καρκίνο του πνεύμονα

Αφηρημένο

Μη-μικροκυτταρικό υπόθαλψη του υποδοχέα του επιδερμικού αυξητικού παράγοντα (EGFR) μεταλλάξεις επιτυγχάνει μια ουσιαστική απάντηση σε αναστολείς του EGFR-τυροσίνης κινάσης (TKIs). Ωστόσο, επίκτητη αντοχή σε EGFR-TKIs θα μπορούσαν να επηρεάσουν μακροπρόθεσμα αποτελέσματα σε όλους σχεδόν τους ασθενείς. Για τον εντοπισμό των πιθανών μηχανισμών αντίστασης, ιδρύσαμε κυτταρικές σειρές ανθεκτικές σε EGFR-TKIs από το ανθρώπινο πνεύμονα καρκινικές κυτταρικές σειρές PC9 and11-18, η οποία έτρεφε ενεργοποιώντας μεταλλάξεις του EGFR. Ένα erlotinib ανθεκτική κυτταρική γραμμή από PC9 και δύο erlotinib ανθεκτικές κυτταρικές γραμμές και δυο gefitinib ανθεκτικές κυτταρικές γραμμές από 11-18 είχαν ανεξάρτητα εγκατεστημένος. Σχεδόν πλήρης απώλεια του μεταλλαγμένου γονιδίου EGFR delE746-A750 παρατηρήθηκε στις ερλοτινίμπη-ανθεκτικά κύτταρα απομονώνονται από PC9, και μερική απώλεια του μεταλλαγμένου γονιδίου αντιγράφου L858R EGFR παρατηρήθηκε ειδικά στα erlotinib- και gefitinib ανθεκτικά κύτταρα από 11-18. Ωστόσο, συστατική ενεργοποίηση του EGFR κατάντη σηματοδότησης, ΡΙ3Κ /Akt, παρατηρήθηκε ακόμη και μετά την απώλεια του μεταλλαγμένου γονιδίου EGFR σε όλες τις ανθεκτικές κυτταρικές γραμμές, ακόμη και με την παρουσία του φαρμάκου. Στα erlotinib-ανθεκτικά κύτταρα από PC9, συστατική PI3K ενεργοποίηση /Akt ανεστάλη αποτελεσματικά με λαπατινίμπη (διπλή TKI του EGFR και HER2) ή BIBW2992 (παν-TKI των πρωτεϊνών της οικογένειας του EGFR). Επιπλέον, erlotinib είτε με HER2 ή HER3 νοκ ντάουν από συγγενή siRNAs τους αναστέλλεται επίσης PI3K ενεργοποίηση /Akt. Η επιμόλυνση του μεταλλαγμένου EGFR ενεργοποίησης συμπληρωματικό DNA αποκατέστησε την ευαισθησία φαρμάκου στην erlotinib ανθεκτική κυτταρική γραμμή. Η μελέτη μας δείχνει ότι η απώλεια του εθισμού σε μεταλλαγμένες EGFR οδήγησε σε αύξηση της εξάρτησης τόσο HER2 /HER3 και PI3K /Akt σηματοδότηση για να αποκτήσουν αντίσταση EGFR-ΤΚΙ

Παράθεση:. Tabara K, Kanda R, Sonoda Κ, Kubo Τ, Murakami Υ, Kawahara Α, et al. (2012) Απώλεια Ενεργοποίηση EGFR μεταλλαγμένο γονίδιο Συμβάλλει στην επίκτητη αντοχή σε αναστολείς EGFR κινάσης τυροσίνης σε κύτταρα καρκίνου του πνεύμονα. PLoS ONE 7 (7): e41017. doi: 10.1371 /journal.pone.0041017

Επιμέλεια: Yiqun Γ Shellman, Πανεπιστήμιο του Κολοράντο, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 21η Φεβρουαρίου 2012? Αποδεκτές: 15 Ιούνη, 2012? Δημοσιεύθηκε: 17 Ιουλίου του 2012

Copyright: © 2012 Tabara et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτή η έρευνα υποστηρίχθηκε από επιχορηγήσεις-σε-βοήθειας για την επιστημονική έρευνα σε τομείς προτεραιότητας (Καρκίνος) από το Υπουργείο Παιδείας, Πολιτισμού, Αθλητισμού, Επιστημών και Τεχνολογίας της Ιαπωνίας και από την έρευνα Ελέγχου 3ο Τρίμηνο Περιεκτική για τον καρκίνο από το Υπουργείο Υγείας, Εργασίας και Πρόνοιας, Ιαπωνία. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

καρκίνο του πνεύμονα μη μικρών κυττάρων (NSCLC) είναι ένα από τα πιο διαδεδομένα κακοήθεις καρκίνοι και η κύρια αιτία θανάτου παγκοσμίως. Ανάπτυξη των αντικαρκινικών φαρμάκων που στοχεύουν τον υποδοχέα του επιδερμικού αυξητικού παράγοντα (EGFR) βελτίωσε τη θεραπεία του NSCLC. Δύο εκπρόσωπος αναστολείς κινάσης EGFR-τυροσίνης (EGFR-TKIs), gefitinib και erlotinib, έχουν μια κοινή δομή κιναζολίνης και έχουν εγκριθεί για τη θεραπεία της προοδευτικής NSCLC. Τόσο η erlotinib και gefitinib δείχνουν παρόμοια επιλεκτικότητα αναστολής της κινάσης με βάση την ποσοτική ανάλυση των μικρών αλληλεπίδρασης μόριο-κινάση χάρτες για 38 αναστολείς κινάσης [1], και δείχνουν θεραπευτική αποτελεσματικότητα έναντι των ασθενών προοδευτική NSCLC [2] – [4].

Οι πιο κοινές μεταλλάξεις ενεργοποίησης EGFR είναι εντός-πλαισίου εξάλειψη στο εξόνιο 19 (delE746-A750) και η σημειακή μετάλλαξη που αντικαθιστά λευκίνης με αργινίνη στο κωδικόνιο 858 του exon21 (L858R) [5] – [9]. Αυτές οι δύο σημαντικές μεταλλάξεις αντιπροσωπεύουν το 85-90% του συνόλου των μεταλλάξεων και να ενισχυθεί η θεραπευτική αποτελεσματικότητα των φάρμακα που στοχεύουν EGFR [10] – [13]. Επιπλέον, αυτές οι μεταλλάξεις ενεργοποίησης αποκτήθηκε εθισμού σε EGFR σε κύτταρα καρκίνου πνεύμονα, έχοντας σαν αποτέλεσμα αυξημένη επιδεκτικότητα σε EGFR-ΤΚΙ όπως gefitinib και erlotinib [6], [14] – [16].

