Αφηρημένο

καρκίνο της ουροδόχου κύστεως (UBC) κατατάσσεται ένατη σε καρκίνο σε όλο τον κόσμο. Στην Αίγυπτο, το πρότυπο του καρκίνου της ουροδόχου κύστης είναι μοναδικό στο ότι επικρατεί τόσο οι μεταβατικές και πλακωδών τύπους κυττάρων. Παρά τη σημαντική έρευνα για το θέμα, είναι ακόμα δύσκολο να προβλεφθεί εξέλιξης του όγκου, η βέλτιστη θεραπεία και την κλινική έκβαση. Η μεταφορέα ανηγμένου φολικού (RFC /SLC19A1) είναι το κύριο σύστημα μεταφοράς για φολικά στα κύτταρα και τους ιστούς των θηλαστικών. RFC είναι επίσης το κύριο μέσο κυτταρικής πρόσληψης για τον καρκίνο του αντιφολικού χημειοθεραπευτικά φάρμακα, ωστόσο, μεταφορά μεμβράνη του αντιφολικών με RFC θεωρείται ως περιοριστική για αντικαρκινική δράση. Ο σκοπός αυτής της μελέτης ήταν να συγκριθεί το επίπεδο έκφρασης του mRNA της RFC /SLC19A1 σε ουροθηλιακά και μη ουροφόρων παραλλαγές καρκινώματα της ουροδόχου κύστης. Ποσοτικοποίηση των RFC mRNA στο βλεννογόνο του 41 ασθενείς χωρίς θεραπεία καρκίνου της ουροδόχου κύστης πραγματοποιείται με τη χρησιμοποίηση RT-qPCR. RFC mRNA επίπεδα σταθερής κατάστασης ήταν ~ 9 φορές υψηλότερες (Ν = 39? P

Το εκφράζεται παντού μεταφορέα ανηγμένου φολικού (RFC) θεωρείται η κύρια οδός μεταφοράς για φολικά σε φυσιολογικές συγκεντρώσεις συμπαράγοντας ακόμα και όταν πολλαπλά συστήματα πρόσληψης είναι παρόντες [ ,,,0],1], [10], [11]. Απώλεια της έκφρασης RFC ή λειτουργία προμηνύει δυνητικά σοβαρές φυσιολογικές και αναπτυξιακές συνέπειες [1], [12]. RFC είναι επίσης μια σημαντική μεταφορέα των ναρκωτικών αντιφολικού που χρησιμοποιούνται για τη χημειοθεραπεία του καρκίνου, όπως η μεθοτρεξάτη (ΜΤΧ), την πεμετρεξίδη και raltitrexed. Η αποτελεσματικότητα της χημειοθεραπείας με αυτούς τους παράγοντες είναι στενά συνδεδεμένη με τα επίπεδα και τη δραστηριότητα των RFC και στις δύο όγκους και φυσιολογικούς ιστούς [13], [14]. ΜΤΧ, για παράδειγμα, συνεχίζει να είναι ένα σημαντικό συστατικό του χημειοθεραπευτικού οπλοστάσιο για μια ποικιλία κακοηθειών, συμπεριλαμβανομένου του καρκίνου της ουροδόχου κύστης [15], [16]. Η πεμετρεξίδη έχει επίσης πρόσφατα θεωρηθεί για χρήση στη θεραπεία του καρκίνου της ουροδόχου κύστης [16]. μεταφορά μεμβράνης από αυτά τα αντιφολικών είναι κρίσιμη για την αντικαρκινική δραστηριότητα δεδομένου ότι αυτό παρέχει επαρκή (μη δεσμευμένης) ενδοκυτταρικό φάρμακο για τη διατήρηση της μέγιστης αναστολής των ενζύμων στόχων (π.χ., DHFR? διϋδροφολική αναγωγάση) και για τη σύνθεση των παραγώγων πολυγλουταμικού απαιτείται για σύνδεση υψηλής συνάφειας προς ενδοκυτταρικά ένζυμα [13 ]. Η μειωμένη έκφραση του γονιδίου μεταφορέα φολικού μπορεί να μελετηθεί αξιόπιστα στο επίπεδο mRNA, και βασίζεται σε μια σειρά από μελέτες [13], [14], [17], [18], [19], [20], [21], η έκφραση είναι πιθανό να αντικατοπτρίζει τη δραστικότητα του RFC και στις δύο όγκους και φυσιολογικούς ιστούς. Ως εκ τούτου, την επιθεώρηση διαφορές στην έκφραση RFC μεταξύ των διαφόρων τύπων καρκίνου της ουροδόχου κύστης μπορεί να ανοίξει το δρόμο για πιθανή βελτίωση των αντιφολικού χημειοθεραπεία που περιέχει ορθολογικά βάση.

Η παρούσα μελέτη, ως εκ τούτου, ανέλαβε να ερευνήσει την έκφραση mRNA και πιθανή κλινική ενδιαφέρον (δηλαδή ενώσεις με το στάδιο του όγκου, το βαθμό και /ή ιστολογικό τύπο) των μεγάλων φυλλικού οξέος μεταφορέα, RFC, σε μια ομάδα ανθρώπινων όγκους της ουροδόχου κύστης των διαφόρων ιστολογικών τύπων.

