Αφηρημένο

έχουν Διακριτικός γονοτυπική και φαινοτυπική χαρακτηριστικά του καρκίνου των ωοθηκών μέσω επιθηλιακά-μεσεγχυματικά μετάβασης (EMT) έχουν συσχετιστεί με αντίσταση στα φάρμακα και την υποτροπή της νόσου. Ερευνήσαμε αν η θεραπευτική αντιστροφή της EMT θα μπορούσε εκ νέου να ευαισθητοποιήσουν καρκινικά κύτταρα των ωοθηκών (συμπλέγματα OCC) στην υπάρχουσα χημειοθεραπεία. Αναφέρουμε ότι epimorphin, μια μορφογενετική πρωτεΐνη, έχει κεντρικό έλεγχο των μεσεγχυματικών έναντι των επιθηλιακών κυττάρων απόφαση καταγωγή των υποθετικών συμπλέγματα OCC. Η έκθεση σε epimorphin επάγεται μορφολογικές αλλαγές που θυμίζει μεσεγχυματικών-to-επιθηλιακά μετάβαση (ΚΟΑ), αλλά με έναν τρόπο που εξαρτάται από τη δόση, δηλαδή, στα 10 μg /mL του epimorphin κυττάρων ληφθεί ένα περισσότερο μεσεγχυματικά-όπως μορφολογία ενώ στα 20 μg /κ.εκ epimorphin κύτταρα εμφανίζουν ένα επιθηλιακά μορφολογία. Οι τελευταίες αλλαγές συνοδεύτηκαν από την καταστολή των δεικτών μεσεγχυματικών, όπως vimentin (↓ περίπου 8 φορές,

σ

& lt? 0.02), ↓ Twist1 (~ 7 φορές,

σ

& lt? 0.03), dystroglycan (↓ ~ 4 φορές,

σ

& lt? 0,01) και Palladin (~ 3 φορές ↓,

σ

& lt? 0,01). Αντίθετα, σημαντικές αυξήσεις των KLF4 (↑ ~ 28-φορές,

σ

& lt? 0.002), β-κατενίνης (~ 6-φορές ↑,

σ

& lt? 0.004), EpCAM (~ ↑ 6-φορές,

σ

& lt? 0.0002) και occludin (↑ -15 φορές,

σ

& lt? 0.004) mRNAs, ως μέρος της δέσμευσης για την επιθηλιακών κυττάρων γενεαλογία ανιχνεύθηκαν σε απόκριση σε 20 μg /mL εξωγενούς epimorphin. Αλλαγές στο occludin επίπεδα mRNA συνοδεύτηκαν από μια παράλληλη, αν και ασθενέστερη έκφραση στο επίπεδο της πρωτεΐνης (~ 5 φορές ↑,

σ

& lt? 0.001). Ομοίως, η απόκτηση του επιθηλιακού-όπως ιδιότητες, συμπεριλαμβανομένης mucin1, CK19, και έκφραση γονιδίου β-κατενίνης, λήφθηκε επίσης παρακάτω epimorphin θεραπεία. Περαιτέρω, η παραγωγή ΜΜΡ3 βρέθηκε να μειωθεί, ενώ η λαμινίνη έκκριση έντονα ενισχύθηκε κατά epimorphin που προκαλείται ΚΟΑ. Αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι υπάρχει ένα παράθυρο δοσολογία για τις δράσεις του epimorphin επί κυτταρικής διαφοροποίησης, όπου μπορεί είτε να καταστείλει ή να ενισχύσουν επιθηλιακή διαφοροποίηση των συμπλέγματα OCC. Σημαντικά, επαγωγή φαινοτύπων επιθηλιακών που μοιάζει με epimorphin οδήγησε σε αυξημένη ευαισθησία στην καρβοπλατίνη. Συνολικά, έχουμε αποδείξει ότι epimorphin μπορεί να επανέλθει συμπλέγματα OCC μακριά από μεσεγχυματικά φαινότυπο τους και προς ένα επιθηλιακό φαινότυπο, ενισχύοντας έτσι την ευαισθησία τους σε ένα πρώτης γραμμής χημειοθεραπευτικό παράγοντα

