Αφηρημένο

Λόγω των σημαντικών ρόλων των miRNA στη μετα-μεταγραφική ρύθμιση και τις συνέπειές της για τον καρκίνο, ο χαρακτηρισμός των miRNA διευκολύνει εμάς να αποκαλύψει μοριακών μηχανισμών που διέπουν την εξέλιξη των ανδρογόνων-ανεξάρτητο καρκίνο του προστάτη (PCA). Η εμφάνιση των τεχνολογιών αλληλούχισης επόμενης γενιάς έχει αλλάξει δραματικά την ταχύτητα όλων των πτυχών της αλληλουχίας σε μια γρήγορη και οικονομικώς αποδοτική τη μόδα, το οποίο μπορεί να επιτρέψει μια αμερόληπτη, ποσοτικές και σε βάθος διερεύνηση των μικρών RNA μεταγραφικό. Σε αυτή τη μελέτη, χρησιμοποιήσαμε υψηλής απόδοσης Illumina αλληλουχίας να αντιπροσωπεύουν συνολικά το πλήρες συμπλήρωμα των μεμονωμένων μικρών RNA και να χαρακτηρίσει τα προφίλ έκφρασης miRNA τόσο στην ανδρογόνων που εξαρτώνται και ανεξάρτητη κυτταρική σειρά ΣΕΣΣ. Τουλάχιστον 83 miRNAs είναι σημαντικά εκφράζονται διαφορικά, εκ των οποίων 41 ρυθμίζονται up-και 42 ρυθμίζονται προς τα κάτω, δείχνοντας αυτά τα miRNAs μπορεί να εμπλέκεται κατά τη μετάβαση του LNCaP σε ανδρογόνα ανεξάρτητο φαινότυπο. Επιπλέον, έχουμε εντοπίσει 43 μυθιστόρημα miRNAs από την εξαρτώμενη από ανδρογόνα και ανεξάρτητη βιβλιοθήκη του προστάτη και 3 από αυτά είναι ειδικά για το ανδρογόνο-ανεξάρτητες ΣΕΣΣ. Λειτουργία σχολιασμός των γονιδίων στόχων έδειξε ότι τα περισσότερα από αυτά τα διαφορικά εκφρασμένων miRNAs τείνουν να στοχεύσετε γονίδια που εμπλέκονται στη μεταγωγή σήματος και την επικοινωνία των κυττάρων, epically το σηματοδοτικό μονοπάτι ΜΑΡΚ. Τα μικρά RNA transcriptomes λαμβάνονται σε αυτή τη μελέτη παρέχει σημαντικές γνώσεις για την καλύτερη κατανόηση της έκφρασης και της λειτουργίας των μικρών RNAs στην ανάπτυξη μη εξαρτώμενου από ανδρογόνα καρκίνου του προστάτη

Παράθεση:. Xu G, Wu J, Zhou L, Chen Β, Sun Ζ, Zhao F, et al. (2010) Χαρακτηρισμός των Μικρών RNA Transcriptomes των ανδρογόνων εξαρτημένων και ανεξάρτητων καρκίνου του προστάτη κυτταρική γραμμή από Deep αλληλουχίας. PLoS ONE 5 (11): e15519. doi: 10.1371 /journal.pone.0015519

Επιμέλεια: Patrick Ling, Queensland University of Technology, Αυστραλία

Ελήφθη: 1 Αυγ 2010? Αποδεκτές: 6 Οκτώβρη, 2010? Δημοσιεύθηκε: 30 Νοεμβρίου, 2010

Copyright: © 2010 Xu et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από το Ίδρυμα Zhejiang Provincial Φυσικών Επιστημών της Κίνας (Αρ Y2100902), Wenzhou Επιστήμης και Τεχνολογίας του έργου (Y20100011), Zhejiang Provincial Επιστήμης και Τεχνολογίας Πλατφόρμα Ανάλυση και Έλεγχος Τεχνολογία Έργα (2009F82G2090045) και το Εθνικό υψηλής Τεχνολογίας Έρευνας και Ανάπτυξης Πρόγραμμα Κίνα (2006AA02A304). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

ο καρκίνος του προστάτη (PCA) είναι η πιο συχνή κακοήθεια του ανδρικού ουρογεννητικού συστήματος και η τρίτη κύρια αιτία θανάτου από καρκίνο [1], [2]. Καθώς η ανάπτυξη του προστάτη εξαρτάται αρχικά σε ανδρογόνα για την επιβίωση, θεραπεία στέρησης ανδρογόνων (ADT) υπήρξε ο στυλοβάτης της θεραπείας για την PCA. Ωστόσο, αυτοί οι όγκοι θα προχωρήσει τελικά σε έναν ανεξάρτητο από ανδρογόνο φαινότυπο και αδυνατούν να ανταποκριθούν στις ADT θεραπεία, που γίνεται το κύριο εμπόδιο της κλινικής θεραπείας. Η κατανόηση των μοριακών μηχανισμών που διέπουν την εξέλιξη των ανδρογόνων-ανεξάρτητο ΣΕΣΣ θα ρίξει σημαντικά τα φώτα για πιθανές στρατηγικές θεραπείας για την PCA. miRNAs (microRNAs) είναι μικρά, μη-κωδικοποίησης RNA (~20-22 νουκλεοτίδια) που ρυθμίζουν αρνητικά την έκφραση των γονιδίων σε μετα-μεταγραφικό επίπεδο [3]. Συσσωρευμένα αποδείξεις δείχνουν ότι miRNAs μπορεί να λειτουργήσει ως καταστολείς όγκων και ογκογονίδια [4], [5]. Λόγω των σημαντικών ρόλων των miRNAs στην μετα-μεταγραφική ρύθμιση, αναγνώριση αυτών των διαφορικά εκφρασμένων και τα νέα miRNAs θα μας διευκολύνουν να αποκαλύψει τις μοριακών μηχανισμών που διέπουν την εξέλιξη των ανδρογόνων-ανεξάρτητο καρκίνο του προστάτη.

