Αφηρημένο

Η παρεκκλίνουσα σηματοδότηση Wnt /β-κατενίνης έχει έντονα συνδέεται με την ογκογένεση του ανθρώπινου καρκίνου του παχέος εντέρου. Αναστολείς αυτού του μονοπατιού μπορεί στη συνέχεια να προσφέρουν θεραπευτικές στρατηγικές, καθώς και χημειοπροφύλαξη για αυτή την κακοήθη νόσο. Henryin είναι μια ent-kaurane διτερπενικών απομονωθεί από

Isodon

rubescens

var.

lushanensis

, ένα φυτό πολύ καιρό χρησιμοποιείται στη λαϊκή ιατρική για την πρόληψη της φλεγμονής και γαστρεντερική νόσο. Στην παρούσα μελέτη, αναφέρουμε ότι henryin επιλεκτικά αναστέλλει τον πολλαπλασιασμό των ανθρώπινων καρκίνου του παχέος εντέρου κύτταρα με γεωγραφική ένδειξη

50 αξία στη νανο-μοριακή ποικιλία. ανάλυσης μικροσυστοιχιών και αναλύσεις δημοσιογράφος έδειξε ότι henryin εργάστηκε ως νέου ανταγωνιστή του μονοπατιού σηματοδότησης Wnt. Henryin μείωσε την έκφραση της κυκλίνης D1 και C-myc, και επάγεται G1 σύλληψης /S φάσης σε κύτταρα HCT116. Ταυτόχρονα, henryin δεν επηρέασε την κυτοσόλιο πυρηνική διανομή των διαλυτών β-κατενίνης, αλλά εξασθενημένη τη σύνδεση των β-κατενίνης /TCF4 μεταγραφικού συμπλόκου πιθανόν μέσω της άμεσης παρεμπόδισης της πρόσδεσης του β-κατενίνης σε TCF4. Έχουμε, επίσης, στη συνέχεια, ανέλυσε τη σχέση δομής-δραστικότητας μεταξύ των διτερπενοειδή τύπου ent-kaurane. Τα στοιχεία μας δείχνουν ότι henryin, ως νέο αναστολέα της Wnt σηματοδότηση, θα μπορούσε να είναι ένας πιθανός υποψήφιος για περαιτέρω προκλινική αξιολόγηση για τη θεραπεία του καρκίνου του παχέος εντέρου, και ως εκ τούτου εγγυάται περαιτέρω διερεύνηση

Παράθεση:. Λι Χ, Pu J, Jiang S, Su J, L-Κονγκ, ο Μάο Β, et al. (2013) Henryin, ένας ent-kaurane διτερπενικών, αναστέλλει σηματοδότηση Wnt μέσω παρεμβολές με β-κατενίνης /TCF4 Αλληλεπίδραση σε καρκινικά κύτταρα του παχέος εντέρου. PLoS ONE 8 (7): e68525. doi: 10.1371 /journal.pone.0068525

Επιμέλεια: Chunming Liu, το Πανεπιστήμιο του Κεντάκι, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 4 Μαρ, 2013? Αποδεκτές: 30 Μάη, 2013? Δημοσιεύθηκε: 2 Ιούλη, 2013

Copyright: © 2013 Li et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε τόσο από το Πρόγραμμα 100 Ταλέντα (YL) και το Ίδρυμα Δυτικής Light (JP) της κινεζικής Ακαδημίας Επιστημών, ο Ταγματάρχης μέλος του Προγράμματος βασικής Έρευνας Ανάπτυξης της Κίνας (Αρ 2009CB522300), το Ίδρυμα Φυσικών Επιστημών της Κίνας (Αρ 81173076, 81172939), και η Πρόσληψη Top Talent Επιστημών και Τεχνολογίας της επαρχίας Γιουνάν (2009C1120), Κίνα. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Καρκίνος του παχέος εντέρου (CRC) είναι μια συχνή κακοήθεια που, παρά τις προόδους στη θεραπεία και τη βελτίωση της διάγνωσης, παραμένει μια μεγάλη πρόκληση για το ιατρικό κατεστημένο παγκόσμιο επίπεδο. Αν και η ακριβής παθογένεια της νόσου δεν είναι απολύτως κατανοητή, χρόνια ασθένεια φλεγμονής του εντέρου θεωρείται παράγοντας κινδύνου που συνεισφέρει στην ανάπτυξη και μετάσταση καρκίνου του παχέος εντέρου [1]. Πολυάριθμες μελέτες έχουν, ωστόσο, πρότειναν ότι ανώμαλη ενεργοποίηση της κανονικής οδού σηματοδότησης Wnt /β-κατενίνης παίζουν σημαντικό ρόλο στην ογκογένεση. Εν απουσία συνδετήρων Wnt, β-κατενίνης φωσφορυλιώνεται από ένα σύμπλοκο συμπεριλαμβανομένων αδενωματώδη πολυποδίαση coli (APC) /Dsh /Axin /ΟδΚ3β, το οποίο στη συνέχεια ουβικουιτινωμένης και αποικοδομείται μέσω της οδού πρωτεασώματος. Όταν η οδός ενεργοποιείται από την πρόσδεση συνδετήρων Wnt να σύμπλοκο υποδοχέα της μεμβράνης της, η καταστροφή β-κατενίνης σύμπλοκο διασπάται και β-κατενίνης σταθεροποιείται και εισέρχεται στον πυρήνα για την ενεργοποίηση της έκφρασης γονιδίου-στόχου σε συνδυασμό με τους παράγοντες μεταγραφής TCF [2,3 ].

Σε καρκινικά κύτταρα κόλου, η οδός /β-κατενίνης Wnt συχνά ενεργοποιούνται ανωμάλως [4-6]. Σύμφωνα με πρόσφατες αναφορές από την Atlas Δίκτυο για τον Καρκίνο Γονιδιώματος, η οδός Wnt ιδιοσυστατικά ενεργοποιημένη σε πάνω από το 90% των ανθρώπινων ορθοκολικού καρκίνου τόσο από γενετικούς όσο και επιγενετικών αλλαγών σε έναν αριθμό γονιδίων που εμπλέκονται στην οδό σηματοδότησης Wnt, όπως β-κατενίνης , APC και Axin2 [7]. Η ενεργοποίηση του σηματοδότηση Wnt /β-κατενίνης στη συνέχεια αυξάνει την έκφραση του Wnt γονιδίων στόχων, όπως Κυκλίνη D1 [8], C-myc [9] και Σουρβιβίνης [10], τα οποία εμπλέκονται στον πολλαπλασιασμό των κυττάρων, την απόπτωση και κυτταρικό κύκλο απορρύθμιση στην ανάπτυξη και την εξέλιξη των κακοήθων παχέος φαινοτύπων του καρκίνου [11-13].