Παράθεση:. Yew KH, Crow J, Hirst J, Pressetto Ζ, Godwin AK (2013) Epimorphin-Induced ΚΟΑ ευαισθητοποιεί ωοθηκών καρκινικά κύτταρα σε Platinum. PLoS ONE 8 (9): e72637. doi: 10.1371 /journal.pone.0072637

Επιμέλεια: Chunming Liu, το Πανεπιστήμιο του Κεντάκι, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 10 Απριλίου 2013? Αποδεκτές: 11 Ιουλ του 2013? Δημοσιεύθηκε: 9 Σεπτεμβρίου 2013

Copyright: © 2013 Yew et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Η μελέτη υποστηρίχθηκε εν μέρει από μια επιχορήγηση του σχεδίου προγράμματος από καρκίνο των ωοθηκών Ταμείου Έρευνας (https://www.ocrf.org), επιχορήγηση από το Μελετητή πρόγραμμα Κάνσας Bioscience Αρχή Επιφανών και επιχορήγηση από το NCI (R01CA140323) να AKG Οι συγγραφείς θα ήθελαν επίσης να αναγνωρίσουμε την υποστήριξη από το Πανεπιστήμιο του Κάνσας Καρκίνος Κέντρα (KUCC) (P30 CA168524) κοινών πόρων και του Πανεπιστημίου του Κάνσας Endowment σύνδεσης. A.K.G είναι η Chancellors Διακεκριμένη Έδρα Βιοϊατρικών Επιστημών στο KUCC. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

επιθηλιακό καρκίνο των ωοθηκών (EOC) είναι η κύρια αιτία θανάτου στις γυναίκες, συχνά λόγω αναγνώριση προχωρημένου σταδίου και επιθετική υποτροπή του όγκου. Υψηλή νοσηρότητα του ασθενούς οφείλεται εν μέρει σε επαναλαμβανόμενες αύξηση της υπολειμματικής καρκινικών κυττάρων των ωοθηκών που γίνονται ανθεκτικά σε πρότυπο χημειοθεραπευτικών θεραπειών, και στη συνέχεια επιθετικά πολλαπλασιάζονται και να εξαπλωθεί ή μεταστάσεις σε πολλαπλές τοποθεσίες. Πρόσφατες μελέτες έχουν αποκαλύψει ότι οι ωοθηκών καρκινικά κύτταρα με επιθηλιακά χαρακτηριστικά είναι στην πραγματικότητα πιο ευαίσθητα σε χημειοθεραπευτικά σχήματα σε σύγκριση με καρκινικά κύτταρα με μεσεγχυματικά χαρακτηριστικά [1], [2], [36]. Ωστόσο, όταν τα κύτταρα αυτά υφίστανται επιθηλιακών-to-μεσεγχυματικά μετάβαση (ΕΜΤ), γίνονται λιγότερο δεκτικές σε συμβατικές θεραπευτικές αγωγές [1] – [3], [36]. EMT, που προκαλείται από μια μεγάλη ποικιλία ερεθισμάτων και κυτοκινών, έχει γίνει εμφανές σημείο εμπλακεί ως μέσο με το οποίο διαφοροποιούνται EOCs υφίστανται μια φαινοτυπική μετατροπή που σχετίζεται με την απώλεια των επιθηλιακών χαρακτηριστικών (π.χ., occludin) και η απόκτηση των δεικτών μεσεγχυματικών (π.χ. vimentin). Ως εκ τούτου, αναστροφή της ΕΜΤ (δηλαδή, ΜΕΤ) μπορεί να καταστήσει τα καρκινικά κύτταρα πιο ευάλωτα σε πρώτης γραμμής αντικαρκινικά φάρμακα και να ενισχύσει τις αποπτωτικά αποτελέσματα ορισμένων χημειοθεραπευτικών παραγόντων.