Για να χαρακτηρίζουν το μικρό μεταγραφικό RNA , οι νέες τεχνολογίες «βαθιά αλληλουχίας», όπως Roche 454 και Illumina Solexa, έχουν χρησιμοποιηθεί τα οποία έχουν σημαντικά πλεονεκτήματα έναντι των προηγούμενων μεθόδων υβριδισμού που βασίζεται, όπως μικροσυστοιχιών και προσδιορισμούς που βασίζονται σε PCR [6], [7]. Πρώτον, παρέχει μια πιο ολοκληρωμένη άποψη της μεταγραφικό miRNAs. αλληλουχίας υψηλής απόδοσης έχει τη δυνατότητα να εντοπίσει μέτρια ή ακόμα και χαμηλή αφθονία miRNAs εμφανίζουν διαφορές έκφρασης μεταξύ διακριτών δειγμάτων, σε βαθμό που στο παρελθόν δεν μπορούσε να ανιχνευθεί αποτελεσματικά. Δεύτερον, η άμεση αλληλούχιση προσφέρει επίσης τη δυνατότητα να ανιχνεύει την μεταβολή μήκους των ώριμων miRNA και πιθανή ενζυματικές τροποποιήσεις. Τρίτον, ο προσδιορισμός αλληλουχίας υψηλής διεκπεραιωτικότητας επιτρέπει την επιτυχή ανακάλυψη νέων miRNAs, τα οποία δεν χρειάζεται να επικαλεστεί επερώτηση υποψήφιος περιοχές του γονιδιώματος αλλά μάλλον μπορεί να επιτευχθεί με άμεση παρατήρηση και την επικύρωση της αναδίπλωσης δυναμικό της πλευρικής γονιδιωματικής αλληλουχίας. Στο σύνολό τους, οι τεχνολογίες αλληλουχίας επόμενης γενιάς προσφέρουν μια ιδιαίτερα ισχυρή, ακριβή και επεκτάσιμο σύστημα που θέτει νέα πρότυπα για την ταχεία, παραγωγικά και οικονομικά αποτελεσματική διερεύνηση των miRNA μεταγραφικό.

Μέχρι τώρα, υπάρχουν έξι γονιδιώματος σε επίπεδο μελέτες έκφρασης miRNA στον καρκίνο του προστάτη, όπως αναθεωρούνται από Gandellini et al. [8]. Η πρώτη miRNA προφίλ έκφρασης του καρκίνου του προστάτη διεξήχθη με Lu και οι συνεργάτες του [5], στην οποία χρησιμοποιείται ένα σφαιρίδιο με βάση την τεχνική κυτταρομετρικής ροής για την αξιολόγηση της προφίλ miRNA σε διαφορετικούς τύπους όγκων. Τα υπόλοιπα πέντε μελέτες που εφαρμόζεται μικροσυστοιχιών ή μέθοδο υβριδισμού χάντρα για τη διερεύνηση υπογραφές έκφραση miRNA στον καρκίνο του προστάτη σε σύγκριση με το φυσιολογικό ιστό, και προσδιόρισε μια σειρά από ανώμαλης εκφράζεται miRNAs σε καρκινικά κύτταρα. Ωστόσο, αυτές οι μελέτες επικεντρώθηκαν μόνο στη σύγκριση των προφίλ έκφρασης miRNA μεταξύ δειγμάτων PCa και τους περιβάλλοντες ιστούς μη-όγκου, ενώ δεν αποκαλύπτει τι είδους miRNA θα μπορούσε να συσχετιστεί με τη μετάβαση από ανδρογόνο ευαίσθητο σε ανδρογόνο ανεξάρτητος στον καρκίνο του προστάτη. Πιο πρόσφατα, η Sun et al. Διαπιστώθηκε ότι πολλές miRNAs, ιδίως miR-221 και miR-222, ήταν σημαντικά υπερ-εκφράζεται σε μη εξαρτώμενου από ανδρογόνα καρκίνου του προστάτη κύτταρα σε σύγκριση με εκείνους στην κυτταρική σειρά ανδρογόνο-εξαρτώμενη, και συνεπάγεται την εμπλοκή και των δύο miRNAs στην ανάπτυξη και την πρόοδο της ανδρογόνο ανεξαρτησία του καρκίνου του προστάτη [9]. Devere White et al. (2009) εντόπισε ένα μικρό σύνολο των miRNAs ήταν έκτροπα που εκφράζονται σε ανδρογόνο-ανεξάρτητες κυτταρικές σειρές προστάτη με τη χρήση της τεχνολογίας των μικροσυστοιχιών [10]. Μια λεπτομερής σύγκριση των προφίλ έκφρασης miRNA μεταξύ των εξαρτώμενων από ανδρογόνα και μη εξαρτώμενου από ανδρογόνα καρκίνων μπορεί να αποκαλύψει το πώς η οδός miRNA εμπλέκεται στην εξέλιξη του καρκίνου του προστάτη σε ανδρογόνο ανεξαρτησία. Χρησιμοποιώντας την αλληλούχιση επόμενης γενιάς, έχουμε λάβει υπογραφές έκφραση miRNA σε ανδρογόνα ανεξάρτητο καρκίνο του προστάτη και αναγνωρίστηκαν 83 miRNAs εκφράζονται διαφορικά σε κυτταρικές γραμμές LNCaP-ΑΙ, καθώς και υποτιθέμενο στόχοι για αυτά τα miRNAs. Απ ‘όσο γνωρίζουμε, αυτή η μελέτη αντιπροσωπεύει το πρώτο παράδειγμα των μικρών RNA μεταγραφικό με αλληλούχιση υψηλής διεκπεραιωτικότητας στον καρκίνο του προστάτη και έχει αποδείξει ότι η βαθιά αλληλούχιση μπορεί να χρησιμεύσει ως ένα ιδανικό, ταχεία και αποδοτική πλατφόρμα για το χαρακτηρισμό των μικρών προφίλ έκφρασης RNA.

Υλικά και Μέθοδοι

Cell Culture

Η LNCaP κυτταρική σειρά ανδρογόνο-εξαρτώμενη ελήφθη από την American Type Culture Collection (Rockville, MD) και συνήθως διατηρείται σε ένα κανονικό μέσο: ερυθρό φαινόλης-θετικά F-12 μέσο (Gibco) με 10% FBS (Biowest) στους 37 ° C σε 5% CO

2. Τα κύτταρα τράφηκαν δύο φορές την εβδομάδα και χωρίζονται μία φορά την εβδομάδα με θρυψινοποίηση (που ορίζεται ως ένα πέρασμα). Για τη δημιουργία ενός ανεξάρτητου από ανδρογόνα κυτταρική γραμμή, LNCaP διατηρήθηκε πρώτα σε άνευ ερυθρού φαινόλης DMEM /F-12 μέσο (Gibco) με 10% ξυλάνθρακα /δεξτράνης FBS επεξεργασμένο (Biowest). Μετά από καλλιέργεια για 5 εβδομάδες, τα κύτταρα μεταφέρθηκαν στο παραπάνω μέσο με 1.0 × 10

-7 mol /L φλουταμίδη (Schering Plough) και καλλιεργήθηκαν για άλλες 105 περάσματα.

