Αφηρημένο

Σημαφορίνης σηματοδότηση μέσω Plexin συχνά συμμετέχει στην ογκογένεση και κακοήθη εξέλιξη σε διάφορους τύπους καρκίνου. Ειδικότερα, ο ρόλος της σημαφορίνης σηματοδότηση στα αδενοκαρκίνωμα παγκρεατικού πόρου (PDAC) παραμένει ανεξερεύνητη, παρά την υψηλή πιθανότητα μετάστασης και της θνησιμότητας. Σε αντίθεση με άλλα επιθηλιακά κακοήθειες που συχνά εκφράζουν ένα μικρό αριθμό ειδικών γονιδίων στην οικογένεια Σημαφορίνης /Plexin, πέντε ή περισσότερα συχνά εκφράζεται σε ανθρώπινα PDAC. Τέτοια ταυτόχρονη έκφραση αυτών των μελών της οικογένειας SEMA3 /Plexin δεν είναι αποτέλεσμα της γονιδιακής ενίσχυσης, αλλά (τουλάχιστον εν μέρει) από την αυξημένη μεταγραφή γονιδίων που ενεργοποιούνται από SOX4 de novo εκφράζονται σε PDAC. Μέσω χρωματίνη-ανοσοκαταβύθιση, δοκιμασία δραστικότητας προαγωγέα λουσιφεράσης και προσδιορισμός μετατόπισης κινητικότητας ηλεκτροφόρησης, SOX4 αποδεικνύεται να συνδεθεί με την συναινετική θέση στον υποκινητή του κάθε

SEMA3

και

Plexin

γονίδιο για την ενίσχυση της δραστηριότητας της μεταγραφής. Αντιστρόφως, RNAi-knockdown του SOX4 σε PDAC κυτταρικές σειρές έχει σαν αποτέλεσμα μειωμένη έκφραση των μελών της οικογένειας SEMA3 /Plexin και συνδέεται με περιορισμένη ανάπτυξη του όγκου τόσο

in vitro

και σε ποντίκια SCID. Έχουμε αποδείξει περαιτέρω ότι τα επίπεδα SOX4 παράλληλα με την συνόψισε την έκφραση των μελών της οικογένειας SEMA3 /Plexin (

P

= 0.033,

NPAR

Kruskal-Wallis

ένα

–

τρόπο

ανάλυση), η οποία συσχετίζεται επίσης με κακή επιβίωση του ανθρώπου PDAC (

P

= 0,0409,

Kaplan-Meier

ανάλυση). Περιέργως, miR-129-2 και miR-335, δύο εκ των οποίων στοχεύουν SOX4 για υποβάθμιση, είναι συν-καταστέλλεται σε ανθρώπινο PDAC περιπτώσεις που συνδέονται με up-ρυθμίζονται SOX4 σε στατιστικά σημαντικό τρόπο. Εν κατακλείδι, αποκαλύπτουμε ένα miR-129-2 (miR-335) /SOX4 /Σημαφορίνης-Plexin κανονιστικό άξονα στην ογκογένεση του καρκίνου του παγκρέατος

Παράθεση:. Huang ΗΥ, Cheng YY, Liao WC, Tien YW , Γιανγκ C-HJ, Hsu SM, et al. (2012) SOX4 μεταγραφικά Ρυθμίζει Πολλαπλές SEMA3 /Plexin Μέλη της οικογένειας και προωθεί την ανάπτυξη όγκων στον καρκίνο του παγκρέατος. PLoS ONE 7 (12): e48637. doi: 10.1371 /journal.pone.0048637

Επιμέλεια: Γκύντερ Schneider, Τεχνικό Πανεπιστήμιο του Μονάχου, Γερμανία

Ελήφθη: 8 Μάη του 2012? Δεκτές: 1 Οκτ του 2012? Δημοσιεύθηκε: 12, Δεκεμβρίου του 2012

Copyright: © 2012 Huang et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από το Εθνικό Πανεπιστήμιο της Ταϊβάν Νοσοκομείο εσωτερικών κεφαλαίων που χορηγούνται σε PH Huang και ΗΥ Huang (NTUH.96-Μ-037). Ο χρηματοδότης δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή παρασκεύασμα το χειρόγραφο

Αντικρουόμενα συμφέροντα:. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

παγκρεατικού πόρου αδενοκαρκίνωμα (PDAC) είναι η τέταρτη κύρια αιτία θανάτου από καρκίνο στις Ηνωμένες Πολιτείες, και ένα από τα δέκα πιο κοινούς καρκίνους στην Ταϊβάν. Η διάγνωση της PDAC συχνά συμβαίνει μόνο μετά από εκτεταμένη μετάσταση. Ως αποτέλεσμα, η κακή πρόγνωση του PDAC μπορεί να αποδοθεί στην επιθετική βιολογική συμπεριφορά του και την αντοχή του σε χημειοθεραπεία ή ακτινοθεραπεία, η οποία απαιτεί μια λεπτομερή μηχανιστική μελέτη του PDAC για θεραπευτικούς σχεδιασμό [1].

Η γονιδιακή έκφραση και γονιδιώματος έχει πλάτος μετάλλαξης μελέτες δείχνουν ότι το ανθρώπινο καρκίνο του παγκρέατος αποτελέσματα από την αλλοίωση των πολλαπλών γονιδίων που λειτουργούν μέσω ενός πυρήνα τουλάχιστον 12 κυτταρικά μονοπάτια σηματοδότησης [2]. Μέσα από μια ανάλυση περισσότερων από 20.000 μεταγραφές, κατά μέσο όρο 63 γενετικών αλλοιώσεων σε καρκίνο του παγκρέατος έχει αποδειχθεί. Οι μηχανισμοί για παρεκκλίνουσα έκφραση κάθε ειδικού γονιδίου σε καρκίνο του παγκρέατος είναι ποικίλα, συμπεριλαμβανομένου σημειακή μετάλλαξη, διαγραφή γονιδίου και ενίσχυση [2].

