Αφηρημένο

Ιστορικό

Tpr είναι μια μεγάλη πρωτεΐνη συσπειρωμένης σπείρας που βρίσκεται στην πυρηνική καλάθι του πυρηνικού συγκρότημα των πόρων για τους οποίους πολλές διαφορετικές λειτουργίες προτάθηκαν από ζύμη σε άνθρωπο.

Μεθοδολογία /Κύρια Ευρήματα

Εδώ μπορούμε να δείξουμε ότι η εξάντληση των Tpr από την RNA παρεμβολής προκαλεί G0-G1 σύλληψη και τελικά προκαλεί γήρανση -όπως φαινότυπο εξαρτάται από την παρουσία του ρ53. Βρήκαμε επίσης ότι η εξάντληση Tpr μειώνει τα NES [ακολουθία πυρηνικής εξαγωγής] εξαρτώμενη πυρηνική εξαγωγή των πρωτεϊνών και προκαλεί μερική συν-εξάντληση των Nup153. Εκτός από τις επιπτώσεις εξάντληση Tpr στο επίπεδο και τη λειτουργία του SENP2 SUMO-πρωτεάσης επηρεάζοντας έτσι κανονισμού τροποποίησή της με SUMO στον πυρηνικό πόρων και τη συνολική τροποποίησή της με SUMO στο κύτταρο.

Συμπεράσματα

Τα στοιχεία μας για πρώτη φορά παρέχει απόδειξη ότι ένα συστατικό πυρηνικού πόρου παίζει έναν ρόλο στον έλεγχο της κυτταρικής γήρανσης. Τα ευρήματά μας δείχνουν επίσης νέους ρόλους για Tpr στη ρύθμιση της SUMO-1 σύζευξη του πυρηνικού πόρου και να επιβεβαιώσει άμεσα συμμετοχή τρίτου ως αντιπροσώπου στο πυρηνικό εξαγωγή των NES-πρωτεϊνών

Παράθεση:. David-Watine Β (2011) φίμωση πυρηνικού πόρου πρωτεΐνη Tpr προκαλεί μια γηρασμένων φαινότυπο στα καρκινικά κύτταρα. PLoS ONE 6 (7): e22423. doi: 10.1371 /journal.pone.0022423

Επιμέλεια: Μιχαήλ Polymenis, Texas A & amp? Μ University, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 1 Απριλίου του 2011? Αποδεκτές: 22 Ιούν 2011? Δημοσιεύθηκε: 19, Ιούλ, 2011

Copyright: © 2011 Brigitte David-Watine. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από το Institut Pasteur. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Ο συγγραφέας έχει δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

συγκροτήματα πυρηνικού πόρου (NPCs) μεσολαβούν όλα επιλεκτική αμφίδρομη μεταφορά μεταξύ του πυρήνα και του κυτταροπλάσματος. Αποδεικτικά στοιχεία και τις αναδυόμενες δείχνει σε επιπλέον ρόλους για NPCs, συστατικό των πρωτεϊνών τους (nucleoporins) και σχετίζονται πρωτεΐνες μεταφοράς, μερικά από τα οποία είναι ανεξάρτητα της κλασικής μεταφορών [1], [2]. Ως εκ τούτου, μπορεί εύλογα να υποθέσει ότι NPCs είναι το κλειδί σε παθολογικές καταστάσεις κελί όπου ανώμαλη κυτταρική ανάπτυξη είναι ένα κεντρικό χαρακτηριστικό.

Η πρωτεΐνη Tpr (για περιοχή του υποκινητή μετατοπισμένο) και τα ομολογά του είναι ένα συντηρημένο συστατικό στον πυρηνικό πλευρά του NPC . Στα θηλαστικά Tpr είναι μία δομική πρωτεΐνη 267-kDa με μακρά Ν-τελική περιοχή που συσχετίζει σε ένα διμερές για να σχηματίσουν ένα παράλληλο, δύο έλικος συσπειρωμένης σπείρας. Ο τομέας C-τερματικό είναι πολύ όξινο και προβλέπεται να είναι αδόμητη [3]. Στα κύτταρα των θηλαστικών Tpr περιορίζεται στις nucleoplasmic ινίδια του NPC και έχει προταθεί ότι δρα ως το κύριο αρχιτεκτονικό στοιχείο του πυρηνικού καλαθιού [4], [5]. Θηλαστικών Tpr είναι δεμένοι με NPC μέσω αλληλεπιδράσεων με Nup153 [5], [6], [7], [8]. Πολλές λειτουργίες έχουν αποδοθεί σε Tpr και τα ομολογά του σε διάφορα είδη ζώων εκτός από ένα ρόλο στη NPC αρχιτεκτονική. Αυτές περιλαμβάνουν mRNA ελέγχου των εξαγωγών [9], [10], η πυρηνική πρωτεΐνη των εξαγωγών [4], [11], σιωπηλή οργάνωση τελομερική χρωματίνης και τον έλεγχο του μήκους των τελομερών [12], [13], [14]. Επιπλέον, Drosophila και των ανθρωπίνων Tpr έχουν δειχθεί ότι εμπλέκονται στην άτρακτο ελέγχου οδοφράγματος [15], [16], [17] και την ανθρώπινη Tpr στον έλεγχο του Erk2 πυρηνο-κυτταροπλασματική μετατόπιση [18].

TPR ομολόγων στη ζύμη, Mlp1p-Mlp2p, εμπλέκονται στην προσάρτηση SUMO-πρωτεάσης Ulp1p να NPC [19], [20]. Αυτή η λειτουργική αλληλεπίδραση φαίνεται να διατηρείται σε Arabidopsis thaliana μεταξύ ESD4 και NUA, τα οποία είναι ομόλογα της Ulp1p και Tpr, αντίστοιχα [21]. Τροποποίησή της με SUMO αντιστοιχεί στην μετα-μεταφραστική σύζευξη του SUMO (μικρές ουβικιτίνης πρωτεΐνη που σχετίζεται με τροποποιητή) σε ένα ειδικό υπόλειμμα λυσίνης σε μια πρωτεΐνη-στόχο. Τροποποίησή της με SUMO διαμεσολαβείται από μια ενζυματική αντίδραση καταρράκτη που περιλαμβάνει διαδοχικά ένα ένζυμο SUMO-ενεργοποίηση ή Ε1 και Ε2 ένα μοναδικό SUMO-ένζυμο σύζευξης, Ubc9. τροποποίηση SUMO είναι αναστρέψιμη επειδή SUMO-ειδικές πρωτεάσες μπορεί να διαχωρίζουν το τμήμα SUMO από τις τροποποιημένες πρωτεΐνες που υποδηλώνει ότι η πρωτεΐνη τροποποίησή της με SUMO δυναμικά ρυθμίζεται σε κύτταρα [22], [23]. Μεταξύ των Ulp1p σχετίζονται SUMO-πρωτεάσες που έχουν χαρακτηριστεί στα θηλαστικά, SENP1 και SENP2 δείχνουν τη μεγαλύτερη ομοιότητα με μαγιά Ulp1 και συνδέονται επίσης με τον πυρηνικό φάκελο. Ulp1p και SENP2 μοιράζονται την ιδιότητα να απευθύνονται σε NPC από μη-καταλυτική Ν-τελικές περιοχές τους [24]. Ωστόσο, στα σπονδυλωτά, το Ν-τερματικό πεδίο NPC-στόχευσης σε SENP2 αλληλεπιδρά με το C-τερματικό τομέα σε Nup153, αλλά όχι με Tpr [25], [26].

