Abstract

Πρόσφατα, έχουμε καταδείξει ότι τριχοσανθίνης (TCS), ένα πολλά υποσχόμενο μέσο για τη θεραπεία του αδενοκαρκινώματος του τραχήλου της μήτρας, ανέστειλε τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό HeLa μέσω της οδού σήματος /ΜΑΡΚ /CREB PKC. Επιπλέον, TCS κάτω-ρυθμιζόμενη έκφραση Bcl-2 καταργήθηκε από ολιγονουκλεοτίδιο δόλωμα (OGN) προς το κυκλικό ΑΜΡ-αποκριτικού στοιχείου (CRE). Το δόλωμα OGN μπλοκάρει την πρόσδεση του CRE πρωτεΐνη δέσμευσης (CREB) προς Bcl-2. Αυτά τα αποτελέσματα πρότειναν ότι με μεσολάβηση CRE γονιδιακή έκφραση μπορεί να παίζει έναν κεντρικό ρόλο στον πολλαπλασιασμό των κυττάρων HeLa. Ωστόσο, λίγα είναι γνωστά για την επίδραση του TCS σε συλλήψεις κυτταρικού κύκλου, ιδιαίτερα, αν τα γονίδια που εμπλέκονται στην κυτταρικού κύκλου ρυθμίζονταν από CRE. παρούσα μελέτη μας δείχνει ότι οι συλλήψεις των S, G1 και G2 /M φάσεις συνοδεύτηκε από τη σημαντική προς τα κάτω ρύθμιση της κυκλίνης Α, D1 και CDK 2, 4 σε κύτταρα HeLa, κυκλίνη D1, Ε και CDK 2, 4 σε Caski και κύτταρα C33A, και κυκλίνη Α, Β1, Ε και CDK 2 σε κύτταρα SW1990. Ωστόσο, οι συλλήψεις κυτταρικού κύκλου αντιστράφηκαν μέσω της σημαντικής πάνω ρύθμιση κυκλίνης Α και D1, από τη συνδυασμένη θεραπεία του TCS και CRE. Συμπερασματικά, αυτά τα δεδομένα καταδεικνύουν για πρώτη φορά ότι οι ειδικές συλλήψεις κυτταρικού κύκλου στα καρκινικά κύτταρα μπορεί να προκληθεί με TCS με αναστολή της σύνδεσης του CREB να CRE σε γονίδια που σχετίζονται με τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό

Παράθεση:. Wang Ρ, Huang S, Wang F, Ren Υ, Hehir Μ, Wang Χ, et al. (2013) Κυκλικές AMP-Response Element Ρυθμιζόμενη Συλλήψεις του κυτταρικού κύκλου σε καρκινικά κύτταρα. PLoS ONE 8 (6): e65661. doi: 10.1371 /journal.pone.0065661

Επιμέλεια: Χονγκ Wanjin, Ινστιτούτο Μοριακής και Κυτταρικής Βιολογίας, Biopolis, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 18 Νοεμβρίου του 2012? Αποδεκτές: 25 Απριλίου, 2013? Δημοσιεύθηκε: 28 Ιούνη 2013

Copyright: © 2013 Wang et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από τις επιχορηγήσεις από το Εθνικό Ίδρυμα Φυσικών Επιστημών της Κίνας (81071653), Φυσικό Ίδρυμα Επιστημών της επαρχίας Zhejiang (Y2111136), Advanced Βασικά Επιστημονικής και Τεχνολογικής Προγράμματα Ningbo (2011C51005), Φυσικό Ίδρυμα Επιστημών της Ningbo City (2011A610050) και KC Wong Ταμείο Magna του Πανεπιστημίου Ningbo. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

η τριχοσανθίνη (TCS), ένα ενεργό συστατικό που απομονώνεται από τους κονδύλους ρίζα του κινεζικού φαρμακευτικό φυτό

