Αφηρημένο

σηματοδότηση Wnt είναι ένα κρίσιμο ρυθμιστικό μονοπάτι για την ανάπτυξη και την ασθένεια. Πολύ λίγα είναι γνωστά για τους μηχανισμούς των σηματοδότηση Wnt σε καρκίνο του προστάτη, μια κύρια αιτία θανάτου στους άνδρες. Μία ποσοτική ανάλυση της έκφρασης του Wnt5A πρωτεΐνης σε συστοιχίες ανθρώπινο ιστό, που περιέχει 600 πυρήνες ιστού του προστάτη, έδειξε (Ii) Εάν η κανονική ή μη κανονική οδό σηματοδότησης ενεργοποιείται στον καρκίνο του προστάτη; (Iii) Ποιο είναι το λειτουργικό ρόλο της Wnt σηματοδότησης στον καρκίνο του προστάτη; Για την αντιμετώπιση αυτών ερωτήματα που εξετάσαμε τις ακόλουθες υποθέσεις: (i) Η έκφραση της πρωτεΐνης Wnt5A είναι αυξημένη σε ανθρώπινου καρκίνου του προστάτη (ii) Η σηματοδότηση Wnt /β-κατενίνης θα πρέπει να οδηγήσει σε αυξημένη έκφραση των γονιδίων στόχων TCF /LEF όπως ΜΜΡ και Timp3 σε καρκίνο του προστάτη (iii) Η ενεργοποίηση της Wnt /Ca

2+ σηματοδότηση στα κύτταρα του καρκίνου του προστάτη θα πρέπει να οδηγήσει σε αύξηση της δραστικότητας του ενζύμου CaMKII προκαλούν αλλοιώσεις σε κυτταρικό σκελετό και κυτταρική κινητικότητα. Δείχνουμε, για πρώτη φορά, ότι η έκφραση της πρωτεΐνης Wnt5A αυξάνεται σε κακοήθεις ανθρώπινο προστάτη σε σύγκριση με καλοήθη ιστό και Wnt /Ca

2+ μηχανισμός σηματοδότησης ενεργοποιείται σε κύτταρα καρκίνου του προστάτη. Πρέπει επίσης να παρέχουν νέες μηχανιστικές ενδείξεις κρίσιμο ρόλο για CaMKII ως ρυθμιστής του κυτταροσκελετού της ακτίνης και την κυτταρική κινητικότητα σε καρκίνο του προστάτη.

Αποτελέσματα

RNA εκτίμηση μεταγραφής χρησιμοποιώντας πραγματικού χρόνου PCR

Μετρήσαμε τα επίπεδα του mRNA για WNT5A (Πίνακας S1), που είχαν διαπιστωθεί από την ανάλυση oligoarray μας να απορυθμίζεται σε κύτταρα καρκίνου του προστάτη [23]. WNT5A mRNA εμφάνισε παρόμοια μέγεθος της αλλαγής (-50 φορές) σε 1542-CP

καρκίνος 3TX κύτταρα συγκριτικά με φυσιολογικά κύτταρα 1542-NPTX, αν μετρηθεί χρησιμοποιώντας oligoarray [23] ή πραγματικού χρόνου PCR (Πίνακας S1). WNT5A μεταγραφή εκφράζεται επίσης σε άλλους καρκίνου του προστάτη κυτταρικές γραμμές π.χ. PC3 και DU145 [19], [23].

έκφραση πρωτεΐνης Wnt5A σε κακοήθεις και καλοήθεις ανθρώπινου προστάτη

3,3-διαμινοβενζιδίνης (DAB) ετικέτα, που αντιπροσωπεύουν έκφραση Wnt5A, παρατηρήθηκε σε αμφότερα κακοήθεις και καλοήθεις πυρήνες ιστού (Εικ. 1Α και Β). Εμείς ποσοτικά την ετικέτα, κατά τρόπο αμερόληπτο, με τη χρήση ενός να αναπαραχθεί, ημι-αυτοματοποιημένη ανάλυση σωματιδίων (αναλύει σωματίδια) πρωτόκολλο χρησιμοποιώντας το λογισμικό ImageJ [24], μετά τη μετατροπή εικόνων RGB σε 16 αποχρώσεις του γκρι bit (Σχήμα 1 C και D) από 600 ατομικές ιστό του προστάτη πυρήνες (βλέπε Υλικά και Μέθοδοι). υπολογίζονται οι παράμετροι του αριθμού, συνολικής έκτασης, μέσου μεγέθους και το κλάσμα περιοχή δίνονται στον Πίνακα S2. Ενσωμάτωση της περιοχής κάτω από την καμπύλη αποκάλυψε μια 55%, 25% και 45% αύξηση της συνολικής περιοχής, το μέσο μέγεθος και το κλάσμα περιοχής (συνολική έκταση /σύνολο pixel), που αντιπροσωπεύει την έκταση και την ένταση της χρώσης, σε κακοήθη πυρήνες (n = 301 ) σε σύγκριση με καλοήθη πυρήνες (n = 299), αντίστοιχα (Σχήμα 1 Ε, F και G) που ήταν πολύ σημαντική (ρ & lt? 0,0001, του Student t-test). Αυτά τα αποτελέσματα υποδεικνύουν ότι η έκφραση Wnt5A είναι αυξημένη σε σύγκριση με κακοήθεις καλοήθεις ανθρώπινου προστάτη.