Κυτταρική γήρανση για πρώτη φορά περιγράφεται ως » αντιγραφική γήρανση «λόγω της περιορισμένης διάρκειας ζωής των ανθρώπινων διπλοειδών ινοβλαστών in vitro [27]. Μελέτες σε καρκινικά κύτταρα έχουν δείξει ότι, παρά το γεγονός ότι είναι σε θέση να διαιρούνται απεριόριστα, μια κατάσταση που μοιάζει στενά αντιγραφική γήρανση μπορεί να προκληθεί οξεία από διάφορα ερεθίσματα όπως χημειοθεραπευτικούς παράγοντες και ακτινοβολία. Αυτό επομένως αντιπροσωπεύει ένα άλλο πρόγραμμα κύτταρο, εκτός απόπτωση, που μπορούν να περιορίσουν τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων [28], [29]. Τα γηρασμένα κύτταρα χαρακτηρίζονται από διευρυμένο μέγεθος κυψέλης, πεπλατυσμένη μορφολογία, ανικανότητα να συνθέσει DNA και η έκφραση του γήρανση που σχετίζεται (SA) -β-γαλακτοσιδάση, την βιοδείκτη γηρασμού [30].

Αναφέρουμε εδώ ότι Tpr είναι κρίσιμης σημασίας για τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων και ότι η εξάντληση Tpr οδηγεί σε φαινότυπο γηρασμό σαν που εξαρτάται από το ρ53. Επίσης, Tpr κάτω ρύθμιση επιπτώσεις στην πυρηνική εξαγωγή των πρωτεϊνών με Crm1-εξαρτώμενη σειρά πυρηνικών εξαγωγής (NES). Τα επίπεδα του Nup153 και λειτουργία SENP2 στον πυρηνικό πόρο επηρεάζονται επίσης. Όπως παρατηρήθηκε συνέπεια οι ουσιαστικές αλλαγές στον τρόπο διεξαγωγής των SUMO-1 σύζευξη σε NPC και μέσα στο κύτταρο.

Αποτελέσματα

Tpr νοκ ντάουν προκαλεί G0-G1 σύλληψη και γηρασμένα φαινότυπο σε κύτταρα HeLa

Tpr περιγράφηκε πρόσφατα να έχει πολλές διαφορετικές λειτουργίες αλλά ο ρόλος του στην κυτταρικού κύκλου, κυτταρική μοίρα και πολλαπλασιασμό δεν έχει ποτέ πλήρως αξιολογηθεί. έτσι Ερευνήσαμε το αποτέλεσμα της εξάντλησης Tpr επί του κυτταρικού κύκλου χρησιμοποιώντας siRNAs που στοχεύουν Tpr σε κύτταρα HeLa. Βρήκαμε ότι το επίπεδο της πρωτεΐνης Tpr ειδικώς μειωμένη μετά από 48 ώρες θεραπείας με ένα από τα δύο συνθετικά siRNAs που χρησιμοποιείται, όπως φαίνεται με ανάλυση κηλίδος Western των συνολικών κυτταρικών εκχυλισμάτων των κατεργασμένων κυττάρων HeLa (Σχ. 1Α και S1 Α).

κύτταρα HeLa σπάρθηκαν σε πλάκες 24-φρεατίων σε 5 10

-4 κύτταρα ανά φρεάτιο σε επεξεργασία με Tpr ή ψευδο siRNAs. 1Α. 48 ώρες μετά την αγωγή siRNA, όπως αναγράφεται στο πάνω μέρος του σχήματος, ένα κυτταρικό εκχύλισμα παρασκευάστηκε και αναλύθηκε με κηλίδωση Western χρησιμοποιώντας αντι-Tpr Mab 203 με 37? τουμπουλίνης χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης. 1Β. Bright εικόνα πεδίου (δεξί πάνελ) και συνεστιακή εικόνας (αριστερό πλαίσιο) κυττάρων HeLa επισημανθεί με ένα αντι-Tpr μονοκλωνικό αντίσωμα μετά από 2 ημέρες επιμόλυνσης με Tpr ή ψευδο siRNA. μπαρ κλίμακας: 5 μm. 1C. καμπύλη ανάπτυξης των κυττάρων HeLa επιμολυσμένα με Tpr, μακέτα siRNA ή μη επιμολυσμένα: έλεγχος (Ctrl). 1D. Αντιπροσωπευτικά προφίλ FACS των ψευδο siRNA επεξεργασία (αριστερό πάνελ), κύτταρα κατεργασμένα Tpr siRNAs (κέντρο) και μη-επιμολυσμένα κύτταρα ή ελέγχου (δεξιά). Αιθανόλη στερεωμένα κύτταρα επωάστηκαν με ΡΙ και αναλύθηκαν με FACS για πλοειδίας. Ο αριθμός των κυττάρων αντιπροσωπεύεται στον κατακόρυφο άξονα και το DNA περιεχόμενο στον οριζόντιο άξονα. Οι G0-G1 και G2-M φάσεις αντιπροσωπεύονται ως πρώτες και δεύτερες κορυφές ξεκινώντας από τον κατακόρυφο άξονα, αντίστοιχα. Η ενδιάμεση περιοχή ριγέ αντιστοιχεί στη φάση S. 1Ε. Επαγωγή γήρανση: κύτταρα επιστρώθηκαν σε χαμηλή πυκνότητα και κατεργάστηκαν με Tpr ή ψευδο siRNAs. Μετά από 6 ημέρες, τα κύτταρα σταθεροποιήθηκαν και υπέστησαν χρώση για δραστικότητα SA-β-gal σε ρΗ 6.0. μπαρ κλίμακας: 20 μm. 1F. Ποσοτικοποίηση της SA-β-gal θετικά κύτταρα σε καλλιέργειες εξαντλημένο από Tpr και χρωματίστηκαν για δραστικότητα SA-β-gal σε ρΗ 6.0. 1G-1. κύτταρα U2OS επιμολύνονται με Tpr ή πλαστή siRNAs. 1G: Μετά από 6 ημέρες τα κύτταρα μονιμοποιήθηκαν και χρωματίστηκαν για ενσωμάτωση BrdU και δραστικότητα SA-β-gal σε ρΗ 6.0. μπαρ κλίμακας: 15 μm. 1Η: Μετά από 6 ημέρες, τα κύτταρα σημάνθηκαν με αντι-HP1γ και αντι-MacroH2A αντισώματα και DAPI. μπαρ κλίμακας: 5 μm. 1Ι: κύτταρα Α375 επιμολύνονται με Tpr ή ψευδο siRNAs. Μετά από 6 ημέρες τα κύτταρα μονιμοποιήθηκαν και χρωματίστηκαν για δραστικότητα SA-β-gal σε ρΗ 6.0. μπαρ κλίμακας: 15 μm