Η ανώμαλη έκφραση της Κλάσης 3 Σημαφορίνης καθώς και οι συγγενείς υποδοχείς Plexin (PLXN ) και νευροπιλίνη (ΕΠΜ) σε διαφορετικούς τύπους καρκίνου στον άνθρωπο δείχνει ότι SEMA3-gated Plexin σηματοδότηση ρυθμίζει καρκινικών κυττάρων συμπεριφορές [3], [4]. Για παράδειγμα, υπερέκφραση του SEMA3C και SEMA3E διαμεσολαβεί την εξέλιξη του όγκου και της μετάστασης σε καρκίνους, συμπεριλαμβανομένου του αδενοκαρκινώματος ανθρώπινου πνεύμονα, καρκίνο του προστάτη, καρκίνο ενδομητριοειδές, και μαστικό αδενοκαρκίνωμα. Αντίθετα, η

SEMA3F

και

SEMA3B

τα γονίδια διαγράφονται συχνά σε επιθηλιακά κακοήθεια, με αποτέλεσμα την αυξημένη αγγειογένεση [3]. Για PDAC, υπερ-έκφραση του NRP1 και SEMA3A έχει αναφερθεί ότι συσχετίζεται με πτωχή πρόγνωση [5]. Ωστόσο, οι μοριακές διαδικασίες που διέπουν τέτοια έκφραση κατά τη διάρκεια της ογκογένεσης PDAC δεν έχουν διευκρινιστεί, και αν άλλα μέλη της κατηγορίας 3 Σημαφορίνης ή Plexin συμμετέχουν στον σχηματισμό καρκίνου του παγκρέατος ή εξέλιξης δεν είναι ακόμα γνωστή. Εδώ, εξετάσαμε την έκφραση του SEMA3 και Plexin /νευροπιλίνη σε φυσιολογικό ανθρώπινο πάγκρεας, PDAC χειρουργικά δείγματα, και κυτταρικές γραμμές PDAC. Σε αντίθεση με άλλα επιθηλιακά κακοήθειες που συχνά ειδικά υπερ-εκφράζουν ένα μικρό αριθμό γονιδίων στην οικογένεια Σημαφορίνης, οι περισσότερες περιπτώσεις PDAC υπερ-εκφράζουν περισσότερα από πέντε γονίδια που σχετίζονται με SEMA3 και Plexin. Ο μηχανισμός βασίζεται η συν-έκφραση SEMA3 /μέλη της οικογένειας Plexin στο PDAC Έτσι διερευνήθηκε.

Υλικά και Μέθοδοι

Δήλωση Ηθικής

Εμείς επιβεβαίωσε ότι οι εργασίες για μπλοκ ανθρώπινο ιστό και τα δείγματα νωπών Paired όγκου /μη όγκου σε αυτή τη μελέτη εγκρίθηκε από τον ιστό και την Επιτροπή Δεοντολογίας, με γραπτή ενημέρωσε συναινέσεις ακολουθώντας τις κατευθυντήριες γραμμές που ορίζονται από τον ιστό και επιτροπή δεοντολογίας NTUH. Η

in vivo

δοκιμασία ογκογένεσης σε ποντίκια SCID πραγματοποιήθηκε κατόπιν έγκρισης που εκδίδεται από την Επιτροπή Θεσμικών Ζωικά Φροντίδα και Χρήση (IACUC) του Εθνικού Ταϊβάν University College of Medicine και το Κολέγιο Δημόσιας Υγείας.

περίπτωση επιλογής

Εξήντα δύο περιπτώσεις πορογενές αδενοκαρκίνωμα του παγκρέατος εντοπίστηκαν μέσω μιας αναζήτησης των παθολογικών αρχεία είναι νηολογημένα στην Εθνική Ταϊβάν Πανεπιστημιακό Νοσοκομείο (NTUH), η Ταϊβάν από τον Ιανουάριο 1996 έως τον Δεκέμβριο του 2006. για την ποσοτική PCR πραγματικού χρόνου, ελήφθησαν είκοσι τρία ζεύγη περιπτώσεις παγκρεατικών μη-όγκου και καρκινικών ιστών καταψύχθηκαν. Επιλεγμένα δημογραφικά στοιχεία ανακτήθηκε από το μητρώο του καρκίνου του νοσοκομείου όπως αναφέρεται λεπτομερώς στο συμπληρωματικό πίνακα S1.

καλλιέργειας κυττάρων, παρεμβολή RNA, και επιλογή των σταθερών επιμολυσμένων κυτταρικών κλώνων

PANC-1, MIAPaCa2, και κύτταρα Capan-1 αγοράστηκαν από την ATCC. Όλα τα κύτταρα αναπτύχθηκαν σε ϋΜΕΜ μέσο συμπληρωμένο με 10% βόειο εμβρυϊκό ορό και 1% πενικιλλίνη /στρεπτομυκίνη στους 37 ° C με 5% CO

2.

Για παρεμβολή RNA, οι στόχευσης ολιγονουκλεοτίδια ειδικά για

SOX4

γονίδιο (NM_003107.2: nt.1999-2019 και nt.1362-1382) ή ομελέτα ακολουθίες κλωνοποιήθηκαν στο pSuperGFP /neo φορέα. Λεντοϊού Τα siRNAs που στοχεύουν SOX4 μέσω των κατασκευάστηκαν ολιγονουκλεοτίδια που κατευθύνονται έναντι nt.4433-4453 και nt.1101-1121 (NM_003107.2), αντίστοιχα, αγοράστηκαν από την RNAi κεντρικό εργαστήριο στην Ταϊπέι Sinica Academica.

PLXNA2

siRNA πλασμίδια εμπορικά αγοράστηκαν (Santa Cruz). Τα σταθερώς επιμολυσμένα με πλασμίδιο κλώνοι επελέγησαν με G418 (Sigma). RNAi-knockdown κάθε μορίου επιβεβαιώθηκε με RT-PCR και στυπώματος Western

Αντισώματα, ανοσοϊστοχημεία, και

κηλίδα Western

Τα αντισώματα που χρησιμοποιήθηκαν περιλάμβαναν αντι-ανθρώπινης NRP1 (R &? D Systems)., SEMA3A, -3Β, -3C, -3Ε, PLXNA1, -Α2, -Α3, -D1, NRP2, SOX4 (Santa Cruz), SEMA3F (Chemicon), της ιστόνης 3 (Millipore), Ki-67 (DAKO), ERK1 /2, φωσφο-ERK1 /2 (Μεταγωγή σήματος), PCNA, και τουμπουλίνης (Calbiochem). Ανοσοϊστοχημεία και στύπωμα Western πραγματοποιήθηκαν όπως περιγράφηκε προηγουμένως [6].

μαλακό άγαρ κλωνογονική δοκιμασία, κυτταρομετρία ροής, την επισήμανση BrdU, και in vivo δοκιμασία

ογκογένεση

Αυτές οι δοκιμασίες πραγματοποιήθηκαν όπως περιγράφηκε προηγουμένως [7 ].

η ποσοτικοποίηση του mRNA ή μικρο-RNA και χρωματίνης δοκιμασία ανοσοκατακρήμνισης (chip) θα

δοκιμασίες ChIP πραγματοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας το EZ Magna Kit (Millipore), όπως υποδεικνύεται από τον κατασκευαστή. Real-time PCR ανάλυση χρησιμοποιήθηκε για την ποσοτικοποίηση mRNA ή μικρο-RNA όπως περιγράφηκε προηγουμένως [6]. Οι εκκινητές που χρησιμοποιήθηκαν αναφέρονται λεπτομερώς στο συμπληρωματικό Υλικά και μέθοδοι.

