Αφηρημένο

Ιστορικό

Τα microRNAs (miRNAs) είναι σημαντικοί ρυθμιστές που παίζουν βασικό ρόλο στην ογκογένεση και την εξέλιξη του όγκου. Μια προηγούμενη έκθεση έδειξε ότι τα μέλη του ας-7 οικογένειας μπορούν να δράσουν ως καταστολείς των όγκων σε πολλούς καρκίνους. Μέσω συστοιχία miRNA, βρήκαμε ότι ας-7F ήταν προς τα κάτω σε άκρως μεταστατικού δυναμικού κυτταρικές γραμμές γαστρικού καρκίνου GC9811-P και SGC7901-M, σε σύγκριση με γονικές κυτταρικές σειρές τους, GC9811 και SGC7901-NM? Ωστόσο, ο μηχανισμός δεν ήταν σαφής. Σε αυτή τη μελέτη, θα διερευνήσει αν αφήσουμε-7f δρα ως καταστολέας των όγκων να αναστέλλει την εισβολή και τη μετάσταση του γαστρικού καρκίνου.

Μεθοδολογία /Principal

Σε πραγματικό χρόνο PCR έδειξε μειωμένα επίπεδα ας-7f έκφραση σε μεταστατικό γαστρικό καρκινικούς ιστούς και κυτταρικές σειρές που είναι δυνητικά πολύ μεταστατικός. Κυτταρική εισβολή και η μετανάστευση ήταν σημαντικά μειωμένη σε κυτταρικές σειρές SGC7901-Μ GC9811-P και μετά από επιμόλυνση με αφήσει-7f-μιμείται. Άτριχων ποντικών με μοντέλα ξενομοσχεύματος καρκίνου του στομάχου επιβεβαίωσε ότι αφήνω-7f θα μπορούσε να αναστείλει τη γαστρική μετάσταση του καρκίνου in vivo μετά από επιμόλυνση από τον φακοϊό pGCsil-GFP- ας-7f. Λουσιφεράσης δημοσιογράφος απέδειξε ότι αφήνω-7F συνδέεται άμεσα με την 3’UTR της MYH9, το οποίο κωδικοποιεί για την μυοσίνη ΙΙ Α, και σε πραγματικό χρόνο PCR και κηλίδωση Western έδειξε επίσης ότι αφήνω-7f μειωτικά την έκφραση της μυοσίνης ΔΣ το mRNA και τα επίπεδα της πρωτεΐνης .

Συμπεράσματα /Σημασία

η μελέτη μας έδειξε ότι η υπερέκφραση των αφήστε-7f στο γαστρικό καρκίνο θα μπορούσαν να εμποδίσουν την εισβολή και τη μετανάστευση των γαστρικών καρκινικών κυττάρων μέσω της άμεσης στόχευσης του όγκου μετάστασης που σχετίζονται με το γονίδιο MYH9. Αυτά τα στοιχεία υποδηλώνουν ότι αφήνω-7f μπορεί να είναι μια νέα θεραπευτική υποψήφιος για καρκίνο του στομάχου, δεδομένης της ικανότητάς της να μειώσει κυτταρική εισβολή και τη μετάσταση

Παράθεση:. Liang S, Ο L, Zhao Χ, Miao Υ, Gu Υ, Guo C, et al. (2011) microRNA Ας-7f Αναστέλλει εισβολή και μετάσταση όγκου με στόχευση MYH9 στην Ανθρώπινη γαστρικού καρκίνου. PLoS ONE 6 (4): e18409. doi: 10.1371 /journal.pone.0018409

Επιμέλεια: Donald Gullberg, Πανεπιστήμιο του Μπέργκεν, Νορβηγία

Ελήφθη: 27 Σεπ, 2010? Δεκτές: 7, Μάρ, 2011? Δημοσιεύθηκε: 18 Απρίλη 2011

Copyright: © 2011 Liang et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτή η μελέτη υποστηρίχθηκε από το Εθνικό Ίδρυμα Φυσικών Επιστημών της Κίνας (Νο 30801330, Αρ 30871143, Αρ 81030044)) και το Εθνικό Πρόγραμμα βασικής Έρευνας της Κίνας (Αρ 2010CB529300, Νο 2010CB529306). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Καρκίνος στομάχου (GC) είναι η πιο κοινή γαστρεντερική κακοήθεια στην Ανατολική Ασία, την Ανατολική Ευρώπη και τα μέρη της Κεντρικής και Νότιας Αμερικής, και είναι η δεύτερη κύρια αιτία θανάτου από καρκίνο σχετίζονται [1]. Η εκτεταμένη μετάσταση υπήρξε σημαντικός λόγος για τη θλιβερή έκβαση των ασθενών GC. Η μετάσταση είναι μια σύνθετη, πολυσταδιακή διαδικασία σύμφωνα με την οποία τα καρκινικά κύτταρα μεταναστεύουν από το πρωτεύον νεόπλασμα σε ένα μακρινό τοποθεσία [2]. Η διαδικασία ξεκινά όταν τα πρωτογενή κύτταρα όγκου εισβάλλουν γειτονικό ιστό, που ακολουθείται από τα κύτταρα που εισέρχονται στην κυκλοφορία του αίματος (ενδαγγείωση), μετατόπισης μέσω του αγγειακού συστήματος, που εξέρχεται από τα αιμοφόρα αγγεία (εξαγγείωση) στον περιβάλλοντα παρέγχυμα ιστού, την έναρξη μικρομεταστάσεων και τελικά πολλαπλασιαζόμενα να σχηματίσουν μακροσκοπικά δευτερογενή όγκους [3]. Μία από τις κρίσιμες ρυθμιστικές αρχές που εμπλέκονται σε αυτή τη διαδικασία είναι ένα microRNA (miRNA) [4].

Τα microRNAs (miRNAs) είναι μια κατηγορία των ενδογενών και των μικρών μη-κωδικοποίησης ρυθμιστικά RNA, οι οποίες ρυθμίζουν γονίδια στο μετά μεταγραφικό επίπεδο [5]. Ώριμη miRNAs μπορεί να μεταγραφεί από την RNA πολυμεράση II και παράγονται από τη διαδοχική επεξεργασία πρωτογενών μεταγραφές miRNA από Drosha και Dicer? μπορούν στη συνέχεια να χρησιμεύσει ως μεταγραφικούς ρυθμιστές της γονιδιακής έκφρασης μέσω ζευγαρώματος συμπληρωματικών βάσεων σε αγγελιοφόρο RNA που [6]. Πολλές εκθέσεις δείχνουν ότι miRNAs παίζουν βασικούς ρόλους σε διάφορες βιολογικές διαδικασίες, όπως η διαφοροποίηση των κυττάρων, τον πολλαπλασιασμό, την απόπτωση, αντοχή στο στρες, το μεταβολισμό των λιπών, ογκογένεση και μετάσταση όγκου [7], [8], [9].