Epimorphin, επίσης γνωστή ως συνταξίνη-2, είναι ένας σημαντικός μεσολαβητής πολλών θεμελιωδών διεργασιών στην εμβρυϊκή ανάπτυξη, και συχνά παίζουν κρίσιμο ρόλο στην περιοχή του μεσέγχυμα-επιθήλιο αλληλεπιδράσεις [4] – [8]. Μεταγενέστερες μελέτες έχουν επίσης δείξει ότι epimorphin μεσολαβεί επιθηλιακά σχηματοποίησης και μορφογένεση σε πολλούς ιστούς, όπως του παγκρέατος αγωγοί [5], μαστικό αδένα [6], του πνεύμονα [7], και μικρές εντερικό επιθήλιο [8]. Ενώ epimorphin φαίνεται να εκφράζεται στην ωοθήκη θηλαστικών και όρχεις [9], ο ακριβής μηχανισμός με τον οποίο αυτή η μεσεγχυματικά μορφογόνου ασκεί ρυθμιστική δράση της επί των ανθρωπίνων γονάδες παραμένει σε μεγάλο βαθμό άγνωστος.

Αν και η συγγενή υποδοχέα epimorphin και κατάντη σηματοδότησης του μηχανισμός δεν έχουν ακόμη ταυτοποιηθεί, epimorphin έχει βρεθεί να συνδέεται με ιντεγκρίνη υποδοχείς σε μαστικά επιθηλιακά κύτταρα [10] και των υποδοχέων EGF επί εντερικών επιθηλιακών κυττάρων [11] οι οποίοι ενεργοποιούν παράγοντες μεταγραφής πρωτεΐνη δέσμευσης CCAAT /ενισχυτή (C /EBPα και β) [12], [15] και NF-κΒ [13]. Είναι ενδιαφέρον, krueppel-σαν παράγοντας 4 (KLF4), ένας παράγοντας μεταγραφής ψευδαργύρου-δακτύλου που εκφράζεται σε επιθηλιακά κύτταρα πολλών οργάνων [16], έχει αποδειχθεί ότι δεσμεύονται άμεσα με την C /ΕΒΡβ υποκινητή [17] και να αλληλεπιδρούν με ΝΡ-κΒ υπομονάδα p65 [18], τα οποία ρυθμίζουν τη διαφοροποίηση των πνευμόνων κατά την οργανογένεση επιθηλιακών [19] και μαστικά επιθηλιακά διακλάδωσης [20], αντίστοιχα. Περαιτέρω έρευνες έχουν δείξει ότι epimorphin μπορεί να προκαλέσει επιθηλιακά μορφογένεση με τον ενεργοποιητή ουροκινάσης πλασμινογόνου τύπου (υΡΑ) [13], [14], καθώς και ινβολουκρίνη και κυτοκερατίνη [15].

Με δεδομένο το προτεινόμενο ρόλο της epimorphin ως προ-επιθηλιακών παράγοντας σε διάφορους ιστούς [5] – [8], αξιολογήσαμε εάν epimorphin σηματοδότηση μπορεί να είναι σε θέση να διεγείρουν τα ωοθηκών καρκινικά κύτταρα με μεσεγχυματικά χαρακτηριστικά προς το επιθηλιακό κύτταρο γενεαλογίας και αν αυτή η μετατροπή θα μπορούσε να οδηγήσει σε αυξημένη ευαισθησία σε πρότυπο παράγοντες χημειοθεραπείας .

Υλικά και Μέθοδοι

Αντιδραστήρια

Εμβρυϊκό Βόειο ορό, SYBR Green, Dye Αίτηση για ποσοτική PCR, και κοκτέιλ αναστολέα πρωτεάσης ελήφθησαν από την Sigma-Aldrich (St. Louis , ΜΟ). RPMI Medium 1640 ελήφθη από τη Gibco /Invitrogen. RNeasy Mini Kit, Sensiscript® ανάστροφης μεταγραφάσης Kit, QIAamp DNA Micro Kit, και QIAquick Gel Extraction Kit ήταν όλοι αγοράζονται από την Qiagen (Valencia, CA). AmpliTaq Gold με GeneAmp 10Χ PCR Ρυθμιστικού και MgCl

2 διάλυμα ελήφθησαν από την Applied Biosystems (Foster City, CA).

