Αφηρημένο

Ιστορικό

Το γλυκογόνο συνθάσης κινάσης 3 β (ΟδΚ3β) είναι κεντρικά εμπλέκονται σε διάφορες κυτταρικές διαδικασίες, συμπεριλαμβανομένων πολλαπλασιασμού και απόπτωσης. Η παρούσα μελέτη στοχεύει να διερευνήσει την επίδραση της έκφρασης ΟδΚ3β για την πρόγνωση της ανθρώπινης μη-μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα (NSCLC) και τις επιπτώσεις της αναστολής της GSΚ3β σε κυτταρικές σειρές NSCLC.

Μέθοδοι

Ανοσοϊστοχημική και δοκιμασίες κηλίδος Western χρησιμοποιήθηκαν για την αξιολόγηση του επιπέδου έκφρασης της ΟδΚ3β σε ανθρώπινους ιστούς NSCLC. Λεντοϊών παρεμβολή RNA πραγματοποιήθηκε για να αναστέλλουν την έκφραση του ΟδΚ3β στο Α549, Η292, Η1299 και SK-MES-1 κυτταρικές γραμμές. Η επιβίωση των κυττάρων, την απόπτωση και την κινητικότητα αξιολογήθηκαν

in vivo

και

in vitro

.

Αποτελέσματα

Τα επίπεδα της ΟδΚ3β ήταν μεγαλύτερη στους ιστούς NSCLC (n = 211) σε σχέση με τους ιστούς ελέγχου (n = 194) (

P

& lt? 0.001). Η ανάλυση παρακολούθησης 5 ετών έδειξε ότι η θετική έκφραση της ΟδΚ3β ήταν ενδεικτική της κακής πρόγνωσης (

P

= 0,006). Επιπλέον, knockdown του ΟδΚ3β σε κυτταρικές γραμμές NSCLC κατέστειλε τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων, συνελήφθη καρκινικών κυττάρων σε φάση Ο0 /Ο1, επαγόμενη απόπτωση και μειωμένη κυτταρική κινητικότητα. Ένα μοντέλο ξενομοσχεύματος έδειξε ότι η απορρύθμιση των ΟδΚ3β εξασθενημένων ογκογένεσης, όπως επιβεβαιώνεται από μειωμένη πολλαπλασιασμού των κυττάρων βασίζεται σε Ki-67 και σημαντικά αυξημένη αποπτωτικό κυτταρικό θάνατο. Η αναστολή της ΟδΚ3β είχε ασυνεπή αποτελέσματα επί της έκφρασης του β-κατενίνης, ανάλογα με τον τύπο του κυττάρου που εξετάστηκαν.

Συμπέρασμα

Η ανώμαλη έκφραση του ΟδΚ3β χρησιμεύει ως ανεξάρτητος δείκτης κακής πρόγνωσης για NSCLC. Η αναστολή της ΟδΚ3β καταστέλλεται ογκογένεση από ελαφρυντικές τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων, αυξάνοντας την απόπτωση και τον περιορισμό των κυττάρων κινητικότητα. Τα αποτελέσματα αυτά προσδιορίζουν ΟδΚ3β ως υποκινητή όγκου και ένα πιθανό θεραπευτικό στόχο στον NSCLC

Παράθεση:. Zeng J, Liu D, Qiu Ζ, Huang Υ, Chen Β, Wang L, et al. (2014) ΟδΚ3β υπερέκφραση Δείχνει κακή πρόγνωση και την αναστολή του μειώνει τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό και την επιβίωση των μη-μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα κύτταρα. PLoS ONE 9 (3): e91231. doi: 10.1371 /journal.pone.0091231

Επιμέλεια: Srikumar Π Chellappan, H. Lee Moffitt Cancer Center & amp? Research Institute, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 11 του Σεπτεμβρίου 2013? Αποδεκτές: 10η Φεβρουαρίου 2014? Δημοσιεύθηκε: 11 Μαρτίου του 2014

Copyright: © 2014 Zeng et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από επιχορηγήσεις από το Ίδρυμα Φύση Επιστημών της Κίνας (81201851 έως Dan Liu και 81641028 έως Weimin Li). Ο δικτυακός τόπος του Εθνικού Ιδρύματος Φύση Επιστημών της Κίνας είναι https://www.nsfc.gov.cn/Portal0/default166.htm. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

ο καρκίνος του πνεύμονα είναι η κύρια αιτία της παγκόσμιας θάνατοι σχετίζονται με τον καρκίνο για δεκαετίες [1]. Στην Κίνα, ο αριθμός των κρουσμάτων και των θανάτων που σχετίζονται με τον καρκίνο του πνεύμονα καρκίνο του πνεύμονα έχει αυξηθεί με την αύξηση των επιπέδων της κατάχρησης τσιγάρου και τη ρύπανση [2]. Μη μικροκυτταρικός καρκίνος του πνεύμονα (NSCLC), η οποία περιλαμβάνει κατά κύριο λόγο αδενοκαρκίνωμα και καρκίνωμα πλακωδών κυττάρων, αντιπροσωπεύει σχεδόν το 85% των καρκίνων του πνεύμονα. Παρά το γεγονός ότι έχουν εισαχθεί νέες θεραπευτικές προσεγγίσεις, οι περισσότεροι ασθενείς εξακολουθούν να διαγνωστεί σε προχωρημένα στάδια, και το ποσοστό επιβίωσης 5-ετών παραμένει λιγότερο από το 15% [1]. Για να βελτιωθεί η έκβαση και την ποιότητα ζωής των ασθενών με NSCLC, πολλές πρόσφατες μελέτες έχουν εστιάσει στην εύρεση νέων θεραπευτικών στόχων και τον εντοπισμό βιοδείκτες για τη διευκόλυνση της εξατομικευμένης θεραπείας [3].

Η κινάση συνθετάσης γλυκογόνου 3 βήτα (ΟδΚ3β) είναι μια πολυλειτουργική πρωτεΐνη κινάση σερίνης /θρεονίνης που αρχικά απομονώθηκε από σκελετικό μυ κουνελιού [4]. Υπό συνθήκες ηρεμίας, η ΟδΚ3β είναι ουσιαστικά δραστική οφείλεται στην φωσφορυλίωση τυροσίνης-216, και φωσφορυλιώνει και αναστέλλει μια διαφορετική ομάδα των προ-ογκογόνο υποστρώματα, όπως β-κατενίνης, η κυκλίνη D1, c-Jun, c-Myc και CREB. Με τη σειρά του, ο φωσφορυλίωση της σερίνης-9 αδρανοποιεί ΟδΚ3β [5] – [7]. Με βάση αυτές τις λειτουργίες, η ΟδΚ3β είναι ένας πιθανός καταστολέας όγκων, και η αδρανοποίηση του ΟδΚ3β έχει αναφερθεί σε πολλά καρκινικά κύτταρα [8], [9]. Ωστόσο, πολλές μελέτες έχουν αποδείξει ότι η ΟδΚ3β μπορεί να ρυθμίσει θετικά τον πολλαπλασιασμό και την απόπτωση των καρκινικών κυττάρων [10] – [18]. Επιπλέον, μελέτες έχουν δείξει ότι η αναστολή της ΟδΚ3β εξασθενεί επιβίωση και τον πολλαπλασιασμό και επάγει την απόπτωση σε διάφορους τύπους καρκίνων, όπως του καρκίνου του παγκρέατος [11], ορθοκολικό καρκίνο [12], [15] και καρκίνου της ουροδόχου κύστης [18]. Ωστόσο, ο ρόλος της ΟδΚ3β διαφέρει σε διαφορετικές μορφές καρκίνου [19], και ο ακριβής ρόλος της ΟδΚ3β σε NSCLC παραμένει ασαφής.

Σε αυτή τη μελέτη, διερευνήσαμε την έκφραση της ΟδΚ3β σε ανθρώπινους ιστούς NSCLC και προγνωστική σημασία της. Στο Η292, Η1299, SK-MES-1 και Α549 κυτταρικές σειρές NSCLC, η έκφραση της ΟδΚ3β ανεστάλη από μικρές φουρκέτα RNA (shRNA) μεταφέρθηκε από φορέα λεντοϊού. Σταθερό νοκ ντάουν κυτταρικές σειρές επαληθεύτηκαν και χρησιμοποιήθηκαν σε περαιτέρω έρευνα. Ογκογένεση, πολλαπλασιασμό, απόπτωση και κυτταρική μετανάστευση αξιολογήθηκαν επίσης τόσο

in vivo

και

in vitro

, και τα αποτελέσματα έδειξαν ότι παρεκκλίνουσα έκφραση του ΟδΚ3β υπηρέτησε ως ανεξάρτητος δείκτης κακής πρόγνωσης για NSCLC. Επιπλέον, η αναστολή της ΟδΚ3β με παρεμβολή RNA καταστέλλεται ογκογένεση με εξασθένηση του πολλαπλασιασμού των κυττάρων, αυξάνοντας την απόπτωση και καταστολή κυττάρων εισβολής. Μαζί, αυτά τα ευρήματα εντοπίζουν ΟδΚ3β ως υποκινητή όγκου και ένα πιθανό θεραπευτικό στόχο για NSCLC.

Υλικά και Μέθοδοι

1. Οι ασθενείς και οι

συλλογή ιστού

χειρουργικά ιστούς NSCLC (n = 211) και τα δείγματα του φυσιολογικού πνεύμονα δίπλα στους ιστούς όγκου (n = 194) ελήφθησαν από την Δυτική Κίνα Νοσοκομείο, Πανεπιστήμιο Sichuan. Κανένας από τους ασθενείς είχαν υποστεί αγωγή με προεγχειρητική χημειοθεραπεία ή ακτινοθεραπεία. Συνέχεια πληροφορίες ήταν διαθέσιμες για 160 περιπτώσεις. Οι παθολογικές στάδια καθορίστηκαν σύμφωνα με τη Διεθνή Ένωση κατά του Καρκίνου (UICC) όγκου-node-μετάσταση (TNM) σύστημα ταξινόμησης για τους κακοήθεις όγκους. Για την περαιτέρω διερεύνηση, η έκταση της διαφοροποίησης και ιστολογικού τύπου προσδιορίστηκε σύμφωνα με την ταξινόμηση του Παγκόσμιου Οργανισμού Υγείας για NSCLC. Μετά από χειρουργική εκτομή, όλοι οι ασθενείς έλαβαν την καθιερωμένη θεραπεία, σύμφωνα με NCCN Οδηγίες Κλινικής Πρακτικής του 2004 στην Ογκολογία για NSCLC. Γραπτή συγκατάθεση λήφθηκε από κάθε ασθενή, και έγκριση του διοικητικού συμβουλίου θεσμική αναθεώρηση αυτής της μελέτης λήφθηκε από τη Δυτική Κίνα Νοσοκομείο, Πανεπιστήμιο Sichuan.

2. Σταθερό γονιδιακής σίγησης χρησιμοποιώντας μικρά παρεμβαλλόμενα RNA που προκαλείται από τον φορέα λεντοϊού

Το ανθρώπινο πνεύμονα NSCLC κυτταρικές γραμμές Α549, Η292, Η1299 και SK-MES-1, που ελήφθησαν από την American Type Culture Collection (ATCC), καλλιεργήθηκαν σύμφωνα με τα πρωτόκολλα ATCC

Ακολουθίες (GAAGAAAGATGAGGTCTAT) με στόχο ΟδΚ3β (GenBank με: NM_002093) (, Carlsbad, CA Invitrogen) επιλέχθηκαν που έχουν σχεδιαστεί με τη χρήση του Designer BLOCK-iT παρεμβολής RNA (RNAi).. Μια αλληλουχία δεν σχετίζεται με το γονίδιο της ΟδΚ3β (TTCTCCGAACGTGTCACGT) σχεδιάστηκε ως αρνητικός έλεγχος (NC) [20]. Η φορέα λεντοϊού pGCSIL-GFP αγοράστηκε από GeneChem και NeuronBiotech Corp (Σαγκάη, Κίνα). Πράσινη φθορίζουσα πρωτεΐνη (GFP) χρησιμοποιήθηκε ως δείκτης για να παρατηρήσουν και ταξινόμηση αυτών των επιμολυσμένων κυττάρων του όγκου με φθορισμό ενεργοποιημένων κυττάρων (FACS). Τα αποτελέσματα του RNA παρεμβολής αξιολογήθηκαν με RT-PCR (στα 5

ου ημέρες μετά την επιμόλυνση) και κηλίδωση Western (σε 7

ου ημέρα μετά την επιμόλυνση). Στη συνέχεια, οι κυτταρικές σειρές NSCLC με σταθερή και διαρκή γονίδιο ΟδΚ3β γκρεμίζω ελήφθησαν για την περαιτέρω

in vivo

και

in vitro

μελέτες. Τα κύτταρα που έχουν μολυνθεί με τον φακοϊό που εξέδωσε την ακολουθία στόχευσης GSK3 ονομάστηκαν ως γκρεμίζω ομάδα (ομάδα KD). Ομοίως, τα κύτταρα που περιέχουν το φακοϊό εξέδωσε την ακολουθία NC πήραν το όνομά τους με την ομάδα NC? και αυτά τα καρκινικά κύτταρα δεν έχουν μολυνθεί από φακοϊό χρησιμοποιήθηκαν ως κανονικός έλεγχος και ονομάστηκε ως ομάδα ελέγχου (ομάδα CON).

3. Ογκογένεση σε ξενομοσχεύτηκε ποντίκια

Γυμνά ποντίκια (BALB /c-nu /nu, n = 6 για κάθε ομάδα, ίσο αριθμό ανδρών και γυναικών, ηλικίας 6-8 εβδομάδων) χορηγήθηκαν από το Κέντρο Εργαστήριο Ζώων του Σιτσουάν Πανεπιστήμιο. Οι ποντικοί στεγάστηκαν σε στρωτή ροή ντουλάπια κάτω από ειδικές συνθήκες ελεύθερες παθογόνων και τρέφονται κατά βούληση. Όλες οι μελέτες στις οποίες συμμετείχαν ποντίκια διεξήχθησαν σύμφωνα με τα Εθνικά Ινστιτούτα Υγείας των κατευθυντήριων γραμμών για τη Φροντίδα και Χρήση των Ζώων Εργαστηρίου. Έγκριση για τη μελέτη αυτή δόθηκε από την Επιτροπή Θεσμικών Ζωικά Φροντίδα και Θεραπεία του Πανεπιστημίου Σιτσουάν.

Μετά τη θεραπεία με διαφορετικούς ιούς, εκθετικά αναπτυσσόμενα κύτταρα Α549 υποδόρια ένεση στις πλάτες των Balb /c γυμνά ποντίκια (1 × 10

6 /ml το καθένα). Οι όγκοι των όγκων αξιολογήθηκαν κάθε 3 ημέρες σύμφωνα με τον ακόλουθο τύπο: όγκος του όγκου (mm

3) = d

2 × D × 0,52. Τέσσερις εβδομάδες μετά την εμφύτευση του όγκου, οι ποντικοί θυσιάστηκαν ανώδυνα. όργανά τους εξετάστηκαν για ακαθάριστα στοιχεία ανατομικές αλλαγές.

4. προσδιορισμούς πολλαπλασιασμού κυττάρων

Ο Καταμέτρηση κυττάρων Kit-8 (CCK-8? Dojindo, Rockville, USA) χρησιμοποιήθηκε για την εκτίμηση του πολλαπλασιασμού κυττάρου σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. Καρκινικά κύτταρα (2 χ 10

3 ανά φρεάτιο) σπάρθηκαν σε πλάκες καλλιέργειας 96-φρεατίων, και υποβλήθηκε σε επεξεργασία με 10% FBS και επωάζονται στους 37 ° C. Η οπτική πυκνότητα στα 450 nm μετρήθηκε στις 24, 48, 72, 96 και 120 ώρες μετά την επιμόλυνση ιού. Τα δεδομένα που παρουσιάζονται είναι αντιπροσωπευτικά 3 ανεξάρτητων πειραμάτων και παρουσιάζονται ως μέσος όρος ± S.D.

5. κυτταρικού κύκλου ανάλυση

Εβδομήντα δύο ώρες μετά την επιμόλυνση, τα δεδομένα κυτταρικού κύκλου ελήφθησαν από την ανάλυση των κυττάρων ΡΙ-χρώση χρησιμοποιώντας ενεργοποιούμενη με φθορισμό διαλογή κυττάρων (FACS) με ένα κυτταρόμετρο ροής FACSCalibur (Becton Dickinson, Franklin Lakes, USA ). Για κάθε δείγμα, τουλάχιστον 3 × 10

5 κύτταρα μετρήθηκαν, και τα δεδομένα αναλύθηκαν με λογισμικό CellQuest BD. Τα δεδομένα που παρουσιάζονται είναι αντιπροσωπευτικά 3 ανεξάρτητων πειραμάτων και παρουσιάζονται ως μέσος όρος ± S.D.

6. Η απόπτωση ανάλυση

Καρκινικά κύτταρα (περίπου 5 × 10

5), βάφτηκαν με 5 μΐ αννεξίνης V-APC και 7ΑΑΌ (KeyGen, Nanjing, Κίνα) σε θερμοκρασία δωματίου και στη συνέχεια αναλύθηκαν με κυτταρομετρία ροής μέσα σε 1 h. Η αννεξίνη V (+) /7ΑΑΌ (-). Κύτταρα θεωρήθηκαν ως αποπτωτικά κύτταρα

Η μέθοδος TUNEL (in situ κυτταρικού θανάτου Detection Kit AP, Roche, Ελβετία) χρησιμοποιήθηκε για να προσδιοριστεί το επίπεδο της απόπτωσης σε ξενομοσχεύματος ιστούς όγκων. Τα αποπτωτικά κύτταρα ανιχνεύθηκαν με τη χρήση αλκαλικής φωσφατάσης και χρωματίζονται με κόκκινο χρώμα. Για κάθε όγκο, αποπτωτικά κύτταρα σε 5 τυχαία πεδία υψηλής ισχύος μετρήθηκαν και ο ρυθμός της απόπτωσης υπολογίστηκε με τον ακόλουθο τύπο:

Η απόπτωση ρυθμός = αριθμός αποπτωτικών κυττάρων /συνολικό αριθμό των κυττάρων του όγκου μετρήθηκαν × 100 %.

7. Εκχύλιση RNA και σε πραγματικό χρόνο PCR

Οι εκκινητές για την ανθρώπινη ΟδΚ3β ήταν 5′-ATTTCCAGGGGATAGTGGTGT-3 ‘(νοηματικό) και 5′-TCCTGACGAATCCTTAGTCCAAG-3′ (antisense)? και εκείνες για GAPDH ήταν 5’-CCATCACCATCTTCCAGG-3 ‘(νοηματικό) και 5′-ATGAGTCCTTCCACGATAC -3’ (αντιπληροφοριακό). Οι εκκινητές και ανιχνευτές αγοράστηκαν από GeneChem, Shanghai, Κίνα. Τα επίπεδα έκφρασης του mRNA ποσοτικοποιήθηκαν εις τριπλούν με πραγματικού χρόνου RT-PCR χρησιμοποιώντας ένα θερμικό ανακυκλωτή 2720 (Applied Biosystems, Foster City, California). Τα σχετικά επίπεδα των μεταγραφών στόχου ποσοτικοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας τη μέθοδο 2 (-Delta Delta CT) [21] και ομαλοποιήθηκε ως προς το επίπεδο των ανθρώπινων μεταγραφημάτων GAPDH.

8. Κυτταρική εισβολή δοκιμασία

Η κυτταρική εισβολή Assay Kit (ECM550, Chemicon, California, USA) χρησιμοποιήθηκε για την αξιολόγηση των κυττάρων εισβολής. Μετά την επιμόλυνση του ιού, ένα κλάσμα του παρασκευασμένου κυτταρικού εναιωρήματος (300 μΐ, 1.0 × 10

6 κύτταρα /ml) προστέθηκε σε κάθε άνω ένθετο. Μετά από 48 ώρες επώασης, τα ένθετα βυθίστηκαν σε διάλυμα χρώσης για 20 λεπτά για τη χρώση των μεταστατικών κυττάρων επί της μεμβράνης. Στη συνέχεια, οι επεμβατικές κύτταρα σε 5 τυχαία απόψεις μικροσκόπιο μετρήθηκαν. Τα δεδομένα που παρουσιάζονται είναι αντιπροσωπευτικά 3 ανεξάρτητων πειραμάτων και παρουσιάζονται ως μέσος όρος ± S.D.

9. Western blotting ανάλυση

Σύνολο πρωτεΐνες εκχυλίστηκαν από ιστούς όγκων NSCLC και επιμολυσμένα καλλιεργημένα κύτταρα και στη συνέχεια τα προσόντα χρησιμοποιώντας ένα κιτ εκχύλισης πρωτεΐνης (keygen, Nanjing, Κίνα) και το αντιδραστήριο BCA Protein Assay (Thermo επιστημονικές, Rockford, USA) . Οι πρωτεΐνες διαχωρίστηκαν με SDS-PAGE και κατέστησαν ορατά με ανοσοστύπωση με αντισώματα ειδικά για ΟδΚ3β (# 9315, αραίωση 1: 400) και β-κατενίνης (# 9582, αραίωση 1: 200) (Cell Signaling Technology, Beverly, USA). Μετά από έκθεση σε ένα υπόστρωμα HRP χημειοφωταύγειας (Millipore, Billerica, USA), οι πρωτεΐνες-στόχοι ανιχνεύονται χρησιμοποιώντας ένα σύστημα ChemiDoc XRS (Bio-Rad, Philadelphia, USA), και οι εικόνες αναλύθηκαν με Gel-Pro Analyzer 4.0 λογισμικό (Cybernetics Media ).

10. Ανοσοϊστοχημική

δοκιμασία

ΟδΚ3β σε ιστούς όγκων NSCLC και των παρακείμενων φυσιολογικών ιστών ήταν ανοσοϊστοχημικά χρώση όπως περιγράφεται σε προηγούμενες μελέτες μας [22] – [24]. Ημιποσοτική εκτίμηση των τομών διεξήχθη με 2 παθολόγους με τυφλό τρόπο. Ο αρνητικός έλεγχος για ανοσοχρώση πραγματοποιήθηκε χωρίς πρωτογενές αντίσωμα. θεωρήθηκαν Τόσο το κλάσμα και η ένταση των ανοσοχρωματισμένη καρκινικών κυττάρων. Το σκορ κλάσμα υπολογίστηκε ως ο μέσος όρος των 5 τυχαία επιλεγμένα πεδία υψηλής ισχύος αξιολογήθηκε με οπτικό μικροσκόπιο ως ακολούθως: 0, δεν χρωματίζονται κύτταρα στόχους (όγκος, βρογχικό ή κυψελιδικά κύτταρα)? 1, & lt? 20% των κυττάρων βάφονται? 2, 20~50% των κυττάρων βάφονται? και 3, πάνω από το 50% των κυττάρων χρωματίζονται. Το σκορ ένταση ορίζεται ως ακολούθως: 0, καμία αισθητή χρώση των κυττάρων-στόχων? 1, ελάχιστα ανιχνεύσιμη χρώση στο κυτταρόπλασμα ή /και τον πυρήνα των κυττάρων-στόχων? 2, άμεσα εμφανής καφέ χρώση? και 3, σκούρο καφέ χρώση. Οι βαθμολογίες κλάσμα και η ένταση πολλαπλασιάστηκαν για να δώσουν ένα συνολικό σκορ που κυμαίνεται από 0 έως 9. Οι βαθμολογίες μεταξύ 2 και 9 θεωρείται ως θετική έκφραση. Ανοσοϊστοχημική δοκιμασίες πραγματοποιήθηκαν επίσης σε ιστολογικές τομές παραφίνης σε παραφίνη όγκους ξενομοσχεύματος.

Η χρώση της πολλαπλασιαστικής δείκτη Ki-67 διεξήχθη για να αξιολογηθεί η ανάπτυξη των όγκων ξενομοσχεύματος. Το αντίσωμα Ki-67 (# MA1-80199, αραιωμένο 1: 100) ελήφθη από Thermo Fisher Scientific, Rockford, ΗΠΑ. Ο δείκτης σήμανσης Κϊ-67 (Ki-67 LI) υπολογίστηκε σύμφωνα με τον ακόλουθο τύπο:

Ki-67 LI = αριθμός Ki-67 θετικών κυττάρων /συνολικό αριθμό των κυττάρων του όγκου μετρήθηκαν × 100%

11. Η στατιστική ανάλυση

SPSS 17.0 για Windows (SPSS Inc., Chicago, Ill, USA) χρησιμοποιήθηκε για όλες τις αναλύσεις των δεδομένων. Τα αποτελέσματα ανοσοϊστοχημείας και οι ενώσεις τους με κλινικά χαρακτηριστικά αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας το τεστ chi-square. δοκιμή rank Spearman χρησιμοποιήθηκε για την ανάλυση της συσχέτισης μεταξύ φαινοτύπων πρωτεΐνης. Η μέθοδος Kaplan-Meier χρησιμοποιήθηκε για να αναλυθούν μονοπαραγοντική επιβίωση, και οι συγκρίσεις των κατανομών επιβίωσης μεταξύ των ομάδων πραγματοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας τη δοκιμασία log-rank. Η προγνωστική σημασία της έκφρασης ΟδΚ3β σε σχέση με άλλες παθολογικές μεταβλητές εκτιμήθηκε χρησιμοποιώντας πολυπαραγοντική ανάλυση παλινδρόμησης Cox. Τα ποσοτικά στοιχεία εκφράζονται ως ο μέσος ± S.D. Η στατιστική σημασία των διαφορών μεταξύ των ομάδων προσδιορίσθηκε με μονόδρομη ANOVA που ακολουθείται από PLSD δοκιμή post-hoc Fisher. Όλα

P

τιμές ήταν 2-ουρά, και τις αξίες του

P

& lt? 0,05 θεωρήθηκαν στατιστικά σημαντικές.

Αποτελέσματα

1. ΟδΚ3β ρυθμίζεται αυξητικά σε NSCLC ιστούς όγκου

Αντιπροσωπευτικές εικόνες του ανοσοϊστοχημική χρώση για ΟδΚ3β σε ιστούς NSCLC και τα αντίστοιχα φυσιολογικούς ιστούς φαίνονται στο Σχήμα 1Α. ΟδΚ3β ήταν εμφανώς εκφράζεται σε NSCLC (n = 211), κυρίως στο κυτταρόπλασμα των καρκινικών κυττάρων. Οι συγκρίσεις των επιπέδων πρωτεΐνης ΟδΚ3β μεταξύ του όγκου και των φυσιολογικών ιστών του πνεύμονα φαίνονται στον Πίνακα 1. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι το επίπεδο της ΟδΚ3β ήταν σημαντικά αυξημένη σε ιστούς NSCLC σε σύγκριση με τους φυσιολογικούς ιστούς των πνευμόνων (

P

& lt? 0.001). Δυτική δοκιμασίες αποτύπωση επιβεβαίωσε επίσης ότι το επίπεδο έκφρασης της ΟδΚ3β σε όγκους ήταν υψηλότερη από ότι στην κανονική τους ομολόγους τους. (

P

= 0,04, Σχήμα 1Β).

(Α) Τυπικό χρώση εικόνες IHC του ανθρώπινου όγκου NSCLC και φυσιολογικό ιστό πνεύμονα (μεγέθυνση χ 200). (Β) προσδιορισμούς κηλιδώσεως Western επιβεβαίωσε ότι σε ζεύγη ιστών κανονική /όγκου από ασθενείς με καρκίνο NSCLC, υψηλότερα επίπεδα έκφρασης της ΟδΚ3β σε όγκους αποτελέσματα σε σύγκριση με τα κανονικά αντίστοιχά τους. Τα πειράματα επαναλήφθηκαν 3 φορές, και τα δεδομένα παρουσιάζονται ως μέσος όρος ± SD. *

P

& lt? 0.001. (Γ) Η φωσφορυλιωμένη συνθάσης γλυκογόνου (PGS), ένα υπόστρωμα του ΟδΚ3β, ανιχνεύθηκε σε αυτά τα NSCLC κυτταρικές σειρές, με εξαίρεση H292.

Η

Ως υπόστρωμα του ΟδΚ3β, πρωτεΐνης έκφραση φωσφορυλιωμένου συνθάσης γλυκογόνου (pGS) χρησιμοποιήθηκε για να δείξει την δραστηριότητα της ΟδΚ3β. Σε αυτές τις 4 κυτταρικές σειρές, με εξαίρεση Η292 pGS, ανιχνεύθηκε (Σχήμα 1 C), η οποία πρότεινε υψηλή δραστικότητα του ΟδΚ3β στον ανθρώπινο καρκίνο του πνεύμονα.

2. Θετική έκφραση της ΟδΚ3β σχετίζεται με κακή πρόγνωση για NSCLC

Οι ασθενείς με πλήρη κλινικές πληροφορίες (160 περιπτώσεις, 39 γυναίκες και 121 άνδρες, 61,19 ± 10,53 χρόνια) συμμετείχαν στην ανάλυση επιβίωσης. Η μεσαία ηλικία ήταν 60,00 χρόνια (εύρος, 29 έως 83 ετών). Τα κλινικά χαρακτηριστικά και τα αποτελέσματα ανάλυσης επιβίωσης συνοψίζονται στον πίνακα 2 και στο σχήμα 2. Το ποσοστό επιβίωσης 5 ετών για ολόκληρη την ομάδα ήταν 49,07%, και ο μέσος χρόνος παρακολούθησης ήταν 58,00 μήνες (εύρος 0 έως 77,67 μήνες).

(Α) Σε ολόκληρη την ομάδα, οι ασθενείς με θετική έκφραση της ΟδΚ3β είχαν μικρότερο χρόνο επιβίωσης,

P

= 0.006. Σχήμα 2Β-D δείχνει την ανάλυση επιβίωσης για τις υποομάδες. (Β) Στο κάτω διαφοροποίηση υποομάδας, οι ασθενείς με θετική έκφραση της ΟδΚ3β είχαν σημαντικά μικρότερο χρόνο επιβίωσης,

P

= 0,013. (Γ) Στη Τ1 + Τ2 υποομάδας, οι ασθενείς με θετική έκφραση της ΟδΚ3β είχαν σημαντικά μικρότερους χρόνους επιβίωσης,

P

= 0.003. (Δ) Στην υποομάδα N0 + Ν1, οι ασθενείς με θετική έκφραση της ΟδΚ3β είχαν σημαντικά μικρότερο χρόνο επιβίωσης,

P

= 0,010. (Ε) Οι ασθενείς στην υποομάδα M0 με θετική έκφραση της ΟδΚ3β είχαν σημαντικά μικρότερο χρόνο επιβίωσης,

P

= 0,008. Kaplan-Meier για τις πρωτεΐνες που διερευνήθηκαν χρησιμοποιήθηκαν για να συγκρίνουν το θετικό (

διακεκομμένες γραμμές

) και αρνητικό φαινότυπο (

συμπαγείς γραμμές

).

Η

μονοπαραγοντική ανάλυση διεξήχθη για να εκτιμηθεί η σχέση μεταξύ κλινικά χαρακτηριστικά και την έκφραση της ΟδΚ3β. Όπως φαίνεται στον Πίνακα 2, οι ασθενείς με NSCLC διαφορετικά κλινικά χαρακτηριστικά, όπως το φύλο, η ηλικία, ιστολογικό τύπο και όγκο-κόμβου-μετάσταση (TNM) στάδιο, έδειξε παρόμοια επίπεδα ΟδΚ3β. Η προγνωστική σημασία των θετικών έκφρασης ΟδΚ3β σε διάφορες υποομάδες εκτιμήθηκε χρησιμοποιώντας τη δοκιμασία log rank. Σε ολόκληρη την ομάδα, οι ασθενείς με θετική έκφραση της ΟδΚ3β είχαν μικρότερο χρόνο επιβίωσης (

P

= 0,006, Σχήμα 2Α). Τα αποτελέσματα έδειξαν επίσης ότι το αντρικό φύλο, μεγαλύτερης ηλικίας και καρκίνο εκ πλακωδών κυττάρων (SCC), με θετική έκφραση της ΟδΚ3β συσχετίστηκαν με χειρότερη πρόγνωση (

P

= 0.019,

P

= 0.020 και

P

= 0.002, αντίστοιχα). Επιπλέον, οι ασθενείς με NSCLC με ελάχιστα διαφοροποιημένη όγκους ή στις υποομάδες σχετικά πρώιμο στάδιο (Τ1 + Τ2, N0 + Ν1 και M0) με θετική έκφραση της ΟδΚ3β είχαν σημαντικά μικρότερο χρόνο επιβίωσης (

P

= 0,013,

P

= 0,003,

P

= 0,010 και

P

= 0,008, αντίστοιχα?. φαίνεται στο Σχήμα 2Β-Ε)

Επιπλέον, πολυπαραγοντική ανάλυση παλινδρόμησης Cox αποκάλυψε ότι , σε αυτή την ομάδα, το μέγεθος του όγκου, των λεμφαδένων εισβολή και την έκφραση της ΟδΚ3β ήταν ανεξάρτητοι προγνωστικοί παράγοντες του NSCLC πρόγνωση. Αυτά τα αποτελέσματα πρότειναν ότι η ΟδΚ3β παίζει σημαντικό ρόλο στην ογκογένεση NSCLC και προκάλεσε περαιτέρω ανάλυση.

3. ΟδΚ3β ρυθμίζει θετικά πολλαπλασιασμό των καρκινικών κυττάρων και την επιβίωση σε NSCLC

Ένα λεντοϊού φορέας χρησιμοποιήθηκε για τη μεταφορά σχεδιαστεί Τα siRNAs που στοχεύουν ΟδΚ3β σε αυτές τις 4 κυτταρικές σειρές NSCLC να επίμονα σίγαση της έκφρασης του. Τα αποτελέσματα του RNA παρεμβολής αξιολογήθηκαν με RT-PCR (5 ημέρες μετά τη διαμόλυνση) και κηλίδωση Western (7 ημέρες μετά την επιμόλυνση). Αυτά τα αποτελέσματα κατέδειξαν ότι τα επίπεδα του RNA και της πρωτεΐνης του ΟδΚ3β σε καρκινικά κύτταρα από όλα τα 4 κυτταρικές σειρές που εξετάστηκαν ήταν σημαντικά μειωμένες, όπως φαίνεται στο Σχήμα 3Α-Β (όλα

P

& lt? 0.001). Επιπλέον, οι ιστοί ξενομοσχεύματα που απομονώθηκαν από γυμνούς ποντικούς ήταν ανοσοϊστοχημικά χρωματισμένο, και τα αποτελέσματα επαλήθευσαν την παρατεταμένη σταθερή μείωση στα επίπεδα της ΟδΚ3β μετά παρεμβολή RNA (Σχήμα 3C). Αυτά τα αποτελέσματα έδειξαν ότι η ΟδΚ3β ήταν αποτελεσματικά και σταθερά γκρέμισε από την shRNA σε όλες τις 4 κυτταρικές σειρές NSCLC.

(Α) της ΟδΚ3β ειδικό Τα siRNAs διαμολύνθηκαν σε κύτταρα NSCLC με βραδέος ιού φορέα, και τα κύτταρα συλλέχθηκαν και μετρήθηκαν 5 ημέρες μετά την επιμόλυνση. Real-time PCR έδειξε ότι υπάρχουν παρεμβολές από shRNA αποτελεσματικά γκρέμισε την έκφραση του mRNA της ΟδΚ3β στα κύτταρα NSCLC. (Β) Τα κύτταρα συλλέχθηκαν και μετρήθηκαν 7 ημέρες μετά την επιμόλυνση. στυπώματος Western δείχνει την αποτελεσματικότητα της πρωτεΐνης σιγαστήρα με shRNA. (Γ) Μετά την επεξεργασία με το GSK3 shRNA (ομάδα Κο), ο αρνητικός έλεγχος shRNA (ομάδα NC) ή φυσιολογικού ορού (ομάδα CON), τα κύτταρα Α549 (1 × 10

6 /ml) εγχύθηκαν μέσα στις πλάτες των γυμνούς ποντικούς. Τέσσερις εβδομάδες αργότερα, ξενομοσχεύματος όγκοι απομονώθηκαν και ανοσοϊστοχημική χρώση. Τα αποτελέσματα επαληθεύονται οι υπέστη μειωμένα επίπεδα της ΟδΚ3β στην ομάδα KD σε σχέση με τις ομάδες ελέγχου. Τα βέλη υποδεικνύουν θετική χρώση στο κυτταρόπλασμα των καρκινικών κυττάρων (μεγέθυνση χ 400). Τα πειράματα επαναλήφθηκαν 3 φορές, και τα δεδομένα εκφράζονται ως μέσος όρος ± SD. *

P

& lt?. 0.001

Η

Ο προσδιορισμός CCK-8 κατέδειξε ότι η εξουδετέρωση της ΟδΚ3β κατέστειλε σαφώς τη βιωσιμότητα όλων των κυτταρικών σειρών 4 (όλα

P

& lt? 0.001, Εικόνα 4Α). Στην

in vivo

μελέτη χρησιμοποιώντας ξενομοσχεύματος ποντίκια, οι όγκοι στην ομάδα KD αυξήθηκαν σημαντικά πιο αργά και είχαν χαμηλότερους όγκους των όγκων σε όλη τη διάρκεια 4 εβδομάδων (

P

= 0.001, Εικόνα 4Β ). Στο τέλος της περιόδου παρατήρησης, τα βάρη των ξενομοσχευμάτων στην ομάδα KD ήταν πολύ χαμηλότερες από εκείνες για τις ομάδες ελέγχου (

P

= 0,001, Σχήμα 4C). Επιπλέον, το Ki-67 LI των ξενομοσχευμάτων ήταν δραματικά μειωμένη στην ομάδα KD σε σύγκριση με εκείνες των ομάδων NC και CON (38,98% έναντι 75,14% έναντι 73,84%,

P

& lt? 0.001, Εικόνα 4D), η οποία έδειξε ότι η προς τα κάτω ρύθμιση της ΟδΚ3β ανέστειλε τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων

in vivo

. Αυτά τα αποτελέσματα υποδεικνύουν ότι η ΟδΚ3β ρυθμίζει θετικά την ανάπτυξη και την ογκογένεση των κυττάρων NSCLC, και είμαστε δίπλα προσπάθησε να αντιμετωπίσει το πώς έγιναν με τη μεσολάβηση αυτές οι επιδράσεις.

(Α) Η δοκιμή CCK-8 έδειξαν ότι η αναστολή της ΟδΚ3β κατέστειλε τον πολλαπλασιασμό από τις κυτταρικές σειρές NSCLC

in vitro

. *

P

& lt? 0.001. (Β)

In vivo

: Όπως περιγράφεται στο Σχήμα 3C, τα μοντέλα ξενομοσχεύματος αναπτύχθηκαν σε γυμνούς ποντικούς. Κάθε ομάδα αποτελείτο από 6 ζώα. Παρατηρήθηκαν όγκοι κάθε 3 ημέρες για 4 εβδομάδες. Οι όγκοι ξενομοσχεύματος των ποντικών στην ομάδα KD αυξήθηκαν σημαντικά βραδύτερη (όπως καθορίζεται από τον όγκο του όγκου) για ολόκληρη την περίοδο παρατήρησης. *

P

& lt? 0.001. (Γ) Σύγκριση των απομονωμένων όγκων ξενομοσχεύματος. Η εικόνα δείχνει ότι οι όγκοι που απομονώθηκε από την ομάδα KD ήταν μικρότερα και ελαφρύτερα από τους όγκους από την ομάδα ελέγχου. Τα δεδομένα εκφράζονται ως το μέσο ± SD, η = 6. *

P

& lt? 0.001. (D) Αντιπροσωπευτική εικόνα του Ki-67 IHC ενός ξενομοσχεύματος όγκου δει κάτω από ένα μικροσκόπιο. Για τον υπολογισμό της Ki-67 LI, κύτταρα με καφέ-βάφονται πυρήνες θεωρήθηκαν θετικά, υποδεικνύοντας ενεργό πολλαπλασιασμό (μεγέθυνση χ 400). Τα δεδομένα εκφράζονται ως το μέσο ± SD, *

P

& lt? 0.001. ανάλυση (Ε) του κυτταρικού κύκλου σε 72 ώρες μετά την επιμόλυνση. Τα αποτελέσματα δείχνουν ότι η αναστολή της ΟδΚ3β οδήγησε σε G1 /S σύλληψης σε Α549 και SK-MES-1 κύτταρα και άλλαξε τις αναλογίες του κυτταρικού πληθυσμού σε διαφορετικές φάσεις του κυτταρικού κύκλου. Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως το μέσο ± S.D. από 3 ανεξάρτητα πειράματα πραγματοποιήθηκαν εις τριπλούν. *

P

& lt? 0.001. (F) με κυτταρομετρία ροής, τα αποπτωτικά αποτελέσματα της ανάλυσης έδειξαν ότι η αναστολή της ΟδΚ3β αύξησε σημαντικά την αποπτωτική ποσοστό των κυττάρων NSCLC (εκτός από κύτταρα Α549)

in vitro

. *

P

& lt? 0.001, ▴

P

& gt? 0,05. (G) Τα αποτελέσματα της δοκιμασίας TUNEL για όγκους ξενομοσχεύματος προτείνει ότι η αναστολή της ΟδΚ3β αύξησε την αποπτωτική ποσοστό των κυττάρων Α549

in vivo

(μεγέθυνση χ 400). Τα δεδομένα εκφράζονται ως το μέσο ± SD, *

P

& lt? 0.001. δοκιμασίες (H) Transwell που δείχνει ότι η αναστολή της ΟδΚ3β

in vitro

μείωσε σημαντικά την ικανότητα εισβολής των κυττάρων NSCLC. Τα δεδομένα εκφράζονται ως το μέσο ± S.D. *

P

& lt?. 0.001

Η

Μετά την εκτέλεση η ανάλυση του κυτταρικού κύκλου με κυτταρομετρία ροής, βρήκαμε ότι η αναστολή της ΟδΚ3β αύξησε τον αριθμό των κυττάρων σε G0 /G1 φάση και μείωσε τον αριθμό των κυττάρων στη φάση S σε Α549 (

P

= 0.003, και

P

& lt? 0.001) και SK-MES-1 κύτταρα (

P

= 0.002,

P

= 0,022) (Εικόνα 4Ε). Σε Η1299 και Η292 κύτταρα, ΟδΚ3β knockdown είχε ως αποτέλεσμα μια τάση προς την αύξηση του πληθυσμού G0 /G1, αλλά οι διαφορές δεν ήταν στατιστικά σημαντική (σε Η1299 κύτταρα,

P

= 0,056? Και σε κύτταρα Η292,

P

= 0,216).

In vitro

, η δοκιμασία κυτταρικής απόπτωσης πρότεινε ότι τα αποπτωτικά ποσοστά στην ομάδα KD ήταν σημαντικά υψηλότερες από αυτές στις ομάδες ελέγχου, με η εξαίρεση της Α549 κυτταρικής σειράς (Η292, Η1299 και SK-MES-1, όλα τα

P & lt?

0.001? Α549,

P

= 0.461, Εικόνα 4F). Για τους ποντικούς ξενομοσχεύματος, η δοκιμασία TUNEL αποκάλυψε ότι η αποπτωτική ποσοστό στην ομάδα KD (3,06% ± 1,24%) ήταν πολύ υψηλότερη από εκείνες των άλλων ομάδων (ομάδα NC, 0,11% ± 0,04%? Και ομάδα CON, 0,46% ± 0,23%) (

P

& lt? 0.001). Όπως φαίνεται στο Σχήμα 4G, αποπτωτικά κύτταρα βάφτηκαν κόκκινα και συρρικνωμένο. Μαζί, αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι η αναστολή της ΟδΚ3β που επάγεται NSCLC απόπτωση των κυττάρων.

4. Η αναστολή της ΟδΚ3β μειώνει την ικανότητα εισβολής των κυττάρων NSCLC

Για να μετρήσει τα κύτταρα τα οποία μετανάστευσαν

in vitro

, η δοκιμασία φρεατίων χρησιμοποιώντας κύτταρα NSCLC επαναλήφθηκε 3 φορές, και τα αποτελέσματα παρουσιάζονται στο Σχήμα 4Η. Για όλες τις κυτταρικές σειρές 4, η ομάδα KD έδειξαν σημαντικά λιγότερα επεμβατικές κυττάρων (όλα

P & lt?

0,001), η οποία πρότεινε ότι η αναστολή της ΟδΚ3β κατέστειλε σημαντικά την ικανότητα εισβολής των κυττάρων NSCLC. Στα ξενομόσχευμα ποντικούς, δεν μεταστάσεις βρέθηκαν κατά ακαθάριστο εξέταση και ψηλάφηση. Επιπλέον, το φως ανάλυση μικροσκοπία απεκάλυψε καμία ένδειξη μεταστατικών εστιών στα σταθερά και χρωματίστηκαν οργάνων.

Έκφραση

5.β-κατενίνης μετά την αναστολή της ΟδΚ3β

Όπως φαίνεται στο Σχήμα 5, η έκφραση επίπεδο του β-κατενίνης ήταν σημαντικά αυξημένη στην ομάδα KD του πλακώδους κυττάρου γραμμής SK-MES (

P

& lt? 0.001). Επιπλέον, knockdown του ΟδΚ3β κατέστειλε σημαντικά την έκφραση του β-κατενίνης σε Η1299 κύτταρα (

P

& lt? 0.001), αλλά όχι σε Η292 (

P

= 0.108) ή Α549 κύτταρα (

P

= 0,185).

(Α) Τυπικό ζώνες στην δοκιμασία κηλίδος Western κατέδειξε ότι τα επίπεδα της πρωτεΐνης β-κατενίνης ρυθμίζονταν με ειδικό τρόπο τύπο κυττάρου μετά την αναστολή της ΟδΚ3β. (Β) Ποσοτική ανάλυση της έκφρασης β-κατενίνης. Το πείραμα επαναλήφθηκε 3 φορές, και τα δεδομένα εκφράζονται ως μέσο ± SD. *

P

& lt?. 0.001

Η

Συζήτηση

ΟδΚ3β αρχικά αναγνωρίστηκε ως μείζον ρυθμιστικό ένζυμο του μεταβολισμού του γλυκογόνου [4], [7]. Από τότε, αυτή η πρωτεΐνη έχει βρεθεί ότι είναι ένας σημαντικός ρυθμιστής της κυτταρικής επιβίωσης και της απόπτωσης, το οποίο συνδέει αυτήν την πολυλειτουργική κινάσης σε καρκίνο [25], [26]. Πρόσφατα, ένας αριθμός από μελέτες έχουν δείξει ότι η ΟδΚ3β μπορεί να ρυθμίσει θετικά τον πολλαπλασιασμό και την απόπτωση των καρκινικών κυττάρων [10] – [18], αν και ο ακριβής ρόλος της ΟδΚ3β στον καρκίνο του πνεύμονα παραμένει άγνωστος. Ως εκ τούτου, η παρούσα μελέτη διερεύνησε την προγνωστική σημασία της ΟδΚ3β και τη λειτουργία του σε NSCLC.

Πρώτον, η υπερέκφραση της ΟδΚ3β σε ιστούς NSCLC παρατηρήθηκε κατά τη σύγκριση των NSCLC ιστούς με παρακείμενες φυσιολογικούς ιστούς, και αυτό παρεκκλίνουσα συσσώρευση ΟδΚ3β σε κύτταρα NSCLC σχετίστηκε με βραχύτερο χρόνο επιβίωσης και ταυτοποιήθηκε ως ένα νέο παράγοντα κινδύνου για κακή πρόγνωση. Παρά το γεγονός ότι έχει δοθεί λίγη προσοχή στην έκφραση της ΟδΚ3β στον καρκίνο του πνεύμονα, τα στοιχεία δείχνουν ότι η υπερέκφραση της ρ-ΟδΚ3β μπορεί να χρησιμεύσει ως δείκτης για χειρότερη πρόγνωση στον καρκίνο του πνεύμονα [27]. Επειδή π-ΟδΚ3β είναι η αδρανής μορφή του ΟδΚ3β, η υπερέκφραση του ρ-ΟδΚ3β δεν είναι απαραίτητα ισοδύναμο με την απώλεια της ΟδΚ3β, ιδιαίτερα όταν το συνολικό επίπεδο πρωτεΐνης είναι επίσης αυξητικά σε μεγάλο βαθμό. Στη μελέτη μας, η υψηλή έκφραση των PGs, το οποίο είναι ένας δείκτης της δραστηριότητας της ΟδΚ3β, ανιχνεύθηκε σε περισσότερα από κυτταρικές σειρές NSCLC, υποδεικνύοντας ότι η ΟδΚ3β είναι εξαιρετικά δραστική σε κύτταρα NSCLC. Ως εκ τούτου, η μελέτη μας πρότεινε ότι η υπερέκφραση του συνολικού ΟδΚ3β ήταν πάνω-ενεργοποιηθεί και ανατίθενται κακή πρόγνωση σε ασθενείς με NSCLC. Παρόμοια αποτελέσματα έχουν αναφερθεί για τον καρκίνο της ουροδόχου κύστης [18]. Ως εκ τούτου, ΟδΚ3β υπερέκφραση μπορεί να χρησιμεύσει ως βιοδείκτη για τη βελτίωση της πρώιμης διάγνωσης, η επιλογή των ασθενών και τον καθορισμό της πρόγνωσης.

addtion, τα αποτελέσματά μας έδειξαν ότι η IHC ΟδΚ3β εντοπίζεται κυρίως στο κυτταρόπλασμα σε ιστούς του ασθενούς και ξενομοσχεύματος όγκου. Αντίθετα, πολλές μελέτες απέδειξαν ότι η ΟδΚ3β συσσωρεύτηκε στον πυρήνα σε παγκρεατικά [11], νεφρικούς καρκίνους [28] και της ουροδόχου κύστης [18]. Σε αυτούς τους ιστούς όγκων, την πυρηνική ΟδΚ3β θα μπορούσαν να παίζουν ένα ρόλο στην ΝΡ-κΒ με τη μεσολάβηση της κυτταρικής επιβίωσης καρκίνο? Ωστόσο, μετά από knockdown ΟδΚ3β, τα επίπεδα έκφρασης ΝΡ-κΒ στα διάφορα NSCLC κυτταρικές σειρές της μελέτης μας ήταν ασυνεπής, υποδεικνύοντας ότι η ΟδΚ3β μπορεί να προκαλεί επιβίωση των καρκινικών κυττάρων ανεξάρτητη της έκφρασης ΝΡκΒ (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Ως εκ τούτου, υποκυτταρική εντόπιση του ΟδΚ3β είναι πολύπλοκη και σφιχτά σχετικά με το μοριακό μηχανισμό του. Περαιτέρω μελέτη σχετικά με τον υποκυτταρικό εντοπισμό του ρόλου της ΟδΚ3β πρέπει να διεξαχθεί.

Το επόμενο σημαντικό ερώτημα είναι πώς να εξηγήσει την έντονη επιρροή της ΟδΚ3β για την πρόγνωση του NSCLC ασθενούς. Αυτή η μελέτη επιχείρησε να διερευνήσει τις βασικές μοριακούς μηχανισμούς της ΟδΚ3β

in vitro

και

in vivo

. Έχει καθιερωθεί ότι η ΟδΚ3β παίζει κεντρικό ρόλο στη ρύθμιση της απόπτωσης [26]. Για παράδειγμα, η ΟδΚ3β νοκ-άουτ ή θεραπεία με λίθιο ενισχύει την απόπτωση σε ηπατοκύτταρα [29], και ένα αυξημένο ρυθμό απόπτωσης μετά την αναστολή της ΟδΚ3β έχει αναφερθεί στον καρκίνο του προστάτη [30], του καρκίνου του παγκρέατος [11], λευχαιμία [13], γλοίωμα [ ,,,0],17] και καρκίνου της ουροδόχου κύστης [18].