Array συγκριτική γενωμική υβριδισμού

DNA για συστοιχία συγκριτική γενωμική υβριδισμού εκχυλίστηκε από PANC-1, κύτταρα MIAPaCa2 ή φυσιολογικό ανθρώπινο θηλυκό γενωμικού DNA. Κυτταρική σειρά DNA και τον έλεγχο του DNA σημάνθηκαν με Cy5 ή Cy3, αντίστοιχα, από διπλές πειράματα και υβριδοποιήθηκε σε διαφάνειες πίνακα που περιέχει 2621 BAC κλώνους με μέσο ανάλυση 1-ΜΒΡ (SpectralChip 2600 array, PerkinElmer). Διαφάνειες σαρώθηκαν για Cy3 και Cy5 φθορισμού χρησιμοποιώντας το GenePix® 4000B μικροσυστοιχιών Scanner (Molecular Devices). Οι εικόνες αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας SpectralWare 2.2 (Spectral Genomics).

Ανίχνευση K-Ras και γονίδιο SOX4 μετάλλαξη

τμήματα όγκου στο ανακτηθούν μονιμοποιηθεί με φορμαλίνη εγκλεισμένοι σε παραφίνη ανθρώπινοι ιστοί αποκόπηκαν και DE- παραφινοποιήθηκαν, και γενωμικό DNA εκχυλίζεται. Όλες οι εκκινητές που χρησιμοποιήθηκαν έχουν παρατηρηθεί σε συμπληρωματικά υλικά και μεθόδους.

λουσιφεράσης ανταποκριτής δοκιμασία

Οι αλληλουχίες προαγωγού προβλεπόμενες κλωνοποιήθηκαν σε φορέα pGL3Basic αναφοράς λουσιφεράσης (Promega) και επαληθεύεται από την άμεση αλληλούχιση. κύτταρα HeLa σε πλάκες 24-φρεατίων συν-επιμολυσμένα με το κατασκεύασμα υποδεικνύεται συν ένα SOX4 εκφράζουν κατασκεύασμα και ρΡΙ_-ΤΚ DNA πλασμιδίου χρησιμοποιώντας Lipofectamine 2000 (Invitrogen). Μετά την επιμόλυνση για 48 ώρες, τα κύτταρα συλλέχθηκαν για δοκιμασία δραστικότητας λουσιφεράσης (Promega).

δοκιμασία μετατόπισης ηλεκτροφορητικής κινητικότητας (EMSA)

Πυρηνικό εκχύλισμα παρασκευάστηκε από κύτταρα HeLa και η συνολική συγκέντρωση πρωτεΐνης προσδιορίζεται με αντιδραστήριο Bradford (BioRad). Για κάθε πείραμα EMSA, 2000 cpm του

32Ρ-επισημασμένο δίκλωνων θραυσμάτων DNA χρησιμοποιήθηκε για την αντίδραση σύνδεσης που περιέχει πυρηνικό εκχύλισμα και πολυ-dl-dC (Sigma) στους 30 ° C για 30 λεπτά σε ένα διάλυμα που περιέχει 5 mM MgCl

2, 20 mM ΗΕΡΕδ-ΚΟΗ ρΗ 7,9, 60 mM ΚΟΙ, 1 mM DTT, 0,5 mg /ml αλβουμίνη βόειου ορού, 12% γλυκερόλη και 1 mM PMSF. Στην ανταγωνιστική ανίχνευση, εχρησιμοποιήθη όγκος πεντα- ή είκοσι φορές του κρύου καθετήρα σε σχέση με το καυτό ανιχνευτή. Μετά τη διακοπή της αντίδρασης πρόσδεσης, τα δείγματα υποβλήθηκαν σε ηλεκτροφόρηση σε πήκτωμα, ξηραίνεται υπό κενό, και εκτέθηκαν σε φιλμ ακτίνων Χ για την ανίχνευση ραδιενέργειας.

Στατιστική ανάλυση

Α ζευγαρωμένα

t

-test test χρησιμοποιήθηκε για να εκτιμηθεί η συσχέτιση μεταξύ των αποτελεσμάτων των ανοσοϊστοχημική χρώση στον όγκο και μη-όγκου ιστούς. Ο αντίκτυπος των αποτελεσμάτων ανοσοϊστοχημεία για τη συνολική επιβίωση των ασθενών με PDAC εκτιμήθηκε με ανάλυση επιβίωσης Kaplan-Meier και οι διαφορές μεταξύ των υπο-ομάδων αναλύθηκαν από δοκιμασία log-rank. Μια μονόδρομη δοκιμασία NPAR χρησιμοποιήθηκε για να εκτιμηθεί η σχέση μεταξύ SOX4 (ή E2F1) έκφραση και την ένταση ανοσοϊστοχημεία της SEMA3, ΕΠΜ, ή πλεξίνες. Pearson συσχέτιση χρησιμοποιήθηκε για να αξιολογήσει τη σχέση μεταξύ κανονικοποιημένη έκφραση SOX4 και το επίπεδο microRNA (παρουσιάζεται ως φορές οι αλλαγές στις οποίες χρησιμοποιήθηκε η αναλογία της αξίας που προέρχεται από όγκο σε σχέση με εκείνη που προέρχεται από ένα μέρος μη-όγκου σε ζεύγη φρέσκο ​​ιστούς). Ένας μετασχηματισμός log (με βάση το 10) κάθε τιμή αναλογίας εκτελέστηκε για να επιτευχθεί η κανονική κατανομή που απαιτείται για τη δοκιμή γραμμικής παλινδρόμησης. Στατιστικά στοιχεία ελήφθησαν με τη χρήση SPSS 12.0 (SPSS), και οι υπολογισμοί για την επιβίωση των ασθενών έγιναν χρησιμοποιώντας GraphPad Prism 4.0 λογισμικό (software GraphPad).

Αποτελέσματα

Η ταυτόχρονη έκφραση πολλών μελών της κατηγορίας 3 σημαφορίνες και ο υποδοχέας πολυ- οικογένεια νευροπιλίνη /Plexin σε PDAC