Κυτταροκαλλιέργεια και Θεραπεία

Τα ανθρώπινα καρκινικά κύτταρα των ωοθηκών (συμπλέγματα OCC) , A1847, Α2780 και OVCAR10 έχουν περιγραφεί προηγουμένως [21] και χρησιμοποιήθηκαν σε όλα τα πειράματα. Τα κύτταρα αναπτύχθηκαν σε RPMI-1640 συμπληρωμένο με 10% (ν /ν) ορό εμβρύου μόσχου, 2 mM Ε-γλουταμίνη, 0,2 μονάδες /ml ανθρώπινη ινσουλίνη, 50 μονάδες /ml πενικιλλίνη, 50 μg /ml στρεπτομυκίνη σε 37 ° C κάτω από υγροποιημένη κατάσταση του 95% αέρα και 5% CO

2. A1847 και Α2780 καλλιεργήθηκαν σε πυκνότητα 5 χ 10

4 κύτταρα /mL σε 24 φρεατίων πλάκες και υποβλήθηκαν σε επεξεργασία είτε με 10 μg /mL ή 20 μg /mL του epimorphin (R &? D Systems, Minneapolis, ΜΝ) που ακολουθείται από 3 ημέρες επώασης σε 1% μέσο που περιέχει ορό.

SYBR Green πραγματικού χρόνου ποσοτική PCR

Ολικό RNA εξήχθη από epimorphin-επεξεργασμένων και μη επεξεργασμένων συμπλέγματα OCC και πέψη με DNase. RNA υποβλήθηκε σε αντίστροφη μεταγραφή. cDNA στη συνέχεια ενισχύθηκε χρησιμοποιώντας ένα Bio-Rad CFX96 ™ (Hercules, CA) σύστημα ανίχνευσης σε πραγματικό χρόνο. Εκτός εάν ορίζεται διαφορετικά, κάθε μείγμα αντίδρασης περιείχε 10Χ Gold Buffer, 25 χιλιοστά MgCl

2, 2,5 mM dNTPs, 10Χ SYBR Green, AmpliTaq Gold πολυμεράσης, Dye αναφοράς, dH

2O, πρότυπο DNA και 10 μΜ από κάθε εκκινητή. Η ενίσχυση διεξήχθη με ενεργοποίηση αρχική πολυμεράση για 10 λεπτά στους 95 ° C, και 40 κύκλους μετουσίωσης στους 95 ° C για 15 δευτερόλεπτα, ανόπτηση στους 60 ° C για 20 δευτερόλεπτα και επιμήκυνση για 30 δευτερόλεπτα στους 72 ° C (Πίνακας S1). Η τιμή κατωφλίου φθορισμού υπολογίστηκε χρησιμοποιώντας το λογισμικό του συστήματος CFX96 ™ σε πραγματικό χρόνο. Ο υπολογισμός της σχετικής μεταβολής στα επίπεδα mRNA διεξήχθη χρησιμοποιώντας το δέλτα-δέλτα μέθοδο [22], με κανονικοποίηση για το γονίδιο οικοκυρική RPL13A.

κυττάρων ενεργοποιημένων με φθορισμό (FACS)

Epimorphin επεξεργασμένο και μη επεξεργασμένα κύτταρα καρκίνου των ωοθηκών σταθεροποιήθηκαν με 2% παραφορμαλδεΰδη ρυθμισμένο με φωσφορικό για 30 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. Μετά τη σταθεροποίηση, τα κύτταρα κατέστησαν διαπερατά με 1Χ FACS ™ διαπερατότητας Λύση 2 (BD Biosciences, San Jose, CA) για 30 λεπτά σε RT, αποκλείστηκαν με αλβουμίνη βόειου ορού για 30 λεπτά και στη συνέχεια επωάστηκαν με αντι-ανθρώπινο-ΕρΟΑΜ ΡΙΤΟ-συζυγές ποντικού (BD Biosciences, San Jose, CA) και αντι-ανθρώπινο-βιμεντίνη FITC συζυγούς ποντικού (Abcam, Cambridge, ΜΑ) στο σκοτάδι για 30 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. Τα κύτταρα ξεπλύθηκαν με PBS και ο φθορισμός ψηφιακές εικόνες συλλήφθηκαν χρησιμοποιώντας BD Biosciences LSR II. BD FACSDiva ™ Έκδοση 6 λογισμικό εφαρμόστηκε για τον χαρακτηρισμό και την παρακολούθηση των επιδόσεων των κυτταρομετρητές. λογισμικό FlowJo στη συνέχεια χρησιμοποιήθηκε για την ανάλυση κυτταρομετρίας ροής δεδομένων. Single-βάφονται έλεγχοι χρησιμοποιήθηκαν για να ρυθμίσετε τις παραμέτρους αποζημίωσης και μη χρωματισμένα δείγματα που χρησιμοποιήθηκαν για να ρυθμίσετε αρνητική πύλες.