Αντιπροσωπευτικά κακοήθη (Α) και καλοήθη (Β) πυρήνα ιστό από συστοιχίες ανθρώπινο προστάτη χρησιμοποιήθηκε για τον υπολογισμό της έκφρασης Wnt5A (ετικέτα DAB, καφέ, σε μεγάλο βαθμό σε κυψελοειδή κύτταρα). εικόνες RGB (Α και Β) μετατράπηκαν σε 16 εικόνες bit (C και D) για την ποσοτικοποίηση του σήματος DAB χρησιμοποιώντας Αναλύστε πρωτόκολλο Particle στο λογισμικό ImageJ να ληφθεί Συνολική επιφάνεια χρώση (Ε) και το μέσο μέγεθος του σωματιδίου που μετράται (F) , σε pixel, και περιοχή Κλάσμα (G, συνολικής επιφάνειας διαιρούμενο με το σύνολο των pixel στην εικόνα). Wnt έκφραση 5Α αυξήθηκε σε κακοήθη κατά καλοήθεις πυρήνες (p & lt? 0,0001). Κάθε κάδος είναι τα δεδομένα για ένα άτομο, κακοήθη (κόκκινο, n = 301) ή καλοήθεις (πράσινο, n = 299) του πυρήνα.

Η

Μηχανισμοί Wnt σηματοδότησης στον καρκίνο του προστάτη

έκφραση της πρωτεΐνης Wnt5A ήταν επίσης υψηλότερος το 1542-CP

3TX καρκινικά κύτταρα σε σύγκριση με συμφωνημένα φυσιολογικά κύτταρα 1542-NPTX (Εικ. 2Α). Υπήρξε επίσης μια ταυτόχρονη μείωση (2,5 φορές) σε mRNA μεταγραφή του CTNNB1 και άλλων στοιχείων του σηματοδότηση Wnt /β-κατενίνης (π.χ. αξίνη, DVL1, ΟδΚ3β) σε καρκινικά κύτταρα συγκριτικά με φυσιολογικά κύτταρα (Πίνακας S1). Ο ανταγωνισμός της β-κατενίνης λόγω υπερέκφραση Wnt5A, που οδηγεί σε αρνητική ρύθμιση του Wnt-στόχων /β-κατενίνης έχει προταθεί προηγουμένως σε μελάνωμα [25] και τα έμβρυα Xenopus [11]. β-κατενίνης έκφραση πρωτεΐνης, χρησιμοποιώντας κηλίδωση Western έδειξε μία μονή ζώνη (~94kDa) σε μία συγκέντρωση πρωτεΐνης με τρόπο που εξαρτάται, σε προϊόντα λύσης κυττάρου τόσο από 1542-CP

3TX και 1542-NPTX κύτταρα (Σχ. 2Β). Η πυκνομετρική ανάλυση έδειξε ότι δεν υπήρχε μεταβολή στην πρωτεΐνη β-κατενίνης στον καρκίνο συγκριτικά με φυσιολογικό κύτταρο γραμμή (Σχ. 2C). Επιπλέον, σύμφωνα με τα δεδομένα μας oligoarray [23] ένας αριθμός /β-κατενίνης μεσολαβεί TCF γονίδια στόχους μεταγραφή Wnt έδειξαν μειωμένη έκφραση mRNA σε καρκινικά κύτταρα (Πίνακας S3). Μια λεπτομερής εξέταση σε πρωτεΐνες και λειτουργικό επίπεδο των επιλεγμένων στόχων της TCF /LEF μεταγραφής (π.χ. ΜΜΡ2, ΜΜΡ14 και Timp3) [26], επιβεβαίωσε αυτές τις παρατηρήσεις. έκφραση mRNA για αυτά τα γονίδια ήταν 3-10 φορές χαμηλότερο σε καρκινικά κύτταρα συγκριτικά με φυσιολογικά κύτταρα (Πίνακας S1) που υποστηρίζεται από έμμεσο ανοσοφθορισμό (εικ. S1). MMP-14 δραστηριότητα θα πρέπει να αντανακλά την ισορροπία μεταξύ των MMP-14 καταλυτική και Timp3 κανονιστικές δραστηριότητες. δραστικότητα ΜΜΡ ήταν 3 ± 0,06 φορές χαμηλότερη στα καρκινικά κύτταρα χρησιμοποιώντας ζυμογραφία ζελατίνης (Εικ. S2). Αυτά τα αποτελέσματα επιβεβαίωσαν ότι πολυάριθμες στόχοι /β-κατενίνης μονοπάτι σηματοδότησης Wnt ήταν ρυθμισμένα προς τα κάτω στο γονίδιο, πρωτεΐνη ή λειτουργικό επίπεδο.

Western blot (Α) έκφραση πρωτεΐνης Wnt5A, δείχνουν υψηλότερα επίπεδα σε 1542-CP

3TX κύτταρα (CP) σε σύγκριση με το 1542-NPTX κύτταρα (NP). β-ακτίνη χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης. (Β) β-κατενίνης (94 kDa) έκφραση σε κυτταρολύματος από 1542-CP

3TX και 1542-NPTX κυτταρικές γραμμές (GAPDH, 35kDa, που χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης πρωτεΐνης στην ίδια κηλίδα). ανάλυση (C) πυκνομετρική πραγματοποιήθηκε με τη χρήση εμπορικού λογισμικού (GeneTools, Συνοπτικοί, UK). NP (γεμάτο μπαρ) = 1542-NPTX και CP (κούφια bar) = 1542-CP

3TX.

Η

Ανάλυση της γονιδιακής έκφρασης των στόχων CTNNB1 και TCF μεταγραφή /LEF, χρησιμοποιώντας Oncomine [27 ] και το λογισμικό GeneSpring και διατίθενται στο κοινό σύνολα δεδομένων μικροσυστοιχίας για την κανονική (μη-νεοπλασματική ή καλοήθη)

vs ιστό

καρκίνου του προστάτη, έδειξε ότι η έκφραση του συνόλου σχεδόν Wnt /β-κατενίνης /TCF στόχοι αναλύονται, εκτός c-myc , μειώθηκε σε καρκίνο προστάτη (Σχ. S3). Αυτά τα αποτελέσματα είναι παρόμοια με εκείνα για κυτταρικές γραμμές προστάτη και αποδεικνύουν ότι β-κατενίνης μεσολαβεί στην αύξηση TCF μεταγραφή δεν ήταν πιθανό να είναι ο μηχανισμός σηματοδότηση Wnt σε καρκίνο του προστάτη. Συνεπώς εξετάσαμε την υπόθεση ότι στον καρκίνο του προστάτη, σηματοδότηση Wnt μετάγεται μέσω Wnt /Ca

2+ οδό. Πραγματοποιήσαμε πειράματα για να διαπιστωθεί αν Wnt5A που προκαλείται άμεσα απελευθέρωση ασβεστίου στα κύτταρα του προστάτη. Η προσθήκη Wnt5A επάγεται πεπτιδίου κύματα ασβεστίου, που διαρκεί μέχρι 100s, σε προστάτη καρκινική κυτταρική γραμμή με μια αύξηση 3,1 ± 0,1 (η = 12) φορές της έντασης της Φλου-4 από τη γραμμή βάσης (Σχήμα 3 και Ταινία S1).