Για να διερευνηθεί κατά πόσο SEMA3 ή τα σχετικά υποδοχείς (Plexin /νευροπιλίνη) εμπλέκονται στην καρκινογένεση του παγκρέατος, ανοσοϊστοχημεία εκτελέστηκε σε 62 περιπτώσεις PDAC σε συνδυασμό με την κανονική παγκρεατική ιστός. Όπως φαίνεται στο Σχ. 1Α, κανονική παγκρεατικού πόρου και κυψελιδικά επιθηλιακά κύτταρα δεν εκφράζουν SEMA3 ή Plexin. Αντίθετα, παγκρεατικά κύτταρα αδενοκαρκινώματος έδειξε ανοσολογική αντίδραση προς τα περισσότερα μέλη της SEMA3 και την οικογένειά Plexin, και NRP1 (Εικ. 1Α). Περισσότερο από το 90% των περιπτώσεων PDAC αποκάλυψαν ισχυρή κυτταροπλασματική ή μεμβρανώδη ανοσοχρώση SEMA3E, και μια μεταβλητή αναλογία (38% ~68%) των περιπτώσεων ήσαν ανοσοδραστικά προς SEMA3A, SEMA3B, SEMA3C και SEMA3F (Πίνακας 1). Όσο για SEMA3 υποδοχείς, PLXND1 και NRP1 ήταν ανιχνεύσιμα στα περισσότερα PDACs, αντιπροσωπεύοντας το 90% των περιπτώσεων. Αντίθετα, NRP2 ήταν πολύ λιγότερο συχνά εκφράζονται σε PDACs (αντιπροσωπεύοντας το 14%), ενώ υπήρχαν και μεταβλητά ποσοστά έκφρασης των PLXNA1, PLXNA2 και PLXNA3 (31,67%, 68,85% και 66,67%, αντίστοιχα? Πίνακας 1). Όταν η συνδυασμένη έκφραση όλων SEMA3, μέλη PLXN, και NRP1 σε κάθε περίπτωση PDAC αξιολογήθηκε, κατέστη προφανές ότι οι περισσότερες PDAC περιπτώσεις (αντιπροσωπεύοντας το 85,5% σε δείγματα μας) που εκφράζεται 5-10 μέλη της SEMA3 /οικογένειας Plexin (Εικ. 1Β ). Σύμφωνα με την συν-έκφραση SEMA3 /Plexin σε χειρουργικά δείγματα PDAC, ανθρώπινη PDAC που προέρχονται από κυτταρικές σειρές (κύτταρα PANC1, Capan1 και MIAPaCa2) εξέφρασε, επίσης, πολλά μέλη της SEMA3, Plexin και NRP1 στα επίπεδα μεταγραφής και πρωτεϊνών (Εικ. 1Γ και 1D).

(Α) ανοσοϊστοχημεία της ανθρώπινης PDAC περιπτώσεις που δείχνουν έκφραση NRP1 και τα περισσότερα μέλη της SEMA3 /οικογένειας Plexin. Κανονική παγκρεατικός ιστός δεν εκφράζει καμία SEMA3 /Plexin /ΕΠΜ (διαγώνια, γραμμή κλίμακας = 50 μm). Κλίμακα bar = 100 μm. (Β) γράφημα Bar για να δείξει τη διανομή των αριθμών των SEMA3 /Plexin /ΕΠΜ εκφράζεται σε κάθε περίπτωση PDAC. Πενήντα τρεις από τις 62 περιπτώσεις (85,5%) εξέφρασαν πάνω από 5 μέλη. (C) ημι-ποσοτική ανάλυση RT-PCR του SEMA3-, Plexin- και NRP- μεταγραφές σε ανθρώπινες κυτταρικές σειρές PDAC. GAPDH χρησίμευσε ως εσωτερικός έλεγχος φόρτωσης. (D) ανοσοκηλίδος του ολικού κυτταρολύματος από ανθρώπινες κυτταρικές σειρές PDAC για την ανίχνευση ενδογενούς SEMA3, Plexin, και NRP1. (Ε) εκπρόσωπο SEMA3-, Plexin- και NRP1-ανοσοαντιδραστικότητας ανιχνεύθηκαν σε PanIN βλάβες που γειτνιάζουν με διηθητικό καρκίνωμα. μπαρ κλίμακα = 100 μm.

Η

Όταν ανάλυση επιβίωσης Kaplan-Meier διεξήχθη σε συσχέτιση με την έκφραση της SEMA3, Plexin ή ΕΠΜ μέλη, δεν υπάρχει σημαντική συσχέτιση βρέθηκε εκτός από το ότι SEMA3F-θετικών περιπτώσεων εμφανίζεται πλέον η επιβίωση και η λιγότερο συχνή μετάσταση στους λεμφαδένες (Συμπληρωματικές Εικ. S1 και αδημοσίευτα στοιχεία). Επιπλέον, δεν παρατηρήθηκε συσχέτιση μεταξύ κομβικών μετάστασης και επίπεδο έκφρασης του SEMA3 ή Plexin (συμπληρωματικός Πίνακας S2). Επιπλέον, μεσολάβηση RNAi knockdown μιας ενιαίας SEMA3 ή Plexin είχε ως αποτέλεσμα μια ασήμαντη επίδραση τόσο κυτταρική επιβίωση και τον πολλαπλασιασμό (Συμπληρωματικές Σχ. S2B, S2C, S2D). Συνεπώς, κανένα μεμονωμένο μέλος του SEMA3 /Plexin διαδραματίζει καθοριστικό ρόλο στο σχηματισμό όγκων ή την πρόοδο της PDAC.

Δεδομένου ότι ο καρκίνος του παγκρέατος εκφράζει ποικίλες ποσότητες SEMA3 και Plexin σε έντονη αντίθεση με την μη έκφραση σε κανονική παγκρεατικού πόρου ιστού , θα εικάζουν ότι η ταυτόχρονη έκφραση SEMA3 /Plexin μπορεί να εμπλέκεται στην PDAC ογκογένεση. Ως εκ τούτου, έχουμε την επόμενη εξετάστηκε η έκφραση του SEMA3 και Plexin σε παγκρεατικά πρόδρομος καρκινικές βλάβες, ειδικά, του παγκρέατος ενδοεπιθηλιακή νεοπλασία (PanIN). Όπως φαίνεται στο Σχ. 1Ε, πολλά μέλη της SEMA3 και Plexin συν NRP1 ήταν ήδη παρούσα σε PanIN βλάβες που γειτνιάζουν με επεμβατικές πορογενές νεοπλασματικών φωλιές όγκου, γεγονός που υποδηλώνει ότι η ταυτόχρονη έκφραση SEMA3 /PLXN /NRP1 εμφανίζεται στα πρώτα βήματα της PDAC ογκογένεσης.

Έκφραση της SOX4 σε PDAC συσχετίζεται με την συνόψισε την έκφραση των γονιδίων από τις οικογένειες NRP1, SEMA3 και Plexin

Αρκετοί μηχανισμοί θα μπορούσαν να αποτελούν τη βάση την παρατήρηση ότι πολλά μέλη της SEMA3 και την οικογένειά Plexin ήταν συν-ρυθμισμένη προς τα πάνω σε PDAC. Πρώτον, γονίδια που κωδικοποιούν SEMA3 και τα μέλη της οικογένειας Plexin μπορεί να συν-ενισχύεται λόγω των συχνών μεταβολών αριθμού αντιγράφων σε καρκίνο του παγκρέατος. Έχουμε παρατηρήσει ότι τα περισσότερα γονίδια του ανθρώπινου SEMA3 και οικογένειες Plexin βρίσκονται σε κάθε χρωμόσωμα 3 ή 7 (Εικ. 2Α). Κατά συνέπεια, χρησιμοποιήσαμε σειρά συγκριτική γονιδιωματική υβριδισμού για να διερευνήσει τη δυνατότητα ενίσχυσης του DNA σε τόπους οικογένεια γονιδίων SEMA3 και Plexin. Όπως φαίνεται στο Σχ. 2Β, καμία αλλαγή στον αριθμό αντιγράφων του DNA παρατηρήθηκε σε χρωμοσωμικές περιοχές 7p12.1 (

SEMA3A

locus), 7q21 (

SEMA3C

,

SEMA3D

,

SEMA3E

loci) (Εικ. 2Β), 1q32.2 (

PLXNA2

locus), 3p21.3 (

SEMA3B

και

SEMA3F

loci), 3q21.3 (

PLXNA1

και

PLXND1

loci), ή 10p12 (

NRP1

locus) (Συμπληρωματικές Εικ. S2A). Αμφίβολο ενίσχυση DNA παρατηρήθηκε στο χρωμόσωμα περιοχή Xq28 μόνο, όπου

PLXNA3

κατοικίας (Συμπληρωματικές Εικ. S2A).

(Α) του γονιδίου τόπους του κάθε ανθρώπου

SEMA3

,

Plexin

, και

ΕΠΜ

γονίδιο. (Β) εκπρόσωπο array CGH στο χρωμόσωμα 7 με γονιδιωματικό ϋΝΑ που εξάγεται από PANC-1 και MIAPaCa2 κύτταρα, αντίστοιχα, σε σύγκριση με φυσιολογικό ανθρώπινο γονιδιωματικό DNA (μπλε κουκκίδες και γραμμή: εμπρός πείραμα, η κυτταρική γραμμή έναντι του ελέγχου? Κόκκινα σημεία και γραμμή: αντίστροφη πείραμα , τον έλεγχο σε σχέση με κυτταρική σειρά). Καμία σημαντική ενίσχυση του γονιδίου (& gt? = Ή & lt? = Αλλαγή 2 φορές) παρατηρήθηκε γύρω από

SEMA3A

,

3C

,

3D

,

3Ε

και

PLXNA4

γονιδιακούς τόπους (υποδεικνύεται με πράσινο χρώμα ορθογώνιο και το βέλος). (Γ) SOX4 εκφράζεται σε κυτταρικές σειρές PDAC. Κυτταρολύματα ανοσοκατακρημνίστηκαν χρησιμοποιώντας αντίσωμα αντι-SOX4 και ανοσοστυπώθηκαν με SOX4 ή ένα αντίσωμα IgG ελέγχου. (D) ανοσοϊστοχημεία του SOX4 και E2F1 σε ανθρώπινο PDAC περιπτώσεις. SOX4 και E2F1 οι δύο ανιχνεύθηκαν σε PanIN διαφόρων ποιοτήτων και επεμβατική αδενοκαρκίνωμα, αλλά όχι σε φυσιολογικά πόρου και λοβιώδη επιθηλίων ή σε χρόνια παγκρεατίτιδα. Κλίμακα bar = 100 μm. (Ε) Σειρά άθροισμα ένταση χρώσης για SEMA3 /Plexin /NRP1 συσχετίζεται με την έκφραση SOX4 σε PDAC περιπτώσεις. Η χρώση του κάθε τμήματος ήταν σκόραρε 1-3 για να κατατάξουν την ένταση του ως αδύναμο, μεσαία ή ισχυρά. Βαθμολογίες όλων των SEMA3 /Plexin /NRP1 ανοσοχρώση για κάθε περίπτωση αθροίστηκαν και συσχετίστηκαν με την έκφραση SOX4 (NPAR Kruskal-Wallis μονόδρομη ανάλυση). Η διάμεση τιμή (γραμμή μέσα στο κουτί), μέγιστη και ελάχιστη τιμές (άνω και κάτω γραμμές έξω από το κουτί, αντίστοιχα) για κάθε ομάδα φαίνονται στην boxplot.

Η

Μια άλλη κοινή αλλαγή στα καρκινικά κύτταρα φίμωση του όγκου γονίδια καταστολής με υπερμεθυλίωση [8]. Αν και SEMA3F και SEMA3B γενικά θεωρούνται ως καταστολείς όγκων και μεθυλιώνεται

SEMA3F

έχει αναφερθεί σε καρκίνους του πνεύμονα [9], είναι νεο-έκφραση αντί της καταστολής της SEMA3 /Plexin έκφραση που παρατηρείται γενικά σε PDACs (βλέπε Τραπέζι 1). Περαιτέρω, CpG-πλούσια νησιά για την τροποποίηση της μεθυλίωσης δεν βρίσκονται πάντα στις προβλεπόμενες περιοχές υποκινητή της SEMA3 οικογένεια γονιδίων /Plexin (όπως προβλέπεται από το Πρόγραμμα EMBOSS CpGPlot). Ως αποτέλεσμα, έχουμε την επόμενη διερευνήθηκε η πιθανότητα ότι συν-έκφραση των SEMA3 /μελών Plexin /ΕΠΜ οικογένεια στην PDACs προκαλείται από την νεο-έκφραση κάποιου γονιδίου (ων) κύριου ελέγχου κρίσιμη για την ογκογένεση του PDAC, πιθανώς μεταγραφικού παράγοντα (ες) ότι θα μπορούσαν να αλληλεπιδράσουν με ένα μοτίβο που υπάρχουν στον υποκινητή του κάθε SEMA3 /Plexin /ΕΠΜ γονίδιο πρόσδεσης συναίνεση DNA. Αρκετοί υποψήφιοι, συμπεριλαμβανομένων E2F1, GATA6 και SOX2, ελήφθησαν μέσω μιας αναζήτησης βιβλιογραφίας. Ο μεταγραφικός παράγοντας E2F1 θα μπορούσε να ενεργοποιήσει

NRP1

μεταγραφή στο φλοιό του ποντικιού κάτω από ισχαιμικές αλλαγή [10]. Ποντίκι

SEMA3C

και

PLXNA2

είναι οι άμεσοι στόχοι της GATA6 κατά τη διάρκεια της καρδιακής ανάπτυξης [11]. Τέλος,

SEMA3C

και

NRP1

έχουν αναφερθεί να είναι οι άμεσες γονιδίων στόχων του SOX4 [12]. Ως εκ τούτου, προσπαθήσαμε να εντοπίσουμε τη θέση σύνδεσης SOX4 συναίνεση [(Α /Τ) (Τ /Α) CAA (A /T) G], η GATA6-θέση πρόσδεσης [(A /T /C) GAT (Α /Τ ) (Α)], και ο E2F1-θέση πρόσδεσης [ΤΤΤ (C /G) (C /G) CGC] σε προβλεπόμενες υποκινητές για κάθε SEMA3 και Plexin γονίδιο [12] – [15]. Όπως αναφέρεται στο συμπληρωματικό πίνακα S3, όλα SEMA3, Plexin, και ΕΠΜ γονίδια έχουν τουλάχιστον ένα υποθετική θέση δέσμευσης SOX4 και μία θέση δέσμευσης E2F1 στις προβλεπόμενες περιοχές υποκινητή.