η οικογένεια ας-7 είναι μια συντηρημένη οικογένεια miRNAs. Ας-7 αρχικά παρατηρήθηκε στα elegans νηματώδες Caenorhabditis [10], και έχουν δεκατέσσερα μέλη έχουν βρεθεί μέχρι σήμερα [11]. Πρόσφατα, τα επίπεδα έκφρασης των πολλών μελών ας-7-οικογένεια βρέθηκαν να μειώνονται σε μία ποικιλία καρκίνων. Για παράδειγμα, ας-7 ρυθμίζεται μειωτικά στον καρκίνο του πνεύμονα, μελάνωμα, και κεφαλής και λαιμού πλακώδους καρκινώματος, ενώ η υπερέκφραση του ας-7 μπορούν να αναστείλουν τον καρκίνο κυτταρική ανάπτυξη [12], [13], [14], [15], [16 ], [17], [18]. Αρκετές ογκογονίδια, όπως το RAS, MYC και HMGA2, είναι άμεσοι στόχοι της ας-7 [19], [20], [21]. Ας-7f είναι ένα μέλος της οικογένειας let-7. Προηγούμενες μελέτες έχουν δείξει ότι ας-7f είναι επάνω ρυθμισμένη σε πρωτοπαθή καρκίνο του μαστού και προάγει την αγγειογένεση [22]? προς τα κάτω ρύθμιση σε ΡΑΗ [23] προκλήθηκε από τη χρόνια υποξία ή μονοκροταλίνη σε αρουραίους, και το επίπεδο μειώθηκε σε κυστίδια των ασθενών με NSCLC [24] στο πλάσμα. Επιπλέον, ας-7f μπορεί να επηρεάσει τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων με τη στόχευση καλλικρεΐνη σχετίζονται πεπτιδασών (KLKs), μία οικογένεια πρωτεασών σερίνης που έχουν αποδειχθεί να απορυθμίζεται σε διάφορες κακοήθειες, συμπεριλαμβανομένου του καρκίνου των ωοθηκών [25].

μας εργαστηρίου έχουν εντοπιστεί στο παρελθόν μια ομάδα διαφορικά εκφρασμένων miRNAs μεταξύ GC9811 και τα κύτταρα GC9811-P μέσω υψηλού προφίλ chip microRNA αναλύσεις που περιέχουν ας-7f [26]. Κατά τη διάρκεια της περαιτέρω χαρακτηρισμό του let-7f σε διάφορες καρκινικές κυτταρικές γραμμές, βρήκαμε ότι ας-7f λειτουργεί ως καταστολέας μετάστασης. Η ενισχυμένη έκφραση του ας-7f μπορεί να καταστείλει GC εισβολή κυττάρων και μετανάστευση in vitro και in vivo. Με ανάλυση βιοπληροφορικής, εντοπίσαμε ότι MYH9, το οποίο κωδικοποιεί μια βαριά αλυσίδα μυοσίνης ΙΙΑ εμπλέκονται στην προαγωγή της μετανάστευσης των καρκινικών κυττάρων ή εισβολή, ως υποθετικό ας-7f στόχου. Επόμενα πειράματα επιβεβαίωσαν ότι αφήνω-7f να ρυθμίζουν προς τα κάτω την έκφραση της μυοσίνης ΔΣ με στόχο την 3’UTR της MYH9, η οποία παρέχει ένα πιθανό στόχο για θεραπεία GC.

Υλικά και Μέθοδοι

συλλογή ιστών

Πρωτοβάθμια γαστρικό ιστούς όγκων, δίπλα μη-όγκου γαστρικών ιστών και μακρινό μεταστατικό γαστρικό ιστών ελήφθησαν από ασθενείς που υποβλήθηκαν σε χειρουργική επέμβαση στο Xijing Νοσοκομείο Νοσημάτων Πεπτικού σε Xi’an, Κίνα. Όλα τα δείγματα κλινικά και παθολογικά φαίνεται να επισημαίνονται σωστά. Ασθενείς που προσφέρουν δείγματα για τη μελέτη υπεγράφη ενημέρωση έντυπα συγκατάθεσης.

καλλιέργειας κυττάρων

Οι ανθρώπινες κυτταρικές γραμμές γαστρικού καρκίνου GC9811, GC9811-P, SGC7901-NM, SGC7901-Μ συντηρήθηκαν στο δικό μας εργαστήριο και καλλιεργήθηκαν σε RPMI1640 (HyClone), συμπληρωμένο με 10% εμβρυϊκό βόειο ορό. (FBS? GIBCO), 100 μονάδες /ml πενικιλλίνη, και 0,1 mg /ml στρεπτομυκίνη σε 37 ° C σε ένα υγροποιημένο 5% διοξειδίου του άνθρακα επωαστήρα

εκχύλιση RNA και PCR πραγματικού χρόνου

qRT-PCR πραγματοποιήθηκε για τον προσδιορισμό των επιπέδων έκφρασης των δυνητικών ας-7f γονιδίων στόχων. Ολικό RNA εκχυλίστηκε από ιστούς ή καλλιεργημένα κύτταρα χρησιμοποιώντας αντιδραστήριο TRIZOL (Invitrogen Life Technologies). Συμπληρωματικό DNA (cDNA) δημιουργήθηκε με τη χρήση ενός κιτ TaqMan Reverse Transcription (Applied Biosystems). Real-time PCR αναλύσεις πραγματοποιήθηκαν με κιτ TaqMan Micro-RNA Δοκιμασία (Applied Biosystems). Αστάρι του ας-7f αγοράστηκε από Ambion (MI0000437). Primer της MYH9 σειρά σχεδιάστηκε χρησιμοποιώντας Primer Express λογισμικού (έκδοση 1.5). Ο εκκινητής-MYH9 αλληλουχία: (Εμπρός) 5’AGAGCTCACGTGCCTCAACG3 »πρωτόκολλα (Reverse) 5’TGACCACACAGAACAGGCCTG3′.All διεξήχθησαν σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Το επίπεδο έκφρασης του ας-7f ομαλοποιήθηκε σε 5S (Forward: 5’GATTGAATCGAGCACCAGTTAC3 «?

Αντίστροφη: 5’GTCTACGGCCATACCACCCTGAAC3»). Το επίπεδο έκφρασης των MYH9 ομαλοποιήθηκε to18S (Forward: 5’CGGCTACCACATCCAAGGAA3 «?