δοκιμασία πολλαπλασιασμού κυττάρων

τα κύτταρα σπάρθηκαν σε πυκνότητα 3 × 10

3 κύτταρα /φρεάτιο σε μια πλάκα καλλιέργειας 96-φρεατίων σε 90 μΙ κανονικά μέσα. Μετά από 24 ώρες επώασης στους 37 ° C σε 5% CO

2, το μέσο καλλιέργειας αλλάχθηκε με ένα δεύτερο από τα φρεάτια που λαμβάνουν κανονικό μέσο και ένα δεύτερο λήψη ανδρογόνου μέσο ελεύθερο (ελεύθερο ερυθρού φαινόλης μέσο με 5.0 × 10

-6 mol /L φλουταμίδη). Τα κύτταρα επωάστηκαν σε 5% CO

2 στους 37 ° C για 72 ώρες, 10 μΙ του CCK-8 διάλυμα (Dojindo) προστέθηκαν σε κάθε φρεάτιο, και ακολούθησε επώαση για 3 ώρες στους 37 ° C, και η απορρόφηση τελικά προσδιορίστηκε στα 450 nm χρησιμοποιώντας αναγνώστη μικροπλάκας (Bio-Rad).

κηλίδωση Western πραγματοποιήθηκε με τις μεθόδους που περιγράφηκαν προηγουμένως [11]. Τα ακόλουθα αντισώματα χρησιμοποιήθηκαν: κουνελιού αντι-ΒοΙ-2 (1:200, Cell Signaling), κουνελιού αντι-Βαχ (1:100, Cell Signaling) και αντι-β-ακτίνης ποντικού (1:1000, Cell Signaling)

Δοκιμασία Κυτταρικού Κύκλου

τα κύτταρα αιωρήθηκαν σε άνευ ορμόνης και κανονικό μέσο, ​​αντίστοιχα, και στη συνέχεια φυτεύονται σε τρεις 24-φρεατίων με μια σειρά από 3,3 × 10

5 κύτταρα ανά Λοιπόν. Μετά από επώαση σε 5% CO

2 στους 37 ° C για 24 ώρες, φλουταμίδη προστέθηκε στις οπές. Τα κύτταρα συλλέχθηκαν μετά από επώαση σε 5% CO

2 στους 37 ° C για 72 ώρες. Η διαδικασία προεπεξεργασίας της ανάλυσης του κυτταρικού κύκλου ακολουθούσε τις οδηγίες του κύκλου δοκιμής

plusDNA αντιδραστηρίου Kit (Becton Dickinson). Η ανάλυση κυτταρικού κύκλου εκτελέσθηκε χρησιμοποιώντας ένα κυτταρόμετρο ροής ΡΑΟδοβη (BD Εταιρεία)

Real-time RT-PCR

Μικρές RNAs (& lt? 200 nt). απομονώθηκαν με

mirVana

™ Kit PARIS ™ (Ambion) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Για τις αντιδράσεις RT, 1 μg μικρών RNA χρησιμοποιήθηκε για ανάστροφη μεταγραφή με miScript Reverse Transcription Kit (Qiagen), που εκτελούνται σε 37 ° C για 60 λεπτά και μια τελική επώαση στους 95 ° C για 5 λεπτά. MiRNA πραγματικού χρόνου RT-PCR πραγματοποιήθηκε με χρήση του κιτ miScript SYBR Green PCR (Qiagen) σε ένα Applied Biosystems 7000 πραγματικού χρόνου PCR μηχάνημα (ΑΒΙ). Η αντίδραση PCR διεξήχθη στους 95 ° C για 15 λεπτά, ακολουθούμενη από 40 κύκλους επώασης στους 94 ° C για 15 s, 55 ° C για 30 s, και 70 ° C για 30 s. Κάθε PCR επαναλήφθηκε τουλάχιστον τρεις φορές. Το σχετικό επίπεδο έκφρασης του κάθε miRNA ομαλοποιήθηκε με την κατά επίπεδα U6 snRNA. Διπλώστε-αλλαγή αυτή υπολογίζεται σύμφωνα με την 2

-ΔΔCt μέθοδο.

Μικρές RNA Βιβλιοθήκη κατασκευής και υψηλής απόδοσης αλληλουχίας

Το απομονωμένο συνολικό RNA κλασματώθηκε κατά μέγεθος επί ενός τρις ​​15% -borate-EDTA (ΤΒΕ) γέλη πολυακρυλαμιδίου ουρίας να εμπλουτίσει για μόρια 15-30 nt. Το μικρό RNA συνδέθηκε με 3 ‘(5′-pUCGUAUGCCGUCUUCUGCUUGidT-3’) και 5 ‘(5′-GUUCAGAGUUCUACAGUCCGACGAUC-3′) προσαρμογείς χρησιμοποιώντας Τ4 RNA λιγάση και ήταν και πάλι κλασματώθηκε κατά μέγεθος επί ενός ΤΒΕ ουρία πήγμα πολυακρυλαμίδης 15%. Το προκύπτον RNA ήταν αντίστροφα μεταγράφηκε σε cDNA με μικρές Solexa του RNA RT-Primer (5’-CAAGCAGAAGACGGCATACGA-3 ‘). Το cDNA χρησιμοποιήθηκε ως μήτρα για την PCR ενίσχυση χρησιμοποιώντας μικρό σετ εκκινητών RNA Solexa του (5’-CAAGCAGAAGACGGCATACGA-3 ‘? 5′-AATGATACGGCGACCACCGACAGGTTCAGAGTTCTACAGTCCGA-3’). Τέλος, περίπου 20 μg των μικρών RNA χρησιμοποιήθηκαν για την ανάλυση αλληλουχίας χρησιμοποιώντας Illumina 1 G Γονιδίωμα Analyzer σύμφωνα με τα πρωτόκολλα του κατασκευαστή.

Διαβάστε Φίλτρο και Small RNA σχολιασμού

Για βαθέων αλληλούχιση διαβάζει παράγεται από Illumina γονιδιώματος Analyzer, χαμηλής ποιότητας διαβάζει φιλτραρίστηκαν για να αποκλείσει εκείνους που είναι πιθανότερο να αντιπροσωπεύουν τα σφάλματα αλληλουχίας και 3/5 ‘αλληλουχιών προσαρμογέα στη συνέχεια κόβεται σε καθαρό πλήρους μήκους διαβάζει μορφοποιηθεί σε ένα μη περιττό μορφή Fasta. Οι εμφανίσεις της κάθε μοναδικής αλληλουχίας διαβάζει μετρήθηκαν ως ετικέτες αλληλουχίας (ο αριθμός των διαβάζει για κάθε ετικέτα αντανακλά σχετικό επίπεδο έκφρασης) και μόνο μικρές αλληλουχίες RNA των 18-30 nt κρατήθηκαν για περαιτέρω ανάλυση.