Ανοσοβαφή

Τα μη επεξεργασμένα και τα κύτταρα epimoprhin επεξεργασμένα καλλιεργημένα σε μη-επικαλυμμένες γυάλινες καλυπτρίδες (Fisher Scientific, Pittsburgh , ΡΑ) με πυκνότητα 4 χ 10

4 τα κύτταρα μονιμοποιήθηκαν με αιθανόλη για 30 λεπτά στους 4 ° C. Μετά τη σταθεροποίηση, τα κύτταρα κατέστησαν διαπερατά με κρύο (-20 ° C) ακετόνη για 3 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου, δεσμεύτηκαν με 1% αλβουμίνη βόειου ορού για 1 ώρα, και στη συνέχεια επωάστηκαν με β-κατενίνη (L54E2) mAB ποντικού (Alexa Fluor® 488 σύζευγμα?. Cell Signaling Tech, Danvers, ΜΑ) σε ένα υγρό θάλαμο όλη τη νύκτα στους 4 ° C. Την επόμενη ημέρα, τα κύτταρα ξεπλύθηκαν με PBS. Μετά από αρκετές πλύσεις, καλυπτρίδες που περιέχουν τα κύτταρα τοποθετήθηκαν σε πλάκες σε μέσο στερέωσης VECTASHIELD® με DAPI (Vector Labs, Inc, Burlingame, CA). ψηφιακές εικόνες φθορισμού συλλήφθηκαν με τη χρήση μικροσκοπίου Nikon Eclipse 80

i

(Melville, Νέα Υόρκη) συνδέεται με έναν προσαρμογέα φωτογραφική μηχανή Nikon Q-απεικόνισης. MetaMorph λογισμικό ανάλυσης εικόνας (έκδοση 7.7.0.0) χρησιμοποιήθηκε για την απόκτηση και ανάλυση εικόνων.

SDS-PAGE και Western Blot ανάλυση

Οι πρωτεΐνες διαχωρίστηκαν σε 10% Tris-HCl Ready Gel ( Bio-Rad, Hercules, CA), μεταφέρθηκαν σε μεμβράνες νιτροκυτταρίνης, και επωάστηκαν με μονοκλωνικό αντίσωμα ποντικού [ab6276] σε β-ακτίνης σε αραίωση 1/5000, μονοκλωνικό αντίσωμα ποντικού [ab28081] για να βλεννίνης-1 σε αραίωση 1/1000 , μονοκλωνικό ποντικού [ab7754] για κυτοκερατίνη 19 (CK-19) σε αραίωση 1/1000 ή πολυκλωνικό κουνελιού [ab31721] για να occludin σε αραίωση 1/250 για 2 ώρες σε RT. Όλα τα αντισώματα κηλίδας Western ελήφθησαν από την Abcam (Cambridge, ΜΑ). Μετά την επώαση, οι μεμβράνες πλύθηκαν 3Χ επί 15 λεπτά σε ρυθμιστικό πλύσης (PBS-0.05% Tween 20) και επωάστηκαν με ένα δευτερεύον αντι-ποντικού (β-ακτίνη, βλεννίνης-1, βιμεντίνη, Palladin, και κυτοκερατίνη 19) ή αντι- (occludin) αντίσωμα κουνελιού συζευγμένο με υπεροξειδάση (Vector Labs, Burlingame, CA) επί 1 ώρα σε RT. Στη συνέχεια, οι μεμβράνες πλύθηκαν 3Χ επί 15 λεπτά σε ρυθμιστικό πλύσης, και ανοσοαντιδραστικότητα ομαλοποιήθηκε με χημειοφωταύγεια (Amersham, ECL + Plus Kit) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Οι μεμβράνες εκτέθηκαν σε Kodak φιλμ επιστημονικής απεικόνισης (Rochester, ΝΥ) μέσα σε 1 λεπτό για ανίχνευση. πυκνότητες pixel της κηλίδα εικόνες υπολογίστηκαν χρησιμοποιώντας το λογισμικό Image-J (ΝΙΗ). Μεταβολές στα επίπεδα της πρωτεΐνης ομαλοποιήθηκαν με τους ελέγχους και εκφράζονται ως φορές μεταβολής σε σχέση με τους μάρτυρες.