Αντίστροφη: 5’GCTGGAATATCCGCGGCT3 ‘) PCR και συλλογή δεδομένων εκτελέστηκαν σε iCycler (Bio-Rad).. Κάθε δείγμα εις τριπλούν

Vector κατασκευές και Lentivirus Παραγωγή

Το PRI-ας-7f ακολουθία κατασκευάστηκε ως εξής:. (Forward) HSA-ας-7f-1-Xho ΕΑΝ GGGCCCGCTCTAGACTCGAGATATTTGCATGTCGCTATGTG , (Reverse) HSA-ας-7f-1- BamH IR CGCGGCCGCCTAATGGATCCAAAAAAGGCACAGTCGAGGCTGATC. Η αλληλουχία ενισχύθηκε και κλωνοποιήθηκε εντός του pGCsil-GFP (GENECHEM) για να δημιουργηθεί pGCsil-GFP- ας-7f. Ο αρνητικός έλεγχος ήταν pGC FU-RNAi-NC-LV. συσκευασία του ιού πραγματοποιήθηκε σε κύτταρα ΗΕΚ 293Τ μετά την συνδιαμόλυνση των 20 μg φορέα pGCsil-GFP-ας-7f με 15 μg του πλασμιδίου πακεταρίσματος pHelper 1,0 Vector και 10 μg του πλασμιδίου φακέλου pHelper 2,0 φορέα χρησιμοποιώντας Lipofectamine 2000 (Invitrogen). Οι ιοί συλλέχθηκαν 48 ώρες μετά την επιμόλυνση, και προσδιορίστηκαν οι τίτλοι του ιού.

κατασκευή ολιγονουκλεοτιδίων

ας-7f μιμείται, αφήστε-7f αναστολέα και siRNA ολιγονουκλεοτίδια αρνητικού ελέγχου ήταν chemosynthesized (Shanghai GenePhama Co., Ltd). Τα ολιγονουκλεοτίδια που χρησιμοποιήθηκαν στις μελέτες αυτές ήταν η-ας-7f μιμείται: 5’UGAGGUAGUAGAUUGUAUAGUU3’and 5’CUAUACAAUCUACCUCAUU3 «?

Μιμείται αρνητικός μάρτυρας: 5’UUCUCCGAACGUGUCACGUT3’and5’ACGUGACACGUUCGGAGAATT3», έχει-ας-7f αναστολέα: 5’AACUAUACAAUCUACUACCUCA3 ». MircoRNA αναστολέα αρνητικός μάρτυρας: 5’CAGUACUUUUGUGUAGUACAA3 «

διαμόλυνσης κυττάρων

Τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε 80% έως 90% συρροή μετά την σπάρθηκαν σε πλάκες 6-φρεατίων και επιμολύνθηκαν με Lipofectamine 2000 (Invitrogen. , Carlsbad, CA) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Για παροδική επιμόλυνση, τα κύτταρα σε κάθε φρεάτιο μιας πλάκας 6-φρεατίων μορφομετατράπηκαν με αναστολέα miRNA 12,5 μl ή 7,5 μl miRNA μιμούνται ολιγονουκλεοτίδια. Μετά από 48 ώρες διαμόλυνσης, τα κύτταρα συλλέχθηκαν για περαιτέρω πειραματισμό. Για σταθερώς επιμολυσμένα κύτταρα, τα κύτταρα επιμολύνθηκαν με φακοϊό κατά 30% -50% συρροή. Τα κύτταρα στόχοι (1 χ 10

4), συμπεριλαμβανομένων GC 9811-Ρ και τα κύτταρα SGC7901-M, μολύνθηκαν με 1 χ 10

6 ανασυνδυασμένη μονάδες φακοϊό μεταγωγής παρουσία 6 μg /mL πολυβρένιο (GENECHEM) .

δοκιμασία εισβολή

Η επεμβατική ικανότητα των κυττάρων αναλύθηκε χρησιμοποιώντας Transwells (μέγεθος πόρων 8-μm, Corning Costar Corp). Οι Transwells τέθηκαν σε πλάκες 24 φρεατίων. Πρώτον, 0.1 ml Matrigel (50 μg /ml, BD Biosciences) προστέθηκε πάνω στην επιφάνεια της πλάκας και επωάζονται για 2 ώρες, και στη συνέχεια το υπερκείμενο απομακρύνθηκε. Προσφάτως επεξεργασία με θρυψίνη και πλυμένα κύτταρα (GC9811, GC9811-p, SGC7901-NM, SGC7901-M) εναιωρήθηκαν σε ΚΡΜΙ1640 που περιείχε 1% ορό εμβρύου μόσχου. Στη συνέχεια, 100 μΙ του κυτταρικού εναιωρήματος (1 χ 10

5 κυττάρων) προστέθηκε στον άνω θάλαμο του κάθε ενθέματος που επικαλύφθηκε με Matrigel. Στη συνέχεια, 450 μΐ RPMI1640 που περιέχει 10% βόειο εμβρυϊκό ορό προστέθηκε στο κάτω διαμέρισμα, και τα κύτταρα αφέθηκαν να εισβάλουν για 24 h-48 h στους 37 ° C σε ένα 5% CO

2 υγροποιημένο επωαστήρα. Μετά την επώαση, τα κύτταρα σταθεροποιήθηκαν με 95% απόλυτη αλκοόλη και χρωματίζονται με κρυσταλλικό ιώδες. Τα κύτταρα στην ανώτερη επιφάνεια του φίλτρου απομακρύνθηκαν με τη μπατονέτα και τα κύτταρα που είχαν εισβάλει μέσα στην κάτω επιφάνεια του φίλτρου μετρήθηκαν και απεικονίζεται κάτω από ένα ανεστραμμένο μικροσκόπιο (Olympus Corp. Tokyo, Japan) σε 200 χ μεγέθυνση πάνω από δέκα τυχαία πεδία σε κάθε φρεάτιο. Κάθε πείραμα διεξήχθη εις τριπλούν.

Η μετανάστευση των κυττάρων

Η ικανότητα των GC9811, GC9811-P, SGC7901-NM και κύτταρα SGC7901-M να μεταναστεύσουν ανιχνεύθηκε χρησιμοποιώντας Transwells [8-μm πόρου μέγεθος, Corning Costar Corp]. Οι Transwells τέθηκαν σε πλάκες 24 φρεατίων. Προσφάτως επεξεργασία με θρυψίνη και πλυμένα κύτταρα αιωρήθηκαν σε RPMI1640 που περιέχει 1% ορό εμβρύου μόσχου. 5 × 10

4 κύτταρα /φρεάτιο τοποθετήθηκαν στον άνω θάλαμο του κάθε ενθέτου (BD Biosciences, NJ), με το μη επικαλυμμένο με μεμβράνη. 450 μΐ RPMI1640 που περιέχει 10% βόειο εμβρυϊκό ορό προστέθηκε στα κάτω θαλάμους. Μετά από επώαση για 24 ώρες-48 ώρες στους 37 ° C σε ένα 5% CO

2 υγροποιημένο επωαστή, τα κύτταρα μονιμοποιήθηκαν με 95% απόλυτη αλκοόλη και χρωματίζονται με κρυσταλλικό ιώδες. Τα κύτταρα στον εσωτερικό θάλαμο απομακρύνθηκαν με μια μπατονέτα και τα κύτταρα που συνδέονται με την κάτω πλευρά της μεμβράνης μετρήθηκαν και απεικονίστηκαν υπό ένα ανεστραμμένο μικροσκόπιο (Olympus Corp. Tokyo, Japan) σε 200 χ μεγέθυνση πάνω από δέκα τυχαία πεδία σε κάθε φρεάτιο . Κάθε πείραμα διεξήχθη εις τριπλούν.