Όλα μοναδική αλληλουχία ετικέτες που περνούν πάνω από τα φίλτρα χαρτογραφήθηκαν πάνω στο ανθρώπινο γονιδίωμα αναφοράς χρησιμοποιώντας το πρόγραμμα SOAP 2.0 με το πολύ δύο αναντιστοιχίες [12]. Στη συνέχεια, οι μοναδικές ετικέτες ακολουθία ήταν ευθυγραμμισμένες κατά miRBase14.0, υπολογιστικά προβλέψει ανθρώπινη ncRNAs και Rfam 9.1 (https://rfam.sanger.ac.uk/), το σχολιασμό RepeatMasker από RepBase 14.09 (http: //www.girinst. org /), ο ανθρώπινα γονίδια UCSC σχολιασμού hg18 (https://genome.ucsc.edu/) για την ταξινόμηση γνωστό miRNA, θραύσματα υποβάθμιση των μη-κωδικοποίησης του RNA, γενωμική επαναλήψεις και mRNA, αντίστοιχα. Ακολουθίες που δεν συμπίπτουν με κάποιο από αυτά τα σχόλια, αλλά θα μπορούσε να ευθυγραμμιστεί με το γονιδίωμα αναφοράς ονομάζεται «αταξινόμητη».

διαφορική έκφραση Ανίχνευση και τα νέα miRNA Πρόβλεψη

Για να συγκρίνετε διαφορικά εκφρασμένων miRNAs μεταξύ LNCaP και LNCaP-AI, διαβάστε μετράει για κάθε αναγνωριζόμενο miRNAs ομαλοποιήθηκε με το συνολικό αριθμό των miRNA διαβάζει. Η στατιστική σημασία (Ρ-τιμή) ήταν συναχθεί με βάση την Bayesian μέθοδο, το οποίο αναπτύχθηκε για την ανάλυση του προφίλ γονιδιακής έκφρασης ψηφιακά και θα μπορούσε να εξηγήσει την μεταβλητότητα δειγματοληψίας των ετικετών με χαμηλά επίπεδα [13]. Ένα συγκεκριμένο miRNA κρίθηκε ότι είναι σημαντικά διαφορικά εκφρασμένων αν το

P

αξία που δίνεται με τη μέθοδο αυτή ήταν ≤0.001 και υπήρχε τουλάχιστον 2 φορές αλλαγή στην μετράει κανονικοποιημένη ακολουθία. Τα γονίδια-στόχους για κάθε διαφορικά εκφρασμένων miRNA είχαν προβλεφθεί χρησιμοποιώντας TargetScan (https://www.targetscan.org/), Μιράντα (https://www.microrna.org/), PicTar (http: //pictar.mdc-berlin .de /) και RNAhybrid (https://bibiserv.techfak.uni-bielefeld.de/rnahybrid/). Δεδομένου ότι η πρόβλεψη στόχων των miRNAs συχνά υποφέρουν από υψηλό επίπεδο ψευδών θετικών αποτελεσμάτων, μόνο το γονίδιο στόχος υποστηρίζεται από τουλάχιστον τρεις ανεξάρτητες εργαλεία ελήφθησαν υπόψη. Η οντολογία γονιδίων (GO) τους όρους και τις οδούς KEGG στοχευμένων γονιδίων σχολιασμένη χρησιμοποιώντας το εργαλείο DAVID γονίδιο σχολιασμού (https://david.abcc.ncifcrf.gov/UTH).

Οι σχολιαζομένων ακολουθίες που θα μπορούσε να χαρτογραφηθεί στο ανθρώπινο γονιδίωμα θεωρήθηκαν υποψήφια για την ανίχνευση νέων γονιδίων miRNA. Εν συντομία, 100 νουκλεοτίδια του γονιδιωματικής αλληλουχίας που πλευρίζουν κάθε πλευρά αυτών των αλληλουχιών εκχυλίζονται και οι δευτερογενείς δομές RNA προβλέφθηκαν χρησιμοποιώντας RNAfold (https://rna.tbi.univie.ac.at/cgi-bin/RNAfold.cgi). Υποψήφιος μυθιστόρημα miRNA ταυτίστηκε με τη χρήση MIREAP σύμφωνα με τις προεπιλεγμένες ρυθμίσεις, το οποίο έχει υιοθετηθεί ευρέως σε σχετικές μελέτες [14], [15]

Όλα τα δεδομένα αλληλουχίας μαζί με τα αποτελέσματα σχολιασμό μπορεί να είναι διαθέσιμο στη διεύθυνση http:. //59.79. 168.90 /PCA.

Αποτελέσματα

Δημιουργία ενός ανεξάρτητου από ανδρογόνο γραμμή LNCaP κυττάρων

με βάση τις εκθέσεις που ανδρογόνων ευαίσθητα κύτταρα LNCaP (Εικ. 1Α) μπορεί να μετατραπεί σε ανεξάρτητου από ανδρογόνα κυττάρων [16], [17], επιχειρήσαμε να δημιουργήσει ένα ανεξάρτητο από ανδρογόνο κυτταρική γραμμή με τη συνεχή καλλιέργεια των κυττάρων LNCaP

in vitro

. Μετά από τρεις εβδομάδες την έναρξη της καλλιέργειας σε ορμόνη-στερούνται μέσο, ​​ο πολλαπλασιασμός των κυττάρων σταδιακά επιβραδύνει και ένας σημαντικός αριθμός κυττάρων (περίπου 40-50%) υπέστησαν απόπτωση (Σχ. 1Β). Οι υπόλοιπες αλλάξει μορφολογία για να εμφανιστεί ένα νευροενδοκρινικές φαινότυπο (Εικ. 1Β). Με την αύξηση του αριθμού πέρασμα, τα κύτταρα εμφανίστηκαν με προφανή μορφολογικές παραλλαγές και γίνονται μικρές και επίπεδη, αναπτύσσοντας την ικανότητα να αναπτύσσονται σε ένα ανδρογόνο ανεξάρτητο τρόπο (ένα φαινότυπο που χαρακτηρίζεται ως LNCaP-AI) (Εικ. 1 C). Για την εκτίμηση των επιδράσεων των ανδρογόνων περιβάλλον χωρίς επί LNCaP-AI ανάπτυξη κυττάρων, εξετάσαμε συνεχώς το ρυθμό πολλαπλασιασμού των κυττάρων της κυτταρικής γραμμής σε διαφορετικές διόδους. Έχει αποδειχθεί ότι ο ρυθμός ανάπτυξης των κυττάρων των κυττάρων LNCaP-AI δείχθηκε μια σταδιακή πτωτική τάση από δίοδο 1, 2, 5, 10 έως 20, ωστόσο, όπως ο αριθμός πέρασμα αυξάνεται, ρυθμός πολλαπλασιασμού των κυττάρων αυξήθηκε βαθμιαία και έφθασε σχεδόν στο 100% ( Σχ. 1D). Μετά 110 περάσματα κατά τη διάρκεια 2 χρόνων καλλιέργειας, η κυτταρική ανάπτυξη σταθεροποιήθηκε και μπορούν να αναπτύσσονται καλά σε ανδρογόνα εξαντλημένο περιβάλλον.

(Α) Η μορφολογία των γονικών κυττάρων LNCaP, τα οποία καλλιεργήθηκαν σε κανονικό μέσο για 3 ημέρες. (Β) φαινότυπο Νευροενδοκρινής των κυττάρων LNCaP. LNCaP κύτταρα διατηρήθηκαν σε μέσο ανδρογόνα εξαντλημένο και καλλιεργήθηκαν για 3 περάσματα. (C) Μορφολογία των κυττάρων LNCaP-AI. LNCaP κύτταρα καλλιεργήθηκαν με φλουταμίδη εντός μέσου ανδρογόνα εξαντλημένο για 110 περάσματα. (Δ) Οι ρυθμοί ανάπτυξης των κυττάρων του καλλιεργημένα κύτταρα LNCaP ανδρογόνων-εξαντλημένο σε διάφορα περάσματα, όταν καλλιεργούνται σε ανδρογόνων περιβάλλον στέρησης. (Ε-Ρ) Οι επιδράσεις των ανδρογόνων-εξαντλημένο περιβάλλον και φλουταμίδη επί LNCaP-AI (Ε) και LNCaP-FGC (F) του κυτταρικού κύκλου. (AI: ανδρογόνων-εξαντλημένο μέσο? Γρίπη: 1,0 × 10

-7 mol /L φλουταμίδη? Κανόνας: κανονικό μέσο). (G) Bcl-2 και την έκφραση Bax στα LNCaP και LNCaP-AI κύτταρα.

Η

Για να αποδειχθεί περαιτέρω ότι τα κύτταρα LNCaP-AI έχουν αποκτήσει την ικανότητα να προσαρμοστούν στην ορμόνη-ελεύθερο περιβάλλον, περισσότερες μελέτες χρειάζονται για γνώσεις σχετικά με τις επιδράσεις της flutamide ή ανδρογόνο ελεύθερο περιβάλλον επί του κυτταρικού κύκλου των κυττάρων LNCaP με κυτταρομετρία ροής, και τα κύτταρα LNCaP εξαρτώμενων από ανδρογόνα συμπεριλήφθηκαν ως μάρτυρας. Όπως ήταν αναμενόμενο, φλουταμίδη ή ανδρογόνο περιβάλλον χωρίς δεν είχε σημαντική επίδραση επί της διανομής του κυτταρικού κύκλου στα κύτταρα LNCaP-ΑΙ (Σχ. 1Ε). Αντίθετα, αυτή η θεραπεία στα κύτταρα LNCaP προκλήθηκε συσσώρευση των κυττάρων στη φάση Ο0 /Ο1 και συνοδεύεται με μια μείωση στη φάση S, και το αποτέλεσμα αναστολή ήταν πολύ ισχυρότερη όταν οι δύο από αυτούς συνενώθηκαν (Σχ. 1 F). Προηγούμενη μελέτη αποκάλυψε ότι Bcl-2 υπερεκφράζεται στην εξέλιξη σε ανδρογόνο καρκίνο του προστάτη ανθεκτικού [1]. Για να χαρακτηριστεί η έκφραση τόσο Bcl-2 και Bax (Bcl-2 σχετίζεται Χ πρωτεΐνη) πρωτεΐνες στις δύο κυτταρικές σειρές (LNCaP και LNCaP-AI), ανάλυση Western blotting πραγματοποιήθηκε (Εικ. 1 G). Βρήκαμε μια αυξημένη έκφραση του Bcl-2 πρωτείνης σε κύτταρα LNCaP-ΑΙ σε σύγκριση με τα κύτταρα LNCaP. Εν τω μεταξύ, τα κύτταρα LNCaP εξέφρασαν ένα παρόμοιο επίπεδο Bax πρωτεΐνης. Αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι τα κύτταρα LNCaP-AI αποκτήσει μια ενισχυμένη αντι-αποπτωτική δραστικότητα. Με βάση τις παραπάνω παρατηρήσεις, έχουμε δημιουργήσει με επιτυχία μια LNCaP κυτταρική σειρά ανδρογόνο-ανεξάρτητες μέσω μακροχρόνιας καλλιέργειας των κυττάρων LNCaP.

Μικρές RNA Transcriptomes και σχολιασμού

Για να διερευνήσουν τις μικρές transcriptomes RNA, Illumina τεχνολογία αλληλούχισης υψηλής απόδοσης χρησιμοποιήθηκε τόσο LNCaP και LNCaP-AI βιβλιοθήκες μικρά RNA. Αρχικά, συνολικά 9.107.833 και 10.083.251 πρώτες ακολουθία διαβάζει παρήχθησαν για LNCaP και LNCaP-AI, αντίστοιχα. Μετά από το φίλτρο και κούρεμα των διαβάζει με χαμηλής ποιότητας και προσαρμογέα, 3.978.524 και 4.734.866 ακολουθία διαβάζει ελήφθησαν αντιστοιχεί σε 302.325 (LNCaP) και 416.924 (LNCaP-AI) μοναδικές ετικέτες. Παρατήρηση η κατανομή μήκους των μικρών RNAs, βρήκαμε ότι η πλειοψηφία τους από τις δύο βιβλιοθήκες ήταν 22 nt σε μέγεθος (εικ. 2Α), το οποίο είναι σύμφωνο με το τυπικό μέγεθος των miRNA από προϊόντα πέψης Dicer. Εν τω μεταξύ, υπήρχαν ένα υψηλό ποσοστό των πανομοιότυπων ετικετών αλληλουχίας (88,90%) μεταξύ LNCaP και LNCaP-AI. Αυτά τα αποτελέσματα έδειξαν ότι miRNAs έχουν διαδοχικά εμπλουτιστεί και από τις δύο βιβλιοθήκες.

(Α) κατανομή Μήκος αλληλουχία διαβάζει. Και οι δύο βιβλιοθήκες συσσωρευμένη 22-νουκλεοτιδίων μικρού RNAs, η οποία είναι συνεπής με το τυπικό μέγεθος των miRNAs. Β) Οι αναλογίες των διαφόρων κατηγοριών των μικρών RNAs ανιχνεύθηκαν σε LNCaP και LNCaP-AI. Αναφέρεται ότι η πλειοψηφία των διαβάζει και στις δύο βιβλιοθήκες που ανήκουν στις οικογένειες miRNA.

Η

Στη συνέχεια, το 18-30 nt επιλεγμένες αλληλουχίες από τις δύο βιβλιοθήκες να χαρτογραφηθεί στο ανθρώπινο γονιδίωμα, και συνολικά 3.747.159 (94,18%) και 4.433.423 (93,63%) αλληλουχίες ανιχνεύθηκαν να ταιριάζει με το γονιδίωμα με το πολύ δύο αναντιστοιχίες, αντίστοιχα (Σχ. 2Β). Με βάση την ανθρώπινη επισημειώσεις γονιδιώματος και ένας αριθμός καλά χαρακτηρισμένων βάσεις RNA (βλέπε Υλικά και Μέθοδοι), αυτές οι μικρές αλληλουχίες RNA σχολιάστηκαν ως γνωστό miRNA, θραύσματα αποικοδόμηση της μη-κωδικοποίησης RNA (tRNA, rRNA, snRNA /snoRNA et al.) , γονιδιωματική επανάληψη, mRNA ή αταξινόμητη. Όπως ήταν αναμενόμενο, η πιο άφθονη κατηγορία RNA από αμφότερες τις συλλογές ήταν γνωστή miRNAs: 65,22% για LNCaP και 62,33% για LNCaP-AI. Οι υπόλοιπες λιγότερο άφθονες κατηγορίες ήταν μη-κωδικοποίησης RNA και γονιδιωματικό επαναλήψεις. Επιπλέον, ένα μικρό ποσοστό των διαβάζει θα μπορούσε να χαρτογραφηθεί σε αλληλουχίες κωδικοποίησης, οι οποίες είναι πιθανόν να είναι προϊόντα αποικοδόμησης RNA. Συσσωρευμένα στοιχεία έδειξαν ότι ορισμένα γονιδιώματα μπορεί επίσης να μεταγράψει μικρή λειτουργική μη-κωδικοποίησης μεταγραφές, όπως η ενδογενής μικρά παρεμβαλλόμενα RNA ή επαναλάβετε σχετιζόμενη παρεμβαλλόμενα RNA, το οποίο έχει χαρακτηριστεί για τη ρύθμιση της ενδομετάθεσης καταστολής [18]. Για παράδειγμα, αποκαλύπτεται ότι L1 ρετρομετάθεση καταστέλλεται από ενδογενή κωδικοποιημένα μικρά παρεμβαλλόμενα RNA σε ανθρώπινα καλλιεργημένα κύτταρα. Έτσι, αξίζει να σημειωθεί ότι αυτά τα μικρά RNAs μπορεί επίσης να περιέχουν σημαντική βιολογική λειτουργία που αξίζει περαιτέρω προσοχής.

διαφορικά εκφρασμένων miRNA Μεταξύ LNCaP και LNCaP-AI

Με βάση miRBase, 360 miRNAs (285 miRNAs και 75 miRNAs *) και 380 miRNAs (282 miRNAs και 98 miRNAs *) ανιχνεύθηκαν σε LNCaP και LNCaP-AI, αντίστοιχα (Πίνακας S1). Πρώτον, βρήκαμε ότι οι διαφορετικές miRNAs εμφάνισαν σημαντικά διαφορετικά επίπεδα έκφρασης όπως μετριέται με την συχνότητα των μετρήσεων ανάγνωσης, υποδεικνύοντας μια αξιοσημείωτη λειτουργική απόκλιση από αυτά τα miRNAs. Σε LNCaP-AI, για παράδειγμα, περίπου 8,99% των miRNAs και miRNA * s είναι σε μετρήσεις υψηλής ανάγνωσης (& gt? 1000), μεταξύ των οποίων η HSA-ας-7 οικογένεια (HSA-ας-7c, HSA-ας-7F, HSA-ας-7α, HSA-ας-7δ, HSA-ας-7b και HSA-ας-7ε) είναι ένα από τα πιο άφθονα miRNAs στο σύνολο των δεδομένων μας, συμβάλλοντας & gt? 8,94% του συνόλου των miRNA διαβάζει. miRNA μετράνε εντός των ορίων των ενδιάμεσων 100-1000 διαβάζει ήταν μέχρι 17,4% και το υπόλοιπο miRNA μετράει για περίπου 73,7%.

Η σχετική μέτρηση της αλληλουχίας διαβάζει θα μπορούσαν να χρησιμοποιηθούν για την ποσοτικοποίηση των επιπέδων έκφρασης των miRNAs μεταξύ LNCaP και LNCaP -ΌΛΑ ΣΥΜΠΕΡΙΛΑΜΒΆΝΟΝΤΑΙ. Με βάση τον αριθμό των κανονικοποιημένων διαβάζει ανά δείγμα (specifc miRNA /συνολική tags αλληλούχιση στη βιβλιοθήκη), η πλειοψηφία των miRNAs (256) εκφράστηκαν περίπου ισομερώς μεταξύ των δύο βιβλιοθήκες. Ωστόσο, 83 από αυτούς εντοπίστηκαν να εκφράζονται διαφορικά με μια φορές αλλαγών & gt? 2,0 και

P

-τιμή & lt? 0.001 (. Πίνακας 1, Σχήμα 3Α και τον πίνακα S1). Μεταξύ αυτών, 41 ήταν επάνω ρυθμισμένη και 42 ήταν ρυθμισμένα προς τα κάτω. Για την επικύρωση περαιτέρω αυτά τα διαφορικά εκφρασμένων miRNAs, επιλέχθηκαν 29 ατομικές miRNAs να εκτελέσει ποσοτική ανάλυση RT-PCR από ανεξάρτητο βιολογικό επαναλήψεις. Αυτά τα 29 επιλεγμένα miRNAs καλύπτονται τόσο πολύ που εκφράζονται miRNAs (miR-222, miR-30a *, miR-100, miR-10b, miR-148b, miR-1323, miR-221, miR-7, miR-223, miR-374Β , miR-486-5p, miR-7α *, miR-125b-2, miR-27a και miR-423-5) και κάτω εξέφρασε miRNAs (miR-15b, miR-21, miR-17, miR-28-5p , miR-532-3p, miR-200c, miR-93, miR-96, miR-200b *, miR-331-3p, miR-200b, miR-106a, miR-301b και miR-301α). Όπως φαίνεται στο Σχ. 3Β, μια ισχυρή συσχέτιση (συσχέτιση κατά Pearson = 0,91) αποκαλύφθηκε μεταξύ των δεδομένων βαθιά αλληλουχίας Illumina και τις ποσοτικές μετρήσεις RT-PCR, υποδηλώνοντας την ευρωστία της βαθιάς αλληλουχίας με βάση την ανάλυση της έκφρασης.

(A) επίπεδο έκφρασης των LNCaP και LNCaP-AI miRNAs. Ο αριθμός των κάθε miRNA ήταν καταγράφεται μετά από κανονικοποίηση. Κόκκινος κύκλος χρώμα δείχνει διαφορικά εκφρασμένων miRNAs μεταξύ LNCaP και LNCaP-AI με τουλάχιστον 2 φορές αλλαγή και

σ

-τιμή κάτω από 0.001. (Β) Solexa εναντίον qRT-PCR των miRNA πτυσσόμενο αλλαγές.

Η

Γονίδια Μυθιστόρημα miRNA

Ένα από τα πιο σημαντικά πλεονεκτήματα για την αλληλούχιση υψηλής απόδοσης των μικρών RNA μεταγραφικό είναι ότι επιτρέπει στην ανακάλυψη πιθανών νέων miRNAs. Για τον προσδιορισμό των υποψήφιων νέων miRNAs σε LNCaP και LNCaP-AI, πρέπει πρώτα φιλτράρεται ετικέτες Illumina ακολουθία που έχουν ταξινομηθεί σε σχολιασμένη κατηγορίες, όπως είναι γνωστό miRNAs, μη-κωδικοποίησης του RNA, γενωμική επαναλήψεων ή ακολουθίες κωδικοποίησης. Βρήκαμε ότι 235.058 και 259.454 των μικρών ετικετών αλληλουχίας RNA σε LNCaP και LNCaP-ΑΙ, αντιστοίχως, που προέρχονται από μη σχολιαζομένων περιοχές του ανθρώπινου γονιδιώματος. Αυτές οι ετικέτες αταξινόμητη μαζί με πλευρικές αλληλουχίες 100 bp αναλύθηκαν με MIREAP, ένα εξελιγμένο εργαλείο χρησιμοποιείται συνήθως για την ταυτοποίηση νέων miRNAs από δεδομένα αλληλούχισης υψηλής απόδοσης [14], [15]. Με τον τρόπο αυτό, εντοπίσαμε 43 υποτιθέμενο νέο miRNAs και από τις δύο βιβλιοθήκες (Πίνακας 2 και Πίνακας S2): 22 σε LNCaP και 31 σε LNCaP-AI (Πίνακας 2 και Πίνακας S2), και μόνο 10 από αυτά είναι κοινά σε δύο βιβλιοθήκες

επίσης, παρατηρήθηκε ότι αυτά τα 43 miRNAs έχουν μέγεθος που κυμαίνεται από 20-24 nt και τα μήκη των προβλεπόμενων δομές φουρκέτας τους ποικίλλουν 65-98 nt, το οποίο είναι παρόμοιο με το γνωστό ανθρώπινο miRNAs (Πίνακας S2) . Οι ελάχιστες ελεύθερες ενέργειες των προδρόμων τους κυμαίνονται -18,20 έως -67,40 kcal /mol με τη μέση τιμή της -52.70 kcal /mol. Για την επικύρωση περαιτέρω αυτά τα νέα miRNAs, πραγματοποιήσαμε σε πραγματικό χρόνο ανάλυση RT-PCR σε όλες τις 10 υποψήφιες χώρες μυθιστόρημα miRNA με κανονικοποιημένη συχνότητα αλληλουχίας μεγαλύτερο από 10 (οι άλλοι αποκλείστηκαν λόγω του χαμηλού επιπέδου έκφρασης και την ευαισθησία του σε πραγματικό χρόνο ανάλυση RT-PCR). Ως αποτέλεσμα, έχουμε επικυρωθεί με επιτυχία οκτώ από αυτά (Πίνακας 2), που δείχνει ότι το 80% θα μπορούσε να επικυρωθεί με μια μέθοδο αλληλουχίας-ανεξάρτητη.

Σε σύγκριση με άλλες miRNAs στη μελέτη μας, αυτά τα νέα miRNAs έχουν πολύ χαμηλότερο επίπεδο έκφρασης με τον μέσο κανονικό συχνότητα αλληλουχίας των 45, υποδεικνύοντας ότι η πλειοψηφία τους δεν μπορεί να παρουσιάζουν σημαντικές λειτουργίες στον καρκίνο του προστάτη. Μεταξύ αυτών, τρεις LNCaP-AI συγκεκριμένες miRNAs παρουσίασαν σχετική ακολουθία μετράει μεγάλα από 10 και επικυρώνονται από πραγματικού χρόνου RT-PCR, εμπλέκοντας πιθανότατα τη συμμετοχή τους στην ανάπτυξη των LNCaP-AI, και ως εκ τούτου χρήζουν περαιτέρω λειτουργική αξιολόγηση.

προβλεπόμενη Στόχοι των διαφορικά εκφρασμένων miRNAs

για να εξερευνήσετε τη βιολογική λειτουργία των διαφορικά εκφρασμένων miRNAs που προσδιορίζονται στην ανάλυσή μας, πραγματοποιήσαμε υπολογιστική ανάλυση με τη χρήση τεσσάρων ανεξάρτητων αλγορίθμων, συμπεριλαμβανομένων TargetScan, Miranda, RNAhybrid και PicTar, για την αναγνώριση των προβλεπόμενων στόχοι αγγελιαφόρο RNA για κάθε miRNA να είναι σημαντικά διαφορικά εκφραζόμενο. Πίνακας λίστες S3 προβλέψει στόχους που είχαν υποστηριχθεί από τουλάχιστον τρεις από τις παραπάνω τέσσερις αλγορίθμους, στις οποίες συνολικά 6902 γονίδια ήταν πιθανοί στόχοι αυτών των miRNAs. Είναι ενδιαφέρον ότι, μεταξύ αυτών των προβλεπόμενων στόχων, ΑΚΤ3 είχε εμπλακεί σε 11 σημαντικά κάτω-εκφράζεται miRNAs. ΑΚΤ3 κωδικοποιεί ένα μέλος της σερίνης /θρεονίνης οικογένεια της πρωτεϊνικής κινάσης, η οποία είναι γνωστό ότι εμπλέκεται σε μία ευρεία ποικιλία βιολογικών διαδικασιών συμπεριλαμβανομένων του κυτταρικού πολλαπλασιασμού, της διαφοροποίησης, της απόπτωσης, και ογκογένεση. Το up-έκφραση του ΑΚΤ3 στον καρκίνο του προστάτη κυτταρικές γραμμές ανεξάρτητου από ανδρογόνο αποκαλύπτει ότι μπορεί να συμβάλει στην πιο επιθετική φαινότυπο του ανεξάρτητου από ανδρογόνο καρκινώματα του προστάτη [19].