Η

Στη συνέχεια, προσδιορίζεται η θέση σε κύτταρα HeLa με συνεστιακή μικροσκοπία (σχήμα 1Β.).. Οπτικές τομές μέσα από το κέντρο του πυρήνα έδειξε το πρότυπο χαρακτηριστικό στικτή του nucleoporins στο ΒΑ. Η έκθεση σε siRNA που κατευθύνονται έναντι Tpr μείωσε δραματικά τη στικτή Tpr μοτίβο στο ΒΑ (Εικ. 1Β). Από Tpr ήταν αποτελεσματικά κάτω ρυθμίζονται υπό αυτές τις συνθήκες, ήμασταν σε θέση να αναλύσει το ρόλο της στην κυτταρική ανάπτυξη και βιωσιμότητα. Βρήκαμε ότι η αγωγή με διαταραχή του κυτταρικού πολλαπλασιασμού Tpr siRNAs σε σύγκριση με ψευδο κύτταρα siRNA-αγωγή (Σχ. 1 C). Για να διερευνηθεί εάν αυτό οφειλόταν σε σταματήσει τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων ή κυτταρικό θάνατο, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με Annexin-V και ιωδιούχο προπίδιο για την επισήμανση των πυρήνων των νεκρών κυττάρων και τα κύτταρα αναλύθηκαν με ενεργοποιούμενη με φθορισμό διαλογή κυττάρων (FACS). Αριθ ακαθάριστο διαφορά μεταξύ των Tpr siRNA-κατεργασμένα κύτταρα και τους ελέγχους παρατηρήθηκε, υποδεικνύοντας ότι το ελάττωμα αύξηση δεν οφειλόταν σε απόπτωση (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται).

Για να χαρακτηριστεί περαιτέρω η επίδραση της Tpr knockdown στον πολλαπλασιασμό των κυττάρων, αναλύσαμε διανομή του κυτταρικού κύκλου των Tpr siRNA-κατεργασμένα κύτταρα και τους ελέγχους με μέτρηση του περιεχομένου του DNA τους με FACS. Σημειώσαμε ότι mock διαμόλυνση siRNA δεν επηρέασε τον κυτταρικό κύκλο των κυττάρων HeLa σε σύγκριση με τα μη επεξεργασμένα κύτταρα. Αντίθετα, ο κυτταρικός κύκλος συνελήφθη στη φάση G0-G1 σε κύτταρα knockdown Tpr όπως φαίνεται στο Σχ. 1D. Περίπου το 46% του ελέγχου επιμολυσμένα και μη-επιμολυσμένα κύτταρα (2 ημέρες μετά την επιμόλυνση) ήταν στην φάση G0-G1 του κυτταρικού κύκλου, ενώ το 69% των Tpr knockdown κύτταρα ήταν σε G0-G1. Ταυτόχρονα, περίπου 37-38% των κυττάρων ελέγχου προχωρήσει στη φάση S σε σύγκριση με μόνο το 16% των Tpr knockdown κυττάρων (Σχ. 1D). Η ίδια αναλογία των κυττάρων παρατηρήθηκαν στη φάση G2-M κάτω από όλες τις τρεις προϋποθέσεις. Παρόμοια αποτελέσματα ελήφθησαν με τις δύο αλληλουχίες Tpr siRNA (Σχ. S1B).

Στην συνέχεια εκτελείται μία δοκιμασία σχηματισμού αποικίας ως ανεξάρτητη μέτρηση του ελαττώματος πολλαπλασιασμού που προκλήθηκε από την εξάντληση Tpr. Μια σημαντική μείωση (36%) στον αριθμό των αποικιών ήταν εμφανής όταν τα κύτταρα επιμολύνθηκαν με Tpr siRNAs σε σύγκριση με ψευδο-επιμολυσμένα κύτταρα (Σχ. S1c). Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι η επιμόλυνση κυττάρων HeLa με Tpr siRNAs επιβραδυνθεί δραματικά τον πολλαπλασιασμό των καρκινικών κυττάρων.

Μια πιο προσεκτική εξέταση του τρίτου ως αντιπροσώπου siRNA-κατεργασμένα κύτταρα έδειξαν ότι ένα κλάσμα από αυτά είχαν ένα μάλλον «σοβαρή» φαινότυπο στο ότι είχαν η εμφάνιση του γηρασμού με χονδροειδώς διευρυμένη κυτταρόπλασμα. Αυτό μας οδήγησε να διεξάγει περαιτέρω έρευνες επικεντρώθηκαν σε αυτό το συγκεκριμένο απάντηση. Σε παροδικές δοκιμασίες RNAi, η χρονική πορεία για την αποτελεσματική εξάντληση της πρωτεΐνης-στόχου δεν είναι περισσότερο από τέσσερις ημέρες, ενώ τα κύτταρα νοκ ντάουν Tpr συνελήφθησαν στη G0-G1. Εν τω μεταξύ μη επιμολυσμένα κύτταρα συνεχίζουν να διαιρούνται και ταχέως προσπεράσει μη διαιρούμενα κύτταρα. Ως εκ τούτου, ιδρύθηκε όρους υπό τους οποίους τα κύτταρα τοποθετήθηκαν σε χαμηλή πυκνότητα (5.10

4-10

5 ανά πηγάδι σε ένα 6-καλά πλάκα) για να ελαχιστοποιηθεί η επίδραση της overgrowing μη επιμολυσμένα κύτταρα.

Πειράματα κάτω από αυτές τις συνθήκες έδειξε ότι ένα μεγάλο μέρος του πληθυσμού άρχισε να αλλάζει τη μορφολογία 3-4 ημέρες μετά την επιμόλυνση: κύτταρα διευρυμένη και επίπεδη (σχήμα 1 Ε.). Ένα σημαντικό τεστ για τη γήρανση είναι δραστηριότητα SA-β-γαλακτοσιδάσης μετρήθηκε σε όξινο ρΗ [30] και 6 ημέρες μετά την επιμόλυνση, τα περισσότερα από τα διευρυμένη και ισοπεδωμένα κύτταρα ήταν β-gal θετικά και χρώματος μπλε (περίπου 40%) σε φρεάτια knockdown Tpr , ενώ γηρασμένα-όπως το μπλε κύτταρα ήταν σπάνιες (περίπου 10%) στο επεξεργασμένο ψευδο κύτταρο (Σχ. 1 F).