Μέτρηση κυτοκίνες

Για να γίνει διαλογή για την έκκριση εξωκυττάριας μήτρας epimorphin που προκαλείται, A1847 συμπλέγματα OCC (4 × 10

4 κύτταρα /ml σε πλάκες 24-φρεατίων) επωάστηκαν με μέσο μόνο (αρνητικός έλεγχος), 10 μg /mL ή 20 μg /mL του epimorphin για 3 ημέρες. Λαμινίνη (Millipore, Temecula, CA) και ΜΜΡ3 (R &? D Systems, Minneapolis, ΜΝ) έκκριση στα υπερκείμενα καλλιέργειας μετρήθηκαν με σάντουιτς ELISA σύμφωνα με το πρωτόκολλο από τους κατασκευαστές. Τα σημεία δεδομένα εκφράζονται ως μέση συγκέντρωση των διπλών προσδιορισμών στα 450 nm

φαρμακευτικές αγωγές, Cell Βιωσιμότητα Δοκιμασία και νεξίνη κυτταρικού θανάτου Δοκιμασία

A1847, Α2780 & amp.? OVCAR10 απλώθηκαν σε μια πυκνότητα 2 × 10

4 κύτταρα /mL σε 48 φρεατίων πλάκες και καλλιεργήθηκαν με epimorphin σε συγκέντρωση 20 μg /mL για 3 ημέρες. Epimorphin επεξεργασμένα και μη επεξεργασμένα κύτταρα στη συνέχεια καλλιεργήθηκαν με μια σειριακή δόση καρβοπλατίνης (Σέλεκ Chemicals, Houston, ΤΧ, USA) για επιπλέον 3 ημέρες. Η καρβοπλατίνη εύρος δόσεων για epimorphin-επεξεργασμένων και μη επεξεργασμένων A1847 ήταν 1 μΜ, 10 μΜ, 50 μΜ, 100 μΜ, 200 μΜ και 400 μΜ. Η καρβοπλατίνη εύρος δόσεων για epimorphin-επεξεργασμένων και μη επεξεργασμένων Α2780 ήταν 1 μΜ, 10 μΜ, 50 μΜ, 100 μΜ, 150 μΜ και 200 ​​μΜ. Η καρβοπλατίνη εύρος δόσεων για epimorphin-επεξεργασμένων και μη επεξεργασμένων OVCAR10 ήταν 50 μΜ, 100 μΜ, 150 μΜ, 200 μΜ, 400 μΜ και 500 μΜ. Η βιωσιμότητα των κυττάρων προσδιορίστηκε με μέτρηση της μεταβολικής δραστικότητας με χρήση CellTiter-Blue® από την Promega και πλάκες απεικονίστηκαν στην Tecan φθοριόμετρο. Τα δεδομένα στη συνέχεια κανονικοποιήθηκαν σε ποσοστιαία αναστολή και IC

50 συγκεντρώσεις καρβοπλατίνης προσδιορίστηκαν για epimorphin-επεξεργασμένα και μη επεξεργασμένα κύτταρα από το πρόγραμμα γραφικών παραστάσεων SigmaPlot (Systat Software). Ο κυτταρικός θάνατος ή απόπτωση ποσοτικοποιήθηκε χρησιμοποιώντας τον προσδιορισμό γκουάβα νεξίνη αννεξίνης V μέσω μιας ροής γκουάβα EasyCyte ΗΤ κυτταρόμετρο (γκουάβα Technologies, Hayward, CA). Η δοκιμασία νεξίνη χρησιμοποιεί δύο βαφές: 7-AAD, μία χρωστική κελί διαπερνά, ως δείκτης της μεμβράνης δομική ακεραιότητα και αννεξίνης V-ΡΕ για την ανίχνευση φωσφατιδυλοσερίνη στην εξωτερική μεμβράνη των αποπτωτικών κυττάρων. Τα δείγματα παρασκευάστηκαν σύμφωνα με τις προδιαγραφές του κατασκευαστή. Δεδομένα κανονικοποιήθηκαν με τους ελέγχους και εκπροσωπούνται ως μέσο ± S.D.