Ένα σοβαρό πρόβλημα με EGFR -TKI θεραπεία είναι η εμφάνιση όγκων ανθεκτικών στα φάρμακα. Για επίκτητη αντοχή, δευτερογενή μετάλλαξη στο γονίδιο EGFR Τ790Μ [16] – [18] ή εναλλακτικά EGFR-ανεξάρτητη ενεργοποίηση των οδών σηματοδότησης κυτταρικής ανάπτυξης συμπεριλαμβανομένης της ενεργοποίησης c-Met είναι γνωστό [19], [20]. Η απώλεια της έκφρασης ΡΤΕΝ είναι ένας από τους αποκτήθηκαν ανθεκτικών μηχανισμών, η οποία αποδεικνύεται από την απομόνωση gefitinib ανθεκτικά μεταλλάγματα από κύτταρα τα οποία PC9 λιμάνι ενεργοποιώντας μετάλλαξη του EGFR [21], [22]. Εκτός από τα καλώς χαρακτηρισμένα αιτίες της αντίστασης στα φάρμακα σε ασθενείς με καρκίνο του πνεύμονα, διασαφήνιση περαιτέρω μηχανισμό για την επίκτητη αντοχή είναι απαραίτητη για την ανάπτυξη νέων φάρμακα που στοχεύουν EGFR.

Σε αυτό παρούσα μελέτη, erlotinib- και gefitinib ανθεκτικών κυτταρικές γραμμές καθιερώθηκαν από δύο ανθρώπινες κυτταρικές σειρές καρκίνου του πνεύμονα, τα κύτταρα που φιλοξενούν PC9 μετάλλαξη delE746-A750 και 11-18 κύτταρα που φιλοξενούν μετάλλαξη L858R, αντίστοιχα. Παραδόξως, η μερική ή ολική απώλεια του μεταλλαγμένου αντιγράφου γονιδίου EGFR παρατηρήθηκε στο erlotinib- και gefitinib ανθεκτικές κυτταρικές γραμμές. Η κλινική σημασία της απώλειας των μεταλλαγμένων EGFR συζητείται σε σχέση με την στενή συνεργασία της με την απόκτηση ανθεκτικότητας στα φάρμακα σε EGFR-TKIs σε ασθενείς με NSCLC.

Η

Υλικά και Μέθοδοι

Cell Culture και αντιδραστήρια

Ανθρώπινες κυτταρικές σειρές καρκίνου του πνεύμονα, PC9, QG56 και 11-18 καλλιεργήθηκαν σε μέσο RPMI συμπληρωμένο με 10% ορό εμβρύου βοός (FBS) όπως περιγράφηκε προηγουμένως [14], [21]. PC9 και QG56 ευγενικά από τον Dr. Yukito Ichinose (Εθνική Οργάνωση Νοσοκομείο Κιούσου Κέντρο Καρκίνου, Φουκουόκα, Ιαπωνία), και 11-18 ήταν από τον Δρ Kazuhiko Nakagawa (Πανεπιστημίου Κίνκι, Osaka, Japan). Erlotinib παρασχέθηκε ευγενώς από τον F. Hoffmann-La Roche Ltd, gefitinib ήταν από την AstraZeneca Inc. BIBW2992 αγοράστηκε από Σέλεκ Chemicals, SU11274 και ουορτμανίνη ήταν από Calbiochem, LY294002 ήταν από την Cell Signaling Technology και λαπατινίμπη ήταν από το Τορόντο Research Chemicals. Αντι-HER2 και αντι-φωσφο-ΗΕΚ2 αντισώματα αγοράστηκαν από την Upstate Biotechnology, αντι-φωσφο-ΕΟΡΚ, αντι-ΕΟΡΚ, αντι-φωσφο-HER3, αντι-φωσφο-c-Met, αντι-φωσφο-Ακί, αντι-Akt, αντι-ΡΤΕΝ, αντι-φωσφο-ERK1 /2, αντι-ERK1 /2, και μετάλλαξη ειδικών (L858R στο εξόνιο 21 και τη διαγραφή Ε746-A750 σε 19 εξόνιο) αντισώματα ήταν από τη Cell Signaling Technology, αντι-ΗΕΚ3 και αντι-c -Met αντισώματα ήταν από την Santa Cruz Biotechnology, αντι-α-τουμπουλίνης αντίσωμα ήταν από τη Sigma-Aldrich, και αντι-GAPDH αντίσωμα ήταν από Trevigen. Συμπληρωματικά DNAs (cDNA) για τον EGFR και μετάλλαγμα EGFR ενεργοποίηση παρεσχέθησαν ευγενώς από τον Dr. Willam Pao και ο Δρ Nishio. Τα κύτταρα επιμολύνθηκαν με cDNA χρησιμοποιώντας Λιποφεκταμίνη LTX, PLUS αντιδραστήριο και Opti-ΜΕΜ (Invitrogen) σύμφωνα με τις συστάσεις του κατασκευαστή. Η ανασυνδυασμένη ανθρώπινη EGF αγοράστηκε από την PeproTech. Τα μικρά RNAs παρεμβολής (siRNA) που αντιστοιχεί σε HER2 (5′-AAACGUGUCUGUGUUGUAGGUGACC-3 ‘), HER3 (5′-GGCAGUGUAUAAUCUAUCUCCACUA-3′) και PIK3CA (5’-CCCUAUUGGUGGUGUUACUGGAUCAAAU-3 ‘) αγοράστηκαν από την Invitrogen, και που αντιστοιχούν σε EGFR (5’-GAGGAAAUAUGUACUACGA-3 ‘) αγοράστηκαν από την Sigma-Aldrich. Τα κύτταρα επιμολύνθηκαν με siRNA δίπολα χρησιμοποιώντας Λιποφεκταμίνη RNAiMAX και Opti-ΜΕΜ (Invitrogen) σύμφωνα με τις συστάσεις του κατασκευαστή.

Δοκιμασίες κυτοτοξικότητας

Εκθετικά αναπτυσσόμενα κυτταρικά εναιωρήματα ενοφθαλμίσθηκαν σε κάθε φρεάτιο και την επόμενη μέρα ο προστέθηκαν ενδεικνυόμενες συγκεντρώσεις των διαφόρων φαρμάκων. Μετά από επώαση για 72 ώρες, η κυτταροτοξικότητα προσδιορίστηκε όπως περιγράφηκε προηγουμένως [21].

Ανάλυση Western Blot

Τα κύτταρα ξεπλύθηκαν με παγωμένο PBS και λύθηκαν σε Triton Χ-100 ρυθμιστικού διαλύματος (50 mmol /L HEPES, 150 mmol /L NaCl, 50 mmol /L NaF, 1% Triton Χ-100, και 10% γλυκερίνη, που περιέχει 5 mmol /L EDTA, 1 mmol /L φαινυλομεθυλοσουλφονυλοφθορίδιο, 10 μg /mL απροτινίνη, 10 μg /mL λευπεπτίνη, και 1 mmol /L ορθοβαναδικό νάτριο), και πρωτεΐνες από κυτταρολύματα διαχωρίστηκαν με SDS-PAGE και μεταφέρθηκαν σε Immobilon μεμβράνες (Millipore Corp.), όπως περιγράφηκε προηγουμένως (21). Μετά τη μεταφορά, οι μεμβράνες επωάστηκαν σε διάλυμα αποκλεισμού, ανιχνεύθηκαν με τα διαφορετικά αντισώματα, πλύθηκαν, και οπτικοποιήθηκε χρησιμοποιώντας συζευγμένο με υπεροξειδάση δευτερογενή αντισώματα χρένο (GE Healthcare) και αντιδραστηρίου ενισχυμένης χημειοφωταύγειας (Amersham).