Tpr siRNA knockdown επίσης επάγεται γηρασμό σε δύο άλλες κυτταρικές γραμμές όγκου, U2OS, ένα ανθρώπινο κύτταρο οστεοσαρκώματος γραμμή, και Α375 ανθρώπινα κύτταρα μελανώματος (σχ. 1G-1i). χρώση BrdU έδειξε ότι SA-β-γαλακτοσιδάση θετικά κύτταρα ήταν αρνητικά BrdU (Εικ. 1 G). Επιπλέον, Tpr siRNAs-κατεργασμένα κύτταρα U2OS και τους ελέγχους σημάνθηκαν με αντισώματα ειδικά για την παραλλαγή ιστόνη μακρο-Η2Α και HP1γ, δύο δείκτες ετεροχρωματίνη συστατική του SAHF (γήρανση συνδέεται ετεροχρωματίνη εστίες) που αναγνωρίστηκε για πρώτη φορά στα γηρασμένα ανθρώπινους ινοβλάστες [31] , [32]. Πολλοί μακρο-Η2Α και HP1γ θετική και colocalizing εστίες παρατηρήθηκαν σε U2OS γηρασμένα κύτταρα πυρήνες, ενώ ήταν απούσα σε πυρήνες ελέγχου. Φωτεινότερη τελείες DAPI αναφέροντας ετεροχρωματίνης colocalized με μακρο-Η2Α και την επισήμανση HP1γ μπορεί να δει κανείς στο Σχ. 1Η.

εξάντληση Tpr προκαλεί πυρηνική συσσώρευση της ρ53

Καθώς η οδός p53 είναι συχνά εμπλέκονται στην παρεμπόδιση της ανάπτυξης του όγκου ενεργοποιώντας την κυτταρική γήρανση ή απόπτωση σε απόκριση να τονίσω ότι ήταν σημαντικό να αξιολογηθεί το καθεστώς των κυττάρων p53 όταν Tpr έχει εξαντληθεί.

χρησιμοποιήθηκε για πρώτη φορά ανοσοκυτταροχημεία για την ανάλυση της κατανομής των ρ53 και ταυτόχρονα μελέτησαν την επίδραση της εξάντλησης Nup153 καθώς αυτό έχει αποδειχθεί την αποκέντρωση Tpr από του πυρηνικού πόρου στην πυρηνική εσωτερικό. Όπως φαίνεται στο Σχ. 2Α, το σήμα p53 εμφανίστηκε ως έντονη επισήμανση στικτή στους πυρήνες των Tpr- και Nup153- εξαντληθεί κύτταρα. Κανένα σήμα δεν παρατηρήθηκε σε κύτταρα μάρτυρες. Συγκριτικά, ενώ η εξάντληση των Nup133, ενός nucleoporin ικρίωμα που παίζει σημαντικό ρόλο στη δομή πυρηνικού πόρου και λειτουργία, δεν επάγει την οποιαδήποτε πυρηνική συσσώρευση της ρ53 [33], όπως συσσώρευση παρατηρήθηκε σε Tpr-εξαντλημένο κύτταρα U2OS (τα δεδομένα δεν φαίνονται) . Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι η εξάντληση Tpr ή ο εσφαλμένος εντοπισμός οδηγήσει σε πυρηνική συσσώρευση του p53.

2Α. Ανάλυση της κατανομής ρ53 σε κύτταρα HeLa με ανοσοφθορισμό. Άνω πίνακα: κύτταρα HeLa επιμολύνθηκαν με Tpr, Nup153 και εικονικές siRNAs όπως υποδεικνύεται στα αριστερά? κάτω πίνακα: κύτταρα HeLa επιμολύνθηκαν με Nup133 και εικονικές siRNAs. Τα κύτταρα σταθεροποιήθηκαν σε 2 ημέρες μετά την -transfection και σημάνθηκαν με ένα αντι-αντίσωμα Tpr (επάνω αριστερά πάνελ) ή αντι-Nup133 (κάτω αριστερό πλαίσιο) και ενός αντι-p53 (δεξιά επάνω και κάτω πάνελ). 2Β. Hela κυτταρολύματα πρωτεΐνη ολόκληρου κυττάρου διαχωρίστηκαν με SDS-PAGE και ανοσοστυπώθηκαν με αντισώματα ειδικά για Tpr, ρ53, ρ21, ρ16 και τουμπουλίνης όπως υποδεικνύεται στην εικόνα. 2C. Λύματα ολόκληρων κυτταρικής πρωτεΐνης των κυττάρων που έλαβαν θεραπεία με U2OS Tpr, Tpr + ρ53 ή ελέγχου (mock) siRNAs διαχωρίστηκαν με SDS-PAGE και ανοσοστυπώθηκαν με αντισώματα ειδικά για Tpr, ρ53, ρ21 και τουμπουλίνης όπως υποδεικνύεται στην εικόνα. 2D. Co-εξάντληση των p53 και Tpr αντιστραφεί επαγωγή γήρανση. Τα κύτταρα επιμολύνθηκαν με mock, Tpr, ρ53 ή ρ53 Tpr και σε συνδυασμούς όπως υποδεικνύεται. Η τελική συγκέντρωση siRNA ήταν 100 nM σε κάθε περίπτωση και αποζημίωσης έγινε με πλαστή siRNAs. Τα κύτταρα σημάνθηκαν για SA-β-γαλακτοσιδάσης στο 6 ημέρες μετά την επιμόλυνση και το αποτέλεσμα δίνεται σαν το ποσοστό SA-β-γαλακτοσιδάση θετικά κύτταρα σε κάθε ένα από τα τρία ανεξάρτητα πειράματα.

Η

Η κυκλίνη εξαρτώμενης κινάσης (CDK) p21 είναι αυξημένα σε πολλές συνθήκες στρες και μεταγραφικά ρυθμίζεται από ρ53. Ως εκ τούτου, διερεύνησε τις συνέπειες της εξάντλησης Tpr στα επίπεδα του p53 και p21. Επίπεδα ρ53 και ρ21 ήταν και οι δύο πάνω ρυθμισμένα σε Tpr-εξαντλημένο κύτταρα HeLa (Σχ. 2Β) και τα κύτταρα U2OS (Σχ. 2C). Επιπλέον, όταν αξιολογούνται σε εκχυλίσματα κυττάρου όπου είχαν εξαντληθεί τόσο Tpr και ρ53, συσσώρευση ρ21 θεωρήθηκε να είναι χαμηλότερη από ό, τι μόνο με Tpr siRNAs (Σχ. 2C). Αυτή η παρατήρηση υποδεικνύει ότι μέρος της συσσώρευσης ρ21 σημειώνεται οφείλεται στην ενεργοποίηση της ρ53. Τα επίπεδα του p16 αναστολείς CDK

ΙΝΚΑ (Εικ. 2Β) και cyclinD1 αυξήθηκαν επίσης σε Tpr-εξαντλημένα κύτταρα HeLa (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται).