Μέχρι σήμερα, η πρόοδος στη θεραπεία και τη διάγνωση του καρκίνου του παχέος εντέρου είναι ακόμα περιορισμένη αποτελεσματικότητά τους, προτρέποντας μας να εξετάσει εναλλακτικές επιλογές για τη μετακίνηση προς τα εμπρός. Στη λαϊκή ιατρική, ορισμένοι

Isodon

είδη, ευρέως κατανεμημένα φυτά, χρησιμοποιούνται ως ποτό τσαγιού για την πρόληψη της φλεγμονής, γαστρεντερικών βακτηριακών λοιμώξεων και ακόμη και όγκων. Υποθέσαμε ότι οι χημικές ουσίες που υπάρχουν σε ορισμένες

Isodon

ειδών που ενδέχεται κατείχε χημειοπροληπτικές ιδιότητες, καθώς και χημειοθεραπευτικά επιδράσεις κατά του καρκίνου. Σε προηγούμενη εργασία μας, πολλά χημικά συστατικά απομονώθηκαν και χαρακτηρίστηκαν από

Isodon

είδη, αλλά η μελέτη των βιοδραστικών το προφίλ τους είναι πολύ περιορισμένη και οι μηχανισμοί που στερούνται [14-16].

Το παρόν μας μελέτη επικεντρώνεται στην εξέταση των ενώσεων που προσδίδουν κατά του όγκου αποτελέσματα, ειδικά για τα ανθρώπινα ορθοκολικού καρκίνου κύτταρα. Βρήκαμε ότι henryin, ένα διτερπενικών ent-kaurane, απομονωμένο από το

Isodon

rubescens

var.

lushanensis

, επέδειξαν επιλεκτική ανασταλτικά αποτελέσματα ανάπτυξης σε ανθρώπινα κύτταρα καρκίνου του παχέος με αναστολή σηματοδότηση Wnt. Τα στοιχεία μας έδειξαν ότι henryin παρεμβαίνει στην /TCF σύνθετη αλληλεπίδραση β-κατενίνης και επάγει την G1 σύλληψη /S φάσης σε καρκίνο του παχέος εντέρου κύτταρα. Κατά συνέπεια, henryin, ως νέος αναστολέας του Wnt οδού /β-κατενίνης, θα μπορούσε να κάνει μια πολλά υποσχόμενη υποψήφιο φάρμακο τόσο για την πρόληψη του καρκίνου του παχέος εντέρου, καθώς και μια νέα θεραπευτική.

Υλικά και Μέθοδοι

Αντιδραστήρια

RPMI 1640, τροποποιημένο μέσο Eagle του Dulbecco (DMEM), ορό εμβρύου μόσχου (FBS), διάλυμα αντιβιοτικών, και θρυψίνη-ΕϋΤΑ αγοράσθηκαν από την Hyclone (Logan, UT, USA). Η πλήρης κοκτέιλ αναστολέα πρωτεάσης αγοράστηκε από την Roche Applied Science (Indianapolis, ΙΝ, USA). ποντικού μονοκλωνικό αντι-CyclinD1 και αντισώματα αντι-β-κατενίνης αγοράσθηκαν από BD Biosciences (San Jose, CA, USA). Κουνέλι μονοκλωνικό αντι-TCF4 και πολυκλωνικό αντίσωμα αντι-φωσφο-β-κατενίνης αγοράσθηκαν από τη Cell Signaling Technology (Danvers, ΜΑ, USA). Κουνέλι μονοκλωνικό αντι-ρ21 αγοράστηκε από Epitomics, Inc (Burlingame, CA, USA). Mouse μονοκλωνικό αντι-λαμίνη A /C, αντι-β-ακτίνης, αντι-ο-Μγο αντισώματα και άλλα αντιδραστήρια, εκτός αν υποδεικνύεται διαφορετικά, αγοράστηκαν από την Sigma-Aldrich (St. Louis, ΜΟ, USA). Καθαρισμένη ανθρώπινη ανασυνδυασμένες πρωτεΐνες β-κατενίνης αγοράστηκε από την σινο βιολογικό inc. Καθαρισμένη ανθρώπινη ανασυνδυασμένη πρωτεΐνες TCF4 αγοράστηκε από ΟηΟεηε. σύστημα δοκιμασίας γονιδίου αναφοράς λουσιφεράσης Dual-αγοράστηκε από την Promega (Madison, WI, USA). Lipofectamine 2000 αγοράστηκε από την Invitrogen (Camarillo, CA, USA). Η QuantiTect SYBR, Πράσινη PCR Kit ελήφθη από την Qiagen (Γερμανία).

Ενώσεις

Henryin και τα ανάλογά της εξήχθησαν από το

Isodon

rubescens

var .

lushanensis

, όπως περιγράφηκε προηγουμένως [14-16]. Οι ενώσεις διαλύθηκαν σε διμεθυλοσουλφοξείδιο (DMSO).

Οι κυτταρικές σειρές

Καρκίνο του παχέος εντέρου κυτταρικές γραμμές (SW480, ΗΤ-29 και HCT116), ανθρώπινο πνεύμονα κυτταρική σειρά καρκίνου Α549, ανθρώπινο φυσιολογικό πνεύμονα επιθηλιακά κυτταρική γραμμή (Beas-2Β) και ΗΕΚ293Τ αγοράστηκαν από την ATCC. Η κανονική του παχέος επιθηλιακά κυτταρική σειρά (CCD-841-con) [17] είχε την καλοσύνη να προικισμένος από τον Δρ Λιν, Li του Ινστιτούτου Βιοχημείας και Βιολογίας Κυττάρου, Κινεζική Ακαδημία Επιστημών (Σαγκάη, Κίνα). Τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν σύμφωνα με τις συστάσεις του κατασκευαστή. Όλα μέσο συμπληρώθηκαν με 10% ορό εμβρύου βοός (FBS) και 1% αντιβιοτικά-αντιμυκητιακά (100 μονάδες /ml πενικιλλίνης G νάτριο, 100 mg /ml στρεπτομυκίνη) (Gibco, Invitrogen, USA).