In Vivo μετάσταση

δοκιμασία

Για τους in vivo δοκιμασίες μετάσταση, οι σταθερές κυτταρικές σειρές GC9811-P και SGC7901-M συλλέχθηκαν από φιάλες καλλιέργειας ιστού μετά την επιμόλυνση με ο φακοϊό pGCsil-GFP- ας-7f και ελέγχουν pGCsil-GFP χρησιμοποιώντας θρυψίνη και πλύθηκαν τρεις φορές με PBS. Στη συνέχεια, 2 × 10

6 κύτταρα αιωρήθηκαν σε 0.2 ml RPMI1640 ελεύθερο ορού για κάθε ποντικό (έξι σε κάθε ομάδα, Fale BALB /c-nu /nu, 6-8 εβδομάδων ηλικίας), και τα κύτταρα εγχύθηκαν εντός του φλέβα της ουράς. Μετά από τέσσερις εβδομάδες από την ένεση, τα ποντίκια θυσιάστηκαν. Ο ηπατικός ιστός παρατηρήθηκε με γυμνό μάτι, και ο αριθμός των ορατών όγκων στην επιφάνεια ήπαρ μετρήθηκαν. Οι ιστοί του ήπατος χωρίστηκαν σε σειριακά τμήματα, σταθεροποιήθηκαν με φωσφορικό ρυθμιστικό ουδέτερη φορμαλίνη, χρωματίζονται με αιματοξυλίνη και ηωσίνη και εξετάσθηκαν ιστολογικά. Nude ποντίκια χειραγωγείται και φροντίζονται σύμφωνα με τις κατευθυντήριες γραμμές ΝΙΗ Animal Care και την Επιτροπή Χρήση στο πείραμα Κέντρο Ζώων του τέταρτου Στρατιωτικό Ιατρικό Πανεπιστήμιο (Xi’an, στην επαρχία Shanxi, PR China).

Λουσιφεράσης Reporter

Για να διερευνηθεί αν η έκφραση MYH9 ρυθμιζόταν από ας-7F, μια δοκιμασία διπλής λουσιφεράσης εκτελέστηκε. Το 3 ‘UTR του MYH9 περιέχουν θέση ας-7f δεσμευτικές ενισχύθηκε με PCR. Ενίσχυση MYH9 χρησιμοποιήθηκαν οι ακόλουθοι εκκινητές: (Εμπρός) XhoIF: 5’CCGctcgagGCCTCTTCTCCTGCAGCCTG 3 ‘(αντίστροφο) NotIR: 5’ATAAGAATgcggccgcTCGTAGCACATGGTTCTCTTTATTG 3’

Ως αρνητικός έλεγχος, το μεταλλαγμένο θέση δέσμευσης της αλληλουχίας 3′-UTR (χρησιμοποιώντας το αντίστροφο συμπλήρωμα της θέσης δέσμευσης) ενισχύθηκε χρησιμοποιώντας τους εκκινητές: (Εμπρός) mutlet7MYH9F: 5’TTGCAATCACACGTGGTGTGGAGTCACACCTCTGCCCCTTGG3 »(Reverse) mutlet7MYH9R: 5’CCAAGGGGCAGAGGTGTGACTCCACACCACGTGTGATTGCAA 3 ‘. Τα προϊόντα αναγεννημένο μέσω ηλεκτροφόρησης πηκτής αγαρόζης και κλωνοποιήθηκε εντός του φορέα αναφοράς λουσιφεράσης PsiCHECK (Promega, Madison, WI). Όλα τα κατασκευάσματα επιβεβαιώθηκαν με αλληλούχιση. Σύνδεση φάση κύτταρα GC9811-P σπάρθηκαν σε πλάκες 24 φρεατίων και συνεπιμολύνονται με αναστολείς Let-7f ή ελέγχου, και ρεπόρτερ λουσιφεράσης χρησιμοποιώντας Λιποφεκταμίνη ™ 2000 (Invitrogen), ακολουθώντας τις οδηγίες. Μετά από 48 ώρες επώασης, πυγολαμπίδας και Renilla λουσιφεράσης δραστικότητα μετρήθηκε με το σύστημα δοκιμασίας ανταποκριτή διπλής λουσιφεράσης (Promega).

Western Blot

Τα κύτταρα πλύθηκαν δύο φορές με παγωμένο PBS και αποξέστηκαν σε ρυθμιστικό RIPA (50 mM Tris-HCl ρΗ 7.4, 1% (ν /ν) Triton Χ-100, 1 mM EDTA, 1 mM λευπεπτίνη, 1 mM φθοριούχο φαινυλμεθυλσουλφονύλιο, 10 mM NaF, 1 mM Na3VO4) με πρόσφατα προστιθέμενη κοκτέιλ αναστολέα πρωτεάσης (Roche) για 15 λεπτά σε πάγο, στη συνέχεια φυγοκεντρήθηκε στις 13.000 rpm για 10 λεπτά και τα υπερκείμενα συλλέχθηκαν. Δέκα μικρογραμμάρια του κάθε δείγματος αναλύθηκε χρησιμοποιώντας 6% SDS-PAGE και μεταφέρθηκαν σε μεμβράνη νιτροκυτταρίνης (Bio-Rad, Hercules, CA). Οι ζώνες επωάστηκαν με 10% άπαχο ξηρό γάλα σε ρυθμισμένο με Τπδ αλατούχο-0,1% Tween-20 για να εμποδίσει τις μη ειδικές θέσεις πρόσδεσης και επωάστηκαν με πρωτογενές αντίσωμα: πολυκλωνικό κουνελιού αντι-ανθρώπινης μυοσίνης ΙΙΑ (αραιωμένο 1:500? Cell Signaling Technology ) όλη τη νύκτα στους 4 ° C. Μετά επαναθέρμανση και επαναλαμβανόμενη πλύση τρεις φορές, 15 λεπτά για κάθε ένα, οι μεμβράνες επωάστηκαν με αντι-κουνελιού δευτερογενές αντίσωμα χράνου-συζευγμένο με υπεροξειδάση (Santa Cruz Biotechnology), αραιώνεται 1:2000 για δύο ώρες σε θερμοκρασία δωματίου. Οι ζώνες ανιχνεύθηκαν χρησιμοποιώντας ένα σύστημα ενισχυμένης χημειοφωταύγειας (Amersham Biosciences).