Τέλος, προκειμένου να αποδείξει επίσημα το ρόλο που διαδραμάτισε η p53 στη διαμεσολάβηση της επαγωγής της γήρανσης σε Tpr εξαντλημένο κύτταρα, που συν-εξαντλημένο τόσο Tpr και p53. Να χτυπήσει κάτω τόσο Tpr και p53 οδήγησε σε μια σημαντική αναστροφή του φαινοτύπου γήρανση, όπως εκτιμάται από το ποσοστό των ΑΕ-β-γαλακτοσιδάση-θετικά κύτταρα (Εικ. 2D).

εξάντληση Tpr παρεμβαίνει με την πυρηνική εξαγωγή NES-εξαρτώμενη

έχει προταθεί ότι τα χαμηλά επίπεδα σταθερής κατάστασης της ρ53 σε φυσιολογικά κύτταρα, δηλαδή με την απουσία του κυτταρικού στρες, να προκύψουν από τη συνεχή Crm1 εξαρτώμενη από την πυρηνική εξαγωγών [34] και μετέπειτα του κυτταροπλάσματος υποβάθμιση του p53. Επίσης, Tpr βρέθηκε πρόσφατα να αλληλεπιδρά με Crm1 σε ένα τριμερές σύμπλοκο εξαγωγή [11]. Μπορούμε λοιπόν να υποθέσουμε ότι Tpr οδηγεί σε p53 πυρηνική συσσώρευση και σταθεροποίηση μπλοκάροντας την πυρηνική εξαγωγή του.

Για να ελεγχθεί αυτή η υπόθεση που χρησιμοποιήθηκε για πρώτη φορά το κατασκεύασμα pSTAT1-NES-GFP, που κωδικοποιεί τα κατάλοιπα 367-427 της ανθρώπινης STAT1 ότι προσδίδει δραστηριότητα NES [35], για να αποτρέψει επιπρόσθετα ρυθμιστικά γεγονότα παρεμβαίνουν με την αναστολή της πυρηνικής εξαγωγής Crm1-εξαρτώμενη. Αυτό το κατασκεύασμα συν-διαμολύνθηκε με Tpr, Crm1 και siRNAs ελέγχου για την ανίχνευση για NES-εξαρτώμενη εξαγωγή. Όπως φαίνεται στο Σχ. 3Α, η κατανομή του σήματος GFP σε ζώντα κύτταρα 48 ώρες μετά την επιμόλυνση έδειξε ότι Crm1- και Tpr-εξάντληση οδήγησε σε σημαντική πυρηνική συγκράτηση του NES-GFP κατασκεύασμα ενώ GFP παρέμεινε κυρίως κυτοσολικό σε ψευδο-κατεργασμένα κύτταρα. Τα κύτταρα στη συνέχεια κατέστησαν διαπερατά και επισημάνθηκαν με Crm1 και Tpr αντισώματα να ελέγξει την αποτελεσματικότητα εξάντληση (Σχ. 3Β).

3Α-3Β. Κατανομή των GFP στα κύτταρα συν-επιμολυσμένα με STAT1-NES-GFP και Tpr, Crm1 ή τον έλεγχο (μακέτα) siRNAs. 3Α: διανομή GFP αναλύθηκε σε ζωντανά κύτταρα. Πυρήνες επισημάνθηκαν με Hoechst 33342. Κλίμακα bar: 10 μm. 3Β: Τα κύτταρα στη συνέχεια κατέστησαν διαπερατά και σημάνθηκαν με αντισώματα ειδικά για Tpr και Crm1 και DAPI για το DNA. Top πίνακα: εξάντληση και τον έλεγχο Tpr? κάτω πίνακα: Crm1 εξάντληση και τον έλεγχο. μπαρ κλίμακας: 10 μm. 3C-3D: εξάντληση Tpr καθυστερεί την πυρηνική εξαγωγή NFκB. κύτταρα HeLa επιμολύνθηκαν με Tpr ή ψευδο siRNAs 2 ημέρες πριν την επαγωγή του ΝΡκΒ. Τα επιμολυσμένα κύτταρα μάρτυρες και στη συνέχεια επωάστηκαν με TNF 100 IU /mL για 40 min. TNF στη συνέχεια απομακρύνθηκε από το μέσο και τα κύτταρα είτε σταθερό είτε διατηρούνται για ένα άλλο 1h30 σε φρέσκο ​​μέσο πριν την μονιμοποίηση. 3C: Ποσοτικοποίηση του σήματος ΝΡκΒ: Όλες οι εικόνες αποκτήθηκαν με την ίδια μεγέθυνση και την έκθεση και το σήμα ΝΡκΒ ποσοτικοποιήθηκε χρησιμοποιώντας το ίδιο εμβαδόν επιφανείας στους πυρήνες και το κυτταρόπλασμα των κυττάρων κάτω από τις διαφορετικές πειραματικές συνθήκες χρησιμοποιώντας OpenLab3.1.2. Το κυτοσολικό σήμα σχεδιάστηκε έναντι του πυρηνικού σήματος και τυπική απόκλιση υπολογίστηκε χρησιμοποιώντας Microsoft Excel. Οι ράβδοι σφάλματος αντιπροσωπεύουν την τυπική απόκλιση. Σημειώστε ότι το κυτοσολικό αναλογία πυρηνικό σήμα είναι πολύ παρόμοια σε κύτταρα ελέγχου πριν από τη θεραπεία TNF και 1h30 μετά την απομάκρυνση του TNF. Αυτό ήταν όπως αναμενόταν και οφείλεται στην ΝΡκΒ επιστρέφουν πλήρως στο κυτταρόπλασμα αυτή τη στιγμή. 1h30 μετά την απομάκρυνση του TNF ο κυτοσολικό αναλογία πυρηνικό σήμα ήταν περίπου 25% χαμηλότερη στους Tpr εξαντλημένο κύτταρα σε σχέση με τα κύτταρα ελέγχου. 3D: ανοσοφθορισμού επισήμανση των NFκB και Tpr 1h30 μετά την απομάκρυνση του TNF σε Tpr εξαντλημένο και τον έλεγχο των κυττάρων. Σταθερή κύτταρα επισημάνθηκαν με ένα αντι-NFκB αντίσωμα και αντι-Tpr mAb 203-37.