MTS δοκιμασίας και GI

50 προσδιορισμός

τα κύτταρα σπάρθηκαν σε πλάκες 96 φρεατίων σε πυκνότητα 5 χ 10

3cells /φρεάτιο και επωάστηκαν για 12h σε CO

2 θερμοκοιτίδα. Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε αγωγή με τη δόση που κυμαίνεται από 0.008 έως 4μΜ του henryin και των αναλόγων της, με σισπλατίνη ως θετικός έλεγχος για 48 ώρες. Στη συνέχεια, 20 μΐ αντιδραστηρίου CellTiter 96® Υδατικό One Solution (Promega, Madison, USA) προστέθηκε και τα κύτταρα επωάστηκαν περαιτέρω στους 37

° C για 1-2 ώρες. Η βιωσιμότητα των κυττάρων στη συνέχεια μετρήθηκε με ανάγνωση της απορρόφησης σε μήκος κύματος 490 nm. Ο ακόλουθος τύπος χρησιμοποιήθηκε για να προσδιοριστούν οι τιμές αναλογία κυτταρικής ανάπτυξης: 100 * (Α490 (δείγμα, T) – Α490 (δείγμα, Τ0)) /(Α490 (έλεγχος, T) – Α490 (έλεγχος, Τ0)). Η GI

50 τιμές-οι συγκεντρώσεις που προκαλούν 50% αναστολή-είχαν κυτταρικής ανάπτυξης προσδιορίστηκε με ανάλυση μη γραμμικής παλινδρόμησης χρησιμοποιώντας λογισμικό TableCurve.

Microarray και ανάλυση δεδομένων

SW480 κύτταρα επωάστηκαν με 4μΜ του henryin ή διμεθυλοσουλφοξειδίου (DMSO) ως έλεγχος για 12 ώρες. Τα κύτταρα λύθηκαν με ΤΚΙζοΙ (Invitrogen, USA) και τα συνολικά RNAs απομονώθηκαν με την QIAGEN RNeasy Mini Kit (Qiagen, Germany), πριν την αντίστροφη μεταγραφή, την επισήμανση και υβριδοποίηση σε Agilent Σύνολο Ανθρώπινου Γονιδιώματος Oligo Microarray (4 × 44K) (Agilent Technologies, ΡβΙο Alto, CA). Η ανάλυση μικροσυστοιχιών διεξήχθη από τη Σαγκάη Bio Corporation. Μετά GO σχολιασμού και ανάλυσης μονοπατιού, επιλέχθηκαν τα γονίδια με περισσότερα από 2 φορές μεταβολή στο επίπεδο έκφρασης για περαιτέρω ανάλυση.

κυττάρων επιμόλυνσης και λουσιφεράση δοκιμασίες ρεπόρτερ

Για δοκιμασίες γονιδίου αναφοράς, τα κύτταρα σπάρθηκαν σε πλάκες 96-φρεατίων και επωάστηκαν στους 37 ° C σε

2 επωαστή για 12 ώρες 5% CO. SW480 και HCT116 κύτταρα συν-επιμολύνθηκαν με 100 ng των πλασμιδίων συνολικά, συμπεριλαμβανομένων 80ng ενός καλά χαρακτηρισμένου Wnt /β-κατενίνης μονοπάτι απόκρισης λουσιφεράσης πυγολαμπίδας πλασμίδιο αναφοράς SuperTOPflash (ST-Luc) και 20 ng του pRL-SV40 (Promega) ρεπόρτερ έλεγχο πλασμίδιο χρησιμοποιώντας Lipofectamine 2000 (Invitrogen) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Κάθε φρεάτιο των κυττάρων ΗΕΚ293Τ διαμολύνθηκε με 200 ng των πλασμιδίων συνολικά, συμπεριλαμβανομένων 80ng του ST-Luc και 20 ng του pRL-SV40 και 10 ng του β-κατενίνης ή 64ng του wnt1 και κενού φορέα πλασμίδια όπως υποδεικνύεται. Μερικά 3h μετά την επιμόλυνση, τα κύτταρα επωάστηκαν με διάφορες συγκεντρώσεις ενώσεων για 24 ώρες. Τα κύτταρα λύθηκαν με 50 μΐ ρυθμιστικό λύσης Promega σε κάθε φρεάτιο και δραστικότητα λουσιφεράσης μετρήθηκε και ομαλοποιήθηκε με δραστηριότητα ανταποκριτή pRL-SV40. Όλα τα πειράματα έγιναν εις τριπλούν ανεξάρτητα. Τα αποτελέσματα αναφέρονται ως μέσες τιμές και τυπικές αποκλίσεις (SD).

αντίστροφη μεταγραφή και ποσοτική πραγματικού χρόνου PCR

Ολικό RNA εξήχθη από καλλιεργημένα κύτταρα με ΤΚΙζοΙ και αντίστροφη μεταγραφή πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας το SuperScript III Αντίστροφη Transcription Kit (Invitrogen) με ολίγο (dT) αστάρωμα σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. μεταγραφές γονιδίων ποσοτικοποιήθηκαν με πραγματικού χρόνου PCR χρησιμοποιώντας SYBR Green Ι και β-ακτίνη χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος. Οι primes που χρησιμοποιήθηκαν ήταν:

Ανθρώπινο CyclinD1 πρόσθιο εκκινητή: 5′-AAGTGCGAGGAGGAGGTCTT-3 ‘και το αντίστροφο εκκινητή: 5′-GGATGGAGTTGTCGGTGTAGA-3’

Ανθρώπινο C-myc μπροστά αστάρι:. 5 «-CTTCTCTCCGTCCTCGGATTCT-3 ‘και τον αντίστροφο εκκινητή:».

Ανθρώπινο β-ακτίνης προς τα εμπρός εκκινητής: 5′-CGCGAGAAGATGACCCAGAT-3′ 5′-GAAGGTGATCCAGACTCTGACCTT-3 και τον αντίστροφο εκκινητή: 5′-GATAGCACAGCCTGGATAGCAAC-3 ‘.

πειράματα RT-PCR διεξήχθησαν εις τριπλούν και η αποτελεσματικότητα της PCR με εκκινητές δίδονται ήταν μεταξύ 95 και 100%. καμπύλες τήξης διεξήχθησαν επίσης για την παρακολούθηση των πολλαπλασιασμούς εκκινητή-ειδική.

κυτοσόλιο και πυρήνα κλασματοποίηση και κηλίδωση Western ανάλυση

SW480 κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με τον henryin σε πλάκες 6 φρεατίων. Κλασματοποιημένα πυρηνικά και κυτοσολικά προϊόντα λύσης λήφθηκαν χρησιμοποιώντας ρυθμιστικό πυρηνικής εκχύλισης και υποτονικό ρυθμιστικό διάλυμα λύσης, αντίστοιχα. Όλα τα ρυθμιστικά εκχύλιση πρωτεΐνης συμπληρώθηκαν με Complete κοκτέιλ αναστολέα πρωτεάσης και του αναστολέα φωσφατάσης κοκτέιλ (Roche). Η συγκέντρωση πρωτεΐνης του κάθε ακατέργαστου προϊόντος λύσης προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας το Enhanced BCA Protein Assay Kit (Beyotime, Σαγκάη, Κίνα). Οι κανονικοποιημένες ποσότητες των δειγμάτων κυτταρολύματος φορτώθηκαν σε SDS-PAGE και μεταφέρθηκαν στο διφθοριούχου πολυβινυλιδενίου (PVDF) μεμβράνες (Millipore, Bedford, ΜΑ, USA). Ανοσοκηλίδωση διεξήχθη χρησιμοποιώντας αντισώματα ανίχνευσης φωσφο-β-κατενίνης (Ser33 /37 /Thr41), β-κατενίνης, Axin2, CyclinD1, C-myc, Survivin, Ρ21, TCF4, με Lamin A /C και β-ακτίνη χρησιμοποιήθηκαν ως έλεγχοι φόρτωση . HRP συζευγμένο αντι-ποντικού IgG και αντι-κουνελιού IgG χρησιμοποιήθηκαν σαν δεύτερα αντισώματα. SuperSignal West Pico χημειοφωταύγειας Υπόστρωμα (Thermo Scientific) χρησιμοποιήθηκε για την ανίχνευση χημειοφωταύγειας, και κηλίδες απεικονίστηκαν χρησιμοποιώντας το φθορισμού Image Analyzer LAS-4000mini System (GE, USA).

συνανοσοκαθίζησης ανάλυση

κύτταρα SW480 καλλιεργήθηκαν σε τρυβλία 6 φρεατίων, υποβλήθηκε σε επεξεργασία με henryin και τα ανάλογά της enmenol και minheryin C για 12h, λύθηκαν σε ρυθμιστικό λύσης πρωτεΐνη (50 mM Tris-HCl, ρΗ 7.4, 150mM NaCl, 1% Triton Χ-100, 1 mM EDTA , και αναστολείς πρωτεϊνάσης) και φυγοκεντρείται σε 14.000 χ g για 15 λεπτά στους 4 ° C. Το υπερκείμενο επωάστηκε με ένα ειδικό πρωτογενές αντίσωμα όλη τη νύκτα στους 4 ° C και στη συνέχεια επωάστηκαν με A /G PLUS αγαρόζης (Santa Cruz Biotechnology, Inc.) για τουλάχιστον 2 ώρες. Τα σφαιρίδια στη συνέχεια πλύθηκαν πέντε φορές και επανα-εναιωρήθηκε σε 50 μΐ ρυθμιστικού διαλύματος SDS φόρτωσης. Η ανάλυση στυπώματος Western έγινε επί των δειγμάτων.

Η in vitro δοκιμασία σύνδεσης

Για να προσδιοριστεί η επίδραση των ενώσεων στην αναστολή της β-κατενίνης /πρόσδεσης TCF4, καθαρισμένες ανασυνδυασμένες πρωτεΐνες β κατενίνης (0.8μg) και TCF4 (0.5μg) επωάστηκαν με henryin και τα ανάλογά της enmenol και minheryin C σε υποδεικνυόμενες συγκεντρώσεις σε 4 ° C για 2 ώρες, αντίστοιχα. β-κατενίνης συγκροτήματα /TCF4 κατεδαφίστηκαν χρησιμοποιώντας σφαιρίδια αγαρόζης /G PLUS πρωτεΐνης Α κορεσμένο με αντίσωμα β-κατενίνης. Η ανίχνευση στη συνέχεια διεξήχθη χρησιμοποιώντας TCF4 αντισώματος σε κηλίδωση Western ανάλυση.

κυτταρικού κύκλου ανάλυση

κύτταρα HCT116 (5 × 10

5cells /φρεάτιο σε πλάκες 12 φρεατίων) επωάστηκαν με henryin για 0h, 12 ώρες και 24 ώρες, αντίστοιχα. Όλα τα προσκολλημένα κύτταρα συλλέχθηκαν και πλύθηκαν δύο φορές με PBS. Τα κύτταρα σταθεροποιήθηκαν με 70% όλη τη νύκτα αιθανόλη. Σταθερή κύτταρα πλύθηκαν με PBS, και στη συνέχεια χρωματίστηκαν με ένα 50 μg /ml ιωδιούχου προπιδίου διάλυμα (ΡΙ) που περιέχει 50 μg /ml RNase Α για 30 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. Η ένταση φθορισμού αναλύθηκε με ροή FACSCalibur1 κυτταρόμετρο (BD Biosciences, San Jose, CA, USA). Τα ποσοστά των κυττάρων που κατανέμεται σε διαφορετικές φάσεις του κυτταρικού κύκλου προσδιορίστηκαν χρησιμοποιώντας ΜΟϋΡΙΤ LT 2.0.

Στατιστικά

Δεδομένα παρουσιάζονται σαν την μέση ± SD για τις υποδεικνυόμενες αριθμούς ανεξάρτητα πραγματοποιήθηκαν πειράματα. ανάλυση μη γραμμικής παλινδρόμησης για τον υπολογισμό του GI

50 ή IC

50 τιμές διεξήχθη με TableCurve. Η στατιστική σημαντικότητα αναλύθηκε με Μαθητή

t-test

ή μονόδρομη ANOVA σε SigmaStat 3.1. Οι διαφορές θεωρήθηκαν στατιστικά σημαντικές όταν Ρ & lt? 0.05.

Αποτελέσματα

Henryin αναστέλλει επιλεκτικά την ανάπτυξη του καρκίνου του παχέος εντέρου και κυττάρων επάγει G1 σύλληψη φάση του κυτταρικού κύκλου

Οι επιδράσεις αναστολής της ανάπτυξης των henryin σε ανθρώπινα καρκινικά κύτταρα ήταν αξιολογούνται κυρίως με αναλύσεις MTS. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 1Β, henryin επέδειξαν ισχυρότερη ανασταλτική επίδραση στην ανάπτυξη των καρκινικών κυττάρων του κόλον (SW480, ΗΤ-29 και HCT116) από οποιαδήποτε άλλα είδη καρκινικών (πνεύμονας καρκινική κυτταρική γραμμή Α549) ή φυσιολογικά κύτταρα (ανθρώπινα φυσιολογικά επιθηλιακά κυτταρική σειρά CCD -841-con και φυσιολογικό πνεύμονα επιθηλιακών κυττάρων γραμμή Beas-2Β). Ως μάρτυρας, η σισπλατίνη είχε παρόμοια ανασταλτικά αποτελέσματα μεταξύ όλων των διαφορετικών κυτταρικών γραμμών που μελετήθηκαν (Σχήμα 1 C). Ανάλυση της GI

50 τιμές του henryin και σισπλατίνης για τις διαφορετικές κυτταρικές σειρές υποστήριξε επίσης την παρατήρηση ότι henryin είχε εκλεκτικό ανασταλτικό αποτέλεσμα επί κυττάρων καρκίνου του κόλου (Σχήμα 1 D). Τα ανασταλτικά αποτελέσματα ανάπτυξης henryin επί κυττάρων SW480 έδειξε μια εξαρτώμενη από το χρόνο δόσης τρόπο (δεν παρουσιάζονται τα δεδομένα). Η ανάλυση κυτταρικού κύκλου έδειξε ότι τα κύτταρα είχαν συλληφθεί κατά τη φάση G1 σε κύτταρα HCT116 που έλαβαν θεραπεία με henryin σε ένα χρονοεξαρτώμενο τρόπο (Εικόνα 1 Ε). Αυτά τα αποτελέσματα μαζί δείχνουν ότι henryin παρουσίασαν εκλεκτική αναστολή της ανάπτυξης για καρκίνο του παχέος εντέρου κύτταρα.

(Α) Οι δομές των henryin και ent-kaurane φαίνονται. (Β) αναστολής της ανάπτυξης των henryin σε διάφορες κυτταρικές σειρές, συμπεριλαμβανομένων κυτταρικών σειρών καρκίνου του παχέος εντέρου (SW480, HCT116 και ΗΤ29), η κανονική του παχέος επιθηλιακή κυτταρική σειρά CCD-con-841, του πνεύμονα καρκίνου του Α549 κυτταρική γραμμή, και φυσιολογικό πνεύμονα επιθηλιακή κυτταρική γραμμή Beas- 2Β, προσδιορίζεται με προσδιορισμούς MTS με σισπλατίνη χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος (C). Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με henryin έως 72 ώρες σε διάφορες συγκεντρώσεις. Η απορρόφηση μετρήθηκε στα 490 nm. Όλα δειγματοληψία έγινε εις τριπλούν και τα δεδομένα παρουσιάζονται ως μέση τιμή ± SD. (Δ) Η διάμεση συγκέντρωση αναστολής της ανάπτυξης (GI

50, 72h) τιμές του henryin και σισπλατίνη για διάφορες κυτταρικές γραμμές. (Ε) Αντιπροσωπευτική ιστογράμματα που δείχνει τη διανομή του κυτταρικού κύκλου, όπως αναλύεται με κυτταρομετρία ροής σε κύτταρα HCT116 σε επεξεργασία με 4μΜ του henryin για 0h, 12h και 24 ώρες αντίστοιχα. Μετρήσεις των κυττάρων φάσης G1 αυξηθεί εντυπωσιακά τα επεξεργασμένα κύτταρα σε ένα χρόνο-εξαρτώμενο τρόπο.

Η

Henryin παρεμβαίνει με σηματοδότηση Wnt στα κύτταρα CRC

Για να διερευνήσουν τις υποκείμενων μηχανισμών μέσω των οποίων henryin αναστέλλει την ανάπτυξη των κυττάρων καρκίνου του παχέος εντέρου, πραγματοποιήσαμε ανάλυση μικροσυστοιχιών και μεταβολές της γονιδιακής έκφρασης αναλύθηκαν σε SW480 κύτταρα επεξεργασμένα henryin. Τα γονίδια διηθούνται θέτοντας κριτήριο φορές αλλοίωση & gt? 2 (up-ρυθμιζόμενες) ή & lt? 0,5 ​​(κάτω-ρυθμιζόμενες) ως διαφορικά εκφρασμένων γονιδίων. Τόσο GO σχολιασμό και ανάλυση μονοπατιού έδειξε ότι henryin επηρεάζει έντονα την μονοπάτι σηματοδότησης Wnt, καθώς και άλλα αλλαγμένη οδούς που σχετίζονται με καρκίνο του παχέος εντέρου βιολογικών διεργασιών και στις δύο βάσεις δεδομένων KEGG και BioCarta (Σχήμα 2Α-Β).

( Α) (ανάλυση Β) ανάλυση μικροσυστοιχιών και τα δεδομένα της διαφορικής έκφρασης γονιδίων υπό θεραπεία henryin. SW480 κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία για 12 ώρες με 4μΜ του henryin με 0,5% DMSO χρησιμοποιήθηκε ως μάρτυρας στην δοκιμασία. GO σχολιασμό και την οδό ανάλυση χρησιμοποιήθηκαν από τις βάσεις δεδομένων BioCarta και KEGG, αντίστοιχα. Τα γονίδια με πλάσια μεταβολή τουλάχιστον & gt? 2 (πάνω ρυθμισμένα) ή & lt? 0,5 ​​(κάτω ρυθμισμένα) ελήφθησαν ως διαφορικά εκφραζόμενα γονίδια. Η ανάλυση των δεδομένων και οι στατιστικές που παράγονται μόνο όταν τα χτυπήματα & gt? 5 σε κάθε οδό σηματοδότησης. Αντιπροσωπευτικές πορείες προκύπτουν από την ανάλυση των δεδομένων των μικροσυστοιχιών εμφανίζονται. (Γ) Henryin αναστέλλει την έκφραση ανταποκριτού Wnt με δοσο-εξαρτώμενο τρόπο σε wnt1 επιμολυσμένα κύτταρα ΗΕΚ293Τ, και ορθοκολικού καρκίνου, κύτταρα SW480 και HCT116. Τρεις ώρες μετά την επιμόλυνση του Wnt1 ή /και ST-Luc, DMSO ή henryin με ενδεικνυόμενη δοσολογία προστέθηκε στα κύτταρα για επιπλέον 24 ώρες και η δραστικότητα λουσιφεράσης μετρήθηκε στη συνέχεια. (D) Henryin (4μΜ) αναστέλλει κατά προτίμηση την σηματοδότηση Wnt (ST-Luc) πάνω από το μονοπάτι σηματοδότησης ΝΡ-κΒ (NF-κΒ-Luc) σε κύτταρα ΗΕΚ293Τ. Σηματοδότηση Wnt διεγέρθηκε με επιμόλυνση wnt1 και σηματοδότησης ΝΡ-κΒ διεγέρθηκε με 25 ng /mL TNFa. Κάθε ράβδος είναι η μέση ± SD από τρία ανεξάρτητα πειράματα. * Ρ & lt? 0,05, ** Ρ & lt? 0,01, σε σχέση με τον έλεγχο του οχήματος. NS, δεν είναι σημαντική.

Η

Μετά την ανάλυση μικροσυστοιχιών, ελέγξαμε την επίδραση της henryin για σηματοδότηση Wnt /β-κατενίνης χρησιμοποιώντας τη δοκιμασία TOPflash δημοσιογράφος. Σε wnt1 επιμολυσμένα κύτταρα ΗΕΚ293Τ, henryin ανέστειλε την έκφραση ανταποκριτού σηματοδότηση Wnt σε ένα δοσο-εξαρτώμενο τρόπο μετά από 24 ώρες θεραπείας (Σχήμα 2C). Wnt σηματοδότηση συστατικώς ενεργοποιημένη σε SW480 και HCT116 κυττάρων λόγω APC αποκοπής και μετάλλαξης β-κατενίνης, αντίστοιχα. Σε αμφότερες τις κυτταρικές γραμμές, η σηματοδότηση Wnt ανεστάλη επίσης με henryin δοσοεξαρτώμενο (Σχήμα 2C). Ταυτόχρονα, henryin δεν έδειξε σαφή επίδραση επί της δραστικότητας του ΝΡ-κΒ σηματοδότηση αποκρίνεται αναφοράς λουσιφεράσης (NF-κΒ-Luc) (Σχήμα 2D). Αυτά τα δεδομένα υποδεικνύουν ότι henryin ειδικώς αναστέλλει σηματοδότηση Wnt /β-κατενίνης.

Για να χαρακτηρίζει τη σχέση δομής-δραστικότητας των henryin, ερευνήσαμε τη δράση των πρόσθετων αναλόγων henryin (Σχήμα 3Α) και εξετάστηκαν οι επιπτώσεις τους στη σηματοδότηση Wnt με ST-Luc δοκιμασία ρεπόρτερ. Δύο από τις ενώσεις, phyllostachysin F και oridonin, οι οποίες διαθέτουν μία ομάδα κετόνης στο C-15 και 14β-ΟΗ, παρόμοια με henryin, επίσης έδειξε διακριτή ανασταλτικά αποτελέσματα επί της δραστικότητας ST-Luc. Εν τω μεταξύ, τα ανάλογα henryin enmenol, minheryin και eriocalyxin Β, τα οποία στερούνται την ομάδα κετόνης στο C-15 ή 14β-ΟΗ, δεν έδειξε καμία επίδραση επί της δραστικότητας ανταποκριτή Wnt (Σχήμα 3Β-C). Στη συνέχεια, εξετάσαμε περαιτέρω τις επιδράσεις αναστολής της ανάπτυξης του enmenol, minheryin και eriocalyxin Β Enmenol και minheryin C, σύμφωνα με μη-ανασταλτική δράση τους επί σηματοδότηση Wnt, δεν παρουσίασαν αύξηση-ανασταλτική επίδραση στα καρκινικά κύτταρα του παχέος (Σχήμα 3D). Αξιοσημείωτα, eriocalyxin Β έδειξε ισχυρή κυτοτοξικότητα έναντι ορθοκολικού καρκίνου, κύτταρα καρκίνου του πνεύμονα κύτταρα και ακόμη και τις συνήθεις κυτταρικές σειρές (Σχήμα 3D). Αυτό το ευρύ φάσμα κυτταροτοξικότητα του eriocalyxin Β θα μπορούσε να οφείλεται στην ανασταλτική δράση της επί της οδού των ΝΡ-κΒ, όπως μια αναφερόμενη αναστολέας του ΝΡ-κΒ [18]. Αυτά τα στοιχεία υποδηλώνουν ότι η ομάδα κετόνης στο C-15 και 14β-ΟΗ είναι υπεύθυνες για την ανασταλτική επίδραση henryin για σηματοδότηση Wnt.

(Α) Δομές henryin και τα ανάλογά της. (Β) Επιπτώσεις της henryin αναλόγων για Topflash δραστηριότητα στα κύτταρα ΗΕΚ293Τ. Τα κύτταρα επιμολύνθηκαν με Wnt1 και ST-Luc για 3h και στη συνέχεια επωάστηκαν με henryin και των αναλόγων της του διαφορετικές δοσολογίες για 24 ώρες και κατόπιν δραστηριότητες λουσιφεράσης μετρήθηκε. (γ) Η μέση αναστολή της ανάπτυξης (GI

50, 72h) και η αναστολή ST-Luc (IC

50, 24h) τιμές του henryin και των αναλόγων της σε κύτταρα SW480 απεικονίζεται. (D) Αποτελέσματα της henryin αναλόγων επί της ανάπτυξης διαφόρων κυτταρικών γραμμών (48 ώρες). Δεδομένα που παρουσιάζονται είναι ο μέσος όρος ± SD από τρία ανεξάρτητα πειράματα.

Η

Henryin αναστέλλει την ενδογενή έκφραση Wnt γονιδίου-στόχου

Ελέγξαμε την έκφραση των ενδογενών Wnt γονίδια-στόχους στα δεδομένα μικροσυστοιχιών μας και διαπίστωσε ότι η έκφραση των γονιδίων στόχων Wnt, συμπεριλαμβανομένων Axin2, κυκλίνη D1, SP5, DKK1, NOS1, ΡΡΑΡδ και FGF20, ήταν σημαντικά κάτω-ρυθμίζονται μετά από θεραπεία με henryin (Σχήμα 4Α). Για να επιβεβαιωθεί τα ανασταλτικά αποτελέσματα της henryin στην έκφραση γονιδίων στόχων Wnt σηματοδότησης, υποβάλλαμε σε αγωγή wnt1 επιμολυσμένα ΗΕΚ293Τ και SW480 κυττάρων με henryin για 12 ώρες και παρακολουθήθηκε η έκφραση του c-myc και Κυκλίνη D1 με RT-PCR. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι henryin μειωμένη έκφραση τους σε ένα δοσο-εξαρτώμενο τρόπο (Σχήμα 4Β-C). Χρησιμοποιήσαμε επίσης αναλύσεις στυπωμάτων western για την ανίχνευση των πρωτεϊνών εκφράσεις Κυκλίνης D1, Survivin, Axin2 και C-myc σε ΗΕΚ293Τ, κύτταρα SW480 και κύτταρα HCT116 σε επεξεργασία με henryin. Σε συμφωνία με τα παραπάνω αποτελέσματα, το επίπεδο πρωτεΐνης του Axin2, κυκλίνη D1, C-myc και Σουρβιβίνης μειώθηκαν κατά henryin 24 ώρες της θεραπείας (Εικόνα 4D-F).

(Α) Henryin ρυθμίζει προς τα κάτω την έκφραση του Wnt γονιδίων στόχων σε δοκιμασία μικροσυστοιχίας. (Β-Ο) Henryin αναστέλλει Κυκλίνη D1 και C-myc έκφραση σε wnt1 επιμολυσμένα κύτταρα ΗΕΚ293Τ και τα κύτταρα SW480. Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με υποδεικνυόμενη δοσολογίες henryin για 12 ώρες. Τα επίπεδα κυκλίνης D1 και C-myc mRNAs προσδιορίστηκαν με PCR πραγματικού χρόνου και κανονικοποιήθηκε ως προς β-ακτίνης. (D) Τα αποτελέσματα του henryin στην έκφραση των πρωτεϊνών Axin2, CyclinD1 και Survivin σε wnt1 επιμολυσμένα κύτταρα ΗΕΚ293Τ. Τα κύτταρα επιμολύνθηκαν με wnt1 3 ώρες πριν από τη θεραπεία henryin. (Ε) Τα αποτελέσματα της henryin στην έκφραση των πρωτεϊνών Axin2, CyclinD1 και Σουρβιβίνης σε κύτταρα SW480. (F) Τα αποτελέσματα του henryin στην έκφραση του CyclinD1, Survivin, C-myc και οι πρωτεΐνες Ρ21 σε κύτταρα HCT116. Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με henryin για 6, 12, 24h και τα κυτταρικά εκχυλίσματα αναλύθηκαν με western αποτύπωση των υποδεικνυόμενων πρωτεϊνών. β-ακτίνη χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης. * P & lt? 0.05, ** P & lt?. 0.01, σε σχέση με τον έλεγχο του οχήματος

Η

Henryin παρεμβαίνει με τη σύνδεση των β-κατενίνης /TCF συγκρότημα

Ένα χαρακτηριστικό γνώρισμα της ενεργοποίησης της Wnt σηματοδότησης είναι η σταθεροποίηση και πυρηνική συσσώρευση του β-κατενίνης σε καρκίνο του παχέος εντέρου κύτταρα. Ελέγξαμε την επίδραση της henryin στο επίπεδο και την κατανομή των β-κατενίνης σε κύτταρα SW480. κύτταρα SW480 υποβλήθηκαν σε θεραπεία για 24 ώρες με henryin σε διάφορες συγκεντρώσεις και η συνολική β-κατενίνης και φωσφορυλιωμένη μορφή του β-κατενίνης εξετάστηκαν (Σχήμα 5Α). Εν τω μεταξύ, η πυρηνική και κυτταροπλασματική β-κατενίνης ήταν επίσης εξετάστηκαν χρησιμοποιώντας ανάλυση κηλίδος Western. Τα αποτελέσματα αποκάλυψαν ότι henryin θεραπεία δεν επηρεάζει ούτε το επίπεδο της ολικής και φωσφορυλιωμένη μορφή της β-κατενίνης, ούτε η κατανομή των β-κατενίνης στα πυρηνικά και κυτταροπλασματικά τμήματα (Σχήμα 5Β), γεγονός που υποδηλώνει ότι henryin στοχεύει το μονοπάτι Wnt κατάντη της β-κατενίνης . Σύμφωνα με την παραπάνω αποτέλεσμα, η δραστικότητα του ST-Luc στα ΗΕΚ293Τ κύτταρα με β-κατενίνης υπερεκφράζεται μειώθηκε σημαντικά από henryin, καθώς και η σταθεροποιημένη μορφή της β-κατενίνης, λόγω της μετάλλαξης S37A (Σχήμα 5C). LiCl είναι ένας αναστολέας της GSK-3β που αναστέλλει τη φωσφορυλίωση και μετέπειτα αποικοδόμηση του β-κατενίνης, οδηγώντας έτσι στη σταθεροποίηση του β-κατενίνης [19]. Όπως ήταν αναμενόμενο, henryin ανταγωνίστηκε LiCl επαγόμενη ενεργοποίηση της κανονικής σηματοδότηση Wnt, καθώς και (Σχήμα 5C). Στο σύνολό τους, τα στοιχεία αυτά δείχνουν ότι henryin δεν επηρεάζει τη σταθεροποίηση της β-κατενίνης ή πυρηνική μετατόπιση της, αλλά μάλλον στοχεύει η Wnt σηματοδότησης προς τα κάτω από αυτό.

(Α) Henryin δεν επηρεάζει το ποσό των συνολικών β κατενίνης και pho-β-κατενίνης σε κύτταρα SW480. (Β) Henryin δεν επηρεάζει την κατανομή των β-κατενίνης στα κλάσματα κυτοσολίου και πυρήνα σε κύτταρα SW480. SW480 κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με τις υποδεικνυόμενες δόσεις henryin για 24 ώρες. Τα κυτταρικά εκχυλίσματα ή κλάσματα παρασκευάστηκαν και αναλύθηκαν με κηλίδωση Western. Lamin A /C και β-ακτίνη χρησιμοποιήθηκαν ως έλεγχοι φόρτωση των πυρήνων και κυτταρόπλασμα πρωτεΐνες, αντίστοιχα. (Γ) Henryin ανταγωνίζεται την σηματοδότηση Wnt διεγείρονται με LiCl ή β-κατενίνης. κύτταρα ΗΕΚ293Τ επιμολύνθηκαν παροδικά με ιδιοσυστατικά ενεργή β-κατενίνης (S37A) πλασμίδια ST-Luc και β-κατενίνης ή, αντίστοιχα, ή σε επεξεργασία με LiCl (20mM). Περίπου 3 ώρες μετά την επιμόλυνση ή τη θεραπεία, henryin προστέθηκε και τα κύτταρα επωάστηκαν για επιπλέον 24 ώρες. Κάθε ράβδος είναι η μέση ± SD από τρία ανεξάρτητα πειράματα. (D) Henryin, αλλά όχι enmenol και minheryin C, μείωσε τα επίπεδα TCF4 συνδέονται με β-κατενίνης σε κύτταρα SW480 σε ένα δοσοεξαρτώμενο τρόπο. Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με τις υποδεικνυόμενες δόσεις henryin και των αναλόγων του enmenol και minheryin C για 12h και ανοσο-καταβύθιση διεξήχθη με αντίσωμα β-κατενίνης με IgG ποντικού ως έλεγχο, και στη συνέχεια TCF4 ανιχνεύθηκε με κηλίδωση Western. (Ε) Henryin διαταράσσει άμεσα την αλληλεπίδραση του β-κατενίνης με TCF4 στην δοκιμασία in vitro δέσμευση. Ανθρώπινη ανασυνδυασμένη β-κατενίνης (0.8μg) και TCF4 (0.5μg) αναμίχθηκαν, επωάστηκαν με διαφορετικές συγκεντρώσεις henryin και των αναλόγων του enmenol και minheryin C, και το μίγμα υποβλήθηκε σε συν-ανοσοκαταβύθιση με αντίσωμα β-κατενίνης και κηλίδωση Western ανάλυση με TCF4 αντίσωμα, με IgG ποντικού χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος. (F) Ποσοτικοποίηση των κηλίδων Western φαίνεται στο D και Ε το ImageJ λογισμικό χρησιμοποιήθηκε για την ανάλυση των εντάσεων των ζωνών. Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως μέσος όρος ± SD από τρία πειράματα. Όρνιθα, henryin, μπάνιο, enmenol, Min, minheryin Γ

Η

Στο πυρήνα, β-κατενίνης χρειάζεται να δεσμεύουν παράγοντες μεταγραφής της οικογένειας TCF για τη ρύθμιση της έκφρασης του γονιδίου-στόχου. Ελέγξαμε αν henryin παρεμποδίζει την αλληλεπίδραση /TCF β-κατενίνης. κύτταρα SW480 σε επεξεργασία με henryin ανοσοκατακρημνίσθηκαν με αντίσωμα β-κατενίνης ή IgG ποντικού ως έλεγχο, και TCF4 ανιχνεύθηκε με κηλίδωση Western και οι κηλίδες αναλύθηκαν με ImageJ για εντάσεις των ζωνών. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι henryin ισχυρά ανέστειλε την πρόσδεση του TCF4 σε β-κατενίνης σε έναν δοσο-εξαρτώμενο τρόπο σε κύτταρα SW480 αλλά όχι τα ανάλογα της enmenol και minheryin C (Σχήμα 5D, 5F), η οποία είναι συνεπής με τις ανασταλτικές δράσεις στην σηματοδότηση Wnt και η ανάπτυξη των καρκινικών κυττάρων των ενώσεων.

για να προσδιοριστεί αν μπορεί να διαταράξει henryin άμεσα την αλληλεπίδραση του β-κατενίνης με TCF4, in vitro δοκιμασίες σύνδεσης εκτελέστηκαν με Puri fi ed ανασυνδυασμένη β-κατενίνης και πρωτεΐνες TCF4. Το αποτέλεσμα έδειξε ότι henryin ισχυρά παρεμπόδισε τη σύνδεση TCF4 σε β-κατενίνη στις δοκιμασίες in vitro δέσμευση, ενώ τα ανάλογά της enmenol και minheryin C εμφάνισαν καμία καμία επίδραση, όπως αναμενόταν (Σχήμα 5Ε, 5F).

Συζήτηση

Στόχευση σηματοδότηση Wnt μπορεί να αντιπροσωπεύει μια πολλά υποσχόμενη στρατηγική για την εξάλειψη της κακοήθους νόσου με ανώμαλη ενεργοποίηση αυτού του μονοπατιού. Κατά συνέπεια, ο προσδιορισμός νέων αναστολέων του /της β-κατενίνης μονοπάτι σηματοδότησης Wnt είναι μεγάλης σημασίας και σπουδαιότητας. Αυτή η αναστολή μπορεί να επιτευχθεί με την διατάραξη της αλληλεπίδρασης /TCF [20] ή πρωτεΐνη β-κατενίνης CREB πρόσδεσης (CBP) [21]. Σταθεροποιητικό Axin2 [22,23] και ενεργοποίηση των CK1α επίσης ελήφθησαν ως αποτελεσματικοί μηχανισμοί για την αναστολή σηματοδότηση Wnt για στοχευμένη θεραπευτικά κατά του καρκίνου του παχέος εντέρου [24]. Στην προηγούμενη έρευνα, αρκετές ενώσεις έχουν βρεθεί να έχουν την ικανότητα να διακόψουν άμεσα β-κατενίνης /ένωση TCF, όπως PKF115-854 και CGP049090, και τα παρόμοια.

Τα τελευταία χρόνια, έχει υπάρξει σημαντικό ενδιαφέρον κατά την αναζήτηση Wnt /β-κατενίνης ανταγωνιστές σηματοδότησης από φυσικά προϊόντα [25]. Πράγματι, πολλοί τύποι δομή των φυσικών προϊόντων έχουν ταυτοποιηθεί που αναστέλλουν σηματοδότηση Wnt /β-κατενίνης, συμπεριλαμβανομένης της Murrayafoline A [26], Tetrandrine αλκαλοειδές [27], η κουρκουμίνη [28], EGCG [29,30], fl avonoids [31, 32], magnolol [33] και άλλοι [34,35]. Πρόσφατα, η ρεσβερατρόλη έχει αναφερθεί ως ικανή να αναστέλλει σηματοδότηση Wnt κατάντη της β-κατενίνης, συμβάλλοντας έτσι στην καταστολή της ογκογένεσης καρκίνου του παχέος εντέρου [36].

Henryin, ένας ent-kaurane διτερπενοειδές, που απομονώνονται από το

Isodon

rubescens

var.

lushanensis

προτίμηση επάγεται ορθοκολικό καρκίνο κύτταρα θάνατο, αφήνοντας τον κανονικό κολονικό CCD-con-841 κύτταρα και φυσιολογικό πνεύμονα επιθηλιακή Beas-2Β επηρεάζονται λιγότερο (Σχήμα 1Β, D). Έχουμε εντοπίσει τα μονοπάτια σηματοδότησης που επηρεάζονται από henryin σε καρκινικά κύτταρα του παχέος εντέρου με τη δοκιμασία των μικροσυστοιχιών, μεταξύ των οποίων βρέθηκε το σηματοδοτικό μονοπάτι Wnt να είναι η έντονα μεταβληθεί μία. Συνεπής με τα δεδομένα μικροσυστοιχίας, και στις δύο wnt1 επιμολυσμένα κύτταρα ΗΕΚ293Τ και ορθοκολικού καρκίνου, κύτταρα henryin ανέστειλε δραστικότητα Wnt-reporter ο οποίος αποκρίνεται σε έναν δοσο-εξαρτώμενο τρόπο (Σχήμα 2C). Henryin μείωσε την έκφραση των ενδογενών Wnt γονιδίων στόχων (Σχήμα 4Α-F) και παρενέβαινε με τη σύνδεση των β-κατενίνης /TCF μεταγραφή συμπλόκου πιθανόν με άμεση παρεμπόδιση της πρόσδεσης o f β-κατενίνης σε TCF 4 (Σχήμα 5D, 5Ε, 5F).