Για την αξιολόγηση λειτουργιών γονιδίου-στόχου, έχουμε σχολιασμένα αυτά στηρίζεται στόχοι miRNA με το γονίδιο οντολογία (GO) και τα συστήματα KEGG χρησιμοποιώντας DAVID. Προβλεπόμενη στόχους miRNA που κατοικείται πολλές μεγάλες κατηγορίες GO, και για ορισμένα από αυτά, ο αριθμός των στόχων του γονιδίου ήταν σημαντικά εμπλουτισμένη (

P

& lt? 0.001, με διόρθωση Benjamini). Οι τρεις ταξινομήσεις GO, μοριακή λειτουργία, βιολογική διαδικασία και κυτταρικού συστατικού αξιολογήθηκαν από το επίπεδο, αλλά μόνο των σημαντικών όρων σε επίπεδο 5 της βιολογικής διαδικασίας παρατίθενται στον Πίνακα S3. Όπως ήταν αναμενόμενο, τα περισσότερα από τα σημαντικά όρων GO είχαν σχέση με τη ρύθμιση της μεταγραφής (π.χ. GO: 0045449, GO: 0006351 και GO: 0006357). Υπάρχουν επίσης μια σειρά από σημαντικά εμπλουτισμένη κατηγορίες GO, συμπεριλαμβανομένων των κυττάρων μορφογένεση (GO: 0000902), ενδοκυτταρική μεταφορά (GO: 0046907), και την απόπτωση (GO: 0006915). Να αναλύσει το ρόλο που παίζουν miRNAs στα ρυθμιστικά δίκτυα, βάλαμε πιθανούς στόχους του miRNA σε μονοπάτια KEGG, και εντόπισε 14 από αυτά ήταν σημαντικά εμπλουτισμένη (

P

& lt? 0.001, με διόρθωση Benjamini). Οι περισσότερες από αυτές miRNAs τείνουν να στοχεύουν τα γονίδια που εμπλέκονται στη μεταγωγή σήματος και της επικοινωνίας των κυττάρων (Πίνακας S4). Για παράδειγμα, βρήκαμε ότι 130 γονίδια στόχου (2,3%) θα μπορούσαν να διατίθενται για την οδό σηματοδότησης ΜΑΡΚ, η οποία εμπλέκεται σε ένα ευρύ φάσμα κυτταρικών αποκρίσεων, συμπεριλαμβανομένης γονιδιακής έκφρασης, τη διαφοροποίηση, πολλαπλασιασμό και την απόπτωση [20]. Στον καρκίνο του προστάτη, μονοπάτια σηματοδότησης ΜΑΡΚ θεωρούνται γενικά για την προώθηση της ανάπτυξης του όγκου και την εμφάνιση της ορμόνης-ανθεκτική νόσο [21], [22], [23].

Συζήτηση

Σε αυτή τη μελέτη , έχουμε εντοπίσει ένα μεγάλο σύνολο miRNAs που εκφράζονται διαφορικά στηρίζεται η εξέλιξη της ανδρογόνο-ανεξάρτητων καρκίνο του προστάτη, οι οποίες επίσης επαληθεύεται από qRT-PCR. Μερικά από αυτά τα miRNAs είναι καλά υποστηρίζονται από πρόσφατα δημοσιευμένες μελέτες. Ένα χαρακτηριστικό παράδειγμα προέρχεται από την υπερέκφραση του miR-221 και miR-222 στο δείγμα LNCaP-AI από 10-20 φορές αύξηση, όπου και οι δύο από αυτούς είναι από τα πιο άφθονα miRNAs στην κυτταρική σειρά LNCaP-AI. Η υπερέκφραση του miR-221 ή miR-222 σε LNCaP θα μπορούσε να μειώσει σημαντικά το επίπεδο της διυδροτεστοστερόνης που προκαλείται ανοδική ρύθμιση της έκφρασης αντιγόνου ειδικού προστατικού και να αυξήσουν ανεξάρτητου από ανδρογόνο ανάπτυξη των κυττάρων LNCaP [9]. Πολλές γραμμές αποδείξεως πρότεινε ότι miR-221 και miR-222 θα μπορούσε να ρυθμίζουν προς τα κάτω την ογκοκατασταλτικό ρ27 σε κύτταρα LNCaP, και η υπερέκφραση τους θα μπορούσε να είναι ένας από τους παράγοντες που συμβάλλουν στην πρόοδο της καρκινώματος του προστάτη [24]. Επιπλέον, η αυξημένη έκφραση του miR-125b, miR-30c, miR-100 που παρατηρήθηκε σε κυτταρικές σειρές LNCaP-AI προσδιορίστηκε επίσης να είναι up-ρυθμίζεται σε πέντε κυτταρικές σειρές AI CaP [25], και

in vitro

πείραμα έδειξε ότι το miR-125b θα μπορούσε να τονώσει την ανάπτυξη AI και κάτω-ρυθμίζουν την έκφραση των BaK1 [25]. Η μείωση του miR-141, miR-19b, miR-22, miR-29a, και miR-29b προσδιορίζονται εδώ σημειώθηκε επίσης μεταξύ των 15 miRNAs που μειώθηκαν σε τέσσερα καρκινώματα του προστάτη ορμονοάντοχου όπως περιγράφεται στο Porkka et al. » s μικροσυστοιχιών με βάση μελέτη [26].

Εντοπίσαμε επίσης μια σειρά από διαφορικά εκφρασμένων miRNAs, η οποία δεν έχει τεκμηριωθεί σε ογκογένεση του προστάτη ή την ανάπτυξη AI. Για παράδειγμα, miR-124, miR-148b, miR-320a και miR-423-5p ήταν επάνω-ρυθμίζονται από 2 έως 14 φορές, ενώ miR-29a, miR-93, miR-200 και miR-1277 ήταν καθοδική ρυθμίζεται από 2 έως 10 φορές, γεγονός που υποδηλώνει ότι αυτές οι miRNAs θα μπορούσε να ασκήσει ένα ρόλο ως γονίδια καταστολής όγκου ή ογκογονίδια στην ανάπτυξη καρκίνου του προστάτη. Είναι ενδιαφέρον να σημειωθεί ότι και τα πέντε μέλη της οικογένειας miRNA-200 (miR-200a, miR-200b, miR-200c, miR-141 και miR-429) ήταν σημαντικά κάτω-ρυθμίζονται σε κύτταρα LNCaP-AI. Όλα αυτά τα miRNAs ταυτοποιήθηκαν επίσης να είναι κάτω-εκφράζεται σε κύτταρα που είχαν υποβληθεί σε επιθηλιακά μεσεγχυματικά να μετάβαση [27], η οποία θεωρείται ως ένα ουσιαστικό βήμα νωρίς για την εξέλιξη των μη επεμβατικών καρκινικά κύτταρα σε μεταστατικά καρκινώματα [28]. Στόχοι αυτών των microRNAs βρέθηκαν να είναι Ε-καδερίνης μεταγραφικοί καταστολείς ZEB1 και SIP1, παράγοντες προηγουμένως εμπλακεί σε μετάσταση όγκου [27]. Μια πιο πρόσφατη μελέτη αποκάλυψε ότι ZEB1 έκφραση θα μπορούσε να ενισχύσει ενδοθηλίου μετανάστευση στα καρκινικά κύτταρα του προστάτη [29].