Υλικά και Μέθοδοι

Ηθικοί κανόνες

Μια πρώτη σειρά 61 ασθενών με καρκίνο της ουροδόχου κύστης συμπεριλήφθηκαν στην παρούσα μελέτη. Όλοι οι ασθενείς «δεδομένα αναλύθηκαν ανώνυμα και των ασθενών συγκατάθεση είχε ληφθεί για να συμπεριλάβει εκτομή ιστού για την τρέχουσα μελέτη, μέσω του τμήματος παθολογίας στο Εθνικό Ίδρυμα Καρκίνου (NCI), Κάιρο, Αίγυπτος. Όλα τα ερευνητικά πρωτόκολλα εγκρίθηκαν από τις θεσμικές συμβούλια αναθεώρηση του ΝΚΜ και της Επιτροπής Έρευνας Ηθικής του Πανεπιστημίου της Γερμανίας στο Κάιρο.

Ασθενείς

Εξήντα ένα βιοψίες των όγκων ελήφθησαν από TUR στο NCI κατά τη διάρκεια της το χρονικό διάστημα από τον Μάρτιο του 2009 έως τον Ιανουάριο του 2010. 17 δείγματα στη συνέχεια αποκλείστηκαν από τη μελέτη κατά το στάδιο ελέγχου της ποιότητας του RNA (βλέπε παρακάτω). Για τα υπόλοιπα 44 δείγματα, το στάδιο του όγκου και της ποιότητας του έχουν ανατεθεί σύμφωνα με το ΤΝΜ [4] από τη μονάδα παθολογίας στο NCI .. Οι ασθενείς που περιλαμβάνονται σε αυτή τη μελέτη (n = 44? 31 άνδρες, 11 γυναίκες και 2 αγνώστων? Εύρος ηλικίας: 31-79) κατανεμήθηκαν σε δύο κύριες ομάδες ανάλογα με όγκο ιστολογικό τύπο: ομάδα urothelial όγκων »? TCC και TCC με πλακώδη μεταπλασία? και ομάδα μη-urothelial όγκων »? SCC και το αδενοκαρκίνωμα. Κατά τη στιγμή της ένταξης, κανένας από τους ασθενείς είχαν λάβει αγωγή με οποιαδήποτε μορφή. Κλινικά χαρακτηριστικά των ασθενών με καρκίνο της ουροδόχου κύστης που περιλαμβάνονται σε αυτή την μελέτη παρατίθενται στον Πίνακα S1.

Σύνολο εκχύλιση RNA και αντίστροφη μεταγραφή

Αποκομμένα βιοψίες όγκων χρησιμοποιήθηκαν για ανάλυση mRNA τοποθετήθηκαν αμέσως σε RNA

αργότερα

® Reagent RNA Σταθεροποίηση (Qiagen, Germany), που διατηρείται στους -4 ° C όλη τη νύκτα, στη συνέχεια, αποθηκεύονται στους -20 ° C. Ολικό RNA εξήχθη από κατεψυγμένα βιοψίες (-30 mg) χρησιμοποιώντας Απολύτως RNA mini-prep kit (Stratagene, Γερμανία) σύμφωνα με τις οδηγίες των κατασκευαστών. Απομονωμένα ακεραιότητα του RNA επαληθεύεται ηλεκτροφορητικώς με χρώση βρωμιούχου αιθιδίου και με Α

αναλογία 260 /Α

280 απορρόφηση (εύρος 1.8-2.0) (Α260 nm = 1 αντιστοιχεί σε 40 μg /ml RNA). Μια αναλογία 2:01 ένταση μεταξύ 28S και 18S rRNA θεωρήθηκε σημείο αναφοράς για ανέπαφο RNA (Σχήμα S1). 17 δείγματα όγκων αποκλείστηκαν από τη μελέτη με βάση το προφίλ ακεραιότητα του RNA τους (Σχήμα S1). 5 μg ολικού RNA μεταγράφηκε ανάστροφα με Sprint ™ RT πλήρη προϊόντα κιτ (Clonetech, Γερμανία) σε έναν όγκο 20 μΐ σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή.

RT-qPCR ποσοτικοποίηση των RFC mRNA

το πρωτόκολλο RT-qPCR ακολούθησε η μελέτη αυτή διαρθρώνεται γύρω από τις ελάχιστες πληροφορίες για Δημοσίευση ποσοτική πραγματικού χρόνου PCR Πειράματα (MIQE) κατευθυντήριες γραμμές, που δημοσιεύτηκαν από Bustin

et al.

[22]. RFC mRNA ποσοτικοποιήθηκε με RT-qPCR στο όργανο Mx3005P ™ (Stratagene, USA). Οι μεταγραφές του β-ακτίνης προσδιορίστηκαν ποσοτικά ως ενδογενής έλεγχος RNA [7], [23] για την εξάλειψη των μεταβολών στην ποσότητα ή /και την ποιότητα του ολικού RNA προστέθηκαν σε κάθε μείγμα αντιδράσεως και κάθε δείγμα κανονικοποιήθηκε με βάση β-ακτίνης του περιεκτικότητα σε mRNA. Όλες οι ποσοτικοποιήσεις σε αυτή τη μελέτη παρουσιάζονται ως ο λόγος μεταξύ του γονιδίου-στόχου και β-ακτίνης. Οι αλληλουχίες εκκινητών, θερμοκρασία ανόπτησης και PCR προϊόντα μέγεθος για το γονίδιο στόχο RFC και του γονιδίου αναφοράς β-ακτίνης παρουσιάζονται στον Πίνακα 1. Η ιδιαιτερότητα κάθε ζεύγος εκκινητών επιβεβαιώθηκε με ανάλυση καμπύλης τήξης (Σχήμα S2), η οποία είχε σαν αποτέλεσμα μόνο προϊόν ειδικές τήξης θερμοκρασίες.