ένα αντιπροσωπευτικό διάγραμμα της αποδέσμευσης ασβεστίου σε κυτταρική σειρά καρκίνου του προστάτη (PC3) ως συνάρτηση του Fluo-4 μεταβολή έντασης συναρτήσει του χρόνου χρησιμοποιώντας συνεστιακή απεικόνιση ζωντανών κυττάρων. Η πράσινη γραμμή αντιπροσωπεύει την αλλαγή στην ένταση Fluo-4 (πράσινη γραμμή) στο (Α) ελέγχου (μετά την προσθήκη του οχήματος PBS) ή (Β) ανασυνδυασμένο πεπτίδιο Wnt5A (100 ng /ml). Υπήρξε μια 3.1 ± 0.1 φορές αύξηση στην Fluo-4 ένταση μετά την προσθήκη Wnt5A (n = 12). Σε μερικά πειράματα Fura Κόκκινο (κόκκινη γραμμή) φορτώθηκε με Fluo-4. Η αναλογία της μεταβολής στην Fluo-4 και Fura-κόκκινο χαράσσεται στο (C).

Η

δραστηριότητας CaMKII και το ρόλο της στον τομέα των διαρθρωτικών πλαστικότητα των κυττάρων του προστάτη

CaMKII είναι ένα σημαντικό αισθητήριο της Wnt /Ca

2 + σηματοδότησης. Σε όλες τις κυτταρικές σειρές προστάτη ενζυμική δραστηριότητα CaMKII ήταν Ca

2+ εξαρτάται, τουλάχιστον το 1542-NPTX, μεγαλύτερη το 1542-CP

3TX και DU145 και προφέρονται σε PC3 κυτταρική σειρά (Εικ. 4). Υπήρξε μια αύξηση 4 και 8 φορές στο Ca

2 + εξαρτώμενη δραστηριότητα CaMKII in1542-NPTX και 1542-CP

κύτταρα 3TX (Εικ. 4), αντίστοιχα. Το πιο σημαντικό, το Ca

2 + εξαρτώμενη δραστηριότητα της CaMKII αυξήθηκε κατά ~ 4 φορές το 1542-CP

3TX σε σύγκριση με το 1542-NPTX (

ένθετο

Εικ. 4). Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν μία αύξηση στην δραστηριότητα του CaMKII σε καρκινικά κύτταρα συγκριτικά με φυσιολογικά κύτταρα.

Η δραστικότητα φωσφοτρανσφεράσης της CaMKII σε προϊόντα λύσης κυττάρου μετρήθηκε με τη χρήση ενός [γ-

32Ρ] ΑΤΡ δοκιμασία που βασίζεται CaMKII ( Upstate, UK) με Ca

2 + (διακεκομμένες μπάρες) ή χωρίς Ca

2 + (κοίλες ράβδοι).

Ένθετο

: Ca

2 + εξαρτώμενη δραστηριότητα CaMKII υπολογίστηκε όπως περιγράφεται στα Υλικά και Μέθοδοι. Οι τιμές είναι μέση τιμή ± SE από 3 πειράματα. NP is1542-NPTX, CP is1542-CP

3TX, DU είναι DU145 και PC είναι PC3 κυττάρων του προστάτη γραμμή.

Η

Για να διερευνήσουν το ρόλο της Wnt σηματοδότησης σε ακτίνη του κυτταροσκελετού των φυσιολογικών και καρκινικών κυττάρων του προστάτη , χρησιμοποιήσαμε έναν προσδιορισμό πληγή /γρατσουνιά σε συνδυασμό με ομοεστιακή μικροσκοπία σάρωσης και ηλεκτρονίων και απεικόνισης ζωντανών κυττάρων. Πρώτον, η προπορευόμενη ακμή του τραύματος παρατηρήθηκε για ακτίνη αναδιαμόρφωση, χρησιμοποιώντας συνεστιακή μικροσκοπία μετά από χρώση με φθορισμό σημασμένο φαλλοϊδίνη. Το 1542-CP

3TX κύτταρα η προπορευόμενη ακμή του τραύματος, στις 4 ώρες μετά τον τραυματισμό, έδειξαν λεία, τακτική χρώση ακτίνης, με κύτταρα που εμφανίζονται σε μια ελασματοπόδια όπως σχηματισμός (Εικ. 5Α). Το 1542-NPTX κύτταρα η αιχμή του τραύματος ήταν παράτυπη με τη μορφολογία των επιμέρους κυττάρων, κάποια με λεπτή τΊΙοροάίβ όπως δομές ορατό σε 4 ώρες (Σχ. 5Β).

Τα κύτταρα τραυματίες και χρωματίστηκαν με phalloidin- φλουορεσκεΐνη -5-ισοθειοκυανικό (FITC, πράσινο) για να απεικονίσει νημάτια ακτίνης χρησιμοποιώντας μια Leica SP2 συνεστιακό μικροσκόπιο. Α, Β και G είναι μη επεξεργασμένα κύτταρα 1542-CP

3TX, 1542-NPTX και PC3, αντίστοιχα. C, D και H είναι AIP (10 μΜ) αντιμετωπίζονται 1542-CP

3TX, 1542-NPTX κύτταρα και PC3, αντίστοιχα. Ε και F είναι 1542-CP

3TX και 1542-NPTX θεραπεία με ανασυνδυασμένη Wnt5A (100 ng /ml). Παράτυπη πληγή αιχμή και χαλαρά από μεσοκυττάρια συνδέσεις και πρόστιμο νήματα της ακτίνης (filopodia όπως προεξοχές), λευκό βέλη, είναι ορατά σε 1542-NPTX φυσιολογικά κύτταρα και μετά τη θεραπεία AIP το 1542-CP

3TX και τον καρκίνο PC3 κύτταρα. ιωδιούχο προπίδιο χρησιμοποιήθηκε για τη χρώση νουκλεϊκού οξέος (κόκκινο). μπαρ κλίμακας = 10 μm

Η

Στη συνέχεια εξετάσαμε τις ακόλουθες υποθέσεις: (i) την αναστολή της CaMKII θα πρέπει να διαταράξει την πληγή αιχμή στον καρκίνο του προστάτη κυτταρικές σειρές (ii) την ενεργοποίηση της Wnt5A σηματοδότησης στο 1542-NPTX κύτταρα θα πρέπει να προωθήσει την αναδιαμόρφωση της ακτίνης του τραύματος όπως παρατηρείται το 1542-CP

3TX κύτταρα. Χρησιμοποιήσαμε μυριστοϋλιωμένης autocamtide-2 που σχετίζονται με ανασταλτικό πεπτίδιο (ΑΙΡ), έναν αναστολέα της CaMKII, και ανασυνδυασμένη πρωτεΐνη Wnt5A (για την ενεργοποίηση σηματοδότηση Wnt) σε φυσιολογικά και καρκινικά κύτταρα για τη δοκιμή αυτών των υποθέσεων (Εικ. 5). Συνεστιακή μικροσκοπία τραυματιών /γδαρμένο μονοστοιβάδα 1542-CP

κύτταρα 3TX επωάζονται με ΑΙΡ (10 μΜ) που εμφανίζονται διαταράσσεται, ακανόνιστη πληγή προπορευόμενη ακμή με λεπτή filopodia (Εικ. 5C, βέλη) σε σύγκριση με κανονικό χείλος τραύματος σε μη επεξεργασμένα κύτταρα (Σχ . 5Α). Η αιχμή των τραυματιών κύτταρα 1542-NPTX με ή χωρίς AIP έδειξε ένα ακανόνιστο άκρη, με χαλαρά κύτταρο σε επαφή κυττάρου και λεπτές προεξοχές ακτίνης (Εικ. 5Β και D). Αυτές οι μικρογραφίες δείχνουν ότι η αναστολή της CaMKII το 1542-CP

3TX καρκινικά κύτταρα προκαλούν filopodia όπως προεξοχές. Αντιστρόφως, τραυματίες 1542-NPTX φυσιολογικά κύτταρα, επωάστηκαν με ανασυνδυασμένη πρωτεΐνη Wnt5A (100 ng /ml), εμφανίζεται μια κανονική αιχμή (Σχ. 5Ε) της πληγής σε σύγκριση με το μη επεξεργασμένο μάρτυρα (Σχ. 5Β). Καμία εμφανής διαφορά δεν παρατηρήθηκε στην αιχμή του τραύματος, για το ακατέργαστο vs Wnt5A πρωτεΐνη επωάζεται 1542-CP

κύτταρα 3TX (εικ. 5Α και F).

Για να επικυρώσετε ότι η αναδιαμόρφωση ακτίνη μεσολάβηση CaMKII και όχι μέσω άλλες κινάσες (π.χ. CaMKIV, PKA, PKC, Raf ή MAPK1, JNK1α1, ή Raf), χρησιμοποιήσαμε tatCN21a, ένας ειδικός αναστολέας του CaMKII [28]. 1542-CP

κύτταρα 3TX σε επεξεργασία με 5 μΜ του tatCN21a έδειξε ακανόνιστα άκρα του τραύματος, χαλαρά κύτταρο σε επαφή κύτταρο και σχηματισμού filopodia (Εικ. S4) όπως αυτή που παρατηρήθηκε με ΑΙΡ (Εικ. 5). Αναστολή της CaMKII επάγεται επίσης, ακανόνιστη άκρη του τραύματος, χαλάρωση του κυττάρου σε επαφή κύτταρο και filopodia σε άλλες καρκίνου του προστάτη κυτταρικές γραμμές συμπεριλαμβανομένων των PC3 (Σχ. 5G και Η και Εικ. S5), DU145 (Εικ. S6) και ανδρογόνα κυτταρική γραμμή ευαίσθητη LnCaP (Εικ. S7).

Ο μηχανισμός με τον οποίο η αναστολή CaMKII προκαλείται σχηματισμός filopodia σε καρκινικά κύτταρα του προστάτη ήταν δίπλα υπόψη. Χρησιμοποιήσαμε μικροσκοπία ηλεκτρονικής σάρωσης για την ποσοτικοποίηση της filopodia όπως δομές (Εικ. 6). Χαμηλή σάρωσης μεγέθυνση ηλεκτρονικές μικρογραφίες του 1542-CP

κύτταρα 3TX δείχνουν τακτικές και ακανόνιστα χείλη προσβολής του τραύματος στο μη επεξεργασμένο (

ένθετο

Σχ. 6Α) και τα κύτταρα που αντιμετωπίζονται AIP (

ένθετο

Σχ. 6Β ). Υψηλή εικόνες μεγέθυνση δείχνουν σαφώς πολυάριθμες και επεκτάθηκε πρόστιμο filopodia σαν προεξοχές από την κυτταρική μεμβράνη (Σχ. 6Β) σε AIP αγωγή 1542-CP

