνεύμονα και λευχαιμία [25 ] – [30]. Είναι ενδιαφέρον ότι, οι μελέτες έδειξαν ότι τα ποσοστά μεθυλίωση του

thrB

ήταν πολύ μεταβλητές μεταξύ των ασθενών, αφού υπερμεθυλιωμένων

thrB

ανιχνεύθηκε στο 25-80% των όγκων που αναλύθηκαν. Επιπλέον, μόνο οι μισές από τις μελέτες για

thrB

μεθυλίωση έγινε τόσο του όγκου και σε συνδυασμό μη ογκογόνους ιστούς ελέγχου. Iwasaki et al. εξέτασε 116 μη μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα, συμπεριλαμβανομένων 6 δείγματα για τα οποία ζεύγη αναλύθηκαν γειτονικούς ιστούς ελέγχου. Από τα δείγματα όγκων 116, 54 αποκάλυψε υπερμεθυλίωση

thrB

. Όταν συγκρίθηκαν 6 ζεύγη όγκου σε σχέση με τα δείγματα ελέγχου,

thrB

μεθυλιώθηκε σε όλους τους όγκους και μη μεθυλιωμένη σε όλα τα δείγματα ελέγχου μη οιδηματώδης. Σε δύο άλλες μελέτες που αναλύουν τους όγκους του καρκίνου του μαστού και κυτταρικές γραμμές [25], [29] υπερμεθυλιωμένο

thrB

ανιχνεύθηκε στο 80% -100% των όγκων και C.A. 37% των ζευγών δειγμάτων. Επιπλέον, ο βαθμός και το σχήμα της μεθυλίωσης κυμαινόταν μεταξύ δειγμάτων που προέρχονται από διαφορετικούς ασθενείς. Παρόμοια διακύμανση παρατηρήθηκε επίσης σε μία μελέτη που πραγματοποιήθηκε σε όγκους του θυρεοειδούς [30], στο οποίο ζεύγη δείγματα φυσιολογικού ιστού δεν ήταν διαθέσιμα και ως εκ τούτου δεν αναλύονται. Η μελέτη μας αποκάλυψε, επίσης, ότι

thrB

μεθυλίωση ποικίλλει σημαντικά μεταξύ των δειγμάτων ιστών που προέρχονται από διαφορετικούς ασθενείς. Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι η έλλειψη ζεύγη δειγμάτων μη-νεοπλασματικές ελέγχου μπορεί να οδηγήσει σε προκατάληψη και να οδηγήσει σε κατάταξη ενός ασθενή συγκεκριμένες διακυμάνσεις στην

thrB

μεθυλίωσης όπως μεταβολές ειδικά για καρκινικό ιστό.

Παρά το γεγονός ότι

thrB

έκφραση δεν φαίνεται να επηρεάζεται από μεθυλίωση του DNA σε νεφρική δείγματα του καρκίνου μας, η κατεργασία της κυτταρικής σειράς UOK171 με δεοξυκυτιδίνη 5-αζα-2 ‘είχε σαν αποτέλεσμα αυξημένη έκφραση του

thrB

γονίδιο. Αυτό υποδηλώνει ότι

thrB

έκφρασης μπορεί να επηρεαστεί έμμεσα από τη δραστηριότητα DNMT1. Σύμφωνα με προηγούμενες μελέτες, η μεθυλίωση του DNA μπορεί να επηρεάσει έμμεσα μεταγραφής ενός γονιδίου στόχου σε διάφορους μηχανισμούς [48], συμπεριλαμβανομένων ρύθμιση των γονιδίων από ένα επανενεργοποιηθεί παράγοντα μεταγραφής ή σήμα μονοπάτι μεταγωγής που επηρεάζεται από μεθυλίωσης DNA. Ποια από αυτούς τους μηχανισμούς μπορεί να επηρεάσει

thrB

έκφρασης σε καρκίνο του νεφρού είναι προς το παρόν άγνωστη. Επιπλέον, δεν μπορούμε να αποκλείσουμε το ενδεχόμενο ότι σε άλλους ασθενείς ccRCC και στις άλλες κυτταρικές σειρές ccRCC που προέρχονται από το

thrB

μεθυλίωση προαγωγού θα μπορούσε να επηρεάσει

thrB

έκφρασης. Αυτό, ελπίζουμε, θα επαληθεύεται από μελλοντικές μελέτες για ccRCC.

Μια άλλη επιγενετικές μηχανισμό που επηρεάζει την έκφραση των γονιδίων στόχων είναι microRNA-εξαρτώμενη ρύθμιση της έκφρασης [49]. Ένα μόνο γονίδιο μπορεί να στοχεύσει με πολλαπλές microRNAs και μόνο microRNA μπορεί να ρυθμίσει πολλά γονίδια-στόχους. Κατά συνέπεια, η απορρύθμιση της έκφρασης miRNA που σχετίζεται με πολυάριθμες καρκίνους οδηγεί σε σοβαρή διαταραχή της κυτταρικής πρωτεώματος και μεταγραφικό. Σε αυτή τη μελέτη εντόπισε δύο microRNAs των οποίων άμεση δέσμευση με το

thrB

3’ΙΙΤΡ επιβεβαιώθηκε στη δοκιμασία λουσιφεράσης εκτελείται σε κυτταρική σειρά HeLa, χρησιμοποιήθηκαν λόγω της σχετικά χαμηλά επίπεδα έκφρασης των δύο αναλύονται miRNAs.