Η

Ένα λειτουργικό Crm1-εξαρτώμενη NES απαιτείται επίσης για IkappaBepsilon μεσολάβηση της πυρηνικής εξαγωγής που ελέγχει την πυρηνο-κυτταροπλασματική διανομής και μετά την επαγωγή της πυρηνικής εκκαθάρισης των πρωτεϊνών NFκB /Rel [36]. Να εκτιμήσει καλύτερα την επίδραση της εξάντλησης Tpr για το NES-πυρηνική εξαγωγή ενός ενδογενούς πρωτεΐνης, κύτταρα HeLa πρώτα επιμολυσμένα με Tpr ή εικονικές siRNAs δύο ημέρες πριν από την επαγωγή του ΝΡκΒ από τον TNF. Όπως φαίνεται στο Σχ. 3C-3D, εξάντληση Tpr καθυστέρησε την εκκαθάριση των ΝΡκΒ από τον πυρήνα σε σύγκριση με εικονικές επεξεργασμένα κύτταρα. Αξίζει να σημειωθεί ότι ΝΡκΒ συσσώρευση στον πυρήνα μετά από θεραπεία TNF δεν ήταν διαφορετική σε ψευδώς και Tpr-siRNAs κατεργασμένων κυττάρων (Σχ. 3C).

Στη συνέχεια, επιδιώξαμε να προσδιορίσουμε αν η εξάντληση Tpr επηρεάζει τα επίπεδα και η κατανομή Crm1 , ή αντιστρόφως. Για να το κάνουμε αυτό επιμολυσμένα κύτταρα HeLa με siRNAs που κατευθύνονται έναντι Tpr και, Crm1, ή ψευδο-διαμολυσμένα κύτταρα HeLa, και 48 ώρες αργότερα θα αντιμετωπίζονται τα κύτταρα με Tpr- και Crm1-ειδικά αντισώματα. Ανάλυση ανοσοφθορισμού για την έκφραση Crm1 τον έλεγχο και τα κύτταρα knock-down Crm1 έδειξε μειωμένα επίπεδα στο πυρηνόπλασμα και πυρηνικό φάκελο των Crm1 siRNA-επιμολυσμένα κύτταρα. Επίσης η έκφραση Tpr μειώθηκε σημαντικά σε Tpr siRNAs-κατεργασμένα κύτταρα. Αντίθετα, η έκφραση Crm1 δεν φάνηκε να επηρεάζεται από την εξάντληση Tpr και Tpr δεν επηρεάστηκε σε Crm1 knock-down κύτταρα (Εικ. S2A-Β).

Tpr επιπτώσεις εξάντληση στην έκφραση και τη διανομή των Nup153 και SENP2 στην πυρηνική καλάθι

Για την καλύτερη αξιολόγηση του ρόλου του τρίτου ως αντιπροσώπου στο οργανισμού πυρηνικού πόρου και τη λειτουργία, εξετάσαμε πιο προσεκτικά τη σχέση μεταξύ Tpr και Nup153 με μέτρηση των επιπέδων τους σε ολικά εκχυλίσματα κυττάρων επιμολυσμένων με Tpr ή Nup153 siRNAs . Όπως φαίνεται από την ανάλυση κηλίδος western των συνολικών κυτταρικών εκχυλισμάτων (Εικ. 4Α), η θεραπεία των κυττάρων με Nup153 siRNAs οδήγησε σε σχεδόν πλήρη εξαφάνιση των Nup153 και αξιοσημείωτη μείωση στην Tpr. Αυτή η μείωση στα επίπεδα Tpr ήταν σύμφωνο με προηγούμενες μελέτες που δείχνουν ότι Tpr είναι εντοπίζεται λανθασμένα στο πυρηνικό εσωτερικό σε Nup153 knockdown κυττάρων [8]. Ομοίως, η θεραπεία με Tpr siRNAs οδήγησε σε σημαντική μείωση της Tpr και ένα πολύ μειωμένο σήμα Nup153 (Σχ. 4Α). Εμείς επόμενη επιβεβαίωσε αυτή την παρατήρηση με ανάλυση ανοσοφθορισμού σε κύτταρα HeLa σε επεξεργασία με Tpr siRNAs και σημάνθηκαν με αντισώματα που κατευθύνονται εναντίον διαφορετικών συστατικών του πυρηνικού φακέλου. Σήμανση με ένα αντίσωμα αντι-emerin και το αντίσωμα Mab414 που αναγνωρίζει όλα τα FG-που περιέχει επανάληψη nucleoporins συμπεριλαμβανομένων Nup153 δεν χονδροειδώς τροποποιημένα (Σχ. 4Β-4C). Αντιθέτως, βρήκαμε ότι η επισήμανση με ένα ειδικό αντι-Nup153 αντίσωμα μειώθηκε (Σχ. 4Β-4C). Καταλήξαμε στο συμπέρασμα από αυτές τις παρατηρήσεις που εξάντληση Tpr πλήττει ειδικά το επίπεδο της πρωτεΐνης Nup153 στο ΒΑ.

4Α. κύτταρα HeLa επιμολύνθηκαν με κοροϊδεύει, Tpr ή Nup153 siRNAs όπως υποδεικνύεται στην κορυφή. Λύματα ολόκληρων κυττάρων αναλύθηκαν 2 ημέρες μετά την επιμόλυνση με ανοσοστύπωμα χρησιμοποιώντας αντισώματα που κατευθύνονται έναντι Tpr, αντι-FG επανάληψης nucleoporin Mab414 να ονομάσει Nup153 και Nup62 και αντι-τουμπουλίνης ως έλεγχος φόρτωσης. 4Β-4C. Nup153 έκφραση έχει μειωθεί σε Tpr-εξαντλημένα κύτταρα. κύτταρα HeLa υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με TPR2 ή ψευδο siRNAs για 2 ημέρες. 4C. Τα κύτταρα μονιμοποιήθηκαν και επισημάνθηκαν με ένα αντίσωμα αντι-Tpr και αντι-emerin, αντι-Mab414 ή αντι-Nup153 αντισώματα. μπαρ κλίμακας: 15 μm. 4D. Λεπτομέρειες από την επισήμανση Mab414 και Nup153. μπαρ κλίμακας: 5 μm. 4D. Ανάλυση της έκφρασης SENP2 σε πυρηνικά εκχυλίσματα των κυττάρων 293 που έλαβαν θεραπεία με Tpr, SENP2 και εικονικές siRNAs με ανάλυση κηλίδος Western. TRFII χρησιμοποιείται ως μάρτυρας φόρτωσης.

Η

Δεδομένου ότι η εξάντληση Tpr μεταβληθεί διανομής Nup153 στον πυρηνικό πόρων και ότι Nup153 δένει SENP2 στο NPC, υποθέσαμε ότι Tpr μπορεί να επηρεάσουν τα επίπεδα της πρωτεΐνης SENP2 και λειτουργία. Για να ελέγξει την υπόθεση αυτή, εκτιμήσαμε την επίδραση της εξάντλησης Tpr για SENP2. Πρώτον, δεδομένου ότι δεν υπάρχει αντίσωμα είναι διαθέσιμη για να παρατηρήσει ενδογενή SENP2 σε σταθερά κύτταρα, αναλύσαμε τα επίπεδα SENP2 σε πυρηνικά εκχυλίσματα των κυττάρων εξαντλούνται σε Tpr, Nup153 ή SENP2 και σε εικονικές εξαντλημένα κύτταρα. εξάντληση τρίτου ως αντιπροσώπου στο HeLa και 293 κύτταρα συνοδεύθηκε από μείωση των SENP2 σε επίπεδα παρόμοια με εκείνα που παρατηρούνται σε SENP2-εξαντλημένο εκχυλισμάτων. Στη συνέχεια, να συγκρίνουν τα διαφορετικά επίπεδα της πρωτεΐνης, που παρακολουθείται Nup133 και trf2 ως μάρτυρας φόρτωσης για πυρηνικά εκχυλίσματα (Εικ. 4D και S3A). Εξάντληση των Nup153 παρομοίως προκάλεσε μείωση στην SENP2 (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται).