η

Κάθε ζεύγος εκκινητών αξιολογήθηκε για τη δευτεροβάθμια δομές και SNPs από το

in silico

εργαλείο αξιολόγησης στο RTPrimerDB (https://medgen.ugent.be/rtprimerdb). Εξαιρετικά καθαρισμένα χωρίς αλάτι αστάρι για RFC και β-ακτίνη (Πίνακας 1) παρήχθησαν εμπορικώς (Metabion GmbH, Γερμανία) και βελτιστοποιημένη σε ένα δύο σταδίων (συνδυασμένη θερμοκρασία αναδιάταξης /επέκτασης) πρωτόκολλο PCR. Ένα σύνολο δειγμάτων cDNA του καρκίνου της ουροδόχου κύστης 3 χρησιμοποιήθηκε για τη βελτιστοποίηση του προσδιορισμού και αξιολόγησης της αποτελεσματικότητας ενίσχυσης (Πίνακας 1) με χρήση «της πρότυπης καμπύλης» μέθοδο. Μία πρότυπη καμπύλη για κάθε γονίδιο στη συνέχεια δημιουργείται αυτόματα από το λογισμικό Mx3005P ™ όπου log η συγκέντρωση στόχος σχεδιάστηκε έναντι της τιμής που αντιστοιχεί κύκλου ποσοτικοποίησης (Cq) [22]. Προϋποθέσεις για όλες τις PCRs βελτιστοποιήθηκαν όσον αφορά την εμπρός και όπισθεν εκκινητές συγκεντρώσεις και διάφορες θερμοκρασίες ανόπτησης (55-66 ° C). Real-time PCR βασικού μείγματος από τα παρακάτω συστατικά της αντίδρασης ήταν έτοιμη να το έδειξε στο τέλος συγκέντρωση: 12.5 μl Ισχύς SYBR® Πράσινη PCR Master Mix (Applied Biosystems, UK), 0,2 μl εμπρός RFC αστάρι (100 ναυτικών μιλίων), 0,2 μl αντίστροφο εκκινητή RFC (100 ηΜ) και 11,1 μΙ ύδατος άνευ νουκλεάσης για το γονίδιο στόχο? και 12,5 μΙ Ισχύς SYBR® Πράσινη PCR Master Mix, 0.75 μΙ προς τα εμπρός εκκινητή β-ακτίνης (300 ηΜ), 0.75 μΐ αντίστροφο εκκινητή β-ακτίνης (300 ηΜ) και 10 μλ ύδατος άνευ νουκλεάσης για το γονίδιο αναφοράς. 24 μΙ του παρασκευασμένου βασικού μείγματος προστέθηκαν με πιπέτα ανά φρεάτιο σε πλάκα 96 φρεατίων. 1 μΙ προτύπου cDNA στη συνέχεια προστέθηκαν σε κάθε φρεάτιο αντίδρασης. Εφαρμογές των συνολικών εισροών cDNA διεξήχθησαν εις διπλούν. Η πλάκα 96 φρεατίων σφραγίστηκε με ένα PCR οπτικό συγκολλητική μεμβράνη (Eppendorf AG, Γερμανία). Η ακόλουθη βελτιστοποιημένο θερμικό προφίλ χρησιμοποιήθηκε: πρόγραμμα μετουσίωση (95 ° C για 10 λεπτά), το πρόγραμμα ενίσχυσης και ποσοτικοποίηση επαναλαμβάνεται 40 φορές (95 ° C για 15 s, 60 ° C για 1 λεπτό, με μία μόνο μέτρηση φθορισμού), που τήκεται καμπύλη προγράμματος (55-95 ° C με ρυθμό θέρμανσης 0,1 ° C ανά δευτερόλεπτο και συνεχή μέτρηση του φθορισμού). Τα δεδομένα φθορισμού συνελέγησαν και το mRNA ποσοτικοποιούνται με Mx3005P ™ έκδοση λογισμικού 4.1. τιμές CQ ήταν υπολογίζονται αυτόματα σύμφωνα με τη «μέθοδο προσαρμογής σημείο»? όπου Cq ορίζεται ως κλασματική αριθμός των κύκλων κατά την οποία η κινητική καμπύλη PCR φθάνει ένα όριο του φθορισμού προγράμματος καθορισμένων.

Ο φορές μεταβολή στην έκφραση του β-ακτίνης υπολογίστηκε σύμφωνα με τη μέθοδο του Schmittgen και Livak [24]. Όπως φαίνεται στον Πίνακα 2, η μεταβολή της έκφρασης β-ακτίνης ήταν ελάχιστη μεταξύ των ουροφόρων και μη ουροθηλιακό ομάδες.

Η

Στατιστική Ανάλυση

Τα δεδομένα ελέγχθηκαν για ομαλότητα χρησιμοποιώντας το Shapiro -Wilk τεστ κανονικότητας. Μη παραμετρικές δοκιμές αποφάσισε αναλόγως. Ρ-τιμές μικρότερες από 0.05 θεωρήθηκαν ότι είναι σημαντικές. Το Mann-Whitney U-test και δοκιμή Kruskal-Wallis χρησιμοποιήθηκαν για να συσχετίσει την έκφραση του RFC με το στάδιο του όγκου, τον βαθμό και τον τύπο. Το λογισμικό

Graph Pad Prism

(έκδοση 5) χρησιμοποιήθηκε για τη στατιστική ανάλυση.