Στατιστική Ανάλυση

Τα δεδομένα αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας το Microsoft Office Excel 2010 και εκφράζονται ως μέσοι ± S.D. όπου ενδείκνυται. Δύο συγκρίσεις ομάδα αξιολογήθηκαν χρησιμοποιώντας t-test unpaired Student. Οι τιμές των p & lt?. 0.05 θεωρήθηκαν στατιστικά σημαντικές

Αποτελέσματα

Μορφολογικά και Μοριακής Επιδράσεις των Epimorphin συνδεδεμένων με ΚΟΑ στον ωοθηκών καρκινικά κύτταρα

Προηγούμενες εργασίες έχουν ενοχοποιηθεί epimorphin ως μεσολαβητές επιθηλιακά μορφογένεση σε διάφορα όργανα και κύτταρα [4] – [13]. Παρ ‘όλα αυτά, λίγα είναι γνωστά για το μηχανισμό με τον οποίο epimorphin μεσολαβούν τέτοια αποτελέσματα στα καρκινικά κύτταρα των ωοθηκών. Χρησιμοποιήσαμε πρώτα μία ELISA κιτ να συγκρίνουν τα επίπεδα των epimorphin σε διάφορες κυτταρικές γραμμές καρκίνου των ωοθηκών με λιπώδη προερχόμενα μεσεγχυματικά βλαστικά κύτταρα τα οποία χρησιμοποιήθηκαν ως θετικοί έλεγχοι. Η ενδογενής παραγωγή epimorphin ήταν σχετικά χαμηλό (εύρος: 0,1-0,3 ng /ml) σε όλες τις κυτταρικές σειρές καρκίνου των ωοθηκών που εξετάστηκαν σε σύγκριση με τον λιπώδη προερχόμενα μεσεγχυματικά βλαστικά κύτταρα (εύρος: 10-12 ng /ml) (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Στη συνέχεια προσδιορίζεται το βέλτιστο χρόνο και τη δόση του epimorphin θεραπεία για την επαγωγή ΚΟΑ στην κυτταρική σειρά καρκίνου των ωοθηκών, Α2780. Πρόσφατες μελέτες έχουν δείξει ότι το 20 μg /ml του epimorphin ήταν σε θέση να ενεργοποιήσει ΜΕΚ-ERK1 /2 οδού (11) και επάγουν MMPs διαφοροποίησης (13). Για να εκτιμηθεί η εξαρτώμενη από τη δόση απόκριση στα καρκινικά κύτταρα των ωοθηκών, πραγματοποιήσαμε την πρώτη ευρεία δόσης-απόκρισης (2 έως 20 μg /ml) του epimorphin χρησιμοποιώντας κύτταρα Α2780. Βρήκαμε μετά από 3 ημερών σε 20 μg /mL του epimorphin, τα κύτταρα Α2780 υποβλήθηκαν σε σημαντικές μορφολογικές αλλαγές (από μεσεγχυματικά σε επιθηλιακό) όπως αναλύεται με αντίθεση φάσης μικροσκόπιο φωτός, ανοσοκηλίδωση και πραγματικού χρόνου ποσοτική RT-PCR ενώ 2 μg /ml του epimorphin προκάλεσε κανένα κυτταρικές αποκρίσεις (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Αξιολογήσαμε την επόμενη η βέλτιστη δόση του epimorphin και διαπιστώθηκε ότι τόσο Α2780 και A1847 αγωγή με την χαμηλότερη δόση (10 μg /mL) του epimorphin παρουσίασαν περισσότερο αστεροειδή και επιμήκη μεσεγχυματικά-όπως εμφάνιση (Σχήμα 1Β & amp?. 1Ε). Σε σύγκριση, η υψηλότερη δόση (20 μg /mL) να οδηγήσει σε μια πιο ολοκληρωμένη επιθηλιακά-όπως διαμορφώνεται ως ορατό με αντίθεσης φάσης μικροσκοπική εξέταση (Σχ 1C & amp?. 1F). Αυτά τα αποτελέσματα πρότειναν μια διφασική επίδραση της epimorphin και ένα στενό παράθυρο δοσολογία να επανέλθει βέλτιστα μεσεγχυματικά κύτταρα σε μια πιο επιθηλιακή μορφολογία. Επιπλέον, αφαιρείται το εξωγενές epimorphin αντικαθιστώντας την κυτταρική καλλιέργεια με φρέσκα μέσα κατά epimorphin επαγόμενη ΜΕΤ για επιπλέον επώαση 3 ημερών. Η epimorphin επαγόμενη ΜΕΤ των καρκινικών κυττάρων των ωοθηκών παρέμειναν επιθηλιακά φαινότυπο όπως αναλύεται με ένα ελαφρύ αντίθεσης φάσης μικροσκόπιο και πραγματικού χρόνου ποσοτική PCR (δεν παρουσιάζονται τα δεδομένα). Για να αναλυθεί περαιτέρω η φύση αυτού του αποτελέσματος, μετρήσαμε τα επίπεδα της αν-ιντεγκρίνης, μία «epimorphin υποδοχέα» σε A1847 και διαπιστώθηκε ότι τα επίπεδα σταθερής κατάστασης της αν-ιντεγκρίνης ήταν χαμηλά αλλά προκλήθηκαν 9 φορές με 20 μg /mL epimorphin (Εικ. 2Α). Παρόμοια με την αν-ιντεγκρίνης επίπεδα του υποδοχέα, τα κατάντη μεσολαβητές, π.χ., παράγοντες μεταγραφής C /ΕΒΡβ (↑ ~ 9 φορές,