Trichosanthes kirilowii

[1], είναι ένας υποσχόμενος παράγοντας για τη θεραπεία του καρκίνου [2]. προηγούμενες εκθέσεις μας έδειξε ότι TCS ανέστειλε αδενοκαρκίνωμα πολλαπλασιασμό του τραχήλου της μήτρας HeLa κυττάρων [3] μέσω της οδού σήμα /ΜΑΡΚ /CREB PKC [4]. Επιπλέον, TCS κάτω ρυθμισμένα Bcl-2 έκφραση [5], το οποίο καταργήθηκε από μια κυκλική ΑΜΡ-αποκριτικό στοιχείο (CRE, TGACGTCA) ολιγονουκλεοτίδιο δόλωμα (OGN), μπλοκάροντας την πρωτεΐνη CRE-δέσμευσης (CREB) θέση δέσμευσης για Bcl-2 [6]. Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι με μεσολάβηση CRE γονιδιακή έκφραση μπορεί να διαδραματίσει καίριο ρόλο στον πολλαπλασιασμό των κυττάρων HeLa.

Ωστόσο, λίγα είναι γνωστά σχετικά με την επίδραση του TCS για τη σύλληψη του κυτταρικού κύκλου των κυττάρων HeLa, του τραχήλου της μήτρας πλακώδες καρκίνωμα (Caski και C33A κυττάρων), και ανθρώπινο καρκίνωμα του παγκρέατος (SW1990 κυττάρων), ειδικότερα, αν τα γονίδια που σχετίζονται με τον κυτταρικό κύκλο ρυθμίζονταν από το OGN CRE δόλωμα.

στην παρούσα μελέτη, ερευνήσαμε περαιτέρω τις επιπτώσεις της TCS στον πολλαπλασιασμό των καρκινικά κύτταρα, συλλήψεις του κυτταρικού κύκλου στην πρόοδο του κυτταρικού πολλαπλασιασμού και το ρόλο της CRE στη ρύθμιση του κυτταρικού κύκλου.

Ο σκοπός της παρούσας μελέτης ήταν να διερευνήσει τις επιπτώσεις της TCS στον πολλαπλασιασμό των καρκινικών κυττάρων και την επίδραση της CRE επί TCS-επαγόμενη συλλήψεις κυτταρικού κύκλου. Ένα σημαντικό ερώτημα ήταν εάν CRE-σε συνδυασμό κυκλίνες έπαιξε κρίσιμο ρόλο στη ρύθμιση της σύλληψης του κυτταρικού κύκλου σε αυτά τα καρκινικά κύτταρα.

Υλικά και Μέθοδοι

Οι κυτταρικές σειρές και τον πολιτισμό

τραχηλικά κύτταρα (HeLa, Caski, C33A) και τα κύτταρα SW1990 ελήφθησαν από την American Type Culture Collection (ATCC, USA). HeLa, Caski, C33A [7] και SW1990 κυτταρική [8] ​​αναπτύχθηκαν σε μονοστιβάδα σε RPMI 1640 (Gibco, ΝΥ, USA) και Dulbecco τροποποιημένο μέσο Eagle (ϋΜΕΜ), που περιέχει 10% θερμο-απενεργοποιημένο βόειο εμβρυϊκό ορό, 100 U /ml πενικιλίνη και 100 μg /ml στρεπτομυκίνης (BioWhittaker, Inc., Walkersville, MD, USA), σε ένα CO

2 επωαστή (Forma Scientific, USA). Το μέσο αντικαταστάθηκε δύο φορές την εβδομάδα, και τα κύτταρα περάστηκαν κάθε 4-5 ημέρες σε αναλογία 1:03.

θεραπεία κυττάρων

Τα κύτταρα επιστρώθηκαν σε 2 χ 10

6 κύτταρα /τρυβλίο σε τρυβλία 100 mm στο βασικό μέσο. Στη συρροή, αυτά πλύθηκαν σύντομα με PBS και στη συνέχεια κατεργάζεται με TCS (Jinshan εταιρείας φαρμακείο, Σαγκάη, Κίνα). Κύτταρα αναφοράς επωάστηκαν σε TCS-ελεύθερο μέσο.