Η ανοσοϊστοχημεία

Δύο συστοιχίες ιστών αγοράστηκαν από SHANXI Chaoying ΒΙΟΤΕΧΝΟΛΟΓΙΑ CO., LTD. Το ένα ήταν γαστρικό καρκινικό ιστό και συμφωνημένα παρακείμενο φυσιολογικό ιστό στομάχου, ο άλλος γαστρικό καρκινικό ιστό και συμφωνημένα μετάσταση λεμφαδένων συστοιχίες .Tissue αποκηρώθηκαν σε 60 ° C για 2 ώρες, ανάκτηση αντιγόνου σε υψηλή θερμοκρασία για 10 λεπτά, επανυδατώθηκαν, επωάστηκαν σε 10% φυσιολογικό ορό κατσίκας για 1 ώρα, στη συνέχεια επωάστηκαν με πολυκλωνικό κουνελιού αντι-ανθρώπινο μυοσίνης II Α (αραιωμένου 1:100? Cell Signaling Technology) όλη τη νύκτα στους 4 ° C. Τα πλακίδια πλύθηκαν σε PBS τρεις φορές για 5 λεπτά η κάθε μία. Οι ιστοί επωάστηκαν σε ορό κατσίκας αντι-κουνελιού (ϋΑΚΟ) για 1 ώρα, ξεπλύθηκε με PBS. Οι τομές ανιχνεύονται χρησιμοποιώντας DAB και αντίθετα με αιματοξυλίνη. Η ένταση χρώσης βαθμολογήθηκε χρησιμοποιώντας μια κλίμακα τεσσάρων βημάτων (0, 1+, 2+, 3+ ή) και το ποσοστό των θετικών κυττάρων εκτιμήθηκε με τρεις διαφορετικούς παθολόγους (0 = καθόλου, 1 = & lt? 1%, 2 = 1 -10%, 3 = 10-30%, 4 = 30-70%, 5 = & gt? 70% των κυττάρων του όγκου). Σύνολο μέσες βαθμολογίες στη συνέχεια ομαδοποιούνται σε τέσσερις κατηγορίες: αρνητικό (μη ανιχνεύσιμη χρώση όταν αξιολογήθηκε σε σύγκριση με μη ειδική χρώση υποβάθρου, ασθενές (+), μέτρια (++) ή ισχυρά (+++) και συγκρίθηκαν χρησιμοποιώντας το τεστ Mann-Whitney

Στατιστική Ανάλυση

έλεγχος τ (two-tailed), μονόδρομη ANOVA και Mann-Whitney test χρησιμοποιήθηκαν για να αναλύσουν την in vitro και in vivo δεδομένα χρησιμοποιώντας SPSS 12.0 λογισμικού (Chicago, IL , USA) P τιμή & lt?. 0,05 ορίστηκε ως στατιστικά σημαντική *

P

& lt?. 0,05? **

P

& lt?. 0.01

Αποτελέσματα

Το επίπεδο της αφήνω-7f έκφραση συχνά μειώθηκε σε ανθρώπινο GC μεταστατικές κυτταρικές σειρές και ιστούς

Έχουμε εξετάσει τα επίπεδα έκφρασης του mRNA της αφήνω-7f σε δύο ζεύγη των ανθρώπινων κυτταρικών γραμμών γαστρικού καρκίνου, GC9811, GC9811 -Ρ και SGC7901-NM, SGC7901-M. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 1Α, η έκφραση του ας-7f ήταν χαμηλότερη στα κύτταρα GC, GC9811-Ρ και SGC7901-M, με υψηλό μεταστατικό δυναμικό, ενώ ας-7f ήταν περισσότερο εντόνως εκφρασμένο στα κύτταρα GC, GC9811 και SGC7901-NM, με χαμηλό μεταστατικό δυναμικό. Για να επικυρώσετε περαιτέρω ο ρόλος της αφήνω-7f στο γαστρικό καρκίνο κύτταρα μετάσταση, συγκρίναμε τα επίπεδα έκφρασης της αφήνω-7f σε φρέσκο ​​ανθρώπινο γαστρικό δείγματα καρκινικού ιστού με μεταστάσεις από οκτώ άτομα (Πίνακας S1), σε κανονικό γαστρικό ιστούς (NG), πρωτοβάθμια γαστρικό καρκινικούς ιστούς (GC) και μακρινό μεταστατικό γαστρικό καρκινικούς ιστούς (MC), αντίστοιχα, με πραγματικού χρόνου PCR. Περιέργως, δεν υπήρχε αξιοσημείωτη αρνητική ρύθμιση της αφήνω-7f στο MC και GC, σε σύγκριση με το αφήνω-7f έκφραση σε NG (Εικόνα 1Β). Παρατηρήσαμε ότι είτε η απώλεια ή μειωμένη έκφραση ας-7f σε όγκους και μεταστατικούς ιστούς τους είχε ως αποτέλεσμα ενισχυμένη μετάσταση σε γαστρικό καρκινικούς ιστούς. Τα αποτελέσματα όλων των πρότειναν ότι η έκφραση ας-7F ήταν αρνητική συσχέτιση πολύ στενά με μειωμένη μεταστάσεις GC και θα μπορούσε να διαδραματίσει ζωτικό ρόλο σε παθολογικές διαδικασίες. Έχουμε παρέχεται έτσι η κλινική και η κυτταρική εννοιολογικά στοιχεία για μια μεταστατική διακόπτη στην ανάπτυξη καρκίνου, που προτείνει ένα ρόλο κλειδί για την έκφραση της αφήνω-7f στην ανάπτυξη καρκίνου.

(Α) Οι μέσες φορές-αλλαγές ας-7f γονιδιακής έκφρασης σε GC9811 και GC9811-Ρ (δεξιά). Οι μέσες φορές-αλλαγές της έκφρασης ας-7f γονιδίων σε SGC7901-NM και SGC7901-Μ (αριστερά). έλεγχος τ, n = 3. (Β) Η σχετική έκφραση ας-7ί να 5S. *

P

& lt? 0,05. **

P

& lt? 0,01. μονόδρομη ANOVA, η = 8. Real-time PCR δείχνουν ότι η σχετική έκφραση ας-7f σε οκτώ γειτονικά μη καρκινικά δείγματα γαστρικού ιστού, και σε κυτταρικές γραμμές γαστρικού καρκίνου GC9811, SGC7901-NM είναι υψηλότερη από ότι στην πρωτογενή τους καρκίνο του στομάχου και μακρινό δείγματα γαστρικού μετάσταση και το υψηλό δυναμικό μετάστασης του καρκίνου του στομάχου κυττάρων GC9811-P και το δείγμα SGC7901-M.Each αναλύθηκε εις τριπλούν και ομαλοποιήθηκε ως προς 5S. Διπλώστε αλλαγή ήταν υπολογίζονται 2-

ΔΔ

Ct.