Αποτελέσματα

έκφραση του mRNA του RFC

Η έκφραση του mRNA του φυλλικού οξέος μεταφορέας RFC ποσοτικοποιήθηκε σε δείγματα καρκίνου του 41 ουροδόχου κύστης, τρία δείγματα χωρίς ένδειξη κακοήθειας που λαμβάνεται από βλεννογόνο της κύστης που γειτνιάζουν με καρκινικό ιστό, και ένα εμπορικά διαθέσιμο RNA κύστη αναφοράς ομαδοποιήθηκαν από 26 άνδρες /γυναίκες Καυκάσιους? ηλικίας 22-70 (Clonetech, Germany). Η τελευταία θα πρέπει να αναφέρεται ως βαθμονομητή στα ακόλουθα τμήματα.

έκφραση mRNA RFC ανιχνεύθηκε σε όλα τα δείγματα της ουροδόχου κύστης που χρησιμοποιούνται σε αυτή τη μελέτη. Τα επίπεδα έκφρασης σε σταθερή κατάσταση RFC mRNA ήταν σημαντικά (

P

& lt? 0,0001) υψηλότερη στα δείγματα του καρκίνου της ουροδόχου κύστης από -9 φορές (8.661, εύρος 0,98 – 50, Ν = 39) σε σχέση με το βαθμονομητή .

Κλινική

vs.

hisotpathological παραμέτρους

Μια πολυπαραγοντική ανάλυση έγινε για να καθορίσει τους πιο σημαντικούς παράγοντες με τους οποίους συνδέθηκε η έκφραση RFC mRNA. Η συσχέτιση μεταξύ των επιπέδων mRNA και RFC δοκιμαζόμενων κλινικοπαθολογικών παραμέτρων του καρκίνου της ουροδόχου κύστης συνοψίζονται στον Πίνακα 3. RFC σχετικό επίπεδο έκφρασης ήταν σημαντικά (

P

& lt? 0,05). Υψηλότερη σε ουροθηλιακά

vs

μη -urothelial καρκινώματα της ουροδόχου κύστης, όπου RFC mRNA αυξήθηκε κατά ~ 14-φορές (13,27? n = 27) σε urothelial όγκους σε σύγκριση με 4 φορές (4.083? n = 10) μόνο αύξηση στα μη urothelial παραλλαγές (Σχήμα 1Α). Το μεσαίο επίπεδο έκφρασης του RFC στην δείγματα TCC ήταν 17,48? n = 23, σε σύγκριση με 5.538? n = 6 σε δείγματα που ταξινομούνται ως TCC με πλακώδη μεταπλασία ή μικτή μεταβατική και ακανθοκυτταρικό καρκίνωμα. Ωστόσο, δεν παρατηρήθηκε στατιστικά σημαντική διαφορά βρέθηκε μεταξύ της έκφρασης του mRNA RFC σε δείγματα καρκίνου της ουροδόχου κύστης που ταξινομούνται ως καθαρή TCC

vs.

Εκείνους που έχουν TCC με πλακώδη μεταπλασία (Σχήμα 1D). Αυτό δείχνει ότι η έκφραση του mRNA RFC σε μη urothelial όγκοι είναι πολύ χαμηλότερη από ό, τι σε ουροθηλιακά ομολόγους τους και το πλακώδες συστατικό κυρίως σχετίζεται με την έκφραση του mRNA μειωμένη RFC. Το επίπεδο έκφρασης των RFC σε δείγματα καρκίνου της ουροδόχου κύστης που περιέχει bilharzial ωάρια ήταν σε σύγκριση με εκείνους χωρίς ενδείξεις bilharzial λοίμωξης, όπου RFC mRNA ήταν σημαντικά (

P

& lt? 0,05) μειώθηκε σε bilharzial που σχετίζεται (BA) δείγματα καρκίνου της ουροδόχου κύστης (3,13? η = 7) σε σύγκριση με το μη-bilharzial σχετιζόμενη ομάδα (9.76? n = 32). (Σχήμα 1 Ε)

Στερεά οριζόντιες γραμμές καταδεικνύουν την διάμεσο του κάθε ομάδα. Όλα τα δεδομένα παρουσιάζονται ως η αναλογία μεταξύ του γονιδίου στόχου και βήτα-ακτίνης. *

P

-τιμή, μη-παραμετρικές, Mann-Whitney ή Kruskal-Wallis τεστ. BA, Bilharizal που σχετίζονται με

Η

Εξετάσαμε τη συσχέτιση μεταξύ των επιπέδων έκφρασης του mRNA RFC και των δεικτών επιθετικότητα του όγκου. (Δηλαδή? Βαθμό και το στάδιο). Η έκφραση του RFC mRNA δεν συσχετίζονται με το βαθμό του όγκου (Εικόνα 1Β), όπου δεν υπήρχε στατιστικά σημαντική διαφορά (

P

= 0,3008) ανιχνεύθηκε μεταξύ των βαθμών Ι, ΙΙ, ή ΙΙΙ. Περαιτέρω, η έκφραση RFC δεν ήταν στατιστικά μεταβληθεί (

P

= 0,2666) μεταξύ των μυών-επεμβατική και μη επεμβατική μυών δείγματα (Σχήμα 1C). Αξίζει να σημειωθεί ότι όλοι οι SCC δείγματα (n = 8) ταξινομήθηκαν ως διηθητικό όγκων, η οποία επισημαίνει την πιο επιθετική φύση του SCC και μη ουροθηλιακό καρκίνωμα. Επιπλέον, δεν υπάρχει στατιστικά σημαντική διαφορά (

P

= 0.2162) βρέθηκε μεταξύ των ηλικιών των ασθενών με ουροθηλιακά καρκινώματα (μέση τιμή = 60.42)

vs.

Εκείνες της μη-ουροφόρων ομάδα (μέση = 52.88).

Συζήτηση

Δεδομένου ότι τα κύτταρα των θηλαστικών δεν μπορούν να συνθέσουν φολικά

de novo

, καλά οργανωμένη διαδικασίες κυτταρικής πρόσληψης έχουν εξελιχθεί για να διατηρήσουν επαρκή επίπεδα ενδοκυτταρικής φολικών [25], [26]. Στο πλαίσιο της κακοήθειας, η κύρια σύστημα φολικού μεταφορέα, RFC, αυξημένη έκφραση είναι συνεπές με την ανάγκη να αυξηθεί κυτταρικό κατακράτηση φολικών να υποστηρίξει τις απαιτήσεις των ταχέως διαιρούμενων καρκινικών κυττάρων για τη σύνθεση του DNA και την αντιγραφή. Στην παρούσα μελέτη, τα ευρήματά μας σε ανθρώπινο κύστη βιοψίες καρκίνου ήταν σύμφωνα με αυτή την έννοια, όπου η έκφραση RFC mRNA αυξήθηκε σημαντικά από ~ 14 φορές σε ουροθηλιακά καρκινώματα της ουροδόχου κύστης (TCC και TCC με πλακώδη μεταπλασία) και από ~ 4 φορές στην μη ουροφόρων παραλλαγές (SCC & amp? αδενοκαρκίνωμα). Η αλλαγμένη έκφραση του RFC έχει επίσης αναφερθεί σε λευχαιμίες, ιδιαίτερα Β-πρόδρομος ALL [11], [26], [27], οστεοσάρκωμα [17], καρκίνο του παχέος εντέρου και του πρωτογενούς λεμφώματος του κεντρικού νευρικού συστήματος [1], τόσο της μεταγραφής και πρωτεΐνες επίπεδα.

η διαφορά στην έκφραση του mRNA RFC μεταξύ ουροθηλιακά και μη ουροθηλιακών όγκους της ουροδόχου κύστης, αναφερόμενη στην παρούσα μελέτη, θα μπορούσε να αποδοθεί σε ανάντη γενετική γεγονότα που λαμβάνουν χώρα σε κάθε είδος, το οποίο μπορεί να επηρεάσει μεταγραφική ρύθμιση της μεταφορέας. Τόσο πανταχού παρούσα και ιστο-ειδικό ΤΡ που μετενεργοποιούν ή καταστέλλουν τη μεταγραφή σε απόκριση προς τις απαιτήσεις για φολικό συμπαράγοντες ελέγχουν τις καθαρές επίπεδα μεταγραφών RFC σε ιστούς [1], [18]. Λογοτεχνία και εξόρυξη οδού χρησιμοποιώντας το

LitInspector

λογισμικού [28] έδειξε ότι RFC (SLC19A1) έχει πιθανές αλληλεπιδράσεις με CREB1 (δεσμευτική CAMP στοιχείο απόκρισης της πρωτεΐνης-1). CRE /ΑΡ-1 που μοιάζει με συναινετική αλληλουχία είναι μία από τις δύο κύριες θέσεις της ρύθμισης των RFC βασικής υποκινητές [18]. CREB, που δεσμεύεται με το CRE /ΑΡ-1, είναι μεταξύ των TFs ενεργοποιείται από το ΕΚΚ (ΜΑΡΚ), τα οποία είναι συστατικά της οδού σηματοδότησης RTK-RAS. Προκύπτει στοιχεία δείχνουν ότι βασικά συστατικά αυτού του μονοπατιού σηματοδότησης συχνά ενεργοποιούνται σε ανθρώπινα καρκινώματα ουροφόρων [29], αλλά όχι στα μη urothelial τύπων [30], [31]. Σε ανθρώπινα κύτταρα ινοσαρκώματος, CREB-1 και c-Jun ήταν οι κυτταρο-ειδικούς παράγοντες μεταγραφής που εμπλέκονται στην πρόσδεση CRE στον υποκινητή RFC. Παρόμοια ευρήματα έχουν αναφερθεί για CREB-1 και ATF-1 σε κύτταρα ανθρώπινου ηπατοκυτταρικού καρκινώματος και ανθρώπινα κύτταρα λευχαιμίας [18], [32]. Επιπλέον, τα δύο τρίτα των αντιφολικού-ανθεκτικές κυτταρικές γραμμές παρουσίασαν σημαντική μείωση της δέσμευσης παράγοντα μεταγραφής σε ένα μόνο χώρο CRE παρούσα στο ελάχιστο προαγωγέα Α του γονιδίου RFC [33]. Ως εκ τούτου, υπάρχουν αυξανόμενες ενδείξεις που να υποδηλώνουν ότι η πρόσδεση του CREB-1 προς CRE στον υποκινητή RFC είναι ένας σημαντικός συντελεστής στην επαγωγή της έκφρασης του γονιδίου RFC σε καρκινικές κυτταρικές σειρές και κακοήθεις όγκους [18], [32], [33]. Ως εκ τούτου, υποθέτουμε ότι η συστατική ενεργοποίηση του μονοπατιού RTK-RAS είναι πιθανώς ένας παράγοντας που ευθύνεται για την αυξημένη έκφραση mRNA σε RFC ουροθηλιακό καρκίνωμα. Σε μη-ουροθηλιακά καρκινώματα, όμως, RAS μεταλλάξεις είναι σπάνιες και άλλες μεταλλάξεις μπαίνουν στο παιχνίδι (p16 & amp? Διαγραφή p15 [31], [32], Bax, Bak & amp? EGFR υπερέκφραση και αδρανοποίηση p53 [32]). Ως εκ τούτου, αναμένουμε διαφορετικά γενετικά γεγονότα να έχουν οδηγήσει στην μέτρια αύξηση των επιπέδων του mRNA RFC σε μη ουροθηλιακά καρκινώματα, και, ενδεχομένως, διαφορετικές TFs εμπλέκονται στην ενεργοποίηση της μεταγραφής RFC. Αυτό υποστηρίζεται περαιτέρω από το γεγονός ότι η αυξημένη έκφραση RFC είναι πολύ πιθανό να συνδέεται με απενεργοποίηση των ογκοκατασταλτικών γονιδίων, όπου το 5-μεθυλο τετραϋδροφολικό (5-CH3-ΤΗΡ) είναι ένας συμπαράγοντας στην de novo σύνθεση των S-αδενοσυλμεθειονίνης, που συμμετέχει σε μεθυλίωση των CpG νησίδων. RFC είναι η κύρια πύλη εισόδου για ΤΗΡ και αυξημένη έκφραση RFC θα οδηγήσει κατά συνέπεια σε συσσώρευση των μεθυλεστέρων μειωμένο φολικό οξύ [11], [15], η οποία μπορεί τελικά να οδηγήσει σε αδρανοποίηση των διαφόρων ογκοκατασταλτικών γονιδίων αρέσει? p16, p15 ή /και p53 [34], [35].

Επιπλέον, με βάση τα ευρήματα της μελέτης μας, RFC υπερέκφραση σημαίνει ότι ουροφόρων καρκινώματα της ουροδόχου κύστης θα είναι εγγενώς πιο ευαίσθητα στην αντιφολικών ενώ οι μη-ουροφόρων καρκινώματα θα δείξει μια λιγότερο ευνοϊκή απάντηση στην αντιφολικός χημειοθεραπεία. Αυτή η κερδοσκοπία μπορεί να εξηγήσει γιατί η MVAC σχήμα παρουσιάζει μόνο περιορισμένη αντικαρκινική δράση κατά των μη-μεταβατική καρκινικών κυττάρων ενώ τα ποσοστά ανταπόκρισης έως και -70% αναφέρθηκαν στο TCC στην ίδια μελέτη [9].

Τα ευρήματά μας δείχνουν ότι η RFC mRNA αυξημένη έκφραση δεν σχετίζεται με το βαθμό του όγκου ή στάδιο εμπλέκουν ότι η αυξημένη έκφραση του mRNA RFC φαίνεται να συμβαίνει νωρίς στη διαδικασία της εξέλιξης του όγκου πολλών σταδίων. Αυτή η υπόθεση υποστηρίζεται περαιτέρω από σταθερή αύξηση της έκφρασης του mRNA RFC μεταξύ των διαφορετικών ηλικιακών ομάδων στη μελέτη μας. Ωστόσο, έχει αναφερθεί ότι μόνο -15% των επιφανειακών όγκων χαμηλής ποιότητας θα προχωρήσει για να διεισδύσει το μυϊκό σύστημα και ότι η υψηλής ποιότητας διηθητικό όγκων, είτε προέρχονται από επίπεδες καρκίνωμα in situ (CIS) /σοβαρή δυσπλασία ή προκύψουν

de novo

[29]. Κατά συνέπεια, μία εναλλακτική υπόθεση μπορεί να είναι ότι η αυξημένη έκφραση του mRNA RFC εμφανίζεται ως συνέπεια της ανεξάρτητα γεγονότα μεταξύ των διαφόρων τύπων των καρκινωμάτων της ουροδόχου κύστης. Είναι ενδιαφέρον, όλα τα μη-ουροφόρων βιοψίες των όγκων που χρησιμοποιούνται σε αυτή τη μελέτη ήταν διηθητικό δείχνει προς τα δυσμενή διαγνωστικά χαρακτηριστικά των μη urothelial όγκους όπως είχε ήδη προταθεί από Ερντεμίρ

et al.

[19]. Η κλινική σημασία της πλακώδους διαφοροποίησης φαίνεται να αποτελεί δυσμενή προγνωστικό στοιχείο που οφείλεται στην σχέση της με υψηλής ποιότητας επεμβατικές όγκους.

Παρά το γεγονός ότι μια σημαντική διαφορά ανιχνεύθηκε μεταξύ των επιπέδων έκφρασης RFC σε bilharzial- και μη bilharzial που σχετίζονται με καρκίνους της ουροδόχου κύστης , η διαπίστωση αυτή δεν μπορεί να είναι καθοριστική, δεδομένου ότι μόνο 7 περιπτώσεις (18% του συνόλου) των bilharzial που σχετίζεται με τον καρκίνο της ουροδόχου κύστης συμπεριλήφθηκαν στη μελέτη αυτή (πρβλ 32 μη-bilharzial που σχετίζονται με την περίπτωση). Περαιτέρω, το υψηλότερο επίπεδο της έκφρασης mRNA RFC στην BA-TCC (2 δείγματα)

έναντι

η SCC ή μικτές (5 δείγματα) μπορεί επίσης να σημαίνει ότι RFC αυξημένη έκφραση του mRNA είναι στην πραγματικότητα ανεξάρτητη από bilharzial μόλυνση.

Αξίζει να σημειωθεί (δεδομένου ότι αυτό υποστηρίζει την καταλληλότητα) είναι ότι τα χαρακτηριστικά των δειγμάτων καρκίνου της ουροδόχου κύστης που χρησιμοποιούνται σε αυτή τη μελέτη ήταν αντιπροσωπευτικό του πληθυσμού ασθενών με καρκίνο της ουροδόχου κύστης »σε σχέση με το φύλο, την ηλικία και ιστολογικών τύπων. Η αναλογία των female:male ασθενών ήταν ~1:3. Η μέση ηλικία των ασθενών καρκίνου της ουροδόχου κύστης που περιλαμβάνονται στη μελέτη ήταν 60, όπου η μέση ηλικία των μη urothelial ομάδες ήταν χαμηλότερη από αυτή των ασθενών ουροφόρων καρκίνωμα ουροδόχου κύστης (53

vs.

60) που υποδεικνύει την επιθετική φύση των μη urothelial παραλλαγές του καρκίνου της ουροδόχου κύστης. Επιπλέον, 64% των ασθενών είχαν ουροθηλιακά καρκινώματα, ενώ μόνο το 24% παρουσιάζονται με μη-ουροφόρων παραλλαγές. Αυτά τα δημογραφικά στοιχεία ήταν σύμφωνα με το μεταβαλλόμενο πρότυπο του καρκίνου της ουροδόχου κύστης στην Αίγυπτο έχουν αναφερθεί στο παρελθόν από τον Felix

et al.

Το 2008 [5], έτσι, αναδεικνύοντας την εμφάνιση και επικράτηση της μεταβατικής τύπο κυττάρου και η αναδίπλωση του μη ουροφόρων τύπους.

Τελικά, η έκφραση RFC μπορεί να θεωρηθεί ως ένα δίκοπο όπλο (Σχήμα 2). Αυξημένη έκφραση RFC θα προωθήσει χημειοευαισθησία να αντιφολικών ενώ, επεκτείνοντας ενδοκυτταρική μεγέθους πισίνα φυλλικό οξύ? η οποία μπορεί να οδηγήσει σε επίκτητη αντοχή. Αυτή η έννοια υποστηρίζεται περαιτέρω από το εύρημα ότι η απώλεια του φολικού οξέος εξαγωγείς οδήγησε στην αντίσταση στην αντιφολικών μέσω επέκτασης του μεγέθους πισίνα φυλλικό οξύ [21]. Ιδιαίτερα, σε καρκινώματα της ουροδόχου κύστης, Rady

et al.

, (Αδημοσίευτα αποτελέσματα) ανέφεραν ότι BCRP (εξαγωγές μονο-, δι-, και triglutamates φολικών) έκφραση μειώθηκε, ενώ MRP3, τα οποία έχουν περιορισμένη ικανότητα να εξάγουν μόνο μονογλουταμική φολικά, βρέθηκε να υπερεκφράζεται [Ανέκδοτα έργα από Rady et al. 2009]. Επιπλέον, MRP3 ήταν σημαντικά υψηλότερη στην ουροφόρων σε σχέση με την παραλλαγή καρκινώματος κύστης μη urothelial [Ανέκδοτες εργασία με Rady et al. 2009]. Αυτές οι μεταβολές στα επίπεδα έκφρασης των αντιφολικών εκροής και εισροής αντλιών σημαίνει ότι η χρησιμοποίηση ενός πάνελ της γενετικής βιοδεικτών για κάθε τύπο του όγκου μπορεί να είναι πιο κατάλληλη για τον καθορισμό ανταπόκριση στη χημειοθεραπεία παρά ένα και μόνο ανεξάρτητο γενετικό δείκτη.

διάγραμμα που απεικονίζει την προτεινόμενη δίκοπο ρόλο του RFC στη χημειοθεραπεία του καρκίνου. Αυξημένη έκφραση είναι προγνωστική της αντιφολικών (ΜΤΧ) μεταφορών. Ταυτόχρονα, η αυξημένη έκφραση του RFC θα οδηγήσει σε φυλλικό οξύ πισίνα επέκταση του μεγέθους αναγκάζοντας μια αναστολής της αρνητικής ανάδρασης σχετικά με την πρόσληψη των αντιφολικών.

Η

Συμπεράσματα και Μελλοντικές Κατευθύνσεις

Η παρούσα μελέτη ήταν ανέλαβε να διερευνήσει μεταβολές στην έκφραση RFC μεταξύ των διαφόρων παραλλαγών του καρκινώματα της ουροδόχου κύστης. mRNA έκφραση RFC δείχθηκε να είναι τύπου-εξαρτώμενη αλλά stage- και βαθμό ανεξάρτητη. Παρά το γεγονός ότι η διαφοροποίηση μεταξύ των ουροφόρων και μη ουροφόρων καρκινώματα της ουροδόχου κύστης μπορεί να γίνει με μικροσκοπική εξέταση, απώτερος στόχος μας θα είναι να ενσωματώσει μοριακή διαγνωστική στην κλινική πρακτική. Υποψήφιοι αξιολόγηση ενός πάνελ φολικού μεταφορέων (όπως? RFC, BCRP, και MRP3), μπορεί να προβλέψει απόκριση σε αντιφολικού θεραπεία, προτείνει νέες θεραπευτικές στρατηγικές και, ως εκ τούτου, να βελτιώσουν την έκβαση της θεραπείας για τους μεμονωμένους ασθενείς με καρκίνο της ουροδόχου κύστης. Οι διαφορές που περιγράφονται μεταξύ ουροθηλιακά και μη ουροφόρων καρκινώματα της ουροδόχου κύστης μπορεί να αντανακλά διαφορετικές αιτιολογίες ή /και τους παράγοντες κινδύνου. Μια μεγαλύτερη μελέτη που σχεδιάστηκε για να παρέχει συσχετίσεις της έκτασης της RFC μεθυλίωσης με κλινικοπαθολογικά χαρακτηριστικά όπως η ηλικία, το φύλο, η ιστολογική βαθμολογία, το στάδιο, και την εξέλιξη θα μπορούσε να παρέχει επιπλέον χρήσιμες πληροφορίες σχετικά με την αιτιολογία του RFC αλλαγμένα επίπεδα της έκφρασης μεταξύ των διαφόρων τύπων καρκίνου της ουροδόχου κύστης. Άλλοι γνωστοί οι στόχοι της μεθυλίωσης του DNA στην κύστη μπορεί επίσης να συμπεριληφθεί για να δείτε το αποτέλεσμα της υψηλότερης έκφρασης των RFC και τα υψηλότερα μεταφορά του φολικού οξέος σε μεθυλίωσης του DNA.

Υποστήριξη Πληροφορίες

Εικόνα S1.

RNA Αξιολόγησης της Ποιότητας. Ηλεκτροφόρηση πηκτής αγαρόζης ολικού RNA minipreps. Οι λωρίδες δείγματα »επισημαίνονται σύμφωνα με τον κωδικό αριθμό τους που τους έχουν ανατεθεί μετά τη συλλογή. Παρατηρώντας απότομη ζώνες των rRNA 28S (4.8 kb) και 18S rRNA (1,8 kb) ήταν η ένδειξη για ανέπαφο RNA (T82, T65, S22 και T38). S22 και S38 περιέχει ίχνη γενωμικού DNA, ωστόσο τα RFC και β-ακτίνης εναρκτήρες σχεδιάστηκαν ώστε να καλύπτουν διασταύρωση /ιντρονίου εξόνης να ελαχιστοποιηθεί γονιδιωματικό ενίσχυση του DNA. T118 έδειξε μερική αποδόμηση αλλά οι μπάντες 28S και 18S ήταν πολύ αχνό? η συνολική απόδοση του RNA του T118 ήταν μόνο 2 μg. T107 έδειξε υποβαθμισμένη RNA και αποκλείστηκε από την περαιτέρω ανάλυση. RNA (βέλη) και το DNA δείκτες μεγέθους (1031-1080 bp) συμπεριλήφθηκαν για σύγκριση. Αυτή η εικόνα φωτογραφήθηκε με τη χρήση του συστήματος λήψης εικόνας UVIsoft (Τόκιο, Ιαπωνία)

doi:. 10.1371 /journal.pone.0021820.s001

(ΔΕΘ)

Εικόνα S2.

τήξεως Αναλύσεις Curve. Ανάλυση καμπύλης τήξης για την επίδειξη ειδικότητα οι εκκινητές ». Πίνακας Α: Dye φθορισμός πέφτει γρήγορα όταν λιώσει το DNA. Το σημείο τήξεως ορίζεται ως το σημείο καμπής της καμπύλης τήξης, το οποίο είναι πιο εύκολο προσδιορίζεται ως το μέγιστο αρνητική 1ο παράγωγο της καμπύλης τήξης. Οι καμπύλες διαστάσεως τόσο για το στόχο (RFC) και αναφορά τα γονίδια (ACTB) απεικονίζεται. Κάθε προϊόν εμφανίζει μια μονή οξεία κορυφή δείχνει την ειδικότητα των ζευγών εκκινητών και απουσία εκκινητή-διμερή ή μη ειδικών προϊόντων ενίσχυσης. NTC είτε δεν καταγράφει μια τιμή Ct ή καταγραφεί τιμές Ct στην περιοχή μεταξύ (35-38), η οποία διαφέρει κατά περισσότερο από 5cycles από την υψηλότερη τιμή Ct που καταγράφονται από τα δείγματα (δεν φαίνεται). Οι επίπεδες καμπύλες της παθητικής βαφής ROX δεν δείχνουν εμβολιασμού (δεν φαίνεται). Πίνακας Β: Ηλεκτροφόρηση πηκτής αγαρόζης του συμβατικού προϊόντος PCR χρησιμοποιώντας αντίστροφη μεταγραφεί cDNA ενός δείγματος όγκου (Τ42) και αντίστροφη μεταγραφή του cDNA του βαθμονομητή (εμπορικά διαθέσιμο, η κανονική RNA ουροδόχου κύστης, Clonetech). Ενιαία ζώνες των σωστών μεγεθών για RFC και το γονίδιο αναφοράς δείχνουν την ιδιαιτερότητα των προϊόντων

doi:. 10.1371 /journal.pone.0021820.s002

(ΔΕΘ)

Πίνακα S1.

Κλινικά χαρακτηριστικά των ασθενών με καρκίνο της ουροδόχου κύστης.

doi: 10.1371 /journal.pone.0021820.s003

(XLS)

Ευχαριστίες

Εκτιμούμε ιδιαίτερα την υποστήριξη του καθηγητή Ashraf Zaghloul και ο Δρ Ahmed Moustafa του National Cancer Institute, κατά την παροχή των δειγμάτων ασθενούς με καρκίνο της ουροδόχου κύστης. Σας ευχαριστούμε καθηγητής Raid Amin, διευθυντής του UWF Στατιστικής Συμβουλευτικές Υπηρεσίες, για τη βοήθειά του με τη στατιστική ανάλυση των αποτελεσμάτων. Καθ Stephen Bustin και καθ Sanaa Eissa συμβάλει μέσα από πολλές γόνιμες συζητήσεις, και επεξεργάστηκε σε πολλές πτυχές της RT-qPCR. Είμαστε επίσης ευγνώμονες για Shady Saad και Deena Αμρ για τη βοήθειά τους με τον καθορισμό των μεθοδολογιών και πειραματικό σχεδιασμό της μελέτης.