Κυτταρική βιωσιμότητα δοκιμασία

Κυτταρική βιωσιμότητα εκτιμήθηκε με Καταμέτρηση κυττάρων Kit-8 (Dojindo Laboratories, Kumamoto, Japan) χρησιμοποιώντας τις μεθόδους που περιγράφηκαν προηγουμένως [3 ], [4], [9].

Η θεραπεία των κυττάρων με CRE-OGNs

CRE δολωμάτων OGN (5′-TGACGTCAGAGAGCGCTCTCTGACGTCA-3 ‘) και OGN ελέγχου (5’-TGACGTCATGACGTCATGACGTCA- 3 ‘) μετατράπηκαν σε φωσφοροθειοϊκό OGNs (Invitrogen Carlsbad, CA, USA) όπως περιγράφεται προηγούμενα [5], [6], [10].

Παρασκευή κυτταρολύματος και πυρηνικών πρωτεϊνών

Η παρασκευάσματα κυτοσολίου και πυρηνικών πρωτεϊνών πραγματοποιήθηκαν όπως περιγράφηκε προηγουμένως [6], [11], [12]. Εν συντομία, στο τέλος της κάθε προσδιοριζόμενου κατεργασία, τα κύτταρα πλύθηκαν σύντομα με ψυχρό PBS και λύθηκαν με διάλυση τους σε 0.5 ml ψυχρού υποτονικό ρυθμιστικό διάλυμα (10 mM HEPES, 40 mM ΚΟΙ, 3 mM MgCl

2, 1 mM διθειοθρεϊτόλη, 0,2 % ΝΡ-40, 1 μg /ml απροτινίνης, 2 μΜ leupeptin, 1 mM φθοριούχο φαινυλμεθυλσουλφονύλιο, 40 mM φωσφορικό ρ-νιτροφαινύλιο, 1 mM ορθοβαναδικό νάτριο και 50% γλυκερόλη). Τα προϊόντα λύσης συλλέχθηκαν και επωάστηκαν σε πάγο για 5 λεπτά, στη συνέχεια φυγοκεντρείται στα 15.000 χ g για 20 s. Το υπερκείμενο συλλέχθηκε και αποθηκεύτηκε ως τα κυτοσολικά κλάσματα. Το σφαιρίδιο (δηλαδή πυρήνες κυττάρων) επαναιωρήθηκε σε υπερτονικό ρυθμιστικό (20 mM HEPES, 420 mM ΚΟΙ, 1.5 mM MgCl

2, 0,2 mM EDTA, 0,5 mM διθειοθρεϊτόλη, 0,2% ΝΡ-40, 1 μg /ml απρωτινίνη, 2 μΜ λευπεπτίνη, 0,5 mM φθοριούχο φαινυλμεθυλσουλφονύλιο, 40 mM φωσφορικό ρ-νιτροφαινύλιο, 1 mM ορθοβαναδικό νάτριο και 25% γλυκερόλη). Μετά την επώαση σε πάγο για 60 λεπτά, τα δείγματα φυγοκεντρήθηκαν στις 15.000 χ g για 20 λεπτά και τα υπερκείμενα συλλέχθηκαν και αποθηκεύονται ως πυρηνικά εκχυλίσματα. Τα κυτοσολικά κλάσματα και πυρηνικά εκχυλίσματα βρασμένο για 10 λεπτά και διαλύθηκε σε 8% SDS PAGE.

