Αφηρημένο

ανθρώπινων καρκίνων του παχέος εντέρου φιλοξενούν συνήθως απώλεια των μεταλλάξεων λειτουργίας σε APC, μια καταστολέας της κανονικής οδού WNT, οδηγώντας έτσι σε υπερκινητικά σηματοδότηση WNT-TCF. Αποκατάσταση της λειτουργίας APC σε ποντίκια, κατασκευασμένο για να καταστείλει την υπό όρους Αρο μέσω RNAi, την επίλυση των εντερικών όγκων που σχηματίζονται λόγω υπερδραστηριοποιημένο σηματοδότησης Wnt-τρισεκατομμυρίων κυβικών μέτρων. Αυτά και άλλα αποτελέσματα ώθησαν την αναζήτηση για συγκεκριμένες WNT ανταγωνιστές οδού ως θεραπευτικά μέσα για κλινικά προβλήματα καρκίνους ανθρώπινου παχέος εντέρου και σχετίζεται μεταστάσεις, οι οποίες παραμένουν σε μεγάλο βαθμό ανίατη. Αυτή η ευρέως αποδεκτή άποψη φαίνεται σε αντίθεση με μια σειρά από διαπιστώσεις που χρησιμοποιούν υλικού ασθενών που προέρχονται: Τα Canonical στόχους TCF καταπιεσμένη, αντί να υπερδραστηριοποιημένο, σε προχωρημένους καρκίνους του παχέος εντέρου, και την καταστολή της λειτουργίας TCF γενικά δεν οδηγήσει σε υποχώρηση του όγκου σε ξενομοσχεύματα. Τα αποτελέσματα ενός αριθμού γενετικές μελέτες ποντικού έχουν επίσης προτείνει ότι κανονικά σηματοδότηση WNT-TCF οδηγεί μεταστάσεις, αλλά οι άμεσες in vivo δοκιμασίες λείπουν, και, απροσδόκητα, TCF καταστολή μπορεί να ενισχύσει άμεσα σπάρθηκαν μεταστατική ανάπτυξη. Εδώ έχουμε απευθύνονται τις ικανότητες της ενισχυμένης και μπλοκάρει WNT-TCF σηματοδότηση για να αλλάξει την ανάπτυξη του όγκου και απομακρυσμένες μεταστάσεις χρησιμοποιώντας ξενομοσχεύματα προηγμένων ανθρώπινων καρκίνων του παχέος εντέρου σε ποντίκια. Θεωρούμε ότι η ενδογενής σηματοδότησης WNT-TCF είναι ως επί το πλείστον αντι-μεταστατική από το προς τα κάτω ρύθμιση της λειτουργίας TCF με dnTCF βελτιώνει γενικά μεταστατική εξάπλωση. Με συνέπεια, την αύξηση του επιπέδου σηματοδότηση Wnt, αυξάνοντας τα επίπεδα της WNT συνδέτες, δεν είναι γενικά υπέρ-μεταστατικό. παρόν και τα προηγούμενα δεδομένα μας αποκαλύπτουν ένα ετερογενές απόκριση σε διαμόρφωση WNT-TCF σηματοδότηση σε ανθρώπινα καρκινικά κύτταρα. Παρ ‘όλα αυτά, τα ευρήματα που ένα κλάσμα των καρκίνων του παχέος εντέρου δοκιμαστεί απαιτούν WNT-TCF σηματοδότηση για την ανάπτυξη του όγκου, αλλά όλα ανταποκριθεί στην καταπιεσμένη σηματοδότησης με την αύξηση μεταστάσεις εκλιπαρούν για μια επαναξιολόγηση του στόχου της παρεμπόδισης της σηματοδότησης WNT-TCF σε καθολικά τη θεραπεία του καρκίνου του παχέος εντέρου. Τα στοιχεία μας δείχνουν ότι ο αποκλεισμός WNT-TCF μπορεί να είναι αποτελεσματική στην αναστολή της ανάπτυξης του όγκου μόνο σε ένα υποσύνολο των περιπτώσεων, αλλά θα ενισχύσει γενικά μεταστάσεις

Παράθεση:. Seth C, Ruiz i Altaba Α (2016), μεταστάσεις και τον καρκίνο του παχέος εντέρου Όγκων ανάπτυξη Display Αποκλίνουσες απαντήσεις σε διαμόρφωση της Canonical σηματοδότηση Wnt. PLoS ONE 11 (3): e0150697. doi: 10.1371 /journal.pone.0150697

Επιμέλεια: Μιχαήλ Klymkowsky, Πανεπιστήμιο του Κολοράντο, Ηνωμένες Πολιτείες |

Ελήφθη: 30 Οκτωβρίου, 2015? Αποδεκτές: 18 Φλεβάρη του 2016? Δημοσιεύθηκε: 3 Μάρτη του 2016

Copyright: © 2016 Seth, Ruiz i Altaba. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Δεδομένα Διαθεσιμότητα:. Όλη η δεδομένα είναι εντός του χαρτιού

Χρηματοδότηση:. το έργο αυτό χρηματοδοτήθηκε από επιχορηγήσεις από το Εθνικό Ίδρυμα ελβετική, η κοινοπραξία ΘΕΡΑΠΕΙΑ ΕΕ-7ου ΠΠ, οι ελβετικές Cancer League και το Département d’Publique Εντολή de Genève σε ARA. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

υπάρχει ένα μεγάλο σώμα της στοιχεία που να υποστηρίζει την άποψη ότι σηματοδότηση Wnt είναι κρίσιμη για ανθρώπινους καρκίνους του παχέος εντέρου, η οποία είναι ίσως καλύτερο παράδειγμα από δύο βασικά ευρήματα i- η συντριπτική πλειοψηφία των καρκίνων του παχέος εντέρου λιμάνι μεταλλάξεις στο ογκοκατασταλτικό APC, ένα βασικό ανταγωνιστή WNT-TCF οδού [1], και II- αποκατάσταση της λειτουργίας APC σε

APC

παραβιαστεί αποτελέσματα ποντικούς στην απώλεια του εντερικού όγκων [2]. Αυτά και άλλα αποτελέσματα έχουν προωθήσει μια αναζήτηση για θεραπευτικούς αναστολείς WNT-TCF σε καθολικά τη θεραπεία ανθρώπινων καρκίνων του παχέος εντέρου με υπερκινητικά κανονική σηματοδότηση WNT (π.χ. [3]). Δεδομένου ότι η APC είναι, μέχρι στιγμής, δεν druggable, οι προσπάθειες για την ανάπτυξη ανταγωνιστές WNT-TCF έχουν επικεντρωθεί σε βήματα προς τα ανάντη (αναστολείς π.χ. Porcupine και τανκυράσης [4-6] ή προς τα κάτω (CBP αποκλειστές [7], Ivermectin [8]) από την APC λειτουργία στο συγκρότημα καταστροφή β-κατενίνης. Ανεξάρτητα από το βήμα στοχευμένες, πολλές οθόνες ή αναλύσεις επικύρωσης έχουν χρησιμοποιήσει ένα TCF-λουσιφεράσης να παρακολουθούν κανονικά τις απαντήσεις WNT οδό [9].

Οι γραμμές των αποδεικτικών στοιχείων που συνοψίζονται παραπάνω υποδηλώνουν α. σθεναρή δράση της WNT-TCF σηματοδότησης σε καρκίνους του παχέος εντέρου τελικού σταδίου και μπορεί να προσφέρει μια συγκλονιστική υπόθεση για την ανάπτυξη και τη χρήση των κανονικών ανταγωνιστών WNT Ωστόσο, ένα σημαντικό εύρημα έρχεται σε αντίθεση με αυτήν την γενικά αποδεκτή άποψη: Η έκφραση της WNT-TCF στόχοι καταπιεσμένη-δεν ενισχύεται, σε προχωρημένους καρκίνους του παχέος εντέρου και των μεταστάσεων σε σύγκριση με όγκους πρώιμο στάδιο [10], [11].

σηματοδότησης WNT-TCF είναι επίσης ευρέως πιστεύεται ότι οδηγούν μεταστάσεων (π.χ. [12]) , η προώθηση του δυναμικού σπορά των κυκλοφορούντων κυττάρων του όγκου και την ενίσχυση της σηματοδότησης που προκαλούνται από συνδετήρα στο μεταστατικό κόγχη [13], [14]. Είναι αξιοσημείωτο, όμως, ότι δεν έχουν άμεση δοκιμές για την αποδεκτή ικανότητα της ενισχυμένης σηματοδότηση κανονικών WNT-TCF για την προώθηση μεταστάσεων από καρκινικά κύτταρα ανθρώπινου κόλον έχουν αναφερθεί. Η καλύτερη απόδειξη για ένα ρόλο των κανονικών σηματοδότηση WNT στο παχύ έντερο μεταστάσεις του καρκίνου προέρχεται από μελέτες με ποντίκια [13], [14] ή με in vitro αναλύσεις (π.χ. [15], [16]), και άλλες μελέτες υποδηλώνουν ένα αποδεδειγμένο ρόλο για ενισχυμένη σηματοδότηση WNT σε μεταστάσεις (π.χ. [17]). Ωστόσο, υποθέτοντας in vivo λειτουργία από in vitro δεδομένα, ή ανθρώπινη βιολογία από δεδομένα ποντικού, μπορεί να είναι προβληματική ως ποντίκια και οι άνθρωποι είναι αρκετά μακρινά είδη, και in vitro συνθήκες μπορεί να επιβάλει WNT-εξάρτηση για ανθρώπινα καρκινικά κύτταρα του παχέος εντέρου [10].

Πειραματικά, η καταστολή της κανονικής σηματοδότησης WNT έχει επιχειρηθεί από το κλείδωμα TCF λειτουργία, η οποία είναι το τελευταίο βήμα της κανονικής σηματοδότησης WNT. Καταστολή WNT-TCF σηματοδότησης με τηγάνι κυρίαρχο-αρνητικό TCF (dnTCF4), που φαίνεται να είναι αποτελεσματική in vitro σε ανθρώπινα καρκινικά κύτταρα του παχέος εντέρου (π.χ. [18]), είναι, παραδόξως, γενικά αναποτελεσματικά στην καταστολή της ανάπτυξης του όγκου μετά τη μεταμόσχευση advanced ανθρώπινων καρκίνων του παχέος εντέρου ? Αντίθετα, μπορεί να ενισχύσει την μεταστατική ανάπτυξη μετά από απευθείας σπορά των καρκινικών κυττάρων στους πνεύμονες [10], [11], [19-21]. Αυτά τα ευρήματα έθεσαν το ενδεχόμενο ότι ο αποκλεισμός των ενεργών σηματοδότησης WNT-TCF σε ανθρώπινα κύτταρα καρκίνου του παχέος εντέρου μπορεί να μην είναι γενικά θεραπευτικά ευνοϊκή, σε αντίθεση με ό, τι έχει αξιωθεί (π.χ. [2], [18]). Παρ ‘όλα αυτά, οι προσεγγίσεις και το μοντέλο που χρησιμοποιείται είναι διαφορετικό και θα μπορούσε να υπάρξει μεθοδολογικές διαφορές που κρύβονται κάτω από τα αποκλίνοντα αποτελέσματα. Για παράδειγμα, άμεσα σπάρθηκαν μεταστάσεις με ουρά ένεση φλέβα των ανθρώπινων καρκινικών κυττάρων [10] δεν Ανακεφαλαιώνοντας πλήρως απομακρυσμένες μεταστάσεις. Επιπλέον, η αποδεκτή ιδέα ότι συνδέτες WNT προωθούν μεταστατικής αύξησης που προέρχεται από γενετικά τροποποιημένα ποντίκια [13], [14], μένει να ελεγχθεί απευθείας χρησιμοποιώντας κύτταρα καρκίνου κόλου που λαμβάνονται από ασθενή.

Εδώ έχουμε σύγκριση κέρδος και αποκλεισμό του λειτουργία προσεγγίσεις για την αντιμετώπιση άμεσα τα αποτελέσματα της διαμόρφωσης WNT-TCF σηματοδότηση επί ανθρώπινου κόλον την ανάπτυξη των καρκινικών ξενομοσχευμάτων σε ποντικούς και σε μεταστάσεις μακρινό όργανο in vivo, χρησιμοποιώντας τόσο πρωτογενή κόλον καρκινικών κυττάρων που λαμβάνονται από ασθενή και δύο καθιερωμένες κυτταρικές γραμμές. Θεωρούμε ότι μόνο μια μειοψηφία των καρκινικών κυττάρων δοκιμάστηκε ανταποκρίνονται στην TCF αποκλεισμό μειώνοντας την ανάπτυξη του όγκου, αλλά σε αντίθεση με όλα τα κύτταρα που εξετάστηκαν ανταποκρίθηκαν με την ενίσχυση απομακρυσμένες μεταστάσεις όργανο. Επιπλέον, αυξημένα σηματοδότηση WNT μέσω ενισχυμένα επίπεδα συνδέτη σε καρκινικά κύτταρα δεν την τόνωση της ανάπτυξης του όγκου σε κάθε περίπτωση. Αντ ‘αυτού, είχε ως αποτέλεσμα μια ετερογενή μεταστατικό απάντηση: ενισχυμένη σηματοδότηση Wnt καταπιεσμένη μεταστατική ανάπτυξη σε μία περίπτωση, τρεις περιπτώσεις ήταν στατιστικώς ανεπηρέαστη, και ενισχυμένη μεταστάσεις σε άλλη περίπτωση. Περαιτέρω ανάλυση της ενίσχυσης των μεταστάσεων σε κύτταρα mCC11 αποκάλυψε ότι αυτό συνέβη σε μόνο μία από τις τρεις ανοσοεπαρκείς στελέχη ποντικού, υποστηρίζοντας ότι αυτό δεν είναι ένα κύτταρο όγκου ενδογενή απόκριση.