Η παρουσία του υποτιθέμενου SOX4 και E2F1 θέσεις πρόσδεσης στον υποκινητή του κάθε SEMA και γονίδιο Plexin μας ώθησε να εξετάσουμε SOX4 και E2F1 έκφραση σε ανθρώπινους ιστούς PDAC και κυτταρικές σειρές. Ανοσοκηλίδωση έδειξαν έκφραση SOX4 σε PANC-1 και κύτταρα MIAPaCa2 (Σχ. 2C). Για ανθρώπινα δείγματα PDAC, ανοσοϊστοχημεία αποκάλυψε ότι 76,4% των ανθρώπινων PDAC εκφράζεται SOX4, και 87,9% εκφράζεται E2F1 (Σχ. 2D). Αντίθετα, acinar και πόρου επιθηλιακά κύτταρα από τα φυσιολογικά πάγκρεας και χρόνιας παγκρεατίτιδας δεν ήταν ανοσοαντιδραστικές να SOX4 ή E2F1. Επιπλέον, SOX4 και E2F1 είχαν ήδη εντοπιστεί σε PanIN των διαφόρων ποιοτήτων (Εικ. 2D), γεγονός που υποδηλώνει ότι SOX4 και E2F1 είναι de novo εξέφρασε στις αρχές της δεκαετίας διαδικασίες PDAC ογκογένεσης.

Για να διερευνήσει τη σχέση μεταξύ της έκφρασης της SOX4 ή E2F1 και του SEMA3 /Plexin /NRP1 σε ασθενείς με PDAC, έχουμε κατετάγη η ένταση χρώσης κάθε SEMA3 και Plexin ως έναν αριθμό από 0-3 (0, αρνητικά? 1, αδύναμη? 2? μέτρια? 3, ισχυρή) και αναλύονται rank sum κάθε ασθενή έναντι SOX4 ή E2F1 έκφρασης.

NPAR

Kruskal-Wallis

ένα

–

τρόπο

αναλύσεις έδειξαν σημαντικές διαφορές στην κατάταξη ποσό της χρώσης SEMA3, πλεξίνες και NRP1 μεταξύ SOX4 θετικών και αρνητικών SOX4 περιπτώσεις (

P

= 0,046) (Σχ. 2Ε). Ωστόσο, δεν παρατηρήθηκε καμία διαφορά όταν η έκφραση E2F1 θεωρήθηκε ως η μεταβλητή (

P

= 0,9121). Η υψηλή συσχέτιση της έκφρασης των SOX4 με SEMA3 μέλη της οικογένειας /Plexin /NRP1 στην ανθρώπινη PanIN και PDAC υποδηλώνει ότι SOX4 μπορεί να λειτουργήσει ως παράγοντας κύριο μεταγραφής για να οδηγήσει την έκφραση SEMA3 και Plexin γονίδια στο σχηματισμό του καρκίνου του παγκρέατος.

SOX4 ενεργοποιεί τη μεταγραφή του SEMA3 και Plexin γονίδια

για να αποδείξει ότι SOX4 θα μπορούσε να ρυθμίζουν τη δραστηριότητα μεταγραφή των γονιδίων SEMA3 και Plexin στο PDAC, πρέπει πρώτα να ερευνηθεί αν SOX4 θα μπορούσε να συνδεθεί με την προβλεπόμενη υποστηρικτής κάθε SEMA3 και γονίδιο Plexin. Χρωματίνης ανοσοκαθίζηση πραγματοποιήθηκε σε κύτταρα PANC-1 έδειξε ότι SOX4 πράγματι συνδέεται προς τον προαγωγό της κάθε SEMA3 και Plexin γονίδιο (Εικ. 3Α και 3Β). Σημαντικές πτυσσόμενο αυξήσεις στην δραστικότητα λουσιφεράσης παρατηρήθηκαν στο κατασκεύασμα οδηγείται από τον προαγωγό που λαμβάνεται από SEMA3 και γονίδιο Plexin όταν διαμολύνθηκε σε SOX4 εκφράζουν κύτταρα HeLa. Επιπλέον, συν-μορφομετατροπή ενός φορέα SOX4 εκφράζει ενισχυθεί περαιτέρω η δραστικότητα προαγωγέα (Σχ 3C, Ρ & lt?. 0.001), η οποία εξασθένισε όταν μεταλλάχθηκαν η θέσεις σύνδεσης SOX4-συναίνεσης (AACAATG να AACAAAA και TACAATG να μεταλλάξεις TACAAAA) ( Σχ. 3D). δοκιμασία μετατόπισης κινητικότητας Ομοίως, ηλεκτροφόρηση έδειξε ότι η πρωτεΐνη που εξάγεται από πυρήνες που περιέχουν SOX4 καθυστέρησε την μετανάστευση ενός ανιχνευτή DNA ραδιοσημασμένου αποτελείται από

SEMA3

ή

Plexin

αλληλουχίες υποκινητή σε ένα εξαρτώμενο από τη συγκέντρωση τρόπο . Αυτή η επίδραση ανακουφίστηκε ειδικά από ένα κρύο-σημασμένο ανιχνευτή αποτελείται από αλληλουχίες πρόσδεσης SOX4 συναίνεση και θα μπορούσε να υπερμετατοπισθεί με την προσθήκη αντισωμάτων SOX4 (Σχ. 3Ε). Αντιστρόφως, μεσολάβηση RNAi εξάντληση των SOX4 σε κύτταρα PANC1 (66% και μείωση 78% σε πρωτεΐνη SOX4 για siSOX4 # 1 και siSOX4 # 2, αντίστοιχα, το Σχ. 3F) είχε ως αποτέλεσμα μια συνακόλουθη μείωση των επιπέδων του mRNA και της πρωτεΐνης των περισσότερων SEMA3 /μέλη Plexin οικογένειας και NRP1 (Σχ. 3G και 3Η). Συλλογικά, αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι SOX4 θα μπορούσε να λειτουργήσει ως κύριο παράγοντα για την ενεργοποίηση της μεταγραφής του SEMA3 και Plexin γονίδια ταυτόχρονα, να οδηγήσει στην έκφραση των πολλαπλών SEMA3 και τα μέλη της οικογένειας Plexin σε παγκρεατικά καρκινικά κύτταρα.