Η

Ας-7f ανέστειλε τις επεμβατικές και μεταστατική ικανότητα των GC κύτταρα in vitro

Επειδή ας-7f πράξεις ως ένα αναδευτήρα σε εισβολή και μεταστατικών διαδικασιών, ερευνήσαμε την επίδραση της μειωμένης ας-7f στις λιγότερο μεταστατικές κυτταρικές γραμμές και αυξημένη ας-7f σε πιο-μεταστατικές κυτταρικές γραμμές. Για να επιτευχθεί αυτό, σύντομης παρεμβολής RNA (siRNA) ολιγονουκλεοτίδια της ας-7f κατασκευάστηκαν και να εισαχθούν σε κύτταρα GC9811 και τα κύτταρα SGC7901 -NM για δοκιμασίες μετάσταση in vitro, όπως GC9811-ας-7f-siRNA κύτταρα, SGC7901-NM-ας-7f κύτταρα -siRNA και τα κύτταρα ελέγχου. Ταυτόχρονα, μιμούνται-ας-7f και αρνητικά ολιγονουκλεοτίδια ελέγχου κατασκευάστηκαν επίσης και εισάγονται σε GC9811-Ρ κύτταρα και κύτταρα SGC7901-M για δοκιμασίες μετάσταση in vitro, ως GC9811-Ρ-ας-7f-μιμητικό κύτταρα, SGC7901-Ν-έχει αφήσει -7f-μιμητικό κύτταρα και κύτταρα ελέγχου. Η εξάντληση του ας-7Ρ μειωμένη σημαντικά την ικανότητα των κυττάρων να μεταναστεύουν GC9811 και εισβάλλουν μέσα από τα επικαλυμμένα με Matrigel μεμβράνες ή μη επικαλυμμένα με Matrigel μεμβράνες προς (Σχήμα 2Α) μέσο σε μια τροποποιημένη δοκιμασία θαλάμου Boyden που περιέχει ορό. Αυξημένη έκφραση του ας-7Ρ κατέστειλε σημαντικά την ικανότητα του GC9811-Ρ κύτταρα να μεταναστεύουν και εισβάλλουν μέσω Matrigel επικαλυμμένα μεμβράνες ή μη επικαλυμμένα με Matrigel μεμβράνες προς μέσο που περιέχει ορό σε μία τροποποιημένη δοκιμασία θαλάμου Boyden (Σχήμα 2Β), σε σύγκριση με τα κύτταρα ελέγχου. Παρόμοια αποτελέσματα βρέθηκαν σε κύτταρα SGC7901-NM (Σχήμα 3Α) και κύτταρα SGC7901-M (Σχήμα 3Β), ενώ ας-7f knockout σε κυτταρικές γραμμές GC είχε ως αποτέλεσμα υψηλότερα ποσοστά εισβολή και τη μετανάστευση.

(Α) Εισβολή και δοκιμασία μετανάστευσης. Εκπρόσωπος τομείς της επεμβατικής (πάνω) ή (κάτω) κύτταρα μετανάστευση στη μεμβράνη (αριστερά). (Μεγέθυνση χ 200). Μέσος αριθμός επεμβατικές ή μετανάστευση κυττάρων ανά πεδίο (δεξιά). Η επεμβατική ή μετανάστευση του αριθμού των κυττάρων των κυττάρων GC9811 επιμολυσμένα με let-7f-αναστολείς αυξάνεται δραστικά από ότι επιμολυσμένα με αρνητικό μάρτυρα. * Ρ & lt? 0,05, t-test του Student, η = 10. (Β). Η επεμβατική ή μετανάστευση αριθμό των κυττάρων του GC9811-Ρ κύτταρα επιμολυσμένα με let-7f-μιμείται είναι δραστικά μειωμένη από ότι επιμολυσμένα με αρνητικό μάρτυρα. * Ρ & lt? 0,05, t-test του Student, η = 10.

Η

(Α) Invasion και μετανάστευση δοκιμασίας. Εκπρόσωπος τομείς της επεμβατικής (πάνω) ή (κάτω) κύτταρα μετανάστευση στη μεμβράνη (αριστερά). (Μεγέθυνση χ 200). Μέσος αριθμός επεμβατικές ή μετανάστευση κυττάρων ανά πεδίο (δεξιά). Η επεμβατική ή μετανάστευση αριθμό των κυττάρων του SGC7901-NM επιμολυσμένα με let-7f-αναστολείς αυξάνεται δραστικά από ότι επιμολυσμένα με αρνητικό μάρτυρα. * Ρ & lt? 0,05, t-test του Student, η = 10. (Β) Η επεμβατική ή μετανάστευση αριθμό των κυττάρων του SGC7901-M Κύτταρα μετεμβολιασμένα με ας-7f-μιμητικά είναι δραματικά μειωμένη από εκείνη που επιμολύνθηκαν με αρνητικό έλεγχο. * P & lt? 0,05, t-test του Student, η = 10.

Η

Ας-7f αναστέλλει την εισβολή και μετάσταση όγκου σε ένα γυμνό μοντέλο ξενομοσχεύματος ποντικού

GC9811-P ή SGC7901-M καρκινικά κύτταρα επιμολυσμένα με τον φακοϊό pGCsil-GFP- ας-7f ή αρνητικό μάρτυρα pGCsil-GFP ενέθηκαν σε γυμνά ποντίκια και τα ποντίκια θανατώθηκαν τέσσερις εβδομάδες μετά τις εμβολιασμούς. Ο αριθμός των μεταστατικών nodi μειώθηκε δραματικά στα γυμνά ποντίκια ενέθηκαν με τις ας-7f επιμολυσμένα κύτταρα pGCsil-GFP-, σε σύγκριση με τους αρνητικούς μάρτυρες (Σχήμα 4Α, 4Β). Αυτά τα δεδομένα παρέχουν ισχυρές ενδείξεις που αφήνουν-7f να αναστέλλουν την εισβολή και μετάσταση όγκου in vivo.