Σε γενικές γραμμές, το παρόν και τα προηγούμενα δεδομένα μας [10] υποδεικνύουν ότι το μπλοκάρισμα της σηματοδότησης WNT-TCF σε ασθενείς με καρκίνο του παχέος εντέρου θα είναι πιθανώς επιζήμια σε όλες τις περιπτώσεις, καθώς αυτό θα οδηγήσει σε αύξηση των μεταστάσεων, ανεξάρτητα από οποιαδήποτε μείωση των πρωτογενών μεγέθους του όγκου σε ένα υποσύνολο των περιπτώσεων. Σε αντίθεση, τα αποτελέσματα αναφέρουμε εδώ υποδεικνύουν ότι η αποκατάσταση της δραστικότητας οδού WNT-TCF σε ανθρώπινα κύτταρα καρκίνου του παχέος εντέρου μπορεί αντιθέτως να έχει θεραπευτική αξία σε ένα υποσύνολο των μεταστατικών καρκίνων.

Υλικά και Μέθοδοι

Ανθρώπινο δείγματα καρκίνου του παχέος εντέρου και κυτταρικής καλλιέργειας

Πρωτογενής ανθρώπινου καρκίνου του παχέος εντέρου (CC) δείγματα CC36 (TNM3), CC14 (TNM4) και mCC11 (μετάσταση στο ήπαρ από CC ασθενή) χρησιμοποιήθηκαν για αυτή τη μελέτη ήταν ως στις αναφορές [10], [21], [22], [23]. Το ΗΤ29 ανθρώπινο CC και κυτταρικών σειρών Τ84, η τελευταία προέρχεται από ένα μετάσταση πνεύμονα, ελήφθησαν από τις Υπηρεσίες κυτταρική γραμμή. Όλα τα πρωτογενή κύτταρα CC χρησιμοποιήθηκαν σε πρώιμο in vitro πέρασμα σε πρότυπες συνθήκες καλλιέργειας (DMEM-F12 με 10% FBS, 5% CO

2).

λεντοϊών εργαλεία και μόλυνση των ανθρώπινων ΥΧ

σταθερή εισαγωγή της βήτα-γαλακτοσιδάσης (βαβΙ) εκφράζοντα (

lacZ

+) κατασκευάσματα ανταποκριτή χρησιμοποιήθηκε λεντοϊού σωματίδια σε μια πολλαπλότητα μόλυνσης (ΜΟΙ) 2. Όλες οι καλλιέργειες μολύνθηκαν ελέγχθηκαν για βαβΙ έκφραση in vitro με χρώση X-Gal. παρτίδες καλλιέργεια κυττάρων με & gt? 90% ομοιογενή έκφραση των βαβΙ επιλέχθηκαν για περαιτέρω μολύνσεις (ΜΟΙ = 2) με GFP

+ lentivectors με ή χωρίς dnTCF4, Wnt1 ή Wnt3A. Παρτίδες με & gt? 85% GFP

+ κύτταρα επιλέχθηκαν για όλα τα πειράματα

πραγματικού χρόνου ποσοτική PCR

3-5d μετά τη μόλυνση, τα μολυσμένα κύτταρα συλλέχθηκαν σε ΤπζοΙ και mRNA. εξάγεται (Τεχνολογίες ζωής). Αντιδράσεις πρότυπο PCR πραγματοποιήθηκαν στις προέρχονται cDNA με τους ακόλουθους εκκινητές:

Ανθρώπινα-ειδικούς εκκινητές:

TBP F: CCACAGCTCTTCCACTCACA

Η

TBP R: GGATTATATTCGGCGTTTCG

Η

HPRT F: GCCAGACTTTGTTGGATTTG

Η

HPRT R: CTCTCATCTTAGGCTTTGTATTTTG

Η

AXIN2 F: AGTGTGAGGTCCACGGAA AC

Η

AXIN2 R: ACTGCCCACACGATAAGGAG

Η

LGR5 F: GGAGCATTCACTGGCCTTTA

Η

LGR5 R: CTGGACGGGGATTTCTGTTA

Η

ASCL2 F: GCGTTCCGCCTACTCGT

Η

ASCL2 R: GGCTTCCGGGGCTGAG

Η

Mouse-ειδικούς εκκινητές:

Wnt1 F: GACGGATTCCAAGAGTCTGC

Η

Wnt1 R: ATTGCGAAGATGAACGCTGT

Η

Wnt3A F: GCACCACCGTGGACGACAG

Η

Wnt3A R: CCTCGCTACAGCCACCCCAC

Η

ενέσεις φλέβα της ουράς σε ποντίκια NSG: Αγνό

lacZ

+ κυτταρικό πληθυσμό

10

6 ανθρώπινο CC κύτταρα σε HBSS εγχύθηκαν σε φλέβα της ουράς 6-εβδομάδων θηλυκά ανοσοκατεσταλμένους NSG ποντίκια (που στερούνται ώριμων κυττάρων Τ, Β και ΝΚ) με εγκεκριμένες διαδικασίες λειτουργίας στην εγκατάσταση ζώων στην UNIGE. Τα ζώα ζυγίζονται 20-25 g κατά την έναρξη του πειράματος. Τα ζώα ελέγχθηκαν συστηματικά για συμπτώματα δυσφορίας και συλλέγονται 4 εβδομάδες μετά τον εμβολιασμό εξής εγκεκριμένα πρωτόκολλα. Πνεύμονες συλλέχθηκαν σε PBS μετά την ανατομή

Η υποδόρια ξενομοσχεύματα σε NSG, Γυμνό και SHO ποντίκια:. LacZ

+ κύτταρα

5×10

5 CC κύτταρα σε HBSS ένεση στον υποδόριο στρώση 6 εβδομάδων θηλυκά ποντίκια Nude (NMRI-Foxn1nu /Foxn1nu, λείπει ώριμα κύτταρα Τ) ή ποντίκια SHO (SHO-PkrdcscidHrhr? λείπει ώριμα κύτταρα Τ και Β κύτταρα) ή ανοσοκατασταλμένους NSG (NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl /SzJ). Κάθε ποντικός μετέφερε 3 ξενομοσχεύματα στα πλευρά. Γυμνό και NSG ποντίκια αγοράστηκαν από την Janvier Labs (Γαλλία) και τα ποντίκια SHO από Charles River (Γαλλία). Όλα τα ζώα 20-25 g κατά την έναρξη του πειράματος και στη συνέχεια συνήθως ελέγχονται για συμπτώματα δυσφορίας κατά τον χρόνο των μετρήσεων του όγκου. Τα ζώα θυσιάστηκαν στο τέλος της 4 εβδομάδες μετά την μεταμόσχευση και ξενομοσχεύματα και τα όργανα συλλέχθηκαν σε PBS μετά την ανατομή. Ξενομοσχεύματα ψιλοκομμένο και αποθηκεύονται σε ΤπζοΙ μετά από διαλυτοποίηση και στη συνέχεια υποβάλλονται σε επεξεργασία για την έκφραση του γονιδίου αναλύσεις από ποσοτική PCR πραγματικού χρόνου.