σ

& lt? 0.056) (Εικ. 2Β) και KLF4 (~ 28-φορές ↑ ,

σ

& lt?. 0.002) (Σχήμα 2C), βρέθηκαν να είναι σημαντικά αυξημένα, γεγονός που υποδηλώνει ότι η C /ΕΒΡβ και KLF4 μπορεί να είναι το κλειδί ρυθμιστές της epimorphin μεσολάβηση ΚΟΑ. Ομοίως, τα επίπεδα του mRNA της β-κατενίνης (↑ ~ 6 φορές,

σ

& lt? 0.004) (Εικ. 2D), occludin (↑ -15 φορές,

σ

& lt? 0,004 ) (Σχ 2Ε) και EpCAM (↑ ~ 6 φορές,

ρ

& lt?.. 0.0002) (Σχήμα 2F) βρέθηκαν να είναι προς τα πάνω ρυθμισμένη έντονα στην υψηλότερη δόση του epimorphin, πάλι υποδεικνύοντας υποστηρίζοντας τη μετατροπή σε επιθηλιακά φαινότυπο. Μοριακοί δείκτες μεσεγχυματικών φαινότυπο, όπως TWIST1 (Σχ. 2G), βιμεντίνη (Σχ. 2Η), dystroglycan (Εικ. 2I) και Palladin (Σχ. 2J), κατεστάλησαν με 20 μg /mL epimorphin αλλά αυξήθηκε σημαντικά κατά τη διέγερση του A1847 με χαμηλότερη δόση epimorphin, υπονοώντας ότι ο διακόπτης μεταξύ μεσεγχυματικών και επιθηλιακών φαινότυποι είναι πιθανό να είναι δοσοεξαρτώμενη.

Α2780 και A1847 επωάστηκαν με 10 μg /mL ή 20 μg /mL του epimorphin για 3 ημέρες. Α-Ρ: Epimorphin (20 μg /ml) προκάλεσε μια στρογγυλεμένη λιθόστρωτο, επιθηλιακά-όπως εμφάνιση τόσο Α2780 (C) και A1847 (F). Σε σύγκριση, epimorphin σε 10 μg /ml οδηγήσει σε μια πιο επίμηκες μεσεγχυματικά μορφολογία τόσο Α2780 (Β) και A1847 (Ε) σε σύγκριση με μη κατεργασμένους μάρτυρες (Α & amp? D). Εικόνες της μορφολογίας των κυττάρων συνελήφθησαν σε μεγέθυνση 10Χ, με τουλάχιστον 3 εικόνες ανά καλά, χρησιμοποιώντας ένