Abstract

μικροπεριβάλλον του όγκου, περιλαμβανομένων των στρωματικών κυττάρων, που περιβάλλουν τα αιμοφόρα αγγεία και συστατικά εξωκυτταρικής μήτρας, έχει οριστεί ως κρίσιμος παράγοντας που επηρεάζει τον πολλαπλασιασμό, φάρμακο-αντίσταση, εισβολή και μετάσταση των κακοηθών επιθηλιακών κυττάρων. Μεταξύ άλλων παραγόντων, οι επικοινωνίες και η αλληλεπίδραση μεταξύ των καρκινικών κυττάρων και στρωματικών κυττάρων έχουν αναφερθεί ότι παίζουν καθοριστικό ρόλο στην προαγωγή και εξέλιξη του καρκίνου. Για να διερευνήσουν αυτές τις σχέσεις, ένα on-chip μοντέλο συν-καλλιέργειας αναπτύχθηκε για τη μελέτη της κυτταρικής αλληλεπίδρασης μεταξύ των κυττάρων καρκινώματος πνεύμονα Α549 ανθρώπινα κύτταρα και MRC-5-ανθρώπινου πνεύμονα επιθηλιακή στις δύο κανονικές συνθήκες πολλαπλασιασμού και θεραπεία. Εν συντομία, μια συσκευή συν-καλλιέργειας που αποτελείται από 2 επιμέρους ρευστού θαλάμους εν παραλλήλω, τα οποία χωρίζονται από ένα φράκτη 100 μm χρησιμοποιήθηκε για την κυτταρική σχηματοποίηση. Microelectrodes συστοιχίες είχαν εγκατασταθεί μέσα σε κάθε θάλαμο, συμπεριλαμβανομένων των ηλεκτροδίων σε διάφορες αποστάσεις μακριά από τη γραμμή αντιπαράθεσης για την ηλεκτροχημική impedimetric εκτίμηση αίσθησης της επιρροής κυττάρου-προς-κύτταρο. Αφού το φράχτη απομακρύνθηκε και εμφανίστηκαν κύτταρο-προς-κύτταρο επαφή, με την αξιολόγηση των αποκρίσεων σήματος σύνθετης αντίστασης που αντιπροσωπεύει την κατάσταση των κυττάρων και τη συμπεριφορά, και οι δύο άμεσες και έμμεσες αλληλεπιδράσεις κυττάρου-προς-κύτταρο μέσω ρυθμισμένα μέσα ερευνήθηκαν. Ο αντίκτυπος των συγκεκριμένων αποστάσεων που οδηγούν σε διαφορετικές επιρροές των ινοβλαστών κυττάρων σε καρκινικά κύτταρα στο περιβάλλον συν-καλλιέργεια ορίστηκε επίσης

Παράθεση:. Tran φυματίωση, Μπεκ C, Ελάχ J (2016) Ηλεκτρικός κυττάρων-υποστρώματος Αντίσταση Sensing (ECI) με μικροηλεκτροδίων Πίνακες για Έρευνα του Καρκίνου τηλέφωνα – ινοβλάστες Αλληλεπίδραση. PLoS ONE 11 (4): e0153813. doi: 10.1371 /journal.pone.0153813

Επιμέλεια: Jonghoon Choi, Πανεπιστήμιο Chunag-Ang, Δημοκρατία της Κορέας

Ελήφθη: 12, Φλεβάρη 2016? Αποδεκτές: 4 Απριλίου, 2016? Δημοσιεύθηκε: 18, Απριλίου, 2016

Copyright: © 2016 Tran et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Δεδομένα Διαθεσιμότητα:. Όλη η δεδομένα είναι εντός του Υποστηρίζοντας αρχεία πληροφοριών του χαρτιού και

Χρηματοδότηση:. η έρευνα υποστηρίχθηκε από το ερευνητικό Κέντρο BioNano Υγείας-Guard, που χρηματοδοτείται από το Υπουργείο Επιστημών, των ΤΠΕ & amp? Μελλοντικό σχεδιασμό (MSIP) της Κορέας ως Παγκόσμια Frontier Έργου (H-GUARD_2015M3A6B2063548) και υποστηρίχθηκε από το Πρόγραμμα Ανάπτυξης των νανοϋλικών Τεχνολογίας μέσω του Εθνικού Ιδρύματος Ερευνών της Κορέας (NRF), που χρηματοδοτείται από την κυβέρνηση της Κορέας (MSIP) (NRF-2014M3A7B4051907).

Αντικρουόμενα συμφέροντα: Οι συγγραφείς δηλώνουν ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

υπάρχουν αυξανόμενες ενδείξεις καταδεικνύουν ότι το μικροπεριβάλλον του όγκου, συμπεριλαμβανομένων στρωματικά κύτταρα, φλεγμονώδη κύτταρα, εξωκυττάρια. μήτρα (ECM), κυτοκίνες, σκάφη και αυξητικούς παράγοντες, παίζει σημαντικό ρόλο στην έναρξη, την εξέλιξη και την εισβολή του καρκίνου [1-3]. Κατά τη διάρκεια της ογκογένεσης, τα καρκινικά κύτταρα αλληλεπιδρούν δυναμικά με τα περιβάλλοντα στρωματικά κύτταρα, όπως ινοβλάστες, λιπώδη κύτταρα και κύτταρα του ανοσοποιητικού συστήματος που κατοικούν. Μεταξύ αυτών, ινοβλάστες αποτελούν τη μεγαλύτερη ομάδα των στρωματικών κυττάρων και φαίνεται να λειτουργούν σε περίοπτη θέση στην εξέλιξη του καρκίνου [4-5].

Πρώτα περιγράφονται στα τέλη του 19

ου αιώνα, οι ινοβλάστες είναι επιμήκη, μη αγγειακή , μη-επιθηλιακών και μη φλεγμονώδη κύτταρα του συνδετικού ιστού με την εκτεταμένη κυτταρικές διαδικασίες που παρουσιάζουν ένα ατρακτοειδές ή ατρακτοειδόμορφα σχήμα σε προφίλ. Ινοβλάστες εκτελεί πολλές σημαντικές λειτουργίες, συμπεριλαμβανομένης της εναπόθεσης της ECM, ρύθμιση της διαφοροποίησης επιθηλιακών, και τη ρύθμιση της φλεγμονής? αυτοί εμπλέκονται επίσης στην επούλωση των πληγών [5]. Κατά την κανονική πολλαπλασιασμό σε υγιή όργανα, ινοβλάστες συνθέτουν και εκκρίνουν διάφορους τύπους κολλαγόνων (δηλαδή, τύποι Ι, III, και V), καθώς και ινωδονεκτίνη και πρωτεογλυκάνες, τα οποία είναι τα βασικά συστατικά του ECM [6]. Οι ινοβλάστες εκκρίνουν επίσης IV κολλαγόνο και λαμινίνη τύπου, τα οποία βοηθούν στο σχηματισμό της βασικής μεμβράνης [7]. Σε τραυματίες όργανα, ινοβλάστες παίζουν σημαντικό ρόλο στη διαδικασία επούλωσης με την εισβολή αλλοιώσεις και δημιουργώντας ECM για να χρησιμεύσει ως ένα ικρίωμα για άλλα κύτταρα [8].

Στο αρχικό στάδιο της ογκογένεσης, τα καρκινικά κύτταρα σχηματίζουν ένα νεοπλαστική βλάβη μέσα στο όριο της βασικής μεμβράνης, αλλά διαχωρίζονται από τον περιβάλλοντα ιστό [9]. Οι βασικής μεμβράνης, ινοβλάστες, κύτταρα του ανοσοποιητικού συστήματος, τα τριχοειδή αγγεία και ECM γύρω από τα καρκινικά κύτταρα σχηματίζουν μια περιοχή που ονομάζεται το μικροπεριβάλλον του όγκου. Δεδομένου ότι η κύρια πηγή συστατικών ECM, οι ινοβλάστες που ορίζεται ως βασικό κυτταρικό συστατικό των όγκων. Σε συνεργασία με τα καρκινικά κύτταρα, η κανονική ινοβλάστες μπορεί να αποκτήσει διαρκώς ενεργοποιημένο φαινότυπο με άμεση επικοινωνία κυττάρου-κυττάρου ή με διάφορα ερεθίσματα που προκύπτουν όταν παρουσιάζεται βλάβη ιστού [10]. Ενεργοποιημένων ινοβλαστών εμφανίζουν τα up-κανονισμούς της ECM αποικοδόμησης μεταλλοπρωτεϊνάσες-2 μήτρας, 3 και 9 (ΜΜΡ-2, ΜΜΡ-3 και ΜΜΡ-9), καθώς και πολλούς αυξητικούς παράγοντες, οι οποίοι επάγουν πολλαπλασιαστικά σήματα σε γειτονικά επιθηλιακά κύτταρα [11] . Από αυτή τη στενή ένωση, τίθεται το ερώτημα σχετικά με τα heterotypic κυτταρικές αλληλεπιδράσεις μεταξύ των καρκινικών κυττάρων και ινοβλαστών στο μικροπεριβάλλον του όγκου. Κατά την τελευταία δεκαετία, ένας αριθμός ερευνητικών μελετών έχουν αποσαφηνίσει την επίδραση των ινοβλαστών σε διάφορες πτυχές της συμπεριφοράς των καρκινικών κυττάρων που συμπεριλαμβάνουν τον πολλαπλασιασμό, αγγειογένεση, εισβολή, μετάσταση και αντοχή φαρμάκου? Ωστόσο, τα καρκινικά κύτταρα συμπεριφορά έχει ακόμη εξηγηθεί πλήρως. Σε περίοπτη θέση, Stoker et al. (1966), Wadlow et al. (2009) και Flaberg et al. (2011, 2012) έχουν δείξει ότι η κανονική ινοβλάστες μπορούν να αναστείλουν την ανάπτυξη των καρκινικών κυττάρων

in vitro

και που αποκαλείται το αποτέλεσμα αυτό ως καταστολή γείτονας [12-15]. Flaberg et al. (2012) σχεδίασαν ένα ποσοτικό προσδιορισμό συν-καλλιέργεια με Η2Α-mRFP-επισημασμένα καρκινικά κύτταρα σε ένα μονο-στρώμα από ινοβλάστες [15]. Κατά τη διάρκεια του 62,5 h, τα καρκινικά κύτταρα πολλαπλασιασμού και κινητικότητα σημαντικά αναστέλλονται από τις ινοβλάστες μέσω άμεσης αλληλεπίδρασης κυττάρου-προς-κύτταρο. Για να κατανοήσουμε πλήρως τις επιδράσεις αυτές, μπορούμε εικάζεται αν υπάρχει μια έμμεση αλληλεπίδραση γείτονα μεταξύ ινοβλάστες και καρκινικά κύτταρα, τα οποία θα ονομαστεί ως αποτέλεσμα απόσταση. Η δεδομένη υπόθεση είναι ότι η ανασταλτική επίδραση των ινοβλαστών σε καρκινικά κύτταρα είναι μια συνάρτηση της απόστασης μεταξύ αυτών των τύπων 2 κυττάρων σε ένα κοινό μικροπεριβάλλον στρωματικών.

Σε αυτή τη μελέτη, προτείναμε ένα απλό μοντέλο συν-καλλιέργειας με ενσωματωμένο συστοιχίες υψηλής απόδοσης μικροηλεκτροδιακές (ΜΕΑ) χρησιμοποιώντας ηλεκτρικό κυττάρων-υπόστρωμα αντίστασης ανίχνευσης (ECI) δοκιμασία (Σχήμα 1) για την παρακολούθηση των συνθηκών του όγκου των κυττάρων συνεχώς όταν έρχεται αντιμέτωπος με καλλιεργημένα ινοβλάστες. Αυτή η μέθοδος ανίχνευσης ηλεκτρικού χρησιμοποιήθηκε σε αυτή τη μελέτη λόγω της εξέχοντα πλεονεκτήματα? Αυτή η μέθοδος είναι μη επεμβατική, απλή εγκατάσταση, εύκολη να γίνει, εξαιρετικά ευαίσθητος σε κυτταρικές συνθήκες και ικανό σε πραγματικό χρόνο παρακολούθηση [16,17]. Η ΜΕΑ ήταν διαμορφωμένο και στις δύο πλευρές των περιοχών κυτταρικής καλλιέργειας σε διάφορες αποστάσεις από τη γραμμή διαχωρισμού. Κατά τη διάρκεια των αλληλεπιδράσεων κυττάρου, κάθε ηλεκτρόδιο καταγράφει συνεχώς ένα σήμα σύνθετης αντίστασης μέσω ενός συστήματος απόκτησης δεδομένων υψηλής απόδοσης. Αυτό το είδος της impedimetric δεδομένων έχει αναγνωριστεί να αντανακλά την κυτταρική προσκόλληση, εξάπλωση, ο πολλαπλασιασμός και η βιωσιμότητα σε συνθήκες επεξεργασίας με περιβαλλοντικές τοξίνες, τα ναρκωτικά, και τα χημικά προϊόντα, καθώς και άλλες ουσίες