Υπο-δερματική

lacZ

+/-

ξενομοσχευμάτων σε NSG ποντίκια

mCC11

lacZ

+ κύτταρα μολύνθηκαν με lentivector σε & gt? 90% απόδοση. Παράλληλα, mCC11 βάρος (

lacZ

-) κύτταρα μολύνθηκαν με GFP

+ lentivectors εκφράζουν Wnt1. mCC11-

lacZ

+ αναμίχθηκαν 1: 1 με mCC11-

lacZ

– /Wnt1

+ κύτταρα και συνολικά 5×10

5 κύτταρα εγχύθηκαν σε κάθε μία από τρεις θέσεις ανά 6-εβδομάδων θηλυκά ανοσοκατεσταλμένους NSG ποντίκια υπό εγκεκριμένες συνθήκες. Τα ζώα ελέγχθηκαν συστηματικά για συμπτώματα δυσφορίας καθημερινά κατά τη στιγμή της μετρήσεις της ανάπτυξης του όγκου. Όλα τα ζώα θυσιάστηκαν στο τέλος της 4 εβδομάδες μετά την μεταμόσχευση και οι όγκοι και τα όργανα συλλέχθηκαν σε PBS, στο τέλος των πειραμάτων.

βήτα-γαλακτοσιδάσης X-Gal χρώση

Όλα τα όργανα πλύθηκαν με κρύο PBS μετά τη συλλογή και σταθεροποιήθηκαν με 4% PFA σε 4 ° C για 2-12h. Χρώση έγινε για 4-8h με X-Gal. Χρωματισμένο δείγματα μετά πλύθηκαν με αποστειρωμένο PBS και επιθεωρούνται για εμφανή μετάσταση κάτω από ένα ανατομικό μικροσκόπιο.

lacZ

+ μεταστάσεις μετρήθηκαν και φωτογραφήθηκαν.

αλληλουχίας exome της APC

αλληλουχίας exome του DNA των πρωτογενών κυττάρων καρκίνου του παχέος εντέρου που χρησιμοποιείται διεξήχθη στο Genomics διευκόλυνση του Πανεπιστημίου της Γενεύης Ιατρική Σχολή. Μόνο APC αναλύθηκε λεπτομερώς για τη μελέτη αυτή. Μόνο οι γνωστές μεταλλάξεις APC που οδηγεί σε απώλεια της λειτουργίας εδώ αναφερθεί.

φροντίδα των ζώων

Όλα τα ποντίκια χρησιμοποιήθηκαν στο πλαίσιο εγκεκριμένων πρωτοκόλλων από το Γραφείο Cantonale de Κτηνιατρικό de Genève (OVC). Τα ζώα παρακολουθούνται αρκετές φορές την εβδομάδα για την ευημερία υπό την καθοδήγηση του κτηνιάτρου. Τα ποντίκια υποβλήθηκαν σε ευθανασία στο τέλος των πειραμάτων και πριν οι όγκοι έφθασαν το τοπικό νομικό όριο μέσω ένεσης ketazol /ξυλαζίνη ή CO

2 εισπνοή.

Αποτελέσματα

Διαμόρφωση των κανονικών σηματοδότηση Wnt σε ανθρώπινα ξενομοσχεύματα καρκίνου του παχέος εντέρου σε ποντίκια γενικά δεν μεταβάλλει ανάπτυξης όγκου

Πρωτογενή ανθρώπινα κύτταρα καρκίνου του παχέος εντέρου (CC14 και CC36), καθώς και μεταστατικό καρκίνο του παχέος εντέρου κύτταρα (mCC11) και μία μεταστατική κυτταρική γραμμή (Τ84) έχουν σταθερά μεταγωγή με GFP

+ κυρίαρχο-αρνητικό TCF4 (dnTCF), Wnt1, ή με lentivectors έλεγχο. Υποδόρια μοσχεύματα σε ανοσοκατεσταλμένα ποντίκια NSG επιλέχθηκαν από το δερματικό του παχέος εντέρου μεταστάσεις του καρκίνου συμβεί σε ασθενείς και επειδή δεν νομάρχη ορθοτοπική μοσχεύματα είναι δυνατόν σε ποντίκια: ακόμα ένεση στο ορθού τοίχο οδηγεί σε διαρροή σκάφος, δεδομένου λεπτότητα και οι όγκοι και οι πιέσεις που εμπλέκονται στην έγχυση , που οδηγεί σε συστηματική διάδοση. Επιπλέον, υποδόρια μοσχεύματα είναι απλή και εξαιρετικά επαναλήψιμα.

Τα επίπεδα έκφρασης των καλόπιστων καρκίνου του παχέος εντέρου WNT-TCF βιοδείκτη δραστηριότητα

AXIN2

, καθώς και οι δείκτες WNT-ρυθμιζόμενη βλαστικών κυττάρων

LGR5

και

ASCL2

(π.χ. [2]), προσδιορίστηκαν με RT-qPCR σε μεταχθέντα κύτταρα in vitro και σε υποδόρια ξενομοσχεύματα (Σχήμα 1Α). Όλα τα κύτταρα in vitro και in vivo ανταποκρίθηκαν στην καταπιεσμένη ή ενισχυμένη σηματοδότησης WNT-TCF, όπως αποδεικνύεται από τα ενδογενή επίπεδα του

AXIN2

mRNA? όλα τα κύτταρα καταστέλλονται

AXIN2

επίπεδα mRNA ως απάντηση στην οδό αποκλεισμό από dnTCF, και όλα τα κύτταρα αυξήθηκαν

AXIN2

επίπεδα mRNA ως απάντηση στην οδό ενεργοποίησης από Wnt1 (Σχήμα 1Α).

LGR5

και

ASCL2

ομοίως ρυθμίζεται αν και με διαφορές τύπο κυττάρων (Σχήμα 1Α).

(Α) Ποσοτικοποίηση των επιπέδων των

AXIN2

,

LGR5

και

ASCL2

με RT-qPCR in vitro και in vivo σε ξενομοσχεύματα στις τέσσερις τύπους κυττάρων που χρησιμοποιούνται σε αυτή τη μελέτη, με WNT-TCF μειορύθμιση μέσω dnTCF4 ή ρύθμιση προς τα άνω μέσω Wnt1 misexpression. Οι αριθμοί είναι οι αναλογίες των πειραματικών τον έλεγχο τιμών Ct, μετά από κανονικοποίηση με τα γονίδια καθαριότητας

TBP

και

HPRT

. Σημειώστε ότι σε όλες τις περιπτώσεις η κανονική WNT-TCF στόχο και δραστηριότητα δημοσιογράφος

AXIN2

προκαλείται από Wnt1 (πράσινα κουτιά) και καταπιεσμένη από dnTCF4 (κόκκινα κουτιά). (Β) GFP + φθορίζουσες εικόνες του αποσυντίθενται όγκων του mCC11 (πάνω σειρά) και Τ84 κύτταρα (κάτω σειρά). Διαφοροποίηση των WNT-TCF σηματοδότησης in vivo προκαλεί μικρές αλλαγές στην αναπτυσσόμενους όγκους. Ράβδοι κλίμακας = 0,6 εκατοστά. (Γ) Ιστόγραμμα της ποσοτικοποίησης των βάρους του όγκου μετά την ανατομή, για καθένα από τα τέσσερα καρκίνου του παχέος εντέρου κύτταρα που χρησιμοποιούνται. Δείτε κείμενο για λεπτομέρειες. ρ τιμές προσδιορίστηκαν με δύο-tailed t τεστ του Student.

Η

Η ανάπτυξη του όγκου παρακολουθήθηκε κάθε δύο ημέρες με τη μέτρηση του όγκου πριν όγκοι έφτασαν τα νόμιμα όρια. Στο τέλος του πειράματος, όλα GFP

+ όγκους συλλέχθηκαν συγχρόνως και φωτογραφήθηκαν. Σε καμία περίπτωση δεν ήταν πειραματικούς όγκους μεγαλύτερες από τους ελέγχους (Σχήμα 1Β και 1Γ). Αντ ‘αυτού, 4/8 ξενομοσχεύματα Τ84 εκφράζοντας dnTCF (Τ84

dnTCF) απέτυχαν να αναπτυχθούν και εκείνων που έκαναν ήταν εντός του εύρους των ελέγχων. Επιπλέον, υπήρξε μια μικρή μείωση στο βάρος όγκου για mCC11

Wnt1 σε σύγκριση με την ομάδα ελέγχου (Σχήμα 1 Β και 1 C). Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι τα επάνω ή προς τα κάτω ρύθμιση της κανονικής σηματοδότησης WNT μπορεί να έχει το πλαίσιο-εξαρτώμενη και αποκλίνουσες επιδράσεις in vivo. Ωστόσο, σε καμία περίπτωση δεν ενισχυμένη σηματοδότηση Wnt οδήγησε σε μεγαλύτερους όγκους και το μπλοκάρισμα της σηματοδότησης WNT-TCF δεν έχουν καθολική αποτελέσματα κατά των όγκων.

Ο αποκλεισμός της δραστηριότητας TCF οδηγεί σε μια γενική αύξηση των μεταστάσεων μακρινό όργανο

για να παρακολουθήσετε σαφώς μεταστατική αποικίες σε απομακρυσμένα όργανα, θα εμβολιάζονται τα καρκινικά κύτταρα με ενσωματωμένο em> κυττάρων

εκφράζοντα lentivectors να επιτρέψουν την αναγνώριση των ανθρώπινων ßGalactosidase

+ (βαβΙ

+) στο ποντίκι ιστούς μετά την αντίδραση XGal (Εικόνα 2Α? [10], [24]). Μπόλιασμα

lacZ

+ CC14

dnTCF, CC36

dnTCF ή mCC11

dnTCF (Σχήμα 2Β) κατέληξε σε καθαρή αύξηση μεταστάσεις στους πνεύμονες των ποντικών NSG, και τους μεταστατικού δείκτη (αριθμός

lacZ

+ μεταστατικό αποικίες διαιρούμενο με το συνολικό βάρος του όγκου σε γραμμάρια από το καθένα ποντίκια πραγματοποιείται 2-3 ξενομοσχεύματα υποδόρια πλευρά) (Σχήμα 2C). Αυτό δείχνει ότι κάτω ρύθμιση της δραστικότητας WNT-TCF (κατά περίπου 50%, όπως προτείνεται από

AXIN2

επίπεδα (Σχήμα 1Α) ενισχύει την πλήρη πειραματικά μεταστατικό φαινότυπο. Δεδομένου ότι η δραστηριότητα dnTCF εμπόδισε την ανάπτυξη του ενός τρίτου (4 /12) του Τ84

dnTCF όγκοι (Σχήμα 1 C), μια γενική μεταστατικό απόκριση σε αυτόν τον τύπο κυττάρων δεν ήταν απολύτως νόημα να ποσοτικοποιηθεί. Ωστόσο, η μεταστατική δείκτης του Τ84

dnTCF ποντίκια που ανέπτυξαν όγκους ήταν παρόμοια με εκείνη του Τ84

ελέγχου (δεν φαίνεται).

(Α) Διάγραμμα μεταμοσχευμένων κυττάρων της διαδικασίας που χρησιμοποιείται για την ανάλυση της επίδρασης της προς τα κάτω ρύθμιση των σηματοδότηση Wnt σε απομακρυσμένες μεταστάσεις in vivo. είναι

lacZ

+, η οποία επιτρέπει την απεικόνιση των μεγάλων αποικιών και ακόμη ενιαίο μεταστατικά κύτταρα σε απομακρυσμένα όργανα, κυρίως τους πνεύμονες (κάτω ένθετο). το ένθετο στα δεξιά δείχνει μια μεγάλη μεγέθυνση του

lacZ +

μεταστάσεις διαφόρων μεγεθών μετά στο σύνολό XGAL χρώση για να αποκαλύψει

lacZ

+ μεταστατικά κύτταρα (σκούρο μπλε κηλίδες). (Β) Εκπρόσωπος εικόνες του αριστερού λοβού πνεύμονα από ποντίκια εμβολιασμένα υποδορίως με κύτταρα ελέγχου ή εκείνα με αποκλεισμένη WNT-TCF σηματοδότηση μέσω η έκφραση του dnTCF4 όπως υποδεικνύεται. (Γ) Ποσοτικοποίηση του αριθμού των πνευμονικών μεταστάσεων ανά ζώο εμφανίζεται ως μεταστατική δείκτης (αριθμός των μεταστάσεων πάνω από το βάρος του όγκου) (άνω σειρά), και το βάρος του όγκου (κάτω σειρά), όπως υποδεικνύεται σε κάθε περίπτωση. (D) Ποσοτικός προσδιορισμός του μεγέθους των αποικιών μεταστατικών πνεύμονα όπως υποδεικνύεται ανά αριστερά πλευρά του πνεύμονα λοβό. Σε όλα τα σχήματα οι ράβδοι σφάλματος είναι S.E.M. και σ τιμές προέρχονται από t τεστ αταίριαστα, δύο-ουρά του Student. Γραμμή κλίμακας = 7 mm για (Α)? 25 χιλιοστά για το (Β).

Η

Η ποσοτικοποίηση του μεγέθους του

lacZ

+ μεταστατικό αποικιών στους πνεύμονες αποκάλυψε ότι υπήρξε μια σταθερή αύξηση του αριθμού των μεγάλων (& gt ? 100 κύτταρα ανά αποικία) μεταστάσεις μετά την καταστολή της σηματοδότησης WNT-TCF σε ποντίκια που φέρουν CC36

dnTCF, CC14

dnTCF και mCC11

dnTCF ξενομοσχευμάτων σε σύγκριση με την ομάδα ελέγχου (Σχήμα 2D). Επιπλέον, τόσο CC36

dnTCF και mCC11

dnTCF ποντικούς που φέρουν όγκο εμφανίζεται επίσης ένα μεγαλύτερο αριθμό μικρομεταστάσεων (& lt? 10 κύτταρα ανά αποικία) έναντι των μαρτύρων (Εικ 2Δ). Αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι μειορύθμιση κανονικών σηματοδότηση WNT μπορεί να οδηγήσει τόσο σε αύξηση του αριθμού των μεταστατικών κυττάρων φθάνει ένα μακρινό όργανο, καθώς και την αύξηση του μεγέθους των μεταστατικών αποικιών.

Ενίσχυση των επιπέδων συνδέτη WNT κάνει γενικά δεν αυξάνουν τον αριθμό των μεταστάσεων μακρινό όργανο

για να ελέγξετε για απομακρυσμένες μεταστάσεις από τόπο πρωτογενούς όγκου σε ένα μακρινό όργανο, οι πνεύμονες σε αυτή την περίπτωση, ο έλεγχος και Wnt1 εκφράζουν

lacZ

+ κύτταρα μεταμοσχεύθηκαν σε πλήρως ανοσοκατεσταλμένους ποντικούς NSG υποδορίως (σχήμα 3Α). Λαμβάνοντας υπόψη ότι η CC14

Wnt1, ή CC36

Wnt1 όγκους δεν είχε μεταβληθεί σημαντικά τα επίπεδα των μεταστάσεων του πνεύμονα σε σύγκριση με την ομάδα ελέγχου (Σχήμα 3Β και 3D), Τ84

Wnt1 όγκους που παράγονται λιγότερα και mCC11

Wnt1 όγκοι παράγουν περισσότερο μεταστάσεις και είχε μια αλλοιωμένη μεταστατικό δείκτη κατανομής και αποικία μεγέθους (Σχήμα 3C και 3D). Αυτό δείχνει ότι η μεταστατική έκβαση του σηματοδότηση Wnt ενεργοποιείται από ενέργεια συνδετήρας μπορεί να είναι το πλαίσιο που εξαρτάται όμως ότι η ενισχυμένη σηματοδότηση WNT δεν είναι καθολικά προ-μεταστατικό.

(Α) Διάγραμμα της διαδικασίας που χρησιμοποιείται για την ανάλυση της επίδρασης της προς τα πάνω ρύθμιση του σηματοδότηση Wnt σε απομακρυσμένες μεταστάσεις in vivo. (Β) Τα αντιπροσωπευτικά παραδείγματα αριστερά πνευμονικών λοβών ποντικών που έφεραν υποδόριους όγκους των διαφόρων κυττάρων καρκίνου του παχέος εντέρου όπως υποδεικνύεται, είτε μεταφέρουν ελέγχου (άνω σειρά) ή Wnt1 εκφράζουν (κάτω σειρά) lentivectors, μετά από χρώση Χ-Gal. Κλίμακα bar = 25 mm. (Γ) Ποσοτικοποίηση του μεταστατικού δείκτη σε κάθε περίπτωση ανά ποντίκι. (D) Ποσοτικός προσδιορισμός του μεγέθους των αποικιών μεταστατικών πνεύμονα όπως υποδεικνύεται ανά αριστερά πλευρά του πνεύμονα λοβό. Σημειώστε ότι οι έλεγχοι είναι η ίδια που χρησιμοποιήθηκε για σχήμα 2 ως τα πειράματα Wnt1 και dnTCF διεξήχθησαν ταυτόχρονα αλλά εμφανίζονται χωριστά για λόγους σαφήνειας.

Η

Ενισχυμένη σηματοδότηση WNT ρυθμίζει τον αριθμό των άμεσα σπάρθηκαν μεταστάσεων σε έναν συγγενούς πλαισίου εξαρτώμενο τρόπο

Για να παράσχει πρόσθετη στήριξη το μεταστατικό φαινότυπο που παρατηρείται με mCC11

Wnt1 και Τ84

κύτταρα Wnt1 στην πλήρη μεταστατικό δοκιμασίες που περιγράφονται παραπάνω, μπορούμε άμεσα σπέρνονται τα καρκινικά κύτταρα στους πνεύμονες, με έγχυση em

lacZ

+ mCC11

Wnt1 ή

lacZ

+ κυττάρων Τ84

Wnt1 στην κυκλοφορία των ποντικιών NSG μέσω της φλέβας της ουράς (Εικόνα 4Α). κύτταρα mCC11

Wnt1 σχηματίζονται πολλές περισσότερες και Τ84

κύτταρα Wnt1 πολύ λιγότερες μεταστάσεις σε σύγκριση με την ομάδα ελέγχου (Σχήμα 4Β και 4C). Ποσοτικοποίηση των μεταστατικών αποικιών ανά μέγεθος αποκάλυψε τις αλλαγές σε όλες τις κατηγορίες, από μόνο μικρομεταστάσεις κύτταρο σε μεγάλες αποικίες με & gt? 100 κύτταρα (Σχήμα 4D). Τα δεδομένα αυτά υποστηρίζουν τα μακρινά αποτελέσματα μετάσταση και υποστηρίζουν ότι η σηματοδότηση Wnt μπορεί να επηρεάσει την μεταστατική ανάπτυξη, ανεξάρτητα από τυχόν άλλες επιπτώσεις συμπεριλαμβανομένου του στρώματος του πρωτοπαθούς όγκου. Αυτά τα αποτελέσματα επιβεβαιώνουν επίσης ότι, παραδόξως, αυξημένη WNT επίπεδα συνδέτη είναι προ-μεταστατικό σε ένα τύπο κυττάρου και αντι-μεταστατικός σε κάποιο άλλο.

(Α) Σχηματικό διάγραμμα του πρωτοκόλλου που χρησιμοποιείται για τη δοκιμή των επιδράσεων της ενισχυμένης σηματοδότηση WNT για μεταστατική ανάπτυξη μετά από άμεση έγχυση μέσα στην κυκλοφορία φιαλίδιο φλέβα της ουράς. (Β-D) Αντιπροσωπευτικά παραδείγματα (Β), η συνολική ποσοτικοποίηση (C) και τον ποσοτικό προσδιορισμό του μεταστατικού μέγεθος αποικιών (C) του X-Gal βάφονται περιοχές του πνεύμονα μετά από ένεση των κυττάρων ελέγχου ή των κυττάρων με ενίσχυση ή σηματοδότηση Wnt όπως υποδεικνύεται. mCC11 μεταστατική ανάπτυξη ενισχύεται, ενώ εκείνο των Τ84 καταστέλλεται (C, D). Σημειώστε ότι ο συνολικός αριθμός των μεταστατικών αποικιών αντιπροσωπεύονται στο (C) για mCC11 είναι ανά αριστερό πνεύμονα λοβό, ενώ δίνεται σπανιότητα τους, ότι για Τ84 είναι για το σύνολο των πνευμόνων. Γραμμή κλίμακας = 7 mm για το (Β).

Η

Η έλλειψη συσχέτισης της κατάστασης APC και φαινότυπο διαφοροποίησης WNT-TCF

Θα μπορούσε να υποστηριχθεί ότι έχουμε επιλέξει κύτταρα που μπορεί να μην έχουν μεταλλαγμένα APC, καθιστώντας έτσι τα αποτελέσματά μας δεν ισχύει γενικά σε περισσότερους ανθρώπινους καρκίνους του παχέος εντέρου. Ωστόσο, οφείλουμε να παρατηρήσουμε ότι τα λιμάνια Τ84

APC

μεταλλάξεων και ότι exome αλληλουχίας του

APC

σε CC14 αποκαλύπτει την παρουσία της απώλειας των μεταλλάξεων λειτουργίας (CHR5 112.173.848 G- & gt? T, Cosmic id 18566, E

853- & gt? STOP? CHR5 112.175.951 G- & gt? Α, Ε

1554- & gt?. πλαισίου)

Για να επεκτείνει αυτά τα ευρήματα επαναλάβαμε τα πειράματα με dnTCF και Wnt1 χρησιμοποιώντας το πηγάδι ονομαστές

APC

μεταλλαγμένη κυτταρική σειρά καρκίνου του παχέος εντέρου ΗΤ29 (Σχήμα 5Α). Σε αυτά τα κύτταρα Wnt1 και dnTCF4 ρυθμίζονται στόχους TCF όπως αναμενόταν (Σχήμα 5Β). Όγκων που εκφράζουν ΗΤ29

dnTCF ήταν ελαφρώς αλλά σημαντικά μικρότερη, αλλά αυτή ήταν και η περίπτωση για ΗΤ29

όγκων Wnt1 (Σχήμα 5C), γεγονός που υποδηλώνει την έλλειψη σαφούς απάντησης ανάπτυξη του όγκου σε διαμόρφωση σηματοδότηση Wnt. Επιπλέον δεν υπήρχε διαφορά σημασία σε αριθμό

lacZ

+ μεταστάσεις από όγκους ΗΤ29

Wnt1 σε σύγκριση με ΗΤ29

ελέγχους (Σχ 5D και 5Ε). Αντίθετα, η αύξηση με ΗΤ29

dnTCF ήταν σημαντική (Σχήμα 5D και 5Ε). Αναλύσεις μεγέθους μεταστατικών αποικιών επιβεβαίωσε αυξήσεις των μικρο- και macrometastases από ΗΤ29

dnTCF, αλλά δεν ΗΤ29

Wnt1, όγκους σε σύγκριση με ΗΤ29

ελέγχους (Σχήμα 5F).

(Α) στρατηγική που χρησιμοποιείται για υποδόρια μεταστάσεων πνεύμονα. (Β) Heat χάρτη της κανονικοποιημένης επίπεδα έκφρασης του mRNA πάνω από τους ελέγχους (και πάνω γονίδια housekeeping) για τα επισημαίνονται γονιδίων σε κύτταρα ΗΤ29 καλλιεργούνται in vitro ή σε ξενομοσχεύματα in vivo. Όλοι οι αριθμοί είναι αναλογίες κατά τους ελέγχους. (C, D) Επιπτώσεις της διαφοροποίησης των σηματοδότηση Wnt με την έκφραση dnTCF ή Wnt1 στην αύξηση του υποδόριου όγκου (C) και του μεταστατικού δείκτη (δείκτης Met) (D). (Ε) Αντιπροσωπευτικά παραδείγματα άφησε εικόνες των πνευμόνων για την κάθε περίπτωση, όπως σημειώνεται. Οι μεταστάσεις χρωματισμένο σκούρο μπλε μετά την αντίδραση XGal λόγω κύτταρο-εγγενή έκφραση τους

lacZ

. (F) Ποσοτικοποίηση των

lacZ

+ μεταστατικό μέγεθος των αποικιών σε τρεις κατηγορίες, όπως φαίνεται. Κλίμακα bar = 20 χιλιοστά για το (Ε).

Η

Μαζί, αυτά τα δεδομένα υποστηρίζουν τη γενική αντίληψη ότι κυττάρου εγγενή μείωση των κανονικών WNT απαντήσεις σηματοδότησης σε καρκινικά κύτταρα είναι προ-μεταστατικού, και υποστηρίζουν ότι η κατάσταση της APC δεν είναι απλά συσχετίζεται με το αποτέλεσμα της διαφοροποίησης των WNT-TCF σηματοδότησης.

Διαφορετικές κανονική συνδέτες WNT ενισχύει τον αριθμό των απομακρυσμένων μεταστάσεων mCC11

για να αποκλειστεί η πιθανότητα ότι οι επιπτώσεις της αυξημένης μεταστάσεις από ενισχυμένη Wnt1 οφείλονταν σε μία εξειδίκευση του συνδέτη που χρησιμοποιείται, επαναλάβαμε την πλήρη μεταστατικά πρωτόκολλο με κύτταρα mCC11 εκφράζουν Wnt3A ή Wnt1, αμφότερα των οποίων ενεργοποιούν κανονικών σηματοδότηση WNT-TCF και, όπως αναμενόταν, την ενίσχυση των επιπέδων του στόχου WNT-TCF

AXIN2

και το WNT-ρυθμίζεται δείκτη βλαστικών κυττάρων του παχέος εντέρου

LGR5

πάνω από εκείνα τα κύτταρα ελέγχου (Σχήμα 6Α). mCC11

Wnt3A

lacZ

+ κύτταρα που παράγονται όγκους παρόμοια με ελέγχους σε μέγεθος, αλλά αναπαράγεται την ενίσχυση των απομακρυσμένων μεταστάσεων πνεύμονα από mCC11

Wnt1 όγκων με τη διανομή παρόμοιου μεγέθους αποικιών (Σχ 6Β και 6C και δεν παρουσιάζονται).

(Α) Ενισχυμένη Wnt1 και Wnt3A παράγουν παρόμοιες αλλαγές στα μέτρα έκφραση του γονιδίου-στόχου με RT-qPCR. (Β) Τα αντιπροσωπευτικά παραδείγματα του Χ-Gal κεχρωσμένη αριστερά πνευμονικών λοβών με μεταστατικό αποικίες όπως περιγράφεται. (Γ) Ποσοτικοποίηση του μεταστατικού δείκτη και το βάρος για mCC11 κ.β., mCC11

Wnt1 και mCC11

Wnt3A. Τόσο Wnt1 και Wnt3A ενισχύσει μεταστάσεις κατά τους ελέγχους, αλλά μόνο Wnt1 όγκοι είναι ελαφρώς μικρότερα. Κλίμακα bar = 20 χιλιοστά για το (Β).