εξάντληση Tpr επηρεάζει τροποποίησή της με SUMO

Η διαπίστωση ότι η εξάντληση Tpr επηρεάζει SENP2 μας ώθησε να αντιμετωπίσει το ζήτημα του κατά πόσον η εξάντληση Tpr ενδέχεται να υπάρξει παρεμβολή με την τροποποίησή της με SUMO άλλων πρωτεϊνών. Προκειμένου να διερευνηθεί αλλαγές στο συνολικό τροποποίησή της με SUMO των πρωτεϊνών, τα κύτταρα HeLa υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με Tpr, SENP2 και siRNAs ελέγχου και πυρηνικά και κυτταροπλασματικά εκχυλίσματα αναλύθηκαν και συγκρίθηκαν με κηλίδωση Western χρησιμοποιώντας ένα αντίσωμα αντι-SUMO-1. Οι κηλίδες των πυρηνικών εκχυλισμάτων έδειξε ότι SENP2 καταστολή προκάλεσε συσσώρευση του υψηλού μοριακού βάρους SUMO-1, όπως αναμενόταν για μια μείωση στην SUMO-πρωτεάσης δραστικότητα. Καμία τέτοια συσσώρευση παρατηρήθηκε σε ψευδο-μορφομετατραπέντα κύτταρα. Αντίθετα, Tpr-εξαντλημένο κύτταρα έδειξαν χαμηλότερη συνολική τροποποίησή της με SUMO από σύγκριση siRNAs επιμολυσμένα κύτταρα (Σχ. 5Α). Παρόμοια αποτελέσματα ελήφθησαν σε U2OS και 293 κύτταρα (Εικ. S3b και τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Κατά συνέπεια, δωρεάν SUMO-1 φαίνεται να συσσωρεύονται σε Tpr-εξαντλημένα κύτταρα (Εικ. S3C).

5Α-5Β. Ανάλυση του συνολικού επιπέδου των τροποποίησή της με SUMO σε κύτταρα επιμολυσμένα με Tpr, Nup153, SENP2 και εικονικές siRNAs. 5Α. Πυρηνικά εκχυλίσματα των siRNAs κατεργασμένων κυττάρων παρασκευάστηκαν και αναλύθηκαν με κηλίδωση Western με τη χρήση των αντισωμάτων όπως περιγράφεται στο αριστερό του σχήματος. RPB1 χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης. 5Β. Ανάλυση των RanGAP1 τροποποίησή της με SUMO. Κυτταροπλασματικά εκχυλίσματα Tpr, Nup153, SENP2 και mock κύτταρα siRNAs επεξεργασμένα παρασκευάστηκαν και αναλύθηκαν με κηλίδωση Western χρησιμοποιώντας ένα αντίσωμα αντι-RanGAP1 αναγνωρίζει τόσο SUMOylated και μη SUMOylated μορφές RanGAP1 και με τουμπουλίνης ως έλεγχος φόρτωσης. 5C: SUMO-1 θεραπεία siRNA παρακάμπτει Tpr εξάντληση προκαλούμενη γήρανση σε κύτταρα HeLa. κύτταρα HeLa επιμολύνθηκαν με Tpr, SUMO-1, Tpr και SUMO-1 και ψευδο siRNAs. Μετά 6 ημέρες, τα κύτταρα μονιμοποιήθηκαν και χρωματίστηκαν για δραστικότητα SA-β-gal σε ρΗ 6.0. Μια αντιπροσωπευτική εικόνα της κάθε κατάσταση παρουσιάζεται. μπαρ κλίμακα:. 15 μm

Η

RanGAP1 (Ran-ΟΤΡάσης ένζυμο ενεργοποίησης 1) είναι άφθονα SUMOylated πρωτεΐνες και τα περισσότερα αντισώματα αντι-RanGAP1 ανίχνευση της SUMO-1-τροποποιημένη μορφή και το SUMO χωρίς RanGAP1, μεταναστεύουν περίπου 80 kDa και 70 kDa, αντίστοιχα. Εξετάσαμε έτσι την επίδραση της εξάντλησης Tpr σχετικά με την κατανομή και το επίπεδο της έκφρασης και τροποποίησή της με SUMO της RanGAP1. Το κλάσμα του SUMO-free RanGAP1 ανιχνεύονται από αυτό το αντίσωμα ήταν αυξημένη σε εκχυλίσματα κυτταρολύματος από Tpr- και υποβλήθηκε σε επεξεργασία σε σύγκριση SENP2-siRNAs να κοροϊδεύει επεξεργασμένα κύτταρα HeLa (Σχ. 5Β) και σε U2OS ολόκληρο εκχυλίσματα κυττάρων (Εικ. S3b). Στο κλάσμα πυρηνικό εκχύλισμα, μόνο SUMO-1-RanGAP1 ανιχνεύθηκε και βρέθηκε να αυξάνεται σε Tpr- και κύτταρα επεξεργασμένα SENP2-siRNAs σύγκριση με κοροϊδεύει επεξεργασμένα κύτταρα όταν ανιχνεύθηκαν με αντι-SUMO-1 και αντι-RanGAP1 αντισώματα, με την αύξηση είναι πιο έντονη σε Tpr επεξεργασμένα κύτταρα από ό, τι στα κύτταρα SENP2 επεξεργασμένα (Εικ. 5Α).

Μέχρι στιγμής, ο ρόλος της πρωτεΐνης τροποποίησή της με SUMO στην επαγωγή γήρανση έχει μελετηθεί μόνο σε φυσιολογικούς ινοβλάστες. Έχουμε διαπιστώσει ότι η εξάντληση των SENP2 θα μπορούσε να προκαλέσει γήρανση των κυττάρων U2OS στην πειραματική μας ρύθμιση (Εικ. S3D). Για την καλύτερη αξιολόγηση της συμβολής της SUMO-1 τροποποίηση μονοπάτι προς την Tpr που προκαλείται φαινότυπο γήρανση στα καρκινικά κύτταρα, θα εκτελούνται παράλληλα RNAi νοκ ντάουν της Tpr, SUMO-1 και σε συνδυασμό SUMO-1 και Tpr. Μετά από 6 ημέρες, τα κύτταρα σταθεροποιήθηκαν και αναλύθηκαν για χρώση SA-β-γαλακτοσιδάσης. Ο συνολικός αριθμός των κυττάρων ήταν δραματικά διαφορετική μεταξύ μόνη προϋπόθεση Tpr και τις δύο άλλες προϋποθέσεις. Σαράντα ή 50 πεδία μετρήθηκαν για κάθε κατάσταση: ο αριθμός των πεδίων που περιέχουν μπλε κύτταρα και το ποσοστό του χώρου που καταλαμβάνεται από διευρυμένη μπλε κύτταρα αξιολογήθηκαν (Πίνακας 1). Στην πραγματικότητα, για SUMO 1 εξαντλημένο κύτταρα, τα περισσότερα πεδία γέμισαν με κύτταρα σε κορεσμό έννοια ότι η πυκνότητα του κυτταρικού πολλαπλασιασμού δεν σταμάτησε. Πολύ λίγοι μπλε κύτταρα παρατηρήθηκαν: 3 (σε ένα πεδίο) σε περίπου 20 μπλε κύτταρα ή έτσι θα μπορούσε να απαριθμούνται μόνο σε 7 τομείς, ενώ το υπόλοιπο είναι αρνητικό. Στο τέλος, τα αποτελέσματα ήταν τόσο διαφορετική ώστε ήταν αδύνατο να συμπεριληφθούν στον πίνακα 1. Ως Μάλιστα υπήρχαν λιγότερο SA-β-γαλακτοσιδάση θετικά κύτταρα στα εξαντλημένα κύτταρα SUMO-1 σε σχέση με την πλαστή έλεγχο. Τα αποτελέσματα που περιγράφονται στον Πίνακα 1 δείχνουν ότι ο πληθυσμός ως σύνολο επηρεάστηκε από εξάντληση Tpr ενώ κύτταρα με μία γήρανση φαινότυπο ήταν πολύ πιο διασπείρονται στο Tpr συν SUMO-1 κατάσταση. Επιπλέον, με ελάχιστες εξαιρέσεις, τα περισσότερα μπλε κύτταρα δεν εμφανίζουν πλήρη φαινότυπο γήρανσης, δεδομένου ότι δεν ισοπεδώθηκαν και η χρώση SA-β-γαλακτοσιδάσης ήταν αμυδρή (Εικ. 5C).

Η

Συζήτηση

Έχουμε αποδείξει σε αυτή τη μελέτη ότι καταστρέφουν Tpr είναι επαρκής για να προκαλέσει μια γηρασμένα φαινότυπο σε κυτταρικές γραμμές όγκου. Ο φαινότυπος γήρανση μπορεί να εξηγηθεί από τη συσσώρευση αρκετών ανάπτυξης καταστολής πρωτεΐνες που ενεργούν για μιτογόνο μεταγωγή σήματος και ρύθμιση του κυτταρικού κύκλου. Δύο κύριες οδοί σηματοδότησης, p16INK4a-pRb και p14ARF-p53, είναι υπεύθυνα για την εκτέλεση της πολλαπλασιαστικής σύλληψης που χαρακτηρίζει τη γήρανση [37], [38]. Η οδός Rb-ρ16 είναι ελαττωματική σε αμφότερες τις κυτταρικές σειρές HeLa και U2OS αλλά ρ53 σε U2OS και HeLa κύτταρα και ρ16 σε κύτταρα HeLa αυξάνονται μετά Tpr knockdown. Ρ53 συσσωρεύεται στον πυρήνα και το ίδιο κάνει και p21 /Cip1, ένας καθοδικός τελεστής που εμπλέκεται σε διάφορες μορφές ελέγχου G1 σημείου ελέγχου. Επιπλέον, μέρος του p21 /Cip1protein πάνω ρύθμιση εξαρτάται από την παρουσία του ρ53

Σε φυσιολογικά κύτταρα, ρ53 είναι ένας στόχος του μονοπατιού ουβικουϊτίνης-πρωτεασώματος:. Τα χαμηλά επίπεδα του αποτελέσματος ρ53 από συνεχή Mdm2- μεσολάβηση πυρηνική εξαγωγή του p53 για κυτοσολικά υποβάθμιση. Σε κύτταρα HeLa, πυρηνική εξαγωγή είναι επίσης απαραίτητη για την αποικοδόμηση της ρ53 που προκαλείται από τον ιό των ανθρώπινων θηλωμάτων (HPV) 18 Ε6 πρωτεΐνη [39]. Δείχνουμε εδώ ότι η εξάντληση Tpr οδηγεί στην πυρηνική συγκράτηση μιας αναφοράς GFP που φιλοξενεί τη σειρά NES της STAT1 και καθυστερεί την μετα-επαγωγή πυρηνικής εκκαθάριση των NFκB μετά την αφαίρεση του TNF σε κύτταρα HeLa [36], δύο γεγονότα εξαρτάται από τον παράγοντα των εξαγωγών Crm1. Tpr βρέθηκε πρόσφατα να αλληλεπιδρούν με Crm1 παρουσία ενός πεπτιδίου NES ή ενός πεπτιδίου NES συν RanGTP όπως σε ένα τριμερές σύμπλοκο εξαγωγή [11]. Αν και οι μοριακές λεπτομέρειες αυτής της αλληλεπίδρασης δεν έχουν ακόμη χαρακτηριστεί, η απουσία Tpr είναι πιθανό να επηρεάσει τη λειτουργία της Crm1 στην πυρηνική εξαγωγή. Βρήκαμε ότι Tpr knock-down επηρεάζει ασθενώς επίπεδα Crm1 σε πειράματα κηλίδος western, αλλά δεν προφανώς αντίκτυπο στα επίπεδα Crm1 όπως μετράται χρησιμοποιώντας ειδικά αντισώματα σε σταθερά κύτταρα. Ωστόσο, έχει ήδη αναφερθεί ότι ακόμη και ελαφρά προς τα κάτω ρύθμιση των Crm1 οδηγεί σε περίοπτη ελαττώματα στην πυρηνική εξαγωγή [40]. αναστολή Crm1 μείωσε επίσης τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων και επαγόμενη από βαθιές μεταβολές των κυττάρων και την απόπτωση (τα δεδομένα δεν φαίνονται), όπως αναφέρθηκε προηγουμένως [41]. Έτσι ευνοούν την υπόθεση ότι η κύρια συνέπεια της εξάντλησης Tpr είναι η πυρηνική συσσώρευση και ενεργοποίηση της p53 από την αναστολή των πυρηνικών εξαγωγών της.

Προς υποστήριξη αυτού, leptomycin Β (ΕΜΒ), ένας αναστολέας Crm1, υπήρξε αποδειχθεί ότι μειώνει την ικανότητα E6 να υποβαθμίσει ρ53 σε καρκινικά κύτταρα του τραχήλου [39], [42] και την αιτία: (i) διατήρηση του STAT1-NES κατασκεύασμα στον πυρήνα [34], [35], (ii) την πυρηνική συσσώρευση και ενεργοποίηση