Α, κηλίδα Western ανάλυση δείχνει την έκφραση του pEGFR, EGFR, pHER2, HER2, pHER3, HER3, PC-Met, c-Met, ΡΤΕΝ, pAkt, Akt, pERK1 /2, και /πρωτεΐνες ERK1 2, και α-τουμπουλίνης ως έλεγχος φόρτωσης. Β, Εκθετικά αναπτυσσόμενα PC9 και PC9 κύτταρα /ER1 εκτέθηκαν σε διάφορες δόσεις erlotinib για 5 ώρες, και ακολουθούμενη από ανάλυση στυπώματος Western. C, Εκθετικά αναπτυσσόμενα 11-18, 11-18 /ER1-7, και 11-18 /ER2-1 κύτταρα εξετέθησαν σε διάφορες δόσεις erlotinib για 5 ώρες, και ακολουθούμενη από ανάλυση στυπώματος Western.

Η

ανθρώπινο RTK πίνακες

συστοιχίες

Proteome Profiler ανθρώπινου φωσφο-RTK αντίσωμα (R & amp? D Systems) χρησιμοποιήθηκαν σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή

ΤΟΠΟΣ-SSCP ανάλυση

ΘΕΣΗ. -SSCP ανάλυση πραγματοποιήθηκε όπως περιγράφηκε προηγουμένως [23] – [25]. Τμήματα γονιδιώματος που περιέχουν μεταλλαγμένες αλληλουχίες ενισχύθηκαν με PCR από ΟΝΑ που εξάγεται από πέντε κυτταρικές γραμμές (11-18, 11-18 /ER1-7, 11-18 /ER2-1, 11-18 /GEF10-1, και 11-18 /GEF20-1), και φυσιολογικά ανθρώπινα ενδοθηλιακά κύτταρα ομφάλιας φλέβας (HUVECs) τα οποία αγοράσθηκαν από την Lonza Inc. Walkersville Για την ανάλυση της μετάλλαξης L858R, εξόνιο 21 του γονιδίου EGFR ενισχύθηκε χρησιμοποιώντας εκκινητές (εμπρόσθιος: 5′-ATTCAGGGCATGAACTACTTGG-3 ‘, αντίστροφη: 5’-GTTACCTCCTTACTTTGCCTC CT-3 ‘) και TaKaRa ExTaq πολυμεράσης (Takara ΒΙΟ Inc.). Τα ληφθέντα αρχεία ίχνος (.fsa) υπηρέτησε ως αρχεία εισόδου στο QSNPlite για ανάλυση [26].

αλληλόμορφων Ποσοτικοποίηση

QSNPlite υπολογίζει την αναλογία κορυφής ύψος (R

h) των δύο αλληλόμορφα του (άγριου τύπου και μεταλλαγμένο αλληλόμορφο) σε κάθε πείραμα SSCP. Για την εκτίμηση του αριθμού αντιγράφων του αλληλόμορφα ανά κύτταρο σε καθεμία από τις πέντε κυττάρων δοκιμής (βλέπε προηγούμενη υποενότητα), αναμιγνύοντας τα πειράματα πραγματοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας HUVECs ως αναφορά. Σε αυτή την περίπτωση, HUVECs ήταν υποτίθεται ότι φέρει δύο αντίγραφα του αλληλόμορφου άγριου τύπου ανά κύτταρο. τιμές RH για κάθε μία από τις πέντε δοκιμαστικά κύτταρα ελήφθησαν όπως τη διάμεση τιμή των πέντε επαναλήψεων, καθεμία από τις οποίες αποτελείται από κύτταρα δοκιμής μόνο και ίσο-τμήμα μίγμα της δοκιμασίας και την αναφορά. Ο αριθμός αντιγράφων των δύο αλληλόμορφα στα κύτταρα δοκιμής εκτιμήθηκε από την διαφορά του R

h τιμές μεταξύ μόνος δοκιμαζόμενων κυττάρων και το μίγμα ίσων μερών, ως ακολούθως: Ας υποθέσουμε ότι τα κύτταρα δοκιμής φέρουν Χ αντίγραφο ανά κύτταρο του άγριου Τύπος EGFR, και Υ αντίγραφο ανά κύτταρο του μεταλλαγμένου EGFR. Στη συνέχεια, το R

h ανάλυσης SSCP για κύτταρα δοκιμή, R

h (δοκιμή), αντιπροσωπεύεται από? R

h (test) = M Χ (X /Y), όπου το Μ είναι ένα σταθερό αλληλόμορφο εξαρτώμενη που προέρχεται από τις διαφορές στην αποδοτικότητα της PCR-ενίσχυσης, αποτελεσματικότητα επισήμανσης, και το σχήμα της κορυφής, μεταξύ άγριου τύπου και μεταλλαγμένα αλληλόμορφα. Παρομοίως, R

h ενός μίγματος ίσων μερών κυττάρων δοκιμής και της αναφοράς, R

h (mix), δίνεται στην εξίσωση που ακολουθεί.

Από τις δύο εξισώσεις παραπάνω, τα Χ και Υ λαμβάνονται ως εξής.

Οι εξισώσεις παραπάνω εμπλέκουν ότι η απόλυτη αριθμού αντιγράφων του μεταλλαγμένου αλληλόμορφου στα εξεταζόμενα κύτταρα δεν μπορεί να εκτιμηθεί, διότι το Μ είναι άγνωστη. Ωστόσο, σε σχέση με τις τιμές των αντιγράφων τους αριθμούς για το ίδιο μεταλλαγμένο αλληλόμορφο σε διαφορετικά κύτταρα τεστ μπορεί να εκτιμηθεί, επειδή το Μ είναι μια σταθερά.

Ένα, κηλίδες Western που δείχνει την έκφραση του delE746-A750 EGFR και συνολική EGFR σε PC9 και PC9 κύτταρα /ER1. Β, Ανίχνευση άγριου τύπου και των αλληλουχιών μετάλλαξης χρησιμοποιώντας ειδικούς εκκινητές. κύτταρα PC9 δείχνουν τόσο άγριου τύπου και μεταλλαγμένων-συγκεκριμένες ζώνες, ενώ PC9 /ER1, 11-18, και QG56 κύτταρα δείχνουν μόνο το άγριου τύπου συγκεκριμένη ζώνη. Mut, μεταλλαγμένο exon19, και WT, άγριου τύπου exon19. C, PCR ανάλυση δείχνει ετεροντούμπλεξ (Mut /WT) και ομοδίπολο (WT /WT και Mut /Mut) σε κύτταρα PC9, και μόνο ομοδίπολο (β /β) σε PC9 κύτταρα /ER1, 11-18 κύτταρα που φιλοξενούν μετάλλαξη L858R, και QG56 κύτταρα που φιλοξενούν φυσικού τύπου EGFR.

Η

Α, ανάλυση κηλίδας Western χρησιμοποιώντας L858R-ειδικό αντίσωμα και το συνολικό αντίσωμα που αναγνωρίζει τόσο EGFR φυσικού τύπου και μεταλλαγμένων EGFR. Τα επίπεδα έκφρασης του μεταλλαγμένου EGFR (L858R), συνολικό EGFR, και L858R έναντι του συνολικού EGFR (L858R /σύνολο EGFR) κανονικοποιήθηκαν με τα επίπεδα έκφρασής τους σε 11-18 κύτταρα. Η ανάλυση στυπώματος Western με πρωτογενή ανθρώπινα ενδοθηλιακά κύτταρα (HUVEC) δείχνει έκφραση του συνολικού EGFR, αλλά όχι μεταλλαγμένη L858R EGFR. Β, αλληλουχίες DNA διαβάζει 15 βάσεων γύρω από την μετάλλαξη L858R στο 11-18, 11-18 /ER1-7, και 11-18 /ER2-1 κυττάρων σε σύγκριση. Τα βέλη δείχνουν βάσης στο 2573. Σημειώνεται ότι το νουκλεοτίδιο του 11-18 στο 2573 ήταν G /T ετεροζυγώτες. C, PLACE-SSCP ανάλυση δειγμάτων DNA από 11-18, 11-18 /ER1-7, και 11-18 /ER2-1 κυττάρων απουσία ή παρουσία ίσων ποσοτήτων DNA από ανθρώπινα αγγειακά ενδοθηλιακά κύτταρα (HUVECs) είναι απεικονίζεται. Δύο κορυφές δείχνουν άγριου τύπου (WT) και μεταλλάκτη (Mut) γονίδιο EGFR (α). Με βάση τις εξισώσεις παρουσιάζεται στο Υλικά και Μέθοδοι, από αντιγραφή αριθμός αλλαγών του αγρίου τύπου και μεταλλαγμένων γονιδίων EGFR εκτιμάται (β).

Η

PCR Ανάλυση

Για να αναλυθεί η μετάλλαξη εξάλειψης , εξόνιο 19 του γονιδίου EGFR ενισχύθηκε χρησιμοποιώντας τους ακόλουθους PCR εναύσματα:

άγριου τύπου ειδική, «μεταλλαγμένο συγκεκριμένες, 5′-TCCCGTCGCTATCAAAACATC-3 ‘και τα δύο άγριου-τύπου και 5′-CCGTCGCTATCAAGGAATTAAG-3 μετάλλαγμα τύπου, 5’-ATGTGGCACCATCTCACAATTGCC-3 ‘αντίστροφο εκκινητή 5′-CCACACAGCAAAGCAGAAACTCAC-3’ και TaKaRa ExTaq πολυμεράση.

Για να αναλυθεί η μετάλλαξη εξάλειψης, exon5 και 8 του γονιδίου ΡΤΕΝ ενισχύθηκε χρησιμοποιώντας τους εκκινητές εμπρός ακόλουθες PCR : exon5, 5′-CTCTGGAATCCAGTGTTTCTTT-3 ‘exon8, 5′-GCAACAGATAACTCAGATTGCC-3′ ανάστροφο εκκινητή:. exon5, 5’-CCAATAAATTCTCAGATCCAGG-3 ‘exon8, 5′-GTTCTTCATCAGCTGTACTCCT-3’

Για να αναλυθεί η μετάλλαξη εξάλειψης, Akt γονίδιο ενισχύθηκε χρησιμοποιώντας τους εκκινητές εμπρός ακόλουθες PCR: 5′-GGGTCTGACGGGTAGAGTGT-3 ‘ανάστροφος εναρκτήρας: 5′-GCGCCACAGAGAAGTTGTT-3’

Επιλογή ασθενών

Έχουμε επιλέξει πρωτογενή NSCLC. που φέρουν μεταλλάξεις του EGFR, όπως εξόνιο 19 delE746-A750 και το εξόνιο 21 L858R σημειακή μετάλλαξη από τα αρχεία κατάσταση μετάλλαξης του EGFR του Τμήματος διαγνωστική παθολογία, Πανεπιστημιακό Νοσοκομείο Kurume, Kurume, Ιαπωνία. Αυτά τα αρχεία κατάσταση μετάλλαξης του EGFR είχαν καθοριστεί με άμεση αλληλούχιση του DNA ή δοκιμή σφιγκτήρα PNA-LNA PCR [27], [28].

Κυτταρολογικό δείγματα από ασθενείς με καρκίνο

Τα κυτταρικά δείγματα ελήφθησαν από πλευριτικό συλλογή (5 περιπτώσεις), λεμφαδένα λεπτή βελόνη κυτταρολογική εξέταση (2 περιπτώσεις), περικαρδιακή συλλογή (1 περίπτωση), και το εγκεφαλονωτιαίο υγρό (3 περιπτώσεις), σύμφωνα με μια προηγούμενη μελέτη [28]. Η υπεζωκοτική συλλογή και στο εγκεφαλονωτιαίο υγρό φυγοκεντρήθηκαν στις 1500 rpm για 10 λεπτά, και το υπερκείμενο υγρό απομακρύνθηκε. Το ίζημα αλείφεται πάνω σε γυάλινες πλάκες, και μονιμοποιήθηκε σε 95% αιθανόλη όλη τη νύκτα. Λεπτής βελόνης κυτταρολογίας των λεμφαδένων διεξήχθη χρησιμοποιώντας μία αναλώσιμη βελόνα 23-gauge συνδέεται με μια πλαστική σύριγγα 10 ml και το slide ορίστηκε για μία νύχτα σε 95% αιθανόλη.

Η ανοσοχρώση για την ενεργοποίηση EGFR μεταλλάξεις

η ανοσοχρώση ανάλυση πραγματοποιήθηκε με τη χρήση αντι-EGFR delE746-A750 ειδική (6B6), το EGFR L858R Μεταλλαγμένα-ειδική (43B2), και το συνολικό EGFR (D38B1) αντισώματα (Cell Signaling Technology) όπως περιγράφηκε προηγουμένως [27].

Ηθική Δήλωση

Η μελέτη των κλινικών δειγμάτων εγκρίθηκε από την Επιτροπή Δεοντολογίας του Πανεπιστημίου Kurume.

Α, Β, εκθετικά αυξανόμενη PC9 και PC9 κύτταρα /ER1 εκτέθηκαν σε διάφορες δόσεις βορτμαννίνης (Α) και LY294002 (Β) για 5 ώρες, και ακολουθούμενη από ανάλυση στυπώματος Western. Γ PC9 και PC9 /ER1 κύτταρα υποβλήθηκαν σε θεραπεία με PIK3CA siRNA ή αγωνίζομαι (SC) siRNA για 48 ώρες, και που ακολουθείται από ανάλυση Western blot.

Η

Αποτελέσματα

Ίδρυση Erlotinib- και Gefitinib-ανθεκτικές γραμμές κυττάρων από PC9 και 11-18 Cells

Για να απομονωθεί erlotinib ανθεκτικές κυτταρικές σειρές από κύτταρα που φιλοξενούν PC9 delE746-A750, και από 11-18 κύτταρα που φιλοξενούν L858R, και οι δύο κυτταρικές σειρές καλλιεργήθηκαν σε σταδιακή αυξανόμενες δόσεις erlotinib από 0.05 έως 10 μΜ, για περίπου 6 μήνες, όπως περιγράφηκε προηγουμένως [21]. Στη συνέχεια, τα κύτταρα που επιλέγονται ανεξάρτητα από κάθε κυτταρική γραμμή erlotinib ανθεκτικό από κάθε πλαστικό πιάτο, για την επέκταση κλωνικώς μία κυτταρική σειρά erlotinib ανθεκτική, PC9 /ER1, από κύτταρα PC9, και δύο erlotinib ανθεκτικές κυτταρικές γραμμές, 11-18 /ER1- 7 και 11-18 /ER2-1 από 11-18 κύτταρα, αντίστοιχα. Επιπλέον, gefitinib ανθεκτικές κυτταρικές γραμμές και ανεξάρτητα απομονώθηκαν και κλωνικά επεκταθεί (11-18 /GEF10-1 και 11-18 /GEF20-1) 11-18 κύτταρα. καμπύλες απόκρισης δόσης των κυτταρικών σειρών ανθεκτικών στα φάρμακα και τη γονική τους ομολόγους τους στην erlotinib ή gefitinib έδειξε απόκτηση ανθεκτικότητας στα φάρμακα αυτά σε διάφορα ανθεκτικά sublines (Σχήμα S1).

Ένα, εκθετικά αυξανόμενη PC9 και PC9 κύτταρα /ER1 ήταν εκτίθενται σε διάφορες δόσεις erlotinib για 5 ώρες, και ακολουθούμενη από ανάλυση στυπώματος Western. B, C, D, PC9 και PC9 /ER1 κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία επί 48 ώρες με 10 ηΜ σκαρφάλωμα (sc) siRNA, 2 ηΜ ή 10 ηΜ EGFR siRNA, HER2 siRNA ή HER3 siRNA αντίστοιχα, και που ακολουθείται από ανάλυση κηλίδος Western.

Α, κύτταρα PC9 /ER1 υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με ή χωρίς 1 μΜ erlotinib, και 5 μΜ lapatinib για 5 ώρες, και ακολούθησε ανάλυση στυπώματος Western. Β, PC9 /κυττάρων ER1 υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 10 ηΜ siRNAs του scrumble και EGFR οικογένεια γονιδίων, και εκτέθηκαν σε erlotinib (1 μΜ) ή BIBW2992 (1 μΜ) για 5 ώρες, και ακολούθησε ανάλυση στυπώματος Western.

Η

Α, κύτταρα PC9 /ER1 επιμολύνονται με την ντελ EGFR (Ε746-A750) cDNA, και ακολούθησε επώαση για διάφορες ημέρες. Η ανάλυση στυπώματος Western πραγματοποιήθηκε με αντισώματα που αναγνωρίζουν del EGFR και συνολική EGFR. Β, καμπύλες απόκρισης δόσης από ψευδώς και ενεργοποιημένων μεταλλαγμένου EGFR cDNA επιμολυντές του PC9 /ER1 προσδιορίσθηκαν με δοκιμασία κυτταροτοξικότητας. Κάθε τιμή είναι μέσος όρος των τριπλών πιάτα ± SD. C, 11-18 /ER1-7 κύτταρα επιμολύνθηκαν με L858R EGFR cDNA, και ακολουθούμενη από ανάλυση στυπώματος Western με ένα ειδικό αντίσωμα του L858R EGFR. D, καμπύλες απόκρισης δόσης των ψευδώς και ενεργοποιείται μεταλλαγμένα προϊόντα επιμόλυνσης EGFR cDNA της 11-18 /ER1-7. Κάθε τιμές είναι μέσος όρος των τριπλών πιάτα ± SD.

Η

PC-9 κύτταρα /ER1 έδειξε 160-250 φορές μεγαλύτερη αντίσταση στην erlotinib και gefitinib, 5 φορές υψηλότερη αντοχή στη λαπατινίμπη σε περισσότερα, και περίπου 2.000 φορές υψηλότερη αντοχή σε BIBW2992 (Πίνακας 1). 11-18 /ER1-7, 11-18 /ER2-1, 11-18 /GEF10-1, και 11-18 /GEF20-1 κύτταρα παρουσίασαν 20 με 110 φορές υψηλότερη αντοχή στην erlotinib και gefitinib και 7 φορές υψηλότερη αντοχή στην λαπατινίμπη και BIBW2992 το πολύ (Πίνακας 1). Από την άλλη πλευρά, όλα αυτά τα ανθεκτικά κύτταρα έδειξαν παρόμοια ευαισθησίες να SU11274 και σισπλατίνη ως γονική αντίστοιχά τους (Πίνακας 1).

Η έκφραση του αυξητικού παράγοντα Υποδοχείς και Ενεργοποίηση θέση τους Erlotinib ανθεκτικά κυτταρικών σειρών που έχουν καταρτισθεί από PC9 και ανάλυση 11-18 Cells

Western blot έδειξε την πιο εντυπωσιακή διαφορά στη φωσφορυλίωση του EGFR χωρίς αξιοσημείωτη αλλαγή στην κατάσταση φωσφορυλίωσης της HER3, c-Met, Akt και ERK1 /2 μεταξύ PC9 και PC9 κύτταρα /ER1. Από την άλλη πλευρά, σχετικά μικρότερη φωσφορυλίωση του EGFR παρατηρήθηκε σε 11-18 /ER1-7 και 11-18 /ER2-1 κύτταρα από 11-18 κύτταρα (Σχήμα 1Α)

επόμενο σύγκριση κατάσταση ενεργοποίησης. πολλαπλών κινασών τυροσίνης υποδοχέα, συμπεριλαμβανομένων c-Met, ΑχΙ, PDGFR και IGF1R που υπερεκφράζεται σε όγκους με μεταλλάξεις του EGFR μεταξύ erlotinib ανθεκτικά υποσειρές και των ομολόγων τους με τη χρήση κινάσης τυροσίνης (RTK) υποδοχέα array φωσφο [29]. Ωστόσο, δεν υπήρξε καμία διαφορά στην κατάσταση ενεργοποίησης αυτών των υποδοχέων αυξητικού παράγοντα, συμπεριλαμβανομένων c-Met μεταξύ ευαίσθητων και ανθεκτικών κυτταρικών γραμμών φάρμακο (Σχήμα S2).

Χρωματίστηκαν

Σύνολο EGFR αντίσωμα και οι τέσσερις ιστολογικών και κυτταρολογικών δειγμάτων. Αντι-delE746-A750 αντίσωμα χρωματίστηκαν μόνο καρκινικά κύτταρα με τη μετάλλαξη delE746-A750 (Α, περίπτωση 1) (βλέπε Πίνακα 2), και το αντίσωμα EGFR L858R χρώση μόνο καρκινικά κύτταρα με τις μεταλλάξεις L858R (Β, περίπτωση 9) τόσο ιστολογικές και κυτταρολογικά δείγματα. Δεν χρώση ήταν εμφανής από τα αντισώματα τόσο EGFR delE746-A750 και EGFR L858R στα καρκινικά κύτταρα, χωρίς να τα ενεργοποιεί μεταλλάξεις του EGFR σε κυτταρολογικά δείγματα (C: περίπτωση 6 και D: η περίπτωση 11)

Η

Akt. η φωσφορυλίωση είναι Δεν Αποκλεισμένοι από την erlotinib σε erlotinib ανθεκτικές κυτταρικές γραμμές

στη συνέχεια εξετάσαμε την επίδραση της erlotinib στη φωσφορυλίωση του EGFR, Akt, και ERK1 /2 στο ερλοτινίμπη ανθεκτικές κυτταρικές σειρές και τη γονική τους ομολόγους τους (Εικόνα 1Β και 1C). Σε κύτταρα PC9, EGFR, Akt, και /2 φωσφορυλίωση ERK1 ήταν όλα ανέστειλαν με δοσο-εξαρτώμενο τρόπο με erlotinib. Ωστόσο δεν υπήρξε σχεδόν καμία αναστολή της φωσφορυλίωσης Akt σε PC9 κύτταρα /ER1 με erlotinib, αλλά /2 φωσφορυλίωση ERK1 παρεμποδίστηκε παρομοίως όπως στα κύτταρα PC9 (Σχήμα 1Β). Από την άλλη πλευρά, η φωσφορυλίωση του EGFR βρέθηκε να κατασταλεί ισοδυνάμως σε 11-18, 11-18 /ER1-7, και 11-18 /ER2-1 κύτταρα με erlotinib. Ωστόσο, σε σύγκριση με 11-18 κύτταρα, η φωσφορυλίωση της Akt σε 11-18 /ER1-7 και 11-18 /ER2-1 κύτταρα δεν ανεστάλη από erlotinib. Αντίθετα, η φωσφορυλίωση ERK1 /2 ήταν ιδιαίτερα ευαίσθητη σε erlotinib σε όλα τα 11-18, 11-18 /ER1-7, και 11-18 /ER2-1 κύτταρα (Σχήμα 1Γ). Εξαγορά της erlotinib αντίστασης παρέχει έτσι συστατική PI3K /Akt φωσφορυλίωση σε κύτταρα ανθεκτικά από PC9 και 11-18 κύτταρα.

πλήρη απώλεια Ενεργοποίηση Mutant EGFR (delE746-A750) Gene σε Erlotinib ανθεκτικά PC9 /ER1 κύτταρα

στη συνέχεια, την επόμενη εξέτασε την κατάσταση EGFR σε PC9 κύτταρα /ER1. ανάλυση κηλίδας Western χρησιμοποιώντας αντι-delE746-A750, L858R, και το συνολικό αντισώματα EGFR έδειξε πλήρη απώλεια της μεταλλαγμένης πρωτεΐνης EGFR έκφραση σε κύτταρα PC9 /ER1 (Σχήμα 2Α). Στη συνέχεια, το προφίλ γονίδιο του άγριου τύπου και μεταλλαγμένων EGFR μεταξύ PC9 και κυττάρων PC9 /ER1 συγκρίθηκε. Η άμεση ανάλυση αλληλουχίας του εξωνίου 19 του γονιδίου EGFR αποκάλυψε πλήρη απώλεια μόνο του μεταλλαγμένου αλληλουχία στην PC9 κύτταρα /ER1 (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Στη συνέχεια, η ανάλυση PCR πραγματοποιήθηκε στο εξόνιο 19 του γονιδίου EGFR με τη χρησιμοποίηση αγρίου τύπου και μετάλλαξης ειδικών εκκινητών. κύτταρα PC9 περιείχαν και τις δύο αλληλουχίες άγριου τύπου και μετάλλαξης διαγραφής, υποδεικνύοντας ετερόζυγο αλληλόμορφα για άγριου τύπου και μεταλλαγμένων EGFR, ενώ υπήρχε μόνο μια αλληλουχία άγριου τύπου σε PC9 /κύτταρα ER1 (Σχήμα 2Β). Το εξόνιο 19 του γονιδίου EGFR ενισχύθηκε περαιτέρω, και η ανάλυση αυτών των δειγμάτων DNA στην πηκτή έδειξε με συνέπεια την παρουσία μόνο της αλληλουχίας άγριου τύπου στο εξόνιο 19 του γονιδίου EGFR σε PC9 κύτταρα /ER1, αν και τα κύτταρα PC9 περιέχονται τόσο η διαγραφή και αλληλουχία άγριου τύπου (Σχήμα 2C). Στο σύνολό τους, τα PC9 κύτταρα /ER1 έδειξε πλήρη απώλεια του μεταλλαγμένου γονιδίου EGFR με απορρόφηση φαρμακευτικής αντοχής σε erlotinib.

Ο πολλαπλασιασμός των κυττάρων και την επιβίωση των ανθρώπινων κυττάρων καρκίνου του πνεύμονα που φιλοξενούν ενεργοποιημένα μεταλλαγμένο EGFR (PC9 και 11-18 κύτταρα ) εξαρτώνται στενά κατά του EGFR με γνώμονα PI3K /Akt μονοπατιού, και αυτός ο πολλαπλασιασμός /επιβίωση είναι ιδιαίτερα ευαίσθητα στην erlotinib και άλλα EGFR TKIs. Πρώτον, υπάρχει μερική ή ολική απώλεια της αλληλόμορφου γονιδίου mEGFR σε κυτταρικές γραμμές ανθεκτικές στα φάρμακα, και στη συνέχεια να αποκτήσουν του εθισμού σε HER2 /HER3 και ΡΙ3Κ /Akt σηματοδότηση (κύτταρα PC9 /ER1). Ωστόσο, πιο οριστική ανάλυση για ανθεκτικές κυτταρικές γραμμές 11-18 είναι απαραίτητη, διότι 11-18 ανθεκτικές κυτταρικές γραμμές δείχνουν μόνο μερική απώλεια της mEGFR.

Η

μερική απώλεια του μεταλλάκτη ενεργοποίησης EGFR (L858R) Gene σε Erlotinib- ή Gefitinib ανθεκτικών κυτταρικών σειρών από 11-18

περαιτέρω σύγκριση των επιπέδων έκφρασης του EGFR φυσικού τύπου και μεταλλαγμένα EGFR από ένα ειδικό αντίσωμα που αναγνωρίζει το μεταλλαγμένο L858R EGFR με ανάλυση κηλίδος Western. Σε σύγκριση με τα γονικά κύτταρα 11-18, η έκφραση της μεταλλαγμένης πρωτεΐνης L858R EGFR ήταν σχετικά χαμηλότερα έναντι συνολικά επίπεδα κυτταρικής EGFR (Εικόνα 3Α).

επόμενο εξετάστηκε εάν ενεργοποίηση μεταλλαγμένο γονίδιο EGFR σε 11-18 /ER1- 7 και 11-18 /ER2-1 κυττάρων επηρεάστηκε από την εξαγορά της αντίστασης erlotinib ή όχι. Η ανάλυση αλληλουχίας DNA έδειξε την παρουσία της μετάλλαξης (L858R) τόσο στα μητρικά και ανθεκτικών κυττάρων (Σχήμα 3Β, τα βέλη δείχνουν νουκλεοτίδιο 2573), αν και εναλλαγή των υψών των κορυφών σε νουκλεοτίδιο 2573 ήταν προφανής. Altered αναλογία άγριου τύπου προς μεταλλαγμένο γονίδιο EGFR παρατηρήθηκε επίσης με ανάλυση PLACE-SSCP [23], [24], όπως επεξηγείται στο Σχήμα 3C. Αυτή η δοκιμασία έδειξε δύο ανεξάρτητους κορυφές, μία για άγριου τύπου και ένα άλλο για μεταλλαγμένο γονίδιο EGFR, τόσο σε 11-18 και ερλοτινίμπη-ανθεκτικά κύτταρα. Ωστόσο, η αναλογία ύψους κορυφής (Rh) των δύο ανθεκτικές κυτταρικές γραμμές ήταν σαφώς διαφορετική. Με την υιοθέτηση της στρατηγικής ανάμιξης, δηλαδή, την ανάμειξη του DNAs του HUVECs που μεταφέρουν 2 αντίγραφα του γονιδίου EGFR φυσικού τύπου με εκείνη των ανθεκτικών κυττάρων, η μεταβολή του αριθμού αντιγράφων του αλληλόμορφου θα μπορούσε να ποσοτικοποιηθεί όπως περιγράφεται στο Υλικά και Μέθοδοι. Τα αποτελέσματα έδειξαν περίπου 50% ελάττωση του μεταλλαγμένου γονιδίου EGFR χωρίς εμφανή αλλαγή του αντιγράφου γονιδίου EGFR φυσικού τύπου (Εικόνα 3C).

Εξετάσαμε επίσης κατά πόσο επιλογή με αντίσταση φαρμάκου στην gefitinib επάγεται επίσης παρόμοιες αλλαγές του μειωμένη έκφραση του γονιδίου ενεργοποιήσεως του EGFR. Δύο gefitinib ανθεκτικές κυτταρικές σειρές, 11-18 /GEF10-1 και 11-18 /GEF20-1, έδειξαν αυξημένη έκφραση της πρωτεΐνης EGFR με σχετικά μειωμένη έκφραση του HER2 και pHER2 σε σύγκριση με τη γονική 11-18 κυττάρων τους (Σχήμα S3A). Σε σύγκριση με τα πατρικά κύτταρα 11-18, φωσφορυλίωση Akt σε 11-18 /GEF10-1 και 11-18 /GEF20-1 δεν επηρεάστηκε από gefitinib όταν φωσφορυλίωση του EGFR και ERK1 /2 παρεμποδίστηκε παρομοίως με gefitinib (Σχήμα S3b) . Η ανάλυση στυπώματος Western με αντι-L858R αντίσωμα έδειξε μειωμένη έκφραση του μεταλλαγμένου EGFR και παρόμοια έκφραση του συνολικού EGFR σε δύο ανθεκτικές κυτταρικές γραμμές σε σύγκριση με 11-18 κύτταρα (Σχήμα S3C). Στη συνέχεια, πραγματοποιήθηκε ανάλυση της αλληλουχίας DNA και βρέθηκε ένα εναλλασσόμενο ύψος κορυφής στην νουκλεοτίδιο 2573 σε gefitinib-ανθεκτικά κύτταρα (Σχήμα S3D). ανάλυση PLACE-SSCP απεκάλυψε επίσης μια μειωμένη μεταλλαγμένο αντίγραφο του γονιδίου EGFR χωρίς εμφανείς αλλαγές στην αντιγραφή του γονιδίου EGFR φυσικού τύπου, και ποσοτική ανάλυση δείχνοντας μία περίπου 50% μείωση του μεταλλαγμένου γονιδίου EGFR σε gefitinib-ανθεκτικά κύτταρα (Σχήμα S3E). Από αυτές τις αναλύσεις των erlotinib- ή gefitinib-ανθεκτικά κύτταρα γραμμές, η απόκτηση ανθεκτικότητας στα φάρμακα μπορεί να τη μεσολάβηση ενός μειωμένη μεταλλαγμένο αντίγραφο του γονιδίου EGFR.

Νοκ ντάουν του HER2 ή HER3 ευαισθητοποιεί την συστατική ενεργοποίηση της Akt στην erlotinib σε PC9 /ER1 κύτταρα

υπήρχε σχεδόν πλήρης απώλεια της μεταλλαγμένο γονίδιο EGFR σε PC9 /ER1 ενώ υπήρχε μόνο μερική απώλεια του μεταλλαγμένου γονιδίου EGFR σε erlotinib ανθεκτικές κυτταρικές σειρές που προέρχονται από 11-18. Αναλύσαμε περαιτέρω με περισσότερες λεπτομέρειες οποιοσδήποτε μηχανισμός υποκείμενη απόκτηση της αντίστασης erlotinib σε PC9 /ER1. Εξετάσαμε την επίδραση της ΡΙ3Κ αναστολείς, wortmannin και LY294002 στην Akt ενεργοποίηση σε PC9 και κύτταρα PC9 /ER1 (Σχήμα 4Α και 4Β). Και οι δύο αναστολείς ΡΙ3Κ ανέστειλε παρομοίως φωσφορυλίωση της Akt, υποδεικνύοντας ότι η ενεργοποιημένη Akt είναι ομοίως ευαίσθητα στους δύο αναστολείς στο PC9 /ER1 και κυττάρων PC9. Επιβεβαιώσαμε επίσης συγκεκριμένα καταστολή της ενεργοποίησης της Akt τόσο PC9 και κύτταρα PC9 /ER1 όταν έλαβαν θεραπεία με PIK3CA siRNA (Σχήμα 4C). Επιπλέον, η ανάλυση αλληλουχίας αποκάλυψε ότι δεν υπήρχε μετάλλαξη σε hot spots του PIK3CA, ΡΤΕΝ και γονίδιο Akt (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Η συστατική ενεργοποίηση Akt σε PC9 /ER1 δεν φαίνεται να οφείλεται σε μεταβολή της PI3K ίδια /Akt μονοπατιού.

Τέλος, εξετάστηκε η οποία μόρια μεταξύ EGFR, HER2 ή HER3 θα μπορούσε να είναι υπεύθυνη για τη συστατική ενεργοποίηση Akt στην erlotinib ανθεκτικά PC9 κύτταρα /ER1. Βρήκαμε φωσφορυλίωση της HER3 δεν κατεστάλη με erlotinib σε PC9 /ER1 σύγκριση με PC9 (Σχήμα 5Α). Στη συνέχεια εξετάστηκε κατά πόσον νοκ ντάουν του EGFR, HER2 ή HER3 από συγγενή siRNAs τους θα μπορούσαν να διαμορφώσουν την ενεργοποίηση των πρωτεϊνών της οικογένειας Akt και EGFR. Knockdown του EGFR οδήγησε σε σημαντικά μειωμένη ενεργοποίηση της Akt μόνο σε κύτταρα PC9 αλλά όχι σε PC9 /ER (Σχήμα 5Β). Από την άλλη πλευρά, knockdown της HER3 θα μπορούσαν να καταστείλουν την ενεργοποίηση της Akt τόσο PC9 και PC9 /ER (Εικόνα 5D). Περαιτέρω ενεργοποίηση της HER3 αξιοσημείωτα κατέστειλε με HER2 knockdown μόνο σε PC9 /ER (Σχήμα 5Β). Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι η HER3 μαζί με σηματοδότηση HER2 είναι υπεύθυνοι για την συστατική ενεργοποίηση της PI3K /Akt στην επίκτητη αντοχή στην erlotinib σε PC9 /ER.

εξετασθεί περαιτέρω εάν η λαπατινίμπη, ένας διπλός αναστολέας της κινάσης του EGFR και HER2, θα μπορούσε καταστέλλουν Akt ενεργοποίηση PC9 /ER1. Η θεραπεία με λαπατινίμπη ανέστειλε φωσφορυλίωση της Akt και HER3, ενώ η erlotinib δεν το έκανε (Σχήμα 6Α). Εξετάσαμε την επόμενη την επίδραση της erlotinib ή έναν αναστολέα κινάσης τυροσίνης παν-όλης της οικογένειας EGFR, BIBW2992 [30], επί της φωσφορυλίωσης Akt σε PC9 /ER1 όταν σίγησε κάθε EGFR, HER2 ή HER3 (Σχήμα 6Β). Η φωσφορυλίωση του HER2, HER3 και AKT ήταν όλα καταστέλλεται και μόνο από BIBW2992. Από την άλλη πλευρά, η φωσφορυλίωση της Akt ανεστάλη από erlotinib είτε με HER2 ή HER3 knockdown. Επιπλέον, HER2 νοκ ντάουν οδήγησε σε σημαντική αναστολή της φωσφορυλίωσης HER3, γεγονός που υποδηλώνει ότι τα κύτταρα PC9 /ER1 αποκτήσει εθισμό στο HER2 /HER3 σηματοδότηση (Εικόνα 6Β).

Τέλος, εξετάστηκε αν η έκφραση της ενεργοποίησης μεταλλαγμένων EGFR θα μπορούσε να αποκαταστήσει την ευαισθησία των ναρκωτικών με την erlotinib σε ανθεκτικά στα φάρμακα κυτταρικές σειρές, PC9 /ER1 και 11-18 /ER1-7. Παροδική διαμόλυνση del (Ε746-A750) cDNA EGFR που προκαλείται ενισχυμένη έκφραση του ενεργοποιημένου μεταλλαγμένου EGFR σε PC9 /ER1 (Σχήμα 7Α). Η υπερέκφραση των del (Ε746-A750) EGFR cDNA ξεπέρασε την αντίσταση των ναρκωτικών στην erlotinib σε PC9 /ER1 (Σχήμα 7Β). Επιπλέον, η επιμόλυνση του άλλου ενεργοποιηθεί μεταλλαγμένου L858R EGFR cDNA που επίσης προκαλείται από αυξημένη έκφραση (Σχήμα 7C) και αποκατέστησε την ευαισθησία των ναρκωτικών στην erlotinib στο 11-18 /ER1-7 κύτταρα (Σχήμα 7D).

Απώλεια Ενεργοποίηση Μεταλλαγμένα EGFR σε Πυρίμαχα μη μικρού κυττάρου πνεύμονα

Σχήμα 8 έδειξε αντιπροσωπευτικές εικόνες IHC για άγριου τύπου, delE746-A750, και έκφραση L858R EGFR σε πρωτογενείς ιστούς καρκίνου του πνεύμονα (Σχήμα 8, κάθε άνω πάνελ), και επίσης ο καρκίνος κύτταρα σε πλευριτική συλλογή ή εγκεφαλονωτιαίο υγρό σε υποτροπιάζον ασθενείς μετά τη θεραπεία με gefitinib (Σχήμα 8, κάθε κατώτερο πάνελ). Όπως φαίνεται στον Πίνακα 2, από 11 ασθενείς οι οποίοι έλαβαν πρώτα gefitinib μετά την επέμβαση του πνεύμονα και στη συνέχεια έδειξε επανάληψη, 8 ασθενείς είχαν τη μετάλλαξη delE746-A750 και 3 είχαν μετάλλαξη L858R στο πρωτογενείς όγκους πνεύμονα τους. Τέσσερις είχε την μετάλλαξη Τ790Μ στη διάδοση ή μεταστατικό κυτταρολογικά δείγματα. Από 11 ασθενείς με ανθεκτική νόσο, 2 από τις 8 περιπτώσεις που είχαν έφερε το delE746-A750 έδειξε απώλεια του ενεργοποίησης μετάλλαξης EGFR, και 1 από τα 3 περιπτώσεις που είχαν έτρεφε L858R έδειξε απώλεια της μετάλλαξης ενεργοποιήσεως (Πίνακας 2). Σε μία περίπτωση (περίπτωση 6), παρατηρήθηκαν τόσο Τ790Μ μετάλλαξη και την έκφραση EGFR άγριου τύπου. Δεν υπήρξε καμία διαφωνία μεταξύ της έκφρασης των αντισωμάτων μετάλλαξη ειδικών EGFR και ανίχνευση μεταλλάξεων EGFR με ανάλυση αλληλουχίας χρησιμοποιώντας δοκιμασία σφιγκτήρα PNA-LNA PCR σε όλα τα δείγματα που εξετάστηκαν σε αυτή τη μελέτη.

Συζήτηση

Ενεργοποίηση μεταλλάξεις του EGFR, όπως delE746-A750 και L858R, αιτία καρκίνου του πνεύμονα κύτταρα στενά ζευγάρι EGFR με τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό ή την επιβίωση [5], [6], [15].