Η

mCC11

κύτταρα Wnt1 προώθηση μεταστάσεις από αδελφικών μη Wnt1-κύτταρα που εκφράζουν

Για να εξακριβωθεί ότι οι συνδέτες WNT από mCC11

κύτταρα Wnt1 ασκήσει αυτόνομη σηματοδότησης μη-κυττάρων in vivo,

lacZ

-αρνητικοί mCC11

κύτταρα Wnt1 αναμίχθηκαν με

lacZ

+ κβ αδελφικών κύτταρα mCC11 και συν-ένεση για να σχηματίσουν υποδόριων όγκων ( Σχήμα 7Α). Μετά την ανάπτυξη του όγκου ελέγξαμε για την ενισχυμένη παρουσία βαβΙ

+ mCC11 κ.β. κύτταρα των πνευμόνων. mCC11 κύτταρα

Wnt1 προώθησε σημαντικά την μεταστατική συμπεριφορά των κυττάρων αδελφό mCC11 κβ (σχήμα 7Β και 7C), υποδεικνύοντας ότι συνδέτες Wnt1 μπορεί επίσης να ενεργήσει μη αυτόνομα σε αυτό το πλαίσιο.

(Α) Διάγραμμα του πρωτοκόλλου που χρησιμοποιείται για τη δοκιμή των μη αυτόνομων επιδράσεις της υπερεκφράζεται Wnt συνδετήρες επί αδελφό, μη-κύτταρα που υπερεκφράζουν mCC11 μπολιασμένα ταυτόχρονα. Μόνο

lacZ

+?

Wnt1

– Τα κύτταρα παρακολουθούνται μετά την αντίδραση XGAL. (Β) Αντιπροσωπευτικές εικόνες του X-Gal κεχρωσμένη αριστερά λοβοί των πνευμόνων υπό τις περιγραφόμενες συνθήκες. (Γ) Ποσοτικοποίηση του μεταστατικού δείκτη και το βάρος του όγκου ανά συνθήκη. Κλίμακα bar = 25 χιλιοστά για το (Β).

Η

mCC11

κύτταρα Wnt1 δεν δείχνουν αυξημένο μεταστάσεις πάνω από ελέγχους σε γυμνούς ή SHO ποντίκια

Τα αποτελέσματα που παρουσιάζονται παραπάνω δείχνουν ότι η κανονική WNT σηματοδότηση είναι προ-μεταστατικό σε κύτταρα mCC11, και ότι Wnt συνδετήρες δρουν τόσο autocrinely και μη αυτόνομα in vivo, γεγονός που υποδηλώνει ότι η κύρια στρώματος του όγκου είναι απίθανο να είναι ο μοναδικός στόχος των προ-μεταστατικό σηματοδότηση WNT. Ωστόσο, μπορούμε επίσης να βρείτε αυτό το κύτταρο-αυτόνομη καταστολή της λειτουργίας TCF με dnTCF οδηγεί σε σημαντική αύξηση της σε μεταστάσεις μακρινό όργανο από αυτά τα κύτταρα, όπως με όλα τα άλλα κύτταρα που εξετάστηκαν. έτσι υποθέσαμε ότι ο αποκλεισμός της WNT-TCF σηματοδότησης στα κύτταρα mCC11 θα μπορούσε να είναι εγγενώς και γενικά προ-μεταστατική (σύμφωνα με τα αποτελέσματα των άλλων δοκιμάζονται κύτταρα), αλλά ότι η ενισχυμένη σηματοδότηση Wnt μπορεί να ενισχύσει μεταστάσεις από κύτταρα mCC11 μέσω μιας μη-κυττάρων αυτόνομα, mCC11-ειδικό μηχανισμό.

για να ελέγξετε αν η ενισχυμένη μεταστατικό φαινότυπο των mCC11

Wnt1 εξαρτάται από το περιβάλλον, θα αλλάξει ριζικά το περιβάλλον των μεταμοσχευμένων κυττάρων του όγκου με την αλλαγή του στελέχους από τους οικοδεσπότες του ποντικιού ( Σχήμα 8Α). mCC11

Wnt1 υποδόριων όγκων μεγάλωσε ως μάρτυρες έκαναν σε γυμνά ή SHO ποντίκια (Σχήμα 8Β και 8C), αλλά, σε αντίθεση με την ισχυρή μεταστατικό φαινότυπο των mCC11

κύτταρα Wnt1 σε ποντίκια NSG περιγράφεται παραπάνω, mCC11

Wnt1 όγκους δεν έδειξε αυξημένο αριθμό των μεταστάσεων σε σύγκριση με τους ελέγχους σε μπολιασμένα με γυμνό ή SHO ποντικούς (Σχ 8Β και 8C). Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι τα κύτταρα mCC11 δεν εμφανίζονται σε ένα κελί εγγενή μεταστατικό ενίσχυση ως απάντηση στην αυξημένη σηματοδότηση Wnt.

(Α) Διάγραμμα της διαδικασίας που χρησιμοποιείται για να εμφυτευθούν κύτταρα mCC11 υποδορίως και οι αναλύσεις που προκύπτουν απομακρυσμένες μεταστάσεις στους πνεύμονες. (Β) Ποσοτικοποίηση των βαρών των όγκων και των μεταστατικών δεικτών που δείχνουν έλλειψη για την προώθηση των μεταστάσεων από mCC11

κύτταρα Wnt1 μπολιάζονται με γυμνό ή SHO φιλοξενεί το ποντίκι.

Η

Συζήτηση

Ενενήντα τρία τοις εκατό των ανθρώπινων καρκίνων του παχέος εντέρου φιλοξενούν υπερενεργοποίηση του κανονικού μονοπατιού WNT, τις περισσότερες φορές με απώλεια της λειτουργίας του APC (https://cancergenome.nih.gov/). Αυτό, σε συνδυασμό με τα αποτελέσματα με τα μοντέλα γενετική ποντίκι, έχει παράσχει υποστήριξη για ένα λειτουργικό ρόλο των υπερκινητικά σηματοδότησης Wnt-τρισεκατομμυρίων κυβικών μέτρων στην έναρξη και ανάπτυξη των εντερικών όγκων με κύτταρα σε καλλιέργεια in vitro και σε μοντέλα ποντικών in vivo (π.χ. [2], [18], [25], [26]). Αρκετές γραμμές απόδειξης που προέρχονται επίσης από την εργασία με διαγονιδιακά ποντίκια παρουσιάζονται πρότεινε ότι η ενίσχυση της Wnt δραστηριότητας, στη μεταστατική θέση μέσω της δράσης του Periostin [13] ή με την προώθηση της μεταναστευτικής συμπεριφοράς των κυκλοφορούντων κυττάρων του όγκου [14], οδηγεί μεταστάσεις σε διαφορετικών τύπων καρκίνου. Αυτά και άλλα δεδομένα έχουν ληφθεί να υποδηλώνουν ότι η υψηλή κανονική σηματοδότηση Wnt σε διαφορετικούς ανθρώπινους καρκίνους, συμπεριλαμβανομένων εκείνων του παχέος εντέρου, είναι απαραίτητη για την ανάπτυξη του όγκου και των μεταστάσεων σε ασθενείς, υποστηρίζοντας για την ανάπτυξη θεραπευτικών ανταγωνιστές οδού WNT-TCF (π.χ. [3 ]).