3TX κυττάρων σε σύγκριση με τα μη επεξεργασμένα κύτταρα (Σχ. 6Α). Αναστολή της CaMKII με ΑΙΡ προκάλεσε ένα παρόμοιο αποτέλεσμα σε κυτταρική σειρά PC3 (Σχ. 5Η και το Σχ. S5B). Η συχνότητα και η διάρκεια της filopodia μετρήθηκε με το χέρι χρησιμοποιώντας το λογισμικό ImageJ. Μια Gaussian προσαρμογή του ιστογράμματος κατανομή μήκους των επεξεργασμένων και μη επεξεργασμένων 1542-CP

κύτταρα 3TX αποκάλυψε μια αύξηση κατά 8 φορές το μήκος και αύξηση 6 φορές στη συνολική συχνότητα των filopodia σαν προεξοχές σε ΑΙΡ σε σύγκριση με το μη επεξεργασμένο 1542-CP

3TX κύτταρα (Σχ. 6C και πίνακα 1). Το ιστόγραμμα θα μπορούσε να τοποθετηθεί για τουλάχιστον δύο μήκη filopodia σαν προεξοχές σε 1542-CP

3TX κύτταρα: μακρύ (μέχρι 2 μm) και πολύ καιρό (& gt? 2 μm). Περαιτέρω ανάλυση έδειξε ότι υπήρξε μια αύξηση κατά 5 φορές σε μήκος, αλλά πολύ μεγαλύτερη (15 φορές) αύξηση της συχνότητας των πολύ μεγάλες προεξοχές σε κύτταρα κατεργασμένα ΑΙΡ σε σύγκριση με τα μη επεξεργασμένα κύτταρα (Πίνακας 1). Τα αποτελέσματα αυτά επιβεβαιώνουν σημαντικό ρόλο για CaMKII μεσολάβηση σηματοδότηση Wnt στην αναδιαμόρφωση της ακτίνης στον καρκίνο του προστάτη με τη μείωση του μήκους και της συχνότητας των filopodia.

Βασικά οι εικόνες είναι αντιπροσωπευτικές εικόνες (γραμμή κλίμακας 1 μm) των μη επεξεργασμένων (Α) και AIP (10 μΜ) επεξεργασμένων κυττάρων (Β). Στο κύριο θέμα είναι η χαμηλή μεγέθυνση της εικόνας (γραμμή κλίμακας 10 μm) από την κύρια εικόνα. Παράτυπη άκρη του τραύματος και πρόστιμο τΊΙοροάίβ σαν προεξοχή είναι ορατά μετά από θεραπεία με AIP (Β, κύρια εικόνα). Μήκος filopodia σαν προεξοχών μετρήθηκε χρησιμοποιώντας λογισμικό Image J και μετατρέπεται σε ιστόγραμμα διανομής (C) για επεξεργασία ΑΙΡ (κοίλες ράβδοι) και χωρίς αγωγή (γραμμοσκιασμένες ράβδοι) κύτταρα. Ένα 8-πλάσια αύξηση στην περιοχή κάτω από την καμπύλη παρατηρήθηκε για σε σύγκριση με το μη επεξεργασμένα κύτταρα χρησιμοποιώντας ένα Gaussian τακτοποίηση.

Η

λειτουργικές επιπλοκές Wnt /Ca

2+ σηματοδότησης σε προστάτη καρκινικά κύτταρα

Κυτταροσκελετού διαδραματίζει αναπόσπαστο ρόλο στην κυτταρική κινητικότητα. Για να διερευνηθούν οι πιθανές εκδηλώσεις της κυτταροσκελετικών μεταβολών ελέγξαμε την υπόθεση ότι η αναστολή CaMKII θα μειωθεί κυτταρική κινητικότητα σε κυτταρικές γραμμές καρκίνου του προστάτη. Χρησιμοποιήσαμε τη δοκιμασία μηδέν πληγή και απεικόνιση ζωντανών κυττάρων με Incucyte (Έσσεν Instruments) για να υπολογιστεί το ποσοστό του κλεισίματος του τραύματος ως μέτρο της κινητικότητας των κυττάρων. Το ποσοστό του κλεισίματος της πληγής μειώθηκε κατά 80% σε κυτταρικές σειρές καρκίνου PC3 αντιμετωπίζονται με AIP (Εικ. 7 και Movie S2, τον έλεγχο και την ταινία S3, AIP).

Confluent PC3 κυτταρικές σειρές καρκίνου του προστάτη τραυματίστηκαν και απεικονίστηκαν όλη τη νύχτα σε διαστήματα 1 ώρα. Οι εικόνες σύμμεικτες (βλ Ταινίες S2, τον έλεγχο και S3, AIP) και τα δεδομένα που εισάγονται σε ένα υπολογιστικό φύλλο. Η προσθήκη της ΑΙΡ (10 μΜ, διαγραμμισμένη ράβδος) μείωσε το ποσοστό κλεισίματος τραύματος κατά 80% σε σύγκριση με τον έλεγχο (κοίλη ράβδος, * ρ & lt? 0.001) ή Wnt5A (100 ng /ml, στερεά ράβδος). Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως μέσες τιμές ± SE, σημασία της διαφοράς μεταξύ ελέγχου και ΑΙΡ ελήφθη με ANOVA. Ισοτιμία του κλεισίματος της πληγής προσδιορίστηκε από την εκτέλεση γραμμική παλινδρόμηση για τον υπολογισμό της κλίσης της γραμμής (

Ένθετο

, εκπρόσωπος της n = 6-7) για το μη επεξεργασμένο έλεγχο (μαύρα τρίγωνα,

R

= 0,99) , Wnt5A (μαύρα τετράγωνα,

R

= 0,99) ή AIP (γεμάτο κύκλο,

R

= 0.97) αντιμετωπίζονται PC3 κύτταρα.

Η

Συζήτηση

Wnt έκφραση και οι μηχανισμοί σηματοδότησης Wnt παραμένει ένας χώρος ελάχιστα ερευνηθεί σε προστάτη. Έχουμε αποδείξει ότι η έκφραση (i) πρωτεΐνη Wnt5A είναι αυξημένη σε σύγκριση με κακοήθεις καλοήθη ιστό ανθρώπινου προστάτη και σε καρκινικές κυτταρικές σειρές σε σύγκριση με το φυσιολογικό. (Ii) Wnt5A είναι σημαντική αισθητήριο της Wnt σηματοδότηση μέσω της ενεργοποίησης της Wnt /Ca

2+ μονοπάτι και δεν Wnt /β-κατενίνης οδού στα κύτταρα του προστάτη. (Iii) Η ενεργοποίηση του CaMKII είναι μία νέα και κρίσιμη ρυθμιστής του κυτταροσκελετού στον καρκίνο του προστάτη. (Iv) αναστολή CaMKII μειώνει σημαντικά την κυτταρική κινητικότητα και την ικανότητα της επούλωσης πληγών σε κυτταρικές σειρές καρκίνου του προστάτη.

Η κατανόηση της μοριακής βάσης του καρκίνου του προστάτη, και ο ρόλος των δικτύων όπως Wnt-μονοπατιού σηματοδότησης, απαιτεί όχι μόνο μια συνολική περιγραφή της γονιδιακής έκφρασης και της πρωτεΐνης σε ανθρώπινο ιστό του προστάτη, αλλά επίσης ένα σύστημα κύτταρο με το οποίο να ερευνήσει τους μηχανισμούς της σηματοδότησης και λειτουργικές συνέπειες της στη νόσο. έρευνες συστοιχία προστατικού ιστού μας δείχνουν ότι υπήρξε μια ιδιαίτερα σημαντική (ρ & lt? 0.0001) αύξηση τόσο της συνολικής έκτασης (έκταση) και το μέσο μέγεθος των επισημασμένων σωματιδίων (ένταση) και κλάσμα περιοχής (Σχήμα 1 Ε, F και G και Πίνακας S2) . Αυτά τα αποτελέσματα υποστηρίζουν τις προηγούμενες παρατηρήσεις των αύξηση στην έκφραση του γονιδίου Wnt5A στον καρκίνο του προστάτη λόγω υπομεθυλίωση [23] και επίσης μια πολύ πρόσφατη έκθεση Yamamoto

et α

l [29] που χρησιμοποιούνται συμβατικά, μη quantiative , η ιστολογική εξέταση για την αξιολόγηση Wnt5A προστάτη έκφραση. Αυτά τα δεδομένα είναι επίσης σε συμφωνία με εκείνη που λαμβάνεται για την κανονική (1542-NPTX) και του καρκίνου (1542-CP

3TX) κυτταρικές σειρές (Σχήμα 2). Λαμβανόμενα μαζί τα δεδομένα ανθρώπινων ιστών και κυτταρικής γραμμής προτείνουν ότι Wnt5A πρωτεΐνη εκφράζεται σε φυσιολογικό (ή καλοήθης) ιστό, αλλά η έκφρασή του αυξάνεται δραματικά σε κακοήθη (καρκινικά) προστατικό ιστό και αυτή η αλλαγή αντανακλάται στις κυτταρικές γραμμές που χρησιμοποιήθηκαν σε αυτή τη μελέτη.

Σχεδόν όλοι οι γνωστοί στόχοι μεταγραφή ενεργοποιείται από την οδό /β-κατενίνης Wnt, π.χ. CTNNB1, CCCNDs, MMPs, PITX2, CD44, APCDD1, ΙΟΥΝ [30] – [32], παραμένουν αμετάβλητα ή ρυθμίζονται προς τα κάτω στις γραμμές ιστών ή κυττάρων του καρκίνου του προστάτη σε σύγκριση με φυσιολογικό ιστό ή κυτταρική γραμμή (Εικ. S3 και Πίνακας S1) . Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι το σύνολο δεδομένων κυτταρική γραμμή αντανακλά σε μεγάλο βαθμό την μορφή έκφρασης του γονιδίου για TCF /LEF ρυθμιζόμενα γονίδια τόσο στην κυτταρική γραμμή και τον καρκινικό ιστό. Επιπλέον, δεν υπήρξε καμία αύξηση στην έκφραση πρωτεΐνης ή λειτουργική δραστηριότητα του κατάντη στόχοι της κανονικής Wnt σηματοδότησης (π.χ. ΜΜΡ-14). Αυτό υποδηλώνει ότι 1542-NPTX και 1542-CP

3TX και κυτταρικές σειρές PC3 μπορεί να είναι ένα χρήσιμο μοντέλο για τη διερεύνηση των μηχανισμών σηματοδότηση Wnt σε καρκίνο του προστάτη ως την ακεραιότητα των Wnt στοιχεία στον καρκίνο του προστάτη σηματοδότηση διατηρούνται σε αυτές τις κυτταρικές γραμμές το γονίδιο, πρωτεΐνες και λειτουργικά επίπεδα.

CaMKII είναι κύριος μεσολαβητής της Wnt /Ca

2+ σηματοδότησης αν και μία περαιτέρω υποομάδα της μη κανονικής σηματοδότηση Wnt μέσω Wnt5A προτείνεται να είναι ένα β-κατενίνης οδός αποδόμησης η οποία δεν απαιτεί την ενεργοποίηση του CaMKII [33]. Μία αύξηση κατά 3 φορές σε ελεύθερο ενδοκυτταρικής συγκεντρώσεως ασβεστίου παρατηρήθηκε μετά την προσθήκη Wnt5A σε κύτταρα προστάτη (Σχήμα 3 και Ταινία S1). Επιπλέον, δεν είδαμε μια μείωση στην έκφραση της πρωτεΐνης β-κατενίνης και τη δραστηριότητα των CaMKII βρέθηκε να αυξάνει στον καρκίνο του προστάτη κυτταρικές γραμμές, δεικνύοντας ότι Wnt /Ca

μονοπάτι 2+ ​​ήταν πιθανό να είναι λειτουργική μέσω CaMKII σε προστάτη καρκίνο

Οι πολλαπλούς ρόλους της CaMKII στην αναδιαμόρφωση της ακτίνης, κυτταρική κινητικότητα και η μετανάστευση των κανονικών κερατινοκυττάρων, των μυών και νευρικά κύτταρα είναι γνωστά [34] – [36].. Ωστόσο, η συμμετοχή των CaMKII μεσολάβηση Wnt /Ca

2 + σηματοδότησης στην ασθένεια έχει λιγότερο καλά χαρακτηριστεί. Pukrop

κ.ά.

[37] πρότεινε ότι η μη κανονική οδός μπορεί να εμπλέκεται στην αυξημένη μετανάστευση /διεισδυτικότητα των MCF7 κυτταρικές σειρές καρκίνου του μαστού όταν ανασυνδυασμένο Wnt5A προστίθεται στην κυτταρική καλλιέργεια. Ωστόσο, οι μηχανισμοί ή αν Wnt5A διαμεσολαβείται επίδραση της μέσω της ενεργοποίησης CaMKII, δεν διερευνήθηκαν. Η κυτταρική κινητικότητα απαιτεί δύο κύριοι τύποι των δομών που βασίζονται ακτίνης στην κυτταρική μεμβράνη, ελασματοπόδια και filopodia. Έχει προταθεί, σε ινοβλάστες, ότι ο σχηματισμός filopodia από ελασματοπόδια είναι μια αυστηρά ελεγχόμενη διεργασία η οποία εν μέρει ελέγχεται από ακτίνη πρωτεΐνες δέσμευσης όπως ενεργοποιημένη (Ένα) /αγγειοδιασταλτικό διεγείρεται φωσφοπρωτεΐνη (VASP) πρόβλεψη ότι το νήμα ακτίνης [38]. Ινοβλάστες κινούνται με την επέκταση ελασματοπόδια στην αιχμή και το σχηματισμό των δομών πρόστιμο ακτίνης που βρίσκονται στην αιχμή προκαλεί ανάδρομη κίνηση [39]? παγίδευση του Ena /VASP στα μιτοχόνδρια αυξήσεις, ενώ της στόχευσης να κυτταρικής μεμβράνης μειώνει την κινητικότητα [38]. Ο ρόλος των Wnt5A μεσολαβούμενη σηματοδότηση σε κυτταρική κινητικότητα [37] και άλλους ενδιάμεσους πρωτεϊνών (π.χ. Ένα /VASP, ARP2 /3) στο σχηματισμό filopodia έχει διερευνηθεί σε ανθρώπινο [14], [40] και [41] κύτταρα μελανώματος ποντικού. Weeraratna και συνεργάτες [40] πρότεινε ότι Wnt5A αυξημένη κυτταρική κινητικότητα σε ανθρώπινες κυτταρικές σειρές μελανώματος με ενεργοποίηση της πρωτεϊνικής κινάσης C (PKC). Witze

et al

[14] έδειξε ότι η οξεία αντίδραση των κυτταρικών γραμμών μελανώματος σε Wnt5A περιλαμβάνει την πρόσληψη σημαντικών πρωτεϊνών του κυτταροσκελετού (ακτίνη και myoxin ΙΙΒ) και Frizzled 3 και μελάνωμα μορίου κυτταρικής προσκόλλησης σε μια ενδοκυτταρική δομή μέσω της ρύθμισης Wnt5A της Rab4 και RhoB γουανοσίνη triphosphatases. Μια άλλη μελέτη διερεύνησε το ρόλο Ror2 κινάσης σε Wnt5A που προκαλείται από τη μετανάστευση των κυττάρων [42]. Σε αντίθεση με τα δεδομένα που παρουσιάζονται εδώ, αυτές τις μελέτες [40], [42] ούτε διερευνήθηκε ούτε χειραγωγείται άμεσα δραστηριότητα CaMKII στα πειράματά τους ή διερευνηθεί ο ρόλος του στο σχηματισμό filopodia. Χρησιμοποιήσαμε tatCN21a, ένας ειδικός αναστολέας του CaMKII (αλλά όχι CaMKIV, PKA, PKC, MAPK1, JNK1α1, ή Raf). Θεραπεία του καρκίνου του προστάτη κυττάρων με tatCN21a προκάλεσε επίσης χαλάρωση των κυττάρων για να επαφής των κυττάρων και το σχηματισμό filopodia επάγεται (Εικ. S4) παρόμοια με τα αποτελέσματα που λαμβάνονται με ΑΙΡ (Εικ. 5). Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι η άμεση αναστολή της CaMKII (και όχι CaMKIV, PKC, ΡΚΑ και άλλες κινάσες) έχει ως αποτέλεσμα την απώλεια της κυτταρικής στην επαφή των κυττάρων και το σχηματισμό filopodia σε κύτταρα καρκίνου του προστάτη.

Σε κυτταρικές σειρές καρκίνου του προστάτη (1542 -CP

3TX και PC3) μια ομαλή, τακτική άκρη του τραύματος παρατηρείται με κοντά κύτταρο σε επαφή κύτταρο που προηγείται της ελασματοπόδια σαν προπορευόμενη ακμή (Σχ. 4 και 5). Σε αντίθεση, η αγωγή με ΑΙΡ προκαλεί αύξηση στα filopodia σαν προεξοχές με χαλάρωση της κυτταρικής στην επαφή κύτταρο που προηγείται του άκρου του τραύματος (Εικ. 5 και 6 και Πίνακας 1). Πράγματι, η ταχύτητα του κλεισίματος της πληγής μειώθηκε κατά 80% μετά από αναστολή της CaMKII σε κυτταρική σειρά καρκίνου (PC3). Αντιστρόφως, η προσθήκη Wnt5A στην κανονική κυτταρική σειρά (1542-NPTX) αύξησε το ποσοστό του κλεισίματος τραύματος (μm /h) σε σύγκριση με τα μη επεξεργασμένα κύτταρα κατά 25 ± 4%. Προτείνουμε ότι η ενεργοποίηση των CaMKII μέσω Wnt5A σηματοδότησης είναι συμφέρουσα για την κινητικότητα των καρκινικών κυττάρων, δεδομένου ότι καταστέλλει το σχηματισμό των λεπτών filopodia που προκαλούν παλίνδρομη κίνηση μειώνοντας έτσι την κινητικότητα των κυττάρων.