κυτταρικού κύκλου ανάλυση

Για ανάλυση κυτταρομετρίας ροής του κυτταρικού κύκλου, 1 × 10

6 κύτταρα συλλέχθηκαν με φυγοκέντρηση, πλύθηκαν με PBS και σταθεροποιήθηκαν με παγωμένο 70% όλη τη νύκτα αιθανόλη. Σταθερή κύτταρα επεξεργάστηκαν με 25 μg /ml RNase Α στους 37 ° C για 30 λεπτά και στη συνέχεια χρωματίζονται με ιωδιούχο προπίδιο (ΡΙ) (50 μg /ml, Sigma) διάλυμα για 30 λεπτά στο σκοτάδι. Η ένταση φθορισμού των μεμονωμένων κυττάρων μετρήθηκε με κυτταρόμετρο ροής (Beckman Coulter, Inc., Miami, FL, USA). Τουλάχιστον 10.000 κύτταρα μετρήθηκαν [13].

Western ανάλυση κηλίδος

Σύνολο κυτταρολύματα παρασκευάστηκαν με λύση των κυττάρων με ρυθμιστικό δοκιμασίας ραδιοανοσοκατακρήμνισης και η συγκέντρωση πρωτεΐνης προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας το κιτ δοκιμασίας πρωτεΐνης (Bio -Rad). Για ανάλυση στυπώματος Western, 50 μg από κάθε δείγμα υποβλήθηκε σε επεξεργασία όπως περιγράφεται [14]. Τα ακόλουθα αντισώματα χρησιμοποιήθηκαν: αντι-κυκλίνης Α, Β1, D1, Ε, αντι-CDK2, 4 και αντι-ακτίνης (Cell Thehnology, Inc., Beverly, ΜΑ σηματοδότηση). Τα δευτερεύοντα αντισώματα συζεύχθηκαν με υπεροξειδάση αγριοραπανιού και ανιχνεύθηκαν με χημειοφωταύγεια (Bio-Rad, Hercules, CA). Οι σχετικές ποσότητες των ανοσοδραστικών πρωτεϊνών σε κάθε ζώνη προσδιορίσθηκαν με σάρωση πυκνομετρική ανάλυση των φιλμ ακτίνων Χ.

Στατιστική ανάλυση

Όλα τα πειράματα επαναλήφθηκαν τρεις φορές. Τα δεδομένα εκφράζονται ως μέσοι ± SD. ANOVA χρησιμοποιήθηκε για να αξιολογήσει τις διαφορές μεταξύ των ομάδων. Τα δεδομένα αναφέρονται ως μέσος όρος ± SD τριών ανεξαρτήτων πειραμάτων. Οι διαφορές θεωρήθηκαν σημαντικές εάν

σ

& lt?. 0.05

Αποτελέσματα

Εφέ ΣΤΛ στον πολλαπλασιασμό των καρκινικών κυττάρων

TCS 20-100 μg /ml ανέστειλε τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων κατά 3% έως 70% μετά από θεραπεία για 24 ώρες (Εικ. 1). Η 50% ανασταλτική συγκέντρωση (IC

50) του TCS σε κύτταρα Caski και C33A βρέθηκε να είναι 60 μg /ml, είναι χαμηλότερη από ότι στις HeLa και κύτταρα SW1990 (100 μg /ml) (Πίνακας 1).

TCS ανέστειλε τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων με δοσο-εξαρτώμενο τρόπο. Τα δεδομένα αντιπροσωπεύουν μέσο ± SD τριών ανεξάρτητων πειραμάτων (*

σ

& lt? 0,05 σε σύγκριση με τον έλεγχο).

Η

Εφέ ΣΤΛ σχετικά με την πρόοδο του κυτταρικού κύκλου και του κυτταρικού κύκλου ρυθμιστικές πρωτεΐνες

TCS-αγωγή καρκινικά κύτταρα αναλύθηκαν με κυτταρομετρία ροής. Εξαρτώμενο από τη δόση τον αριθμό των κυττάρων αυξάνεται από S, G1, G2 /M φάση παρουσιάστηκαν σε HeLa, Caski και κύτταρα SW1990 αντίστοιχα, αφού υποβλήθηκαν σε θεραπεία για 24 ώρες, (Πίνακας 2). Τα επίπεδα των πρωτεϊνών που σχετίζονται με τον κυτταρικό κύκλο προσδιορίστηκαν με δοκιμασία κηλίδος Western. TCS μείωσε την αφθονία του κυκλίνη Α, D1 και CDK 2, 4, ενώ δεν είχε καμία αξιοσημείωτη επίδραση στην έκφραση της κυκλίνης Β1 και Ε σε HeLa κυττάρων (Εικ. 2). Σε Caski κυττάρων, η κυκλίνη D1, Ε και CDK 2, 4 ήταν σημαντικά μειωμένη, ενώ δεν σημειώθηκαν αλλαγές φαίνεται στην έκφραση της κυκλίνης Α και Β1 (Εικ. 3). Παρόμοια αποτελέσματα βρέθηκαν σε κύτταρα C33A (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Σε SW1990 κύτταρο, κυκλίνη Α, Β1, Ε και CDK 2 ήταν σημαντικά ρυθμισμένη προς τα κάτω, δεν διακριτές επιδράσεις παρατηρήθηκαν στην έκφραση της κυκλίνης D1 και CDK4 (Εικ. 4).

κύτταρα HeLa υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με υποδεικνύεται δόσεις του TCS για 24 ώρες. Ο αριθμός των κυττάρων φάσης S αυξήθηκε σημαντικά (Α) και εκφράσεις του κυκλίνη Α, D1 και CDK2, 4 μειώθηκε σημαντικά (Β). Τα δεδομένα αντιπροσωπεύουν μέσο ± SD από τρία ανεξάρτητα πειράματα (*

ρ

& lt? 0,05 σε σύγκριση με τον έλεγχο)

Η

κύτταρα Caski υποβλήθηκαν σε αγωγή με υποδεικνυόμενες δόσεις του TCS για 24 ώρες.. Οι αριθμοί των κυττάρων σε φάση G1 αυξήθηκε σημαντικά (Α) και εκφράσεις της κυκλίνης D1, Ε και CDK2, 4 μειώθηκε σημαντικά (Β). Τα δεδομένα αντιπροσωπεύουν μέσο ± SD από τρία ανεξάρτητα πειράματα (*

ρ

& lt? 0,05 σε σύγκριση με τον έλεγχο).

Η

κύτταρα SW1990 υποβλήθηκαν σε αγωγή με υποδεικνυόμενες δόσεις του TCS για 24 ώρες. Οι αριθμοί των κυττάρων στο G2 /M φάση αυξήθηκε σημαντικά (Α), οι εκφράσεις της κυκλίνης Α, Β1, Ε και CDK2 μειώθηκε σημαντικά (Β). Τα δεδομένα αντιπροσωπεύουν μέσο ± SD τριών ανεξάρτητων πειραμάτων (*

σ

& lt? 0,05 σε σύγκριση με τον έλεγχο).

Η

Επιπτώσεις της CRE-δόλωμα για την πρόοδο του κυτταρικού κύκλου και κανονιστικών πρωτεΐνες

Οι συλλήψεις των S, G1 και G2 /M φάσεων που προκαλείται από TCS σε HeLa (Εικ. 5), Caski (Εικ. 6) και SW1990 (Εικ. 7) κύτταρα, ήταν σημαντικά εξασθενημένο από τη συνδυασμένη θεραπεία της TCS και CRE (Α, Β). Διαπιστώθηκε ότι οι TCS-επαγόμενη μείωση του κυκλίνη Α και Δ1 ήταν αξιοσημείωτα αναστραφεί με την προσθήκη CRE, σε κύτταρα HeLa (Σχ. 5, C, D), κύτταρα Caski (Σχ. 6 C, D) και SW1990 κύτταρα ( Σχ. 7 C, D).

TCS-προκαλούμενη αύξηση του αριθμού των κυττάρων στη φάση S ήταν σημαντικά εξασθενημένο από τη συνδυασμένη θεραπεία του TCS + CRE (Α, Β). Το κάτω-ρυθμιζόμενη έκφραση της κυκλίνης Α και D1 ανατράπηκε από TCS + CRE. Δεν παρατηρήθηκε καμία επίδραση επί άλλων πρωτεϊνών (C, D). Τα δεδομένα αντιπροσωπεύουν μέσο ± SD τριών ανεξάρτητων πειραμάτων (*

σ

& lt? 0,05 σε σύγκριση με τον έλεγχο,

#

σ

& lt? 0,05 σε σύγκριση με το TCS).

Η

TCS-προκαλούμενη αύξηση του αριθμού των κυττάρων σε φάση G1 ήταν σημαντικά εξασθενημένη με TCS + CRE (Α, Β). Η προς τα κάτω ρύθμιση της έκφρασης της κυκλίνης D1 αντιστράφηκε με την κατεργασία TCS + CRE. Δεν παρατηρήθηκε καμία επίδραση επί άλλων πρωτεϊνών (C, D). Τα δεδομένα αντιπροσωπεύουν μέσο ± SD τριών ανεξάρτητων πειραμάτων (*

σ

& lt? 0,05 σε σύγκριση με τον έλεγχο,

#

σ

& lt? 0,05 σε σύγκριση με το TCS).

Η

TCS-επαγόμενη αύξηση του αριθμού των κυττάρων σε G2 /M φάση ήταν σημαντικά εξασθενημένη με την κατεργασία TCS + CRE (Α, Β). Down-ρυθμιζόμενη έκφραση της κυκλίνης Α αντιστράφηκε με την κατεργασία TCS + CRE. Δεν υπήρχε επίδραση επί άλλων πρωτεϊνών (C, D). Τα δεδομένα αντιπροσωπεύουν μέσο ± SD τριών ανεξάρτητων πειραμάτων (*

σ

& lt? 0,05 σε σύγκριση με τον έλεγχο,

#

σ

& lt? 0,05 σε σύγκριση με το TCS).

Η

Συζήτηση

Αυτή η μελέτη έδειξε, για πρώτη φορά, ότι TCS εξασκείται κυτταροτοξικά αποτελέσματα επί βιωσιμότητα των καρκινικών κυττάρων με δοσο-εξαρτώμενο τρόπο (Εικ. 1). Caski και C33A κύτταρα ήταν ευαίσθητα σε ανασταλτική δράση της επί του πολλαπλασιασμού των κυττάρων (Πίνακας 1). Τα αποτελέσματα της είναι αντικαρκινικών μηχανισμοί δείχνουν σαφώς ότι η αύξηση του φάσης S σε κύτταρα HeLa συνόδευσαν την πτώση του G

1 κύτταρα φάσης, ενώ ο αριθμός των G

2 κύτταρα φάσης δεν αλλάζει. Σε Caski και C33A κύτταρα, σημαντική αύξηση του G

1 φάσης και μείωση του S και G παρατηρήθηκαν

2 κύτταρα φάσης. Σε κύτταρα SW1990, μια αύξηση του G

2 /M κυττάρων φάση συνοδεύεται από μια μείωση της τάξης του G

1 κύτταρα φάση, χωρίς βρέθηκαν στον αριθμό των κυττάρων φάσης S (Πίνακας 2) αλλαγή.

Διερευνώντας τις αλλαγές σε πολλαπλά ρυθμιστικά μόρια που εμπλέκονται στον κυτταρικό κύκλο έδειξαν ότι οι εκφράσεις του κυκλίνη Α, D1 και CDK 2, 4 σε κύτταρα HeLa (Σχ. 2), η κυκλίνη D1, Ε και CDK 2, 4 σε Caski και C33A κύτταρα (Σχ. 3), κυκλίνη Α, Β1, Ε και CDK 2 σε κύτταρα SW1990 (Σχ. 4) ήταν σημαντικά κάτω-ρυθμίζονται. Αποκλεισμό της θέσης πρόσδεσης των γονιδίων του κυτταρικού κύκλου για CREB με OGN, ένα δόλωμα CRE, εμπόδισε την TCS-συνελήφθησαν S, G1 και G2 /κυτταρικούς κύκλους Μ σε HeLa (Σχ. 5 Α, Β), Caski (Εικ. 6 Α, Β ) και SW1990 (Εικ. 7 Α, Β) κύτταρα, αντιστοίχως. Το TCS μεσολάβηση κάτω ρύθμιση κυκλίνης Α, D1 σε κύτταρα HeLa (Σχ. 5 Γ, Δ), κυκλίνη D1 σε κύτταρα Caski (Σχ. 6 C, D) και κυκλίνης Α σε κύτταρα SW1990 (Εικ. 7 C, D) αντιστράφηκαν από το συνδυασμό των CRE και TCS.

τα αποτελέσματα αυτά επιβεβαιώνονται και επεκτάθηκε προηγούμενες εκθέσεις μας δείχνουν ότι TCS έχει κυτταροτοξική δράση σε καρκινικά κύτταρα [3], [4], αποκάλυψε και εν μέρει τους μηχανισμούς που διέπουν την ενεργοποίηση πρωτεΐνης CREB [5], [6]. Ωστόσο, δεν έχει αναφερθεί προηγουμένως αν TCS μεσολάβηση διακοπή του κυτταρικού κύκλου λαμβάνει χώρα μέσω του συνδυασμού του CRE και στόχου γονίδια. Η παρούσα μελέτη δείχνει ότι CRE δόλωμα OGN εξασθενεί τη μείωση των εκφράσεων της κυκλίνης Α και D1 προκύπτει από την επεξεργασία TCS, και να αντιστραφεί τις συλλήψεις του κυτταρικού κύκλου.

Η κυτταρικού κύκλου είναι καλά με τη μεσολάβηση ενός πολύπλοκου δικτύου των θετικών και αρνητικού κύκλου κυττάρου ρυθμιστικά μόρια όπως CDKs, CKIs και κυκλίνες [15], [16]. Έχει αναφερθεί ότι ο σχηματισμός των συμπλοκών D /CDK4 και κυκλίνη E /CDK2 δραστική κυκλίνη ελέγχει την εξέλιξη μέσω φάση G1 (G1 /μετάβαση S). Περαιτέρω, η κυκλίνη Α συνδέεται με και ενεργοποιεί CDK2, προωθώντας G1 /S και G2 /M μεταπτώσεων του κυτταρικού κύκλου. Στα τέλη του G2, κυκλίνη Β /CDK2 ενεργοποιείται, επιτρέποντας την είσοδο στη μίτωση [17]. Στην παρούσα μελέτη, βρήκαμε ότι οι μειωμένες εκφράσεις κυκλίνη Α, D1 και CDK2, 4 συσχετίστηκαν τη σύλληψη φάσης S σε κύτταρα HeLa (Εικ. 2). Τα μειωμένα-εκφράσεις της κυκλίνης D, E και CDK2, 4 σχετίζονταν με G1 φάση σε κύτταρα Caski και C33A (Εικ. 3). Οι εκφράσεις του κυκλίνη Α, Β1 και CDK2 ήταν σημαντικά κάτω-ρυθμίζονται σε κύτταρα SW1990, συνελήφθησαν στη G2 /M φάση (Εικ. 4). Βρήκαμε επίσης ότι η CDK2 μειώθηκε σημαντικά σε κυτταρικές σειρές. Το αποτέλεσμα αυτό συμφωνεί με την ιδέα ότι CDK2 έχει μια ευδιάκριτη και ουσιώδη λειτουργία στον κύκλο κυττάρου θηλαστικού, και η μετάλλαξη ή την αναστολή του προκαλεί ένα μπλοκ G1 φάσης [18].