(Α) συστοιχίες μικροηλεκτροδίων (1.: ηλεκτρόδιο, 2 εργάσιμων: κοινή αντίθετο ηλεκτρόδιο) κατασκευάστηκαν για την πειραματική γυάλινα πλακίδια (76 χιλιοστά x 52 χιλιοστά) με κοινή φωτολιθογραφικές διαδικασίες. SU-8 με φωτοευαίσθητη χρησιμοποιήθηκε ως στρώμα παθητικότητας να καλύψει τις αγώγιμες ίχνη. (Β) Η πλατφόρμα ανίχνευσης ήταν χωρισμένη σε 2 τομείς, ένας για τα καρκινικά κύτταρα και μία για παράγοντες μικροπεριβάλλον. Αρκετές ηλεκτρόδια εργασίας mirco μεγέθους είχαν εγκατασταθεί σε κάθε περιοχή σε διαφορετικές αποστάσεις: 100, 250, 650, 1450 και 3050μm μακριά από τη γραμμή αντιπαράθεσης. (Γ) Ένα ενιαίο ηλεκτρόδιο ήταν 100 μm σε διάμετρο. (Δ) μία εικόνα ενός πραγματικού τσιπ μετά την συν-καλλιέργεια των 2 διαφορετικών τύπων κυττάρων στις 2 πλευρές. (Ε) Η διαδικασία σχηματοποίησης συν-καλλιέργεια χρησιμοποιώντας ένα καλούπι δύο κοιλοτήτων. (Ε

1) Μετά την κατεργασία της επιφάνειας για καλλιέργεια κυττάρων, το τσιπ κύτταρο τοποθετήθηκε στο σχεδιασμένο εξάρτημα, και το καλούπι δύο κοιλοτήτων καθορίστηκε στην κατάλληλη θέση με βίδες. Τα 2 θάλαμοι διαχωρίζονται μεταξύ τους από ένα 100μm παχύ τοίχωμα για την κυτταρική σχηματοποίηση. (Ε

2) Αφού τα κύτταρα τόσο σε θάλαμο είχαν προσκολλημένα στην επιφάνεια τσιπ, το καλούπι δύο κοιλοτήτων αντικαταστάθηκε από ένα καλά-τύπου ανοικτή δεξαμενή. Ένα κρεβάτι PDMS εγκαταστάθηκε επίσης στην πρόληψη λύση από τη διαρροή. Το τσιπ κύτταρο συνδέθηκε με το σύστημα μέτρησης και κρατήθηκε στον επωαστήρα κατά τη διάρκεια των μετρήσεων.

Η

Σε αυτή τη μελέτη, δείξαμε την ανασταλτική δράση των MRC-5 ινοβλάστες ανθρώπινου πνεύμονα στην κανονική πολλαπλασιασμό των Α549 ανθρώπινα καρκινικά κύτταρα πνεύμονα. διαφορές σήμα σύνθετης αντίστασης ήταν αποφασισμένοι να αποδείξουν έμμεσα την επίδραση απόσταση μεταξύ MRC-5 και κύτταρα Α549 σε ένα περιβάλλον συν-καλλιέργεια. Ιδιαίτερα στις συνθήκες φαρμακευτική αγωγή, παρατηρήσαμε επίσης μια εντατική καταστολή σε άμεση αλληλεπίδραση με ινοβλάστη καρκίνου, η οποία ήταν υψηλότερη από εκείνη που ασκείται από την έμμεση αλληλεπίδραση. Επιπλέον, η ανασταλτική δράση των ινοβλαστών επιβεβαιώθηκε χρησιμοποιώντας τον φθορισμό ενεργοποιούμενη διαλογή κυττάρων μέθοδος (FACS) σε ένα μικτό μοντέλο καλλιέργειας. Η μελέτη μας είχε ως στόχο να μιμούνται ένα

in-vivo

θεραπευτικό αποτέλεσμα στρωματικά επί της προόδου όγκου με μία νέα ανίχνευση και την τεχνική ανάλυση στο πεδίο πραγματικό χρόνο.

Υλικά και Μέθοδοι

κατασκευή ΜΕΑ

Το μοτίβο ΜΕΑ κατασκευάστηκε σε γυάλινα πλακίδια μικροσκοπίου (52 mm × 76 χιλιοστά) με κοινή φωτολιθογραφικές διαδικασίες χρησιμοποιώντας AZ-5214E ​​(MicroChemicals GmbH, Γερμανία) ως αρνητικό φωτοανθεκτικό για μια διαδικασία απογείωση. Η σχηματοποίηση ακολουθήθηκε από την εναπόθεση ενός 250 Α /Α 500 Ti /Au διστρωματικών χρησιμοποιώντας ένα σύστημα εξάτμισης e-beam, και τα αχρείαστα μερίδες ήταν επιλεκτική απομακρύνεται σε ακετόνη. Μετά σχηματίστηκαν τα ηλεκτρόδια, πραγματοποιήσαμε ένα δεύτερο βήμα φωτολιθογραφία να εφαρμόσει τα 2 μm παχύ στρώμα SU-8 2002 (MICROCHEM, USA) ως ένα στρώμα απομόνωσης για το χρυσό ίχνη, αφήνοντας μόνο τα συστοιχίες ηλεκτροδίων και expodes τακάκια επαφής.

Κυτταρική καλλιέργεια

MRC-5 ινοβλάστες ανθρώπινου πνεύμονος και Α549 καρκινικά κύτταρα ανθρώπινου πνεύμονα ελήφθησαν από την American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA, USA) και καλλιεργήθηκαν σε μέσο RPMI 1640 (Gibco ) συμπληρωμένο με 10% ορό εμβρύου βοός (FBS, Gibco) και 1% αντιβιοτικά /αντιμυκητιακά (Gibco). Αυτά τα κύτταρα διατηρήθηκαν σε κατάσταση των 37 ° C και 5% CO

2 και υπο-καλλιεργήθηκαν υπό θεραπεία του EDTA με τρυψίνη διάλυμα (Gibco). Ο αριθμός των κυττάρων μετρήθηκε χρησιμοποιώντας τον Cellometer (Cellometer Auto Τ4, USA).

τηλέφωνα σχηματομόρφωσης για ΜΕΑ τσιπ

Σε αυτή τη μελέτη, το κύτταρο με σχέδια χρησιμοποιώντας μια κοινή μέθοδο φυσικό εμπόδιο για τη δημιουργία ελεύθερα κυττάρων περιφέρειες συλλογικών κυτταρική μετανάστευση [18]. Ένα φυσικό εμπόδιο εφαρμόστηκε πριν από την κυτταρική σπορά να μπλοκάρει κελί ανάμιξης, και η απομάκρυνση του φυσικού φράγματος κινεί τη διαδικασία μετανάστευση των κυττάρων και την αντιπαράθεση. Ακρυλικό φωτιστικά για το τσιπ κυττάρων και μούχλα διπλού θαλάμου έχουν σχεδιαστεί με τη χρήση AutoCAD και κατασκευάστηκαν χρησιμοποιώντας μια μηχανή άλεσης CNC (Σχήμα 1 Ε). Πριν χρησιμοποιηθεί για κυτταρική καλλιέργεια, όλες οι συσκευές αποστειρώθηκαν σε ένα λουτρό αλκοόλη και ξηραίνονται σε φούρνο με υπεριώδες φως. Αφού το καλούπι διπλού θαλάμου στερεώθηκε στο τσιπ κύτταρο στην κατάλληλη θέση με βίδες, κάθε θάλαμος υπέστη επεξεργασία με ένα διάλυμα κολλαγόνου (10%) για 15 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου για να προάγουν την κυτταρική προσκόλληση. Στη συνέχεια, οι θάλαμοι πλύθηκαν με 1Χ PBS, και τα 2 είδη κυτταρικού εναιωρήματος (5 × 10

5 κύτταρα /θάλαμο) εγχύθηκαν εντός των 2 χωριστούς θαλάμους. Μετά από 12 ώρες, όταν και οι δύο τύποι κυττάρων είχε συνημμένο καλά και είχαν σχηματίσει ένα μονοστοιβάδα επί της επιφάνειας τσιπ, οι θάλαμοι αποσυναρμολογήθηκαν και αντικαταστάθηκαν από την δεξαμενή καλά τύπου. Το τσιπ κυττάρων συνδέθηκε με το σύστημα ECIS και φυλάσσονται στο εκκολαπτήριο κατά τη διάρκεια των μετρήσεων.

χρώση CellTracker για τη μετανάστευση έλεγχο

MRC-5 ινοβλάστες βάφτηκαν με CellTracker πριν από συγκαλλιέργεια να αξιολογήσει τους μετανάστευση στην περιοχή των κυττάρων Α549 όγκου. Εν συντομία, κύτταρα MRC-5 καλλιεργήθηκαν σε τρυβλίο κυτταρικής καλλιέργειας (SPL), και συλλέχθηκαν χρησιμοποιώντας Θρυψίνη-ΕΟΤΑ (Gibco). Τα κύτταρα φυγοκεντρήθηκαν, το υπερκείμενο απομακρύνθηκε και τα κύτταρα επαναιωρήθηκαν σε 1 ml μέσου καλλιέργειας (RPMI-1640 με 10% FBS, 1% PS, 25 mM HEPES, Gibco). Το διάλυμα κύτταρο έλαβε 20 μΜ CellTracker

TM (Life Technologies, CellTracker

TM Πράσινο CMFDA) και τα κύτταρα στη συνέχεια επωάστηκαν για 30 λεπτά. Στη συνέχεια, τα κύτταρα φυγοκεντρήθηκαν και το υπερκείμενο απομακρύνθηκε? τότε, τα κύτταρα επαναιωρήθηκαν σε 1 ml φρέσκο ​​μέσο καλλιέργειας. Τα βαμμένα κύτταρα ήταν τότε έτοιμο να εγχυθεί μέσα στο θάλαμο συν-καλλιέργειας όπως περιγράφεται στην ενότητα κύτταρο σχηματοποίησης. Η χρώση των κυττάρων επιβεβαιώθηκε χρησιμοποιώντας μικροσκοπία φθορισμού (Eclipse 80i, Nikon).

κυτταρομετρία ροής

Α549 και κύτταρα MRC-5 (5 × 10

5 κύτταρα /ml) καλλιεργήθηκαν σε πλάκες 6 φρεατίων τόσο για το μονο-καλλιέργεια των κυττάρων Α549 και την συν-καλλιέργεια των Α549 και κύτταρα MRC-5). Κάθε τύπος κυττάρου υποβλήθηκε σε επεξεργασία με 30 μΜ της κουρκουμίνης (Sigma-Aldrich) για 3 ημέρες. Στη συνέχεια, τα κύτταρα πλύθηκαν τρεις φορές με ψυχρό PBS (Sigma-Aldrich) και τα αιωρούμενα ρυθμιστικό διάλυμα δέσμευσης (10 mM HEPES, 140 mM NaCl, 2.5 mM ΟαΟ

2, ρΗ 7.4, Sigma-Aldrich). Κάθε δείγμα έλαβε 5 μΜ αννεξίνης V συζευγμένη Alexa Fluor® 594 (Life Technologies, διέγερσης /εκπομπής: 590/617 nm) και επωάστηκε για 15 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. Τα κύτταρα αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας ένα ροής Accuri C6 κυτταρόμετρο (BD Bioscience) και τα δεδομένα αναλύθηκαν με λογισμικό FlowJo (Treestar).

MTS δοκιμασία

Η κουρκουμίνη (Sigma-Aldrich) παρασκευάστηκε σε DMSO και αραιώνεται σε επιθυμητές συγκεντρώσεις σε μέσα κυτταρικής καλλιέργειας. Για το πείραμα, τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε 1 × 10

4 κύτταρα /100 μΙ του αρχικού ποσού σπορά σε 96 φρεατίων πλάκα καλλιέργειας κυττάρων για 24 ώρες. Τα κύτταρα Α549 και MCR-5 ινοβλάστες υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με διάφορες συγκεντρώσεις της κουρκουμίνης (1, 10, 30, 50, 70, 100 και 500 μΜ) για 3 ημέρες. Το διάλυμα Kit-8 κυττάρων Μετρώντας (Dojindo Inc.) αραιώθηκε σε 1:10 με μέσο και προστέθηκαν σε κάθε φρεάτιο της πλάκας, και στη συνέχεια τα κύτταρα επωάστηκαν για 4 ώρες. Ο πολλαπλασιασμός των κυττάρων μετρήθηκε στα 450 nm χρησιμοποιώντας VICTOR3 V ανάγνωσης μικροπλάκας Wallac 1420.

Σύστημα μέτρησης

Μια Agilent 4284A Αντίσταση μετρητή ακριβείας (Agilent CA, USA) και ένα κύκλωμα ρελέ σχεδιαστεί μεταγωγής λειτουργούσαν για την ταυτόχρονη μέτρηση της σύνθετης αντίστασης των συστοιχιών ηλεκτροδίων. Οι συνθήκες μέτρησης ήταν 10 mV και 10 kHz κατά διαστήματα 5 λεπτών. LabVIEW (National Instrument, TX, USA) λογισμικό χρησιμοποιήθηκε για τον έλεγχο του μετρητή και καταγράφει τα αριθμητικά δεδομένα σε έναν υπολογιστή, και στη συνέχεια τα δεδομένα απεικονίζονται αυτόματα σε ένα γράφημα σε πραγματικό χρόνο.

Η στατιστική ανάλυση

Όλα τα δεδομένα εκφράστηκαν ως το μέσο (± SD) 3 επαναλήψεις. Η στατιστική ανάλυση έγινε με μονόδρομη παραγοντική ANOVA, ακολουθούμενη από την ειλικρίνεια σημαντική διαφορά του κατά Tukey (HSD) δοκιμή της διαφοράς. Οι διαφορές θεωρήθηκαν στατιστικά σημαντικές σε ρ τιμές μικρότερες από 0.05.

Αποτελέσματα

χαρακτηρισμό ΜΕΑ μέσω μονοκαλλιέργειες των καρκινικών κυττάρων και ινοβλαστών

Στο πρώτο πειραματικό στάδιο, η ΜΕΑ κύτταρο τσιπς επικυρώθηκαν μέσω μονοκαλλιέργειες των καρκινικών κυττάρων Α549 και MRC-5 ινοβλάστες υπό κανονικές συνθήκες πολλαπλασιασμού. Πριν θέσετε σε λειτουργία το σύστημα μέτρησης των κυττάρων, οι συστοιχίες προσαρμόστηκαν (με LabVIEW) για να εξομαλύνει τις συστηματικές διαφορές, όπως η καλωδίωση, συγκόλληση και αγώγιμα ίχνη. Η κανονικοποιημένη ελεύθερο κυττάρων αντίσταση κάθε ηλεκτρόδιο ορίστηκε σε 2,6 kΩ. Το σχήμα 2Α δείχνει τις αποκρίσεις αντίσταση όταν ενιαίο ηλεκτρόδια προκλήθηκαν με διάφορες συγκεντρώσεις των κυττάρων Α549. Τα δεδομένα που λαμβάνονται επί 16 ώρες είχαν τοποθετηθεί από έναν αλγόριθμο λόφο για ανάπτυξη /σιγμοειδή μοντέλο (OriginPro 9). Κάτω από 1,25 × 10

5 κύτταρα /φρεάτιο, οι καμπύλες αντίσταση αντιστοιχούσαν καλά με τις καμπύλες τοποθέτηση. Σε υψηλότερες κυτταρικές πυκνότητες, μία φάση υστέρησης εμφανίστηκε από 4 ώρες έως 8 ώρες, όταν τα κύτταρα αναδιατάσσοντας τους για τη δέσμευση της θέση πριν από τη διαμόρφωση ενός μονοστοιβάδα επί των ηλεκτροδίων. Για την εκτίμηση εύκολα βιωσιμότητα σε όλη αυτή τη μελέτη, μια αδιάστατη παράμετρος που ονομάζεται ο δείκτης κυττάρου (CI) ορίσθηκε ως η σχετική μεταβολή στην μετρούμενη ηλεκτρική αντίσταση και μπορεί να υπολογιστεί χρησιμοποιώντας την εξίσωση belowwhere R

i είναι η αντίσταση των ηλεκτροδίων κύτταρο καλύπτονται και R

ελεύθερο κυττάρων είναι η αντίσταση των κενών ηλεκτροδίων (2,6 kΩ). Μετά από 16 ώρες, μία καμπύλη μέτρησης σχεδιάστηκε, η οποία αντιπροσώπευε την συσχέτιση μεταξύ της αξίας CI και κυτταρικής πυκνότητας σποράς (Σχήμα 2Β).

(Α) Αντίσταση αποκρίσεις του ΜΕΑ σε διάφορες συγκεντρώσεις κυττάρων Α549 όγκου σε μονοκαλλιέργεια για 16 h (σε 10mV, 10kHz). (Β) Η καμπύλη βαθμονόμησης αντιπροσωπεύει τη συσχέτιση μεταξύ Α549 κυτταρική πυκνότητα και την αξία του δείκτη των κυττάρων. (Γ) MTS αποτελέσματα από μονοκαλλιέργειες των κυττάρων Α549 και MRC-5 ινοβλάστες μετά από 72 ώρες έκθεσης σε κουρκουμίνη. Οι τιμές IC50 για τα κύτταρα Α549 και κύτταρα MRC-5 ήταν 50 μΜ και 30 μΜ, αντίστοιχα. Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως η μέση τιμή (± SD) του 3 επαναλήψεις.

Η

Επιπλέον, τα καρκινικά κύτταρα Α549 και MRC-5 ινοβλάστες χωριστά σε επεξεργασία με διάφορες δόσεις της κουρκουμίνης να καθορίσουν την ενδεδειγμένη κατάσταση θεραπείας για την συν-καλλιέργεια μελέτη. Η κουρκουμίνη έχει αποδειχθεί αποτελεσματική στην επαγωγή της απόπτωσης καθώς και αναστολή του πολλαπλασιασμού του αδενοκαρκινώματος του πνεύμονα γραμμή Α549-[19]. Σε αυτή τη μελέτη, η κουρκουμίνη επιλέχθηκε για να δημιουργήσει το περιβάλλον θεραπεία για την προτεινόμενη μοντέλο συν-καλλιέργειας. Μία δοκιμασία MTS εκτελέσθηκε, και μία καμπύλη βιωσιμότητας των κυττάρων παραστάθηκε γραφικά μετά από 72 h (Σχήμα 2C). Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι η κουρκουμίνη έχει σημαντική τοξική επίδραση στις δύο καρκινικά κύτταρα και ινοβλάστες στα 10 μΜ. Οι τιμές IC50 για τα κύτταρα Α549 και κύτταρα MRC-5 ήταν 50 μΜ και 30 μΜ, αντίστοιχα. Η δόση της θεραπείας σε 30 μΜ επιλέχθηκε για την μετέπειτα πείραμα συν-καλλιέργεια, όπου τα καρκινικά κύτταρα εκτέθηκαν ταυτόχρονα τόσο στην τοξική επίδραση της κουρκουμίνης και την ανασταλτική επίδραση των γειτονικών ινοβλαστών.

Ανασταλτική δράση των ινοβλαστών στα κύτταρα του όγκου σε μικτή καλλιέργεια

πολλαπλασιασμός καρκινικών κυττάρων σε αυτόν τον τύπο του μοντέλου συν-καλλιέργειας καθορίζεται από τις ιδιότητες τόσο των καρκινικών κυττάρων και των ινοβλαστών, η οποία θα μπορούσε να ασκήσει αντίθετες πολλαπλασιαστικά αποτελέσματα

in vitro

. Για παράδειγμα, AG09877 ινοβλάστες διεγείρει τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων T47D καρκινώματος, ενώ AG04351 ινοβλάστες επιδεικνύουν ένα αποτέλεσμα παρεμπόδιση της ανάπτυξης στην ίδια κυτταρική σειρά καρκίνου [13]. Για τον προσδιορισμό των αμοιβαίων επιδράσεων μεταξύ Α549 και MRC-5, ένας προσδιορισμός FACS διεξήχθη με ένα μικτό μοντέλο καλλιέργειας με τη χρήση αυτών των 2 κυτταρικές γραμμές. Το σχήμα ανίχνευσης βασίστηκε στις διαφορές στην φωσφατιδυλοσερίνη (PS) θέση μεταξύ υγιών κυττάρων και αποπτωτικών κυττάρων. Σε φυσιολογικά βιώσιμων κυττάρων, PS βρίσκεται στην κυτταροπλασματική επιφάνεια της μεμβράνης του κυττάρου. Όταν τα κύτταρα αρχίζουν να υφίστανται απόπτωση, PS μετατοπίζεται από το εσωτερικό προς το εξωτερικό της κυτταρικής μεμβράνης και είναι εκτεθειμένη στο εξωτερικό κυτταρικό περιβάλλον. Χρησιμοποιώντας μια συγκεκριμένη πρωτεΐνη φωσφολιπίδιο δέσμευσης (αννεξίνης V-συζευγμένο Alexa Fluor® 594) και ένα σύστημα κυτταρομετρίας ροής διαλογή, τα αποπτωτικά κύτταρα σε πρώιμα στάδια μπορεί να διακριθεί από το σύνολο του πληθυσμού των κυττάρων.

Όπως φαίνεται στο Σχήμα 3 , θεραπεία κουρκουμίνη στις μονοκαλλιέργειες επαγόμενη απόπτωση σε δύο κύτταρα Α549 και MRC-5 κύτταρα σε 9,87% και 19,05% αποπτωτικά κύτταρα, αντίστοιχα. Η αναλογία αυτή ήταν λιγότερο σημαντική από ό, τι τα αποτελέσματά μας MTS, καθώς και τα αποτελέσματα των άλλων προηγούμενων μελετών [20]. Αυτές οι διαφορές εξηγούνται από την έλλειψη των νεκρών κυττάρων, τα οποία δεν μπορούν να διακριθούν με FACS με μόνο χρώση PS.

διαφορετικά ποσοστά των αποπτωτικών κυττάρων ελήφθησαν στα κύτταρα Α549 όγκου και MRC-5 ινοβλάστες μονοκαλλιέργειες και στο μικτό πολιτισμό αυτών των δύο κυτταρικές σειρές. [Ένα σχήμα το χρώμα μπορούν να προβληθούν σε απευθείας σύνδεση έκδοση].

Η

Σε μικτές καλλιέργειες χωρίς αποτέλεσμα γείτονα μεταξύ των καρκινικών κυττάρων και των ινοβλαστών, η αναλογία του συνόλου των αποπτωτικών κυττάρων ήταν αναμενόμενο από 9,87% έως 19,05% υπό τις ίδιες πειραματικές συνθήκες. Είναι ενδιαφέρον ότι η αναλογία των αποπτωτικών κυττάρων στις μικτές καλλιέργειες προσδιορίστηκε να είναι 33.71%. Αυτό το αποτέλεσμα πρότεινε ότι η ανασταλτική επίδραση κύτταρο σε κύτταρο ήταν παρούσα παράλληλα με την τοξική επίδραση της κουρκουμίνης και για τους δύο τύπους κυττάρων. Εντούτοις, συγκεκριμένες επιπτώσεις για κάθε κυτταρική γραμμή ήταν δύσκολο να προσδιοριστεί με τη χρήση FACS.

Ανασταλτική δράση των ινοβλαστών στην κανονική του πολλαπλασιασμού των καρκινικών κυττάρων

Για να διακρίνουν την ιδιαίτερη συμβολή της κάθε κυτταρικής σειράς με το συνολικό ανασταλτική επίδραση, εξετάσαμε κυτταρικές συνθήκες με τις απαντήσεις αντίσταση σε ένα μοντέλο συγκαλλιέργειας. Πρώτες αντίσταση δεδομένα των κυττάρων Α549 σε διάφορες αποστάσεις μακριά από ινοβλάστες (0,1, 0,25, 0,65, 1,45, και 3,05 mm) γραμμικά τοποθετηθεί και κανονικοποιήθηκαν, όπως φαίνεται στο Σχ 4Α. Τα αντίστοιχα δεδομένα αντοχής μετά από 24 ώρες και 48 ώρες μετατράπηκαν σε τιμές CI χρησιμοποιώντας την εξίσωση που φαίνεται στο τμήμα 1 (Εικόνα 4Β). Κατά τη διάρκεια του πρώτου 24 ώρες μετά την επαφή των κυττάρων, η επίδραση απόσταση ήταν δυσδιάκριτα, και οι τιμές CI δεν έδειξαν σημαντικές διαφορές μεταξύ της συστοιχίας 1

ου ηλεκτρόδιο (0,1 mm) και το 5

ου συστοιχία ηλεκτροδίων (3.05 mm) .

(Α) Κυτταρική αποκρίσεις αντίστασης (κατά 10mV, 10kHz) των κυττάρων Α549 όγκου ως μία συνάρτηση του χρόνου και της απόστασης από ινοβλάστες επί 54 ώρες συν-καλλιέργειας υπό κανονικές συνθήκες ανάπτυξης. Τα ανεπεξέργαστα δεδομένα ήταν γραμμικά-τοποθετηθεί και μετατρέπονται σε τιμή CI σε σχέση με το ελεύθερο κυττάρων απόκριση του ηλεκτροδίου (2,6 kΩ). τιμές (Β) CI των καρκινικών κυττάρων σε 5 διαφορετικές αποστάσεις μακριά από τις καλλιεργημένες ινοβλάστες. Μετά από 48 h σε συν-καλλιέργεια, οι τιμές CI έδειξαν ότι τα κύτταρα του όγκου που αντιμετώπισαν ινοβλάστες σαφώς αναστέλλεται σε σύγκριση με μακρινό κύτταρα. (* P & lt? 0,02). (C) εικόνες φωτεινού πεδίου της αντιπαράθεσης μεταξύ των καρκινικών κυττάρων και ινοβλαστών σε 0 h και 48 h. Η ράβδος κλίμακας αντιπροσωπεύει 200 ​​μm.

Η

Μια σημαντική διαφορά στον πολλαπλασιασμό των κυττάρων Α549 παρατηρήθηκε σε 48 ώρες. Οι τιμές CI των κυττάρων Α549 σε απευθείας επαφή και να παραπλεύρως επαφή με ινοβλάστες (δηλαδή, στο 1

ου και 2

ου συστοιχίες ηλεκτροδίων) μειώθηκε ελαφρά από 6,12 και 6,23 με 5,57 και 5,77, ενώ εκείνες της περαιτέρω Α549 κύτταρα (δηλαδή, σε 3

ου, 4

ου και 5

ου συστοιχίες ηλεκτροδίων) διατηρήθηκαν σταθερές αποκρίσεις αντίσταση στη συρροή πυκνότητα των κυττάρων (Σχήμα 4C). Αυτά αποτέλεσμα έδειξε καθαρά ότι οι ινοβλάστες είναι ικανές να αναστέλλουν την πολλαπλασιαστική ποσοστό των καρκινικών κυττάρων σε καλλιέργειες αντιμετωπίζουν πιο αποτελεσματικά από ό, τι αποτελεσμάτων που προκαλούνται μέσω του περιβάλλοντος μέσα ενημέρωσης

κύτταρα

ινοβλάστες όγκου αλληλεπίδρασης σε συνθήκες θεραπείας:. Προφανής γείτονας επίδραση σε αποστάσεις

Για να παρέχουν μια πλήρη κατανόηση του φαινομένου του γείτονα μεταξύ των ινοβλαστών και καρκινικών κυττάρων

in vitro

, κατασκευάσαμε ένα μοντέλο συγκαλλιέργειας με MRC-5 κύτταρα και κύτταρα Α549 σε θεραπευτικές συνθήκες. Η κουρκουμίνη εισήχθη στα αντιμέτωποι καλλιέργειες κατά την προηγουμένως καθορισμένη συγκέντρωση, 30 μΜ? σύνθετη αντίσταση στη συνέχεια παρακολουθήθηκε για τα ακόλουθα 84 h. Οι μέσες αποκρίσεις ομαλοποιήθηκαν και μη γραμμικά προσαρμόστηκαν χρησιμοποιώντας έναν αλγόριθμο δόσης-απόκρισης (Σχήμα 5Α). Είναι ενδιαφέρον ότι η δράση απόσταση αποδείχθηκε σαφώς σε πρώιμους χρόνους μετά την έκθεση στο φάρμακο (Σχήμα 5Α και 5Β). Μετά από 24 ώρες, οι μέσες τιμές CI που ελήφθησαν ήταν 5,57, 5,77, 6,35, 6,34 και 6,40 για τα καρκινικά κύτταρα τα οποία βρίσκονταν στα 0,1, 0,25, 0,65, 1,45 και 3,05 mm από τη γραμμή ινοβλαστών αντιπαράθεση. Μετά από 48 h και 72 h, σημαντικές μειώσεις όλων των τιμών CI και η εμφάνιση των κενών μεταξύ των συστοιχιών αντανακλούσε σαφώς το εντατικό συνδυασμένη αποπτωτικό αποτέλεσμα τόσο της δραστικότητας του φαρμάκου κατά του καρκίνου και την αναστολή της ανάπτυξης μέσω αλληλεπιδράσεων ινοβλαστών. Πραγματοποιήσαμε επίσης μια δοκιμασία μετανάστευσης υπό τις αντιμετωπίζουν συνθήκες συν-καλλιέργειας για τη διερεύνηση της ικανότητας μετανάστευση ινοβλαστών στην περιοχή καρκινικά κύτταρα και έτσι να είναι σε θέση να διακρίνει το άμεσο αποτέλεσμα της αλληλεπίδρασης κυττάρου προς κύτταρο από τη συνολική ανασταλτική δράση (σχ 5C). Μετά από 72 ώρες, το εναπομένον ένταση φθορισμού έδειξε την αποτελεσματική αποπτωτική δράση της κουρκουμίνης επί των κυττάρων MRC-5, αλλά δεν παρατηρήθηκε σημαντική μετανάστευση. Αυτά τα αποτελέσματα αντιστοιχούσαν καλά με εκείνα άλλων μελετών σχετικά με τις επιδράσεις της θεραπείας κουρκουμίνη στις κινηματική μετανάστευση καλλιεργημένων ινοβλαστών.

(Α) αποκρίσεις αντίσταση Κινητή (κατά 10mV, 10kHz) των καρκινικών κυττάρων Α549 ως συνάρτηση του χρόνου και η απόσταση από ινοβλάστες πάνω από 84 ώρες συγκαλλιέργειας στην κατάσταση επεξεργασίας κουρκουμίνη. Τα ακατέργαστα δεδομένα προσαρμόστηκαν και μετατρέπονται σε τιμές CI σε σχέση με τις αντιδράσεις ηλεκτροδίου ελεύθερο κυττάρων (2,6 kΩ). τιμές (Β) CI των κυττάρων του όγκου σε 5 διαφορετικές αποστάσεις μακριά από τις καλλιεργημένες ινοβλάστες. Η ανασταλτική επίδραση των ινοβλαστών στα κύτταρα του όγκου ήταν σαφέστερα παρατηρήθηκε στο τοξικό περιβάλλον μετά από 24 h (* ρ & lt? 0,04). (Γ) Το ποσοστό μετανάστευση των ινοβλαστών στην περιοχή των καρκινικών κυττάρων αξιολογήθηκε χρησιμοποιώντας δοκιμασία χρώσης κυττάρων ιχνηλάτης. Στην κατάσταση αγωγής, δεν παρατηρήθηκε σημαντική μετανάστευση. Οι γκρι κουκκίδες υποδεικνύουν τη θέση των συστοιχιών ηλεκτροδίων. Η ράβδος κλίμακας αντιπροσωπεύει 500 μm.

Η

Συζήτηση

έχουν Impedimetric βιοαισθητήρες με βάση κύτταρα έχουν αναγνωριστεί ως μια ευέλικτη και αξιόπιστη πλατφόρμα χαρακτηρισμός για βιο-αναλυτικές μελέτες λόγω εξέχοντα πλεονεκτήματα τους, όπως ως υψηλή ευαισθησία, υψηλή απόδοση και δυνατότητα εγγραφής σε πραγματικό χρόνο. Χρησιμοποιώντας διάφορα σχέδια γεωμετρικά ηλεκτρόδιο, ECIS πλατφόρμες έχουν εκτεταμένα χρησιμοποιηθεί στις μελέτες της προσκόλλησης κυττάρου και εξάπλωση [21,22], κυτταρική κινητικότητα [23], οι λειτουργίες φραγής στρώμα κυττάρων [24], καθώς και για το

in vitro

τοξικολογικές μελέτες και διαλογής φαρμάκων [25,26]? Αυτές οι πλατφόρμες επίσης ενσωματωθεί με άλλα βιο-ανάλυσης συστημάτων [27]. Ο ξεχωριστός σχεδιασμός του ηλεκτροδίου είναι ο πίνακας μικροηλεκτροδίου, το οποίο αποτελείται από πολλές ενιαίες μόνο μικροηλεκτρόδια σε μια κοινή πλατφόρμα. Επειδή είναι της τάξης των μικρών σε μέγεθος, και μόνο μικροηλεκτρόδια είναι σε θέση να αντιμετωπίσει τις ετερογενείς ιδιότητες των κυττάρων που κρύβονται εντός μέσος πληθυσμούς κυττάρων, αντί της παροχής ενός συλλογικού κυτταρική απόκριση σε μία δεδομένη φυσιολογική κατάσταση. Ωστόσο, η χρήση του ενιαίου μικροηλεκτρόδια στην κυτταρική μέτρησης έχει να αντιμετωπίσει την έκτακτη ευαισθησία των κυττάρων συμπεριφορές όπως μικρο-κινήσεις, κατάσχεση, τη διάδοση και τον πολλαπλασιασμό. Αυτή η διακύμανση του σήματος παρουσιάζει μια πρόκληση για τον προσδιορισμό της πραγματικής συμπεριφοράς των κυττάρων σε μια επιφάνεια του ηλεκτροδίου. Η λύση που παρέχονται στην παρούσα μελέτη χρησιμοποιώντας συστοιχίες για επανάληψη της μέτρησης, και στη συνέχεια, εφαρμόζοντας την κατάλληλη τοποθέτηση μεθόδους για τα ληφθέντα δεδομένα μέσης. Χρησιμοποιώντας αυτή τη μέθοδο, οι σχετικές μεταβολές της βιωσιμότητας των κυττάρων μπορεί να αποδειχθεί μέσω του αριθμού CI και μπορεί εύκολα να μετατραπεί σε ποσοστά σε σύγκριση με τις αρχικές τιμές CI.

Αυτή η μελέτη είχε ως στόχο να προτείνει μια απλή αλλά αποτελεσματική μέθοδος για να διερευνήσει την αλληλεπιδράσεις των καρκινικών κυττάρων και ινοβλαστών σε ένα μοντέλο συν-καλλιέργειας, με ιδιαίτερη έμφαση στην επίδραση απόσταση μεταξύ αυτών των 2 κυτταρικές γραμμές. Τα συνολικά ανασταλτικές και τοξικές επιδράσεις επί καρκινικών κυττάρων Α549 παρουσιάζεται στο Σχ 6. Θα πρέπει να σημειωθεί ότι άλλες προηγούμενες μελέτες έχουν εξετάσει την αναστολή του πολλαπλασιασμού των καρκινικών κυττάρων και την κινητικότητα από ινοβλάστες [28-31]? το κοινό συμπέρασμα ήταν ότι η επίδραση της αναστολής ήταν τόσο επαφής- και διαλυτό παράγοντα-εξαρτώμενη. Ωστόσο, η αποτελεσματική απόσταση μεταξύ των καρκινικών κυττάρων και ινοβλαστών δεν είχε ακόμη προσδιοριστεί. Με την ενσωμάτωση μιας πλατφόρμας ΜΕΑ σε ένα μοντέλο συν-καλλιέργειας, προσδιορίσαμε με επιτυχία τις διαφορές των συμπεριφορών των κυττάρων Α549 καρκινικών σε διάφορες αποστάσεις μακριά από MRC-5 ινοβλάστες και στα δύο κανονικές συνθήκες πολλαπλασιασμού και θεραπεία. Τα αποτελέσματά μας έδειξαν ότι οι επιδράσεις επί των κυττάρων όγκου θα μπορούσαν να ταξινομηθούν σε 3 διαφορετικές ζώνες με βάση την βιωσιμότητα των κυττάρων του όγκου. Η πρώτη ζώνη εντοπίστηκε έως 0,25 mm από τη γραμμή ινοβλαστών αντιπαράθεση, όπου τα καρκινικά κύτταρα αναστέλλονται ισχυρά και σε φυσιολογικά και τοξικές συνθήκες. Αυτό το αποτέλεσμα μπορεί να εξηγηθεί από τη συμμετοχή των επιφανειακών μορίων των ινοβλαστών καθώς και των διαλυτών παραγόντων που εκκρίνονται λόγω της αντιπαράθεσης μεταξύ ινοβλάστες και κύτταρα όγκου [31]. Η δεύτερη ζώνη βρισκόταν έως 3 mm από την πρώτη ζώνη, όπου η επίδραση σε κανονικές συνθήκες ανάπτυξης ήταν δυσδιάκριτα αλλά αποδείχθηκε σαφώς στην κατάσταση αγωγής. Αυτό το αποτέλεσμα μπορεί επίσης να εξηγηθεί από τις διαλυτούς παράγοντες που εκκρίνονται από ινοβλάστες από μια περιορισμένη απόσταση. Η τρίτη ζώνη περιλάμβανε την υπόλοιπη περιοχή. Στις κανονικές συν-καλλιέργειες, τα κύτταρα Α549 όγκου σε αυτή τη ζώνη διατηρείται τιμές CI 6,6 και 6,5, η οποία έδειξε ένα φυσιολογικό ρυθμό πολλαπλασιασμού παρά την cross-talk μακρινών κυττάρων. Στην κατάσταση της θεραπείας, η βιωσιμότητα των κυττάρων Α549 προσδιορίστηκε να είναι 75.6%, η οποία ήταν περίπου η ίδια τιμή προσδιορίζεται από το μιτοχονδριακό βασίζεται δοκιμασία MTS (72,1%). Αυτή η ισοδυναμία προφανώς έδειξαν ότι ρυθμισμένα μέσα δεν προκαλεί καμία ανασταλτική επίδραση όταν τα καρκινικά κύτταρα ήταν περισσότερο από 3 mm μακριά από τους ινοβλάστες.

Η

Η απάντηση των κακοήθων ανθρώπινων κυττάρων στα στρωματικά μικροπεριβάλλον και θεραπευτικές αγωγές είναι ένα θεμελιώδες θέμα στην έρευνα για τον καρκίνο, αλλά μια πλήρη κατανόηση δεν έχει επιτευχθεί λόγω της υπέρμετρης στήριξης στις τελικού σημείου δοκιμασίες [32-34]. Σε αυτή τη μελέτη, εισαγάγαμε μια καθιερωμένη δοκιμασία σε μία νέα πλατφόρμα ανίχνευσης για πρώτη φορά για να διευκολύνει τη συνεχή παρακολούθηση και τη θέση εξαρτώμενη από εκτίμηση των κυτταρικών επιδράσεων αναστολής. Τα αποτελέσματα μας τόνισε ότι ο παράγοντας του μεγέθους του όγκου θα μπορούσε να επηρεάσει την αποτελεσματικότητα της χημειοθεραπείας του καρκίνου και θα πρέπει να θεωρείται ως ένα ισχυρό παράμετρος σε συστήματα συν-καλλιέργειας. Περαιτέρω μελέτες που χαρακτηρίζουν τα μοριακά στοιχεία που εκκρίνεται από τα κύτταρα, καθώς και τα μονοπάτια σηματοδότησης που χρησιμοποιούν την πλατφόρμα μας και παρόμοια συστήματα 3D συν-καλλιέργειας για κάθε τύπο καρκίνου θα είναι αξιοσημείωτα ωφέλιμο για την έρευνα του καρκίνου κοινότητα.

Συμπέρασμα

στο καλύτερο της γνώσης μας, αυτή η μελέτη είναι η πρώτη προσπάθεια για την αντιμετώπιση του παράγοντα της απόστασης στη διαφορική αναστολή του πολλαπλασιασμού των καρκινικών κυττάρων από ανθρώπινους ινοβλάστες. impedimetric με βάση κύτταρα Τα αποτελέσματα μας αποκάλυψαν ότι η επίδραση καταστολής γείτονας της κανονικής ινοβλάστες εξαρτάται όχι μόνο κυτταρικό τύπο και τον τρόπο της αλληλεπίδρασης αλλά και την απόσταση μεταξύ των κυτταρικών γραμμών 2. Κύτταρα Α549 όγκου εντατικά ανέστειλαν εντός 0,25 mm από MRC-5 ινοβλάστες, ενώ δεν παρατηρήθηκε αναστολή παρατηρήθηκε σε 3 mm και περισσότερο. Με την ικανότητα της αυτόματες μετρήσεις, υψηλής απόδοσης δοκιμασία μας μπορούν να διευκολύνουν την προκαταρκτική αξιολόγηση του επιθυμητού κυττάρου-κυττάρου αλληλεπιδράσεις σε διαφορετικές συνθήκες ανάπτυξης ή θεραπεία πριν από την χρησιμοποίηση των οποιωνδήποτε άλλων βιολογικές δοκιμασίες.