GC9811-P και SGC7901-Μ κύτταρα επιμολυσμένα με φακοϊό pGCsil-GFP-ας-7f ή αρνητικό έλεγχο lentivirus pGCsil- GFP, και στη συνέχεια με ένεση σε γυμνούς ποντικούς μέσω της φλέβας της ουράς, όπως περιγράφεται στο Υλικά και Μέθοδοι. Τα ζώα θυσιάστηκαν 4 εβδομάδες μετά την ένεση. (Α) Εκπρόσωπος ανατομική φωτογραφίες της ζωής από τα ποντίκια με ένεση GC9811-P- pGCsil-GFP ή GC9811-P- pGCsil-GFP- ας-7f (αριστερά). Ο μέσος αριθμός των ορατών οζιδίων όγκου στο ήπαρ (δεξιά). P & lt? 0,01. έλεγχος τ, η = 6. (β) Αντιπροσωπευτικά ανατομική φωτογραφίες της ζωής από τα ποντίκια που ενέθηκαν με SGC7901-M – pGCsil-GFP ή SGC7901-M – pGCsil-GFP- ας-7f (αριστερά). Ο μέσος αριθμός των ορατών οζιδίων όγκου στο ήπαρ (δεξιά). P & lt? 0,01. έλεγχος τ, n = 6.

Η

Ας-7f ρυθμίζει προς τα κάτω μυοσίνης ΔΣ της έκφρασης με την άμεση στόχευση 3 ‘UTR

της

Για να διερευνήσουν περαιτέρω το μηχανισμό με τον οποίο ας-7f καταστέλλει GC εισβολή και μετάσταση, αναλύσαμε δυναμικό κατάντη μετάσταση όγκου που σχετίζονται με γονίδια-στόχους in silico. Εστιάσαμε στην αφήσουμε-7f γονιδίων στόχων, ιδιαίτερα εκείνα τα γονίδια που ήταν η μετανάστευση ή /και την εισβολή που σχετίζονται με, και διαπίστωσε ότι ΙΙΑ μυοσίνη, που εμπλέκονται στην προώθηση της μετανάστευσης των καρκινικών κυττάρων ή την εισβολή, θα μπορούσε να είναι το γονίδιο στόχος ας-7f. Σε μια προσπάθεια να καθοριστεί εάν μυοσίνης ΙΙΑ ρυθμίζεται από ας-7f μέσω απευθείας σύνδεσης σε 3 ‘UTR, κατασκευάσαμε πλήρους μήκους αγρίου τύπου και μεταλλαγμένων θραυσμάτων MYH9 mRNA 3’ UTR, και εισάγεται τους στην περιοχή αμέσως κατάντη του ένα γονίδιο αναφοράς λουσιφεράσης (Σχήμα 5Α). Στη συνέχεια, ας-7f μιμούνται ολίγο συν-επιμολύνθηκαν με διαφορετικές λουσιφεράση 3 ‘UTR κατασκευασμάτων σε GC9811-Ρ κύτταρα. Βρήκαμε ότι ας-7f μείωσε τη σχετική δραστικότητα λουσιφεράσης στην άγριου τύπου 3 ‘UTR του MYH9 (Σχήμα 5Β). Ωστόσο, η δραστικότητα λουσιφεράσης δεν μειώθηκε απότομα στα UTRs με θέσεις πρόσδεσης μεταλλαγμένο, σε σύγκριση με τα αντίστοιχά mut-τύπου (Σχήμα 5C). Αυτά τα δεδομένα υποστηρίζουν ότι MYH9 είναι άμεσο στόχο ας-7ί.

(Α) Προβλεπόμενη duplex σχηματισμό μεταξύ της ανθρώπινης MYH9 3’UTR (επάνω) και έχει-ας-7f (κάτω) και την αλληλουχία του γράμ- 7f-θέση δέσμευσης εντός του MYH9 3’UTR και μεταλλαγμένα (mut) MYH9 3’ΙΙΤΡ. δραστηριότητα λουσιφεράσης της MYH9 3’UTR (Β) ή mut MYH9 γονίδιο (C) 3’ΙΙΤΡ δημοσιογράφος σε κύτταρα GC9811 μολυνθεί με τον αφήνω-7F, αφήστε-7f-αναστολέα, κενό ή άδειο μιμούνται ολίγο. Οι δοκιμασίες έδειξαν ότι λουσιφεράσης δραστηριότητες της ομάδας ήταν σημαντικά μειωμένη σε σύγκριση με εκείνες των μεταλλαγμένων και των αρνητικών ομάδων ελέγχου. * P & lt? 0,05. (Δ) Η έκφραση της MYH9 αναλύθηκε με qRT-PCR. MYH9 μειώθηκε στα κύτταρα GC9811 και SGC7901 κύτταρα επιμολυσμένα με αφήσει-7f-μιμείται σε σύγκριση με τα κύτταρα GC9811 και SGC7901 κύτταρα επιμολυσμένα με αφήσει-7f -αρνητικοί ελέγχου. (Ε) ας-7f καταστέλλει τα ενδογενή επίπεδα πρωτεΐνης του MYH9, όπως ανιχνεύεται με στύπωση Western. Σταθερό μετάγονται SGC7901-NM και τα κύτταρα GC9811 εκτοπικά εκφράζουν ας-7f χρησιμοποιήθηκαν για την ανάλυση Western blot. Επίδραση της ας-7f για MYH9 στα κύτταρα GC9811 (κορυφή). Επίδραση της ας-7f για MYH9 στα κύτταρα SGC7901-NM (κάτω).

Η

RT-PCR έδειξε ότι η έκφραση του MYH9 στα κύτταρα GC9811 και τα κύτταρα SGC7901-NM επιμολυσμένα με αφήσει-7f-μιμείται είναι ρυθμίζεται προς τα κάτω σε σύγκριση με εκείνα τα κύτταρα επιμολυσμένα με κατασκευάσματα ελέγχου (Εικόνα 5D). Western blotting αποτελέσματα έδειξαν έκφραση της μυοσίνης ΙΙΑ σε GC9811 και κύτταρα SGC7901-NM επιμολυσμένα με ας-7f-μιμητικά είναι ρυθμισμένα προς τα κάτω σε σύγκριση με εκείνους που μορφομετατρέπονται με αρνητικό μάρτυρα (Σχήμα 5Ε). Furthmore, Real-time PCR δείχνει ότι το mRNA σχετική έκφραση MYH9 στους ιστούς GC και απομακρυσμένες μεταστατικές ιστών είναι κάτω-ρυθμίζονται σε σύγκριση με το φυσιολογικό γειτονικό μη καρκινικών δειγμάτων τους (Σχήμα 6Α). Ανοσοϊστοχημεία έδειξε ότι η έκφραση του μυοσίνης ΙΙΑ σε GC λεμφαδένα μετάσταση ρυθμίζεται προς τα πάνω σε σχέση με την πρωτογενή ιστό του GC (Πίνακας 2? Σχήμα 6C? Σχήμα S1B), και είναι ρυθμισμένα προς τα πάνω σε ιστό GC σε σχέση με συμφωνημένα παρακείμενο φυσιολογικό στομάχι του ιστού (Πίνακας 1? Σχήμα 6Β? Σχήμα S1 Α) .Οι δεδομένα καταδεικνύουν ότι αφήνω-7f μπορούν να ρυθμίζουν προς τα κάτω την έκφραση του mRNA της MYH9 και μπορεί να καταστείλει πρωτεΐνη μετάφρασή του