(Α) εκπρόσωπο τελικό σημείο PCR της χρωματίνης ανοσοκαταβύθιση (μάρκας) χρησιμοποιώντας αντίσωμα εναντίον SOX4 σε κύτταρα PANC-1. Γονιδιωματικό DNAs ενισχύθηκαν με σύνολα εκκινητών μετά δεσμευμένες πρωτεΐνες υπέστησαν πέψη με πρωτεϊνάση Κ Τα αποτελέσματα έδειξαν ChIP πρόσδεση του SOX4 στην γονιδιωματική περιοχή που φιλοξενεί θέσεις πρόσδεσης SOX4 στο προβλεπόμενο προωθητή του πιο

SEMA3

και

Plexin

γονίδια. (Β) ποσοτικός προσδιορισμός των αποτελεσμάτων ChIP στο (Α), το η & gt? = 3. Κάθε λωρίδα στο σχήμα 3Α δόθηκε μια τιμή που μετρήθηκε με πυκνομετρία και κανονικοποιήθηκε με την τιμή της IgG. αποδοτικότητα τσιπ ορίζεται ως ποσοστό της τιμής που προέρχεται από PCR του SOX4-ανοσοκαθιζάνουν σε σχέση με εκείνη του συνολικού γονιδιωματικού εισόδου.

Οι ράβδοι σφάλματος

, τυπική απόκλιση (SD) από τουλάχιστον εις τριπλούν. (Γ) αυξημένη δραστηριότητα λουσιφεράσης κατασκευασμάτων που περιέχουν

SEMA3

– ή

Plexin

– υποκινητή απουσία (λευκές ράβδοι) ή παρουσία (γκρι ράβδοι) του συν-εκφράζεται SOX4 σε σύγκριση με τον προαγωγέα pGL3-Basic ελέγχου. Τα κατασκευάσματα που φέρουν μία θέση πρόσδεσης SOX4 συναίνεση επιμολύνθηκαν παροδικά σε SOX4 περιέχουν κύτταρα HeLa. Ορατή είναι αναλογίες της έκφρασης λουσιφεράσης πυγολαμπίδας σε έκφραση λουσιφεράσης Renilla (που εκφράζεται από συν-επιμολυσμένα πλασμίδιο), μετρούμενη 48 ώρες μετά την επιμόλυνση, ομαλοποιούνται στη μέση αναλογία από τον pGL3-Basic. Οι μπάρες σφάλματος δείχνουν SD, n & gt? = 4. Φοιτητών

t-test

, *,

P

& lt? 0,01? **

P

& lt? 0.001. Με την παρουσία του συν-επιμολύνθηκαν SOX4, λουσιφεράσης δραστηριότητα καθοδηγείται από κάθε

SEMA3

– ή

Plexin

– υποκινητή αυξάνεται περαιτέρω (γκρίζες ράβδοι) σε σύγκριση με ψευδο-επιμολυσμένα (λευκές ράβδοι) και των ελέγχων . (Δ) Η μεταγραφική δραστηριότητα του

PLXNA2

υποστηρικτής οδηγείται από SOX4 εξασθενεί, όταν οι περιοχές SOX4 δεσμευτική συναίνεση μεταλλαχθεί. Εγκλωβιστούμε αλληλουχία DNA, η συναινετική θέση SOX4 δεσμευτική? Υπογραμμίζουν με τη σκιά σε επιστολές, τις μεταλλαγμένες θέσεις SOX4 δεσμευτική. γράφημα Bar δείχνει ότι η μετάλλαξη του είτε θέση SOX4 δέσμευσης προκάλεσε σημαντική μείωση στην δραστηριότητα λουσιφεράσης καθοδηγείται από

PLXNA2

προαγωγό σε παρουσία υπερεκφράζεται SOX4. Οι μπάρες σφάλματος, SD, n = 5. Φοιτητών

t-test

, *,

P

& lt? 0,01? **

P

& lt? 0.001. (Ε) EMSA δείχνει ότι η μετανάστευση ενός ραδιοσημασμένου θραύσματος DNA που προέρχεται από το

PLXNA2

υποστηρικτής επιβραδύνεται από SOX4 περιέχουν HeLa αργού πυρηνικού εκχυλίσματος σε συγκέντρωση-εξαρτώμενο τρόπο. Το σήμα της πρωτεΐνης-δεσμεύεται καθυστερημένος band (αιχμές βελών) ελαττώθηκε ειδικά από το κρύο ανιχνευτές που περιέχουν ακολουθίες συναίνεσης SOX4 δεσμευτικές και ήταν σούπερ-μετατοπίστηκε από αντι-SOX4 αντίσωμα (άδειο βέλος). Asterisk, μη ειδικών σημάτων δεσμευτικές? βέλος, un-δεσμευμένο ραδιοσημασμένο ανιχνευτή. (F) αποτελεσματική RNAi νοκ ντάουν της ενδογενούς SOX4 στα κύτταρα PANC-1 που παρουσιάζεται από SOX4 ανοσοαποτύπωση. Η τιμή που αναφέρεται είναι η κανονικοποιημένη σχετική ένταση μετριέται με πυκνομετρία (Η αναλογία SOX4 /τουμπουλίνης για ομελέτα-siRNA κυττάρων ορίζεται ως 1.). Δύο σταθεροί κλώνοι siSOX4 επισημαίνονται ως siSOX4 # 1 και # 2 siSOX4 κατασκευάστηκαν με το ολιγονουκλεοτίδιο στόχευσης που στρέφονται εναντίον διαφορετικών αλληλουχιών νουκλεοτιδίων στο

SOX4

γονίδιο (siSOX4 # 1, nt.1999-2019 NM_003107.2? SiSOX4 # 2 , nt.1362-1382 NM_003107.2). (G) Ανοσοκηλίδωση στα κύτταρα SOX4-εξαντλημένο δείχνει μια ταυτόχρονη μείωση στην ποσότητα της πρωτεΐνης του NRP1, SEMA3- και τα μέλη της οικογένειας Plexin-. Τουμπουλίνης χρησιμοποιήθηκε ως πρότυπο για ομαλοποίηση στην ποσοτικοποίηση του κάθε λωρίδας μετρήθηκε με πυκνομετρία. Η αναλογία υποδεικνύεται ήταν η κανονικοποιημένη τιμή σε κύτταρα siSOX4 σε σχέση με την κανονικοποιημένη τιμή στο περιπλεγμένο-siRNA κύτταρα. (H) σε πραγματικό χρόνο PCR για την ποσοτικοποίηση της έκφρασης του mRNA της

SEMA3

και

PLXN

γονιδίων σε κύτταρα SOX4-εξαντλημένο σε σχέση με SOX4-άφθονα κύτταρα κωδικοποιημένο-siRNA (που παρουσιάζεται από πολλαπλή μεταβολή). Μαθητή

t-test

, *,

P

& lt? 0,01? **

P

& lt?. 0.001

Η

μεσολάβηση RNAi εξάντληση των SOX4 καταστέλλει την ανάπτυξη του όγκου

in vitro

και

in vivo

για να διερευνήσουν πώς SOX4 επηρεάζει ογκογένεση στα κύτταρα PDAC, εξετάστηκε πρώτα η επίδραση της SOX4 νοκ ντάουν στον κυτταρικό πολλαπλασιασμό και την εξέλιξη του κυτταρικού κύκλου. Έδειξε ότι ο συνολικός αριθμός των βιώσιμων κυττάρων μειώθηκε σημαντικά σε SOX4-knockdown κυττάρων καλλιεργήθηκαν

in vitro

για τρεις ημέρες (Σχ. 4Α). Κυττάρων πρόοδο του κύκλου και της απόπτωσης ποσοτικά σύγκριση μεταξύ SOX4-καταστέλλεται και -competent κύτταρα και δεν παρατηρήθηκε σημαντική διαφορά με κυτταρομετρία ροής ή δοκιμασία TUNEL αμφισβητήθηκε από γονιδιοτοξική παράγοντα (Σχ. 4Β και 4C). Σε αντίθεση, ο πολλαπλασιασμός των SOX4-καταστέλλεται (siSOX4 # 1 και 2 siSOX4 #) κύτταρα προφανώς μειώθηκε, ως λιγότερο Ki-67 ανοσοαντιδραστικότητα και πολύ λιγότερο την επισήμανση BrdU παρατηρήθηκαν σε κύτταρα siSOX4 (Εικ. 4D), υποδεικνύοντας ότι ο αριθμός των κυττάρων εισέρχονται στον κυτταρικό κύκλο μειώνεται όταν SOX4 είναι εξαντλημένο. Το εύρημα αυτό υποδηλώνει ότι SOX4 θα μπορούσε να λειτουργήσει για να διευκολύνουν τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων όταν εκφράζεται σε καρκινικά κύτταρα του παγκρέατος.

(Α) Ο πολλαπλασιασμός των κυττάρων επηρεάζεται σε PANC-1 κύτταρα με RNAi-καταστολή της SOX4. 30.000 κύτταρα σπάρθηκαν σε κάθε φρεάτιο σε μία πλάκα 12 φρεατίων. Στις 24, 48 ή 72 ώρες μετά την σπορά, τα κύτταρα συλλέχθηκαν και μετρήθηκαν με δοκιμασία εξαίρεσης κυανούν τρυπανίου.

Οι μπάρες σφάλματος

, SD από έξι ανεξάρτητα πειράματα, Μαθητή

t-test

. (Β) Εκπρόσωπος κυτταρομετρίας ροής των κυττάρων siSOX4 βάφονται με ιωδιούχο προπίδιο δεν παρουσιάζει σημαντική διακύμανση από την ομελέτα-siRNA κύτταρα σε απόπτωση (απεικονίζεται από υπο-G1) ή στην εξέλιξη του κυτταρικού κύκλου. Το ποσοστό των κυττάρων σε υπο-G1, G0 /G1, S και G2 /M φάση δείχθηκε στη δεξιά κάτω γωνία της κάθε οικοπέδου. (Γ) εκπρόσωπος TUNEL-σήμανση των κυττάρων αμφισβητήθηκε από την σισπλατίνη γονιδιοτοξικές παράγοντα (10 μg /ml, 12-Η). Οι διαφορές στην απόπτωση δεν παρατηρήθηκε μεταξύ των κυττάρων (ομελέτα-siRNA) SOX4-νοκ ντάουν (siSOX4 # 1 και siSOX4 2 #) και τον έλεγχο. (D) χαμηλότερο ρυθμό πολλαπλασιασμού των κυττάρων και μείωση του αριθμού των κυττάρων που διαμένουν στο Μ φάση στα κύτταρα siSOX4. siSOX4 και κωδικοποιημένα-siRNA κύτταρα απλώθηκαν σε καλυπτρίδες και επωάστηκαν για 48 ώρες. Πριν τη συγκομιδή και στερέωση με παραφορμαλδεΰδη, τα κύτταρα επωάστηκαν με 10 μΜ BrdU για 3 ώρες και στη συνέχεια υποβλήθηκαν σε αντι-Ki-67 ή χρώση αντι-BrdU ανοσοφθορισμού. Είκοσι τυχαία επιλεγμένα πεδία υψηλής ισχύος (χ400) μετρήθηκαν για τη στατιστική ανάλυση (Student του

t

-τεστ). (Ε) όγκου ξενομοσχεύματος κυττάρων siSOX4 /PANC-1 αναπτύσσεται μικρότερη από εκείνη των κυττάρων ελέγχου (κωδικοποιημένο-siRNA) σε SCID ποντικού. Οι ποντικοί θυσιάστηκαν 30 ημέρες μετά τον υποδόριο εμβολιασμό των κυττάρων ελέγχου στα αριστερά και τα κύτταρα siSOX4 στη δεξιά πλευρά του πλευρού. (F) μικρότερο και ελαφρύτερο ξενομοσχεύματα όγκων των κυττάρων siSOX4 σε σύγκριση με εκείνα του ελέγχου (η = 9, του Student

t

-τεστ). (G) εκπρόσωπος Η &? Επισήμανση Ε, Ki-67, phh3 ανοσοχρώση, και TUNEL σε τομές ιστών από ξενομοσχεύματα όγκου. Ράβδοι κλίμακας = 50 μm. (Η, Ι και J) ποσοτικοποίηση του πολλαπλασιασμού (Ki-67 επισήμανση), η απόπτωση (TUNEL χρώση) και μίτωση (phh3-ανοσοχρώση). Δεκαοκτώ τυχαία επιλεγμένα πεδία (x200) σε κάθε τμήμα Ki-67-βάφονται και τα κύτταρα σε είκοσι επτά τυχαία επιλεγμένα πεδία (X400) για την επισήμανση TUNEL ή ρΗΗ3 ανοσοχρώση μετρήθηκαν σε κάθε όγκο ξένου μοσχεύματος. Ο δείκτης πολλαπλασιαζόμενα και μιτωτικής μετρήσεις των κυττάρων του όγκου siSOX4 είναι σημαντικά χαμηλότερη από εκείνη των κυττάρων ελέγχου, ενώ το ποσοστό των αποπτωτικών κυττάρων δεν διέφερε (του Student

t

-τεστ). n, ο συνολικός αριθμός των κυττάρων που μετρήθηκαν.

Η

Χρησιμοποιώντας ένα

in vivo

ογκογένεση δοκιμασία, αποδείξαμε επίσης ότι οι όγκοι που αναπτύσσονται από κύτταρα SOX4-κατασταλεί ήταν πολύ μικρότερες σε μέγεθος και βάρος σε σύγκριση με εκείνους που αυξάνεται από έλεγχο SOX4-ικανά κύτταρα (Εικ. 4Ε και 4F). Όπως φαίνεται στο Σχ.