Πρωτεΐνη έκφραση Wnt5A στον ανθρώπινο καρκίνο του προστάτη και των μηχανισμών της Wnt σηματοδότησης σε κανονική λειτουργία και καρκίνο του προστάτη κυτταρικές γραμμές, που περιγράφεται εδώ, παρέχει την πρώτη πλαίσιο εντός του οποίου η ακριβής συμμετοχή των υποδοχέων Wnt και εκκριτικών κατσαρωμένα σχετικές πρωτεΐνες [20], [21] και διάφορες πρωτεΐνες δέσμευσης ακτίνης και ενδιάμεσος σηματοδότηση μορίων όπως Ένα /VASP και ERK1 [34], [38], θα μπορούσε να διερευνηθεί σε καρκίνο. Περαιτέρω έρευνες για την ταυτοποίηση του υποδοχέα (ων) για σύνδεση Wnt5A και άλλες πρωτεΐνες που εμπλέκονται στην κατάντη σηματοδότηση μέσω CaMKII σε κυτταρική κινητικότητα στον καρκίνο του προστάτη θα βοηθήσει να διευκρινιστεί η νέα ρόλος του CaMKII στην καταστολή του σχηματισμού filopodia να αυξήσουν την κυτταρική κινητικότητα στον καρκίνο του προστάτη . Εν κατακλείδι, από τα αποτελέσματα που παρουσιάζονται εδώ και πρόσφατη μελέτη μας [23] δείχνει υπομεθυλίωση ως ρυθμιστής της μεταγραφής του γονιδίου Wnt5A στον προστάτη, θα μπορούσε να προβλεφθεί η ακόλουθη σειρά: (i) Γονιδιακή έκφραση της Wnt5A αυξάνεται σε καρκίνο σε σύγκριση με τα φυσιολογικά κύτταρα εξαιτίας να υπομεθυλίωση της περιοχής του γονιδίου υποκινητή (ii) Αύξηση αποτελέσματα γονιδιακής έκφρασης σε αυξημένη έκφραση της πρωτεΐνης του Wnt5A στον ανθρώπινο καρκίνο του προστάτη (iii) Wnt /Ca

2+ οδού (και όχι β-κατενίνης οδός) ενεργοποιείται στον καρκίνο του προστάτη κύτταρα (iv) σηματοδότηση μέσω Wnt /Ca

2 + οδός ενεργοποιεί CaMKII (v) δραστηριότητα CaMKII, πιθανότατα μέσω ενδιάμεσων σηματοδότησης που αφορούν δεσμευτικές πρωτεΐνες ακτίνη, προκαλεί μια σημαντική αναδιοργάνωση του κυτταροσκελετού σε καρκινικά κύτταρα με τη μείωση του μήκους και της συχνότητας του προστίμου , τΊΙοροάίβ όπως δομές ακτίνης. (Vi) κυτταροσκελετού αναδιαμόρφωση λόγω CaMKII προκαλεί αύξηση στην κυτταρική κινητικότητα. Στόχευση της Wnt /Ca

2 + σηματοδότησης, ιδιαίτερα CaMKII μπορεί να παρέχει ένα χρήσιμο εργαλείο στη θεραπεία του καρκίνου του προστάτη.

Υλικά και Μέθοδοι

Κυτταρική καλλιέργεια

Το ανθρώπινο προστάτη επιθηλιακών κυττάρων line1542-NPTX και καρκίνου του προστάτη κυτταρική γραμμή 1542-CP

3TX [43] (που προέρχεται από την κανονική και προστάτη καρκινικού ιστού από τον ίδιο ασθενή [43]) ελήφθησαν από την SL Topalian, National Cancer Institute, ΝΙΗ, ΗΠΑ, δημιουργούς αυτών των κυτταρικών σειρών. καρκίνωμα του προστάτη PC3 κυτταρική γραμμή λήφθηκε από Μ Ε Kaighn τους δημιουργούς αυτής της κυτταρικής γραμμής [44]. DU145 λήφθηκε από την τράπεζα κυττάρων διατηρείται από τον Jørgen Φογκ στο Κέντρο Καρκίνου Sloan Kettering, NY, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής, από μια κατάθεση που γίνεται από τον εντολέα αυτής της κυτταρικής γραμμής [45]. PC3 και DU145 καλλιεργήθηκαν σε RPMI 1640 (Invitrogen) μέσο που περιέχει 5 mM L-γλουταμίνη και ορό εμβρύου μόσχου (FBS) και 1542-NPTX και 1542-CP

3TX διατηρήθηκαν σε κερατινοκύτταρα SFM (KSFM) μέσο και συμπληρώματα ( Invitrogen) με 5% FBS και συμπληρώματα KSFM (Invitrogen).

ποσοτική πραγματικού χρόνου PCR

φθορισμού πραγματικού χρόνου PCR (TaqMan, Applied Biosystems, UK) χρησιμοποιήθηκε για να επαληθευτεί η έκφραση του γονιδίου το 1542 -NPTX και 1542-CP

3TX αρχικά εντοπιστεί από τα πειράματα μικροσυστοιχιών [23]. Απομόνωση RNA περιγράφεται αλλού [23]. ανιχνευτές TaqMan και εκκινητές για PCR πραγματικού χρόνου αγοράστηκαν ως προ-ανεπτυγμένο σύστημα προσδιορισμού? Αναγνωριστικά δοκιμασία Applied Biosystems για τους ανιχνευτές που χρησιμοποιούνται και μια σύντομη πρωτόκολλο δίνεται στον Πίνακα S4.