(Α) σε πραγματικό χρόνο PCR show. ότι η σχετική έκφραση του MYH9 σε οκτώ μακρινά γαστρικό δείγματα μετάσταση είναι υψηλότερο από ότι σε πρωτογενή καρκίνο του στομάχου τους και τις παρακείμενες μη καρκινικά δείγματα γαστρικού ιστού. Κάθε δείγμα αναλύθηκε εις τριπλούν και κανονικοποιήθηκαν ως προς 18S. (Β) Έκφραση MYH9 σε πρωτογενείς γαστρικό καρκίνο (Ca) και παρακείμενο φυσιολογικό ιστό στομάχου του (Ν) με IHC. (Γ) έκφραση των MYH9 στην πρωτοβάθμια γαστρικό καρκίνο (Ca) και συμφωνημένα λεμφαδένα μετάσταση των ιστών του (M) με IHC.

Η

Η

Συζήτηση

Στο παρούσα μελέτη, αποδείξαμε ότι αφήνω-7f έκφραση σε κυτταρικές σειρές μεταστατικού GC ήταν ρυθμίζεται προς τα κάτω σε σύγκριση με αφήσει-7f έκφραση σε μη-μεταστατικά κύτταρα GC. Η έκτοπη έκφραση και siRNA knockdown του ας-7f επιβεβαιωθεί δραστικότητα εισβολή καταστολής του in vitro και in vivo. Επιπλέον, δείχνουμε ότι MYH9 είναι ένας άμεσος στόχος για let-7f και αυτό ας-7f μεσολάβηση καταστολή της MYH9 εξαρτάται από 3′-UTR της. Ως εκ τούτου, τα αποτελέσματα αυτά υπογραμμίζουν την σημασία της ας-7f ως καταστολέας όγκου σε κύτταρο εισβολή και τη μετάσταση με τη στόχευση MYH9 σε γαστρικό καρκίνο.

Πρόσφατες μελέτες δείχνουν ότι miRNAs μπορεί να δρουν ως ενεργοποιητές ή αναστολείς της μετάστασης του όγκου [27] . Για παράδειγμα, microRNA-10b [28], miR-373 και miR-520c [29], [30] διεγείρονται μετανάστευση των καρκινικών κυττάρων και εισβολή στον καρκίνο του μαστού. Επιπλέον, miR-155 μπορεί να προωθήσει την εισβολή και μετάσταση όγκου στον καρκίνο του μαστού με προς τα κάτω ρύθμιση του στόχου της, RhoA [31] και την προώθηση εισβολή και μετάσταση όγκου στο καρκίνωμα πόρου του παγκρέατος με την καταστολή της έκφρασης του TP53INP1 [32]. Η οικογένεια miRNA-200 (miRNA-200Α, miRNA-200b, miRNA-200c, miRNA-141 και miRNA-429) μπορούν να αναστείλουν την εισβολή και μετάσταση όγκου με τη ρύθμιση της EMT [33]. MiR-126 βρέθηκε να αναστέλλει την κυτταρική προσκόλληση, η μετανάστευση και εισβολή εν μέρει μέσω της καταστολής της CRK σε ένα in vitro μοντέλο του μη μικροκυτταρικός καρκίνος του πνεύμονα [34]. Έχει δειχθεί ότι miR-29c είναι σημαντικά μειωμένη σε εξαιρετικά διεισδυτική και μεταστατική ρινοφαρυγγικό καρκίνωμα [35]. MiR-218 αναστέλλει την εισβολή και τη μετάσταση του καρκίνου του στομάχου με τη στόχευση του υποδοχέα Robo1 [26]. Αν και πολλές μελέτες έχουν γίνει για να διερευνήσει τον μηχανισμό της miRNA και μετάσταση όγκου, ο μηχανισμός δεν ήταν σαφής. Το πιο σημαντικό, έχουν λίγες μελέτες έχουν γίνει σχετικά με τους μηχανισμούς ρύθμισης μετάστασης GC με microRNA.

Το γονίδιο ας-7f βρίσκεται στο 9q22.3, και εμπλέκεται σε μία ποικιλία φυσιολογικών και παθολογικών διαδικασιών, συμπεριλαμβανομένης της αγγειογένεσης [36], ανοσοκυττάρων διαφοροποίηση [37], την κυτταρική γήρανση [38], διακοπή της ανάπτυξης [39], της πνευμονικής αρτηριακής υπέρτασης και καρκινογένεση [23]. Ας-7f ρυθμίζεται μειωτικά σε διάφορες κακοήθειες. Ένα εξαιρετικά χαρακτηρισμένο παράδειγμα είναι το καρκίνωμα νεφρικών κυττάρων, στην οποία ας-7f προς τα κάτω ρύθμιση οδήγησε σε σημαντική μείωση της καλλικρεϊνης (KLK) έκφραση [40]. KLKs μπορούν επίσης να απευθύνονται από αφήνω-7f στον καρκίνο των ωοθηκών [25]. Σε θηλώδους καρκίνου του θυρεοειδούς, μειωμένη έκφραση ας-7f θα μπορούσε να είναι ένα ουσιαστικό μοριακού γεγονός στην RET /PTC κακοήθη μετασχηματισμό [41]. Στην περίπτωση του καρκίνου του μαστού πρωτογενούς, ωστόσο, ας-7F ήταν ρυθμισμένη προς τα πάνω σε σύγκριση με φυσιολογικό γειτονικό ιστούς όγκου [22]. Στη μελέτη μας, δείξαμε ότι αφήνω-7f είναι επίσης προς τα κάτω σε ιστούς MC και κυτταρικές σειρές GC με υψηλό μεταστατικό δυναμικό, και εμείς ακόμη διερευνηθεί ο μηχανισμός με τον οποίο ας-7f μειωμένη εισβολή και μετάσταση όγκου.

MYH9 είναι το γονίδιο για μη-μυϊκή μυοσίνης βαριά αλυσίδα ΙΙΑ (NMHCIIA), των οποίων οι μεταλλάξεις είναι υπεύθυνες για μια σύνθετη διαταραχή που ονομάζεται MYH9 σχετίζονται ασθένεια, η οποία χαρακτηρίζεται από έναν συνδυασμό διαφορετικών φαινοτυπικών χαρακτηριστικών [42].