Η ενεργοποίηση των γονιδίων που φέρουν CRE αναφέρεται να συμβεί με φωσφορυλίωση του CREB σε Ser 133 και πρόσδεση σε συναινετικές αλληλουχίες CRE στην περιοχή προαγωγού των γονιδίων [19], [20]. αιχμές φωσφορυλίωση του CREB κατά την διάρκεια της μετάβασης G1-S και στη συνέχεια μειώνεται σταδιακά από τη φάση S σε φάση Μ [21]. Σε συνδυασμό με προηγούμενα αποτελέσματα μας [4] – [6], [9], είναι λογικό να υποθέσουμε ότι τα γονίδια του πολλαπλασιασμού των κυττάρων, που φέρει την ιστοσελίδα CRE, δεσμεύονται σε CREB και να επηρεάσει το επίπεδο φωσφορυλίωσης της, παρεμβαίνοντας έτσι την κυτταρική διαίρεση

CRE εντοπίζει ανάντη του mRNA ξεκινήσει sites. Έχει ένα ρόλο κλειδί στην κυκλίνης Α [22], [23] και D1 [24], [25] η έκφραση μέσω ενεργοποίησης του CREB [26] – [28]. Μια προηγούμενη μελέτη έδειξε ότι η ένωση του CREB με δαμαλίτιδας που σχετίζονται με την κινάση 1 (VRK1) εμφανίστηκε σε ένα κύτταρο-κύκλου με τρόπο που εξαρτάται από τα τέλη του G1 στην S φάση. Επιπλέον, VRK1 ενισχύονται ειδικά τη δραστηριότητα των CRE σε κυκλίνης D1 υποστηρικτής διευκολύνοντας την πρόσληψη φωσφορυλιωμένη CREB σε αυτό τον τόπο [29]. Giampuzzi et al βρήκαν επίσης ότι ένα σημαντικό μείωση της πρωτεΐνης CREB σύνδεσης προς τον προαγωγό της κυκλίνης D1 οδήγησε σε μια δραματική αναστολή της έκφρασης πρωτεΐνης κυκλίνης D1 σε λυσυλο οξειδάση (LOX) -μέχρι-ρυθμιζόμενη κύτταρα [30]. Αυτό το φαινόμενο επιβεβαιώθηκε επίσης σε κύτταρα ινοβλαστών [31], του ενδομητρίου κυττάρου [32], INS κυττάρου [33], ηπατοκυττάρων κυττάρου [34] και άλλες κυτταρικές γραμμές [21], [35], [36]. Επιπλέον, ένας αριθμός παρατηρήσεων προτεινόμενες κυκλίνης Α παίζει κεντρικό ρόλο για την S και G2 /M μετάπτωσης σε κύτταρα θηλαστικών και ο ρόλος αυτός είναι συνεπής με την προτιμησιακή σχέση της με CDK2, αντί του CDC2, κατά τη διάρκεια της φάσης S [37], [38] . CRE επιβεβαιώθηκε ότι απαιτείται για την αποτελεσματική ενεργοποίηση του υποκινητή κυκλίνης Α σε κύτταρα αορτικού λείου μυός [39], ινοβλαστών κυττάρων [40] και ανθρώπινα κύτταρα εμβρυονικό καρκίνωμα [22]. Η παρούσα μελέτη δείχνει σαφώς ότι η συνδυασμένη θεραπεία της TCS και CRE εξασθενεί τη μείωση της κυκλίνης Α και έκφραση D1, αντιστρέφοντας έτσι την επίδραση του TCS για τη σύλληψη του κυτταρικού κύκλου. Ως εκ τούτου, προτείνουμε ότι μεταγραφικού παράγοντα CREB είναι ένα από τα ανάντη ρυθμιστές της TCS που προκαλείται διακοπή του κυτταρικού κύκλου σε καρκινικά κύτταρα.

Συμπέρασμα

Τα ευρήματά μας δείχνουν, για πρώτη φορά, ότι TCS επάγει συγκεκριμένες συλλήψεις κυτταρικού κύκλου στα καρκινικά κύτταρα μέσω της αναστολής της πρόσδεσης του CREB να CRE σε γονίδια που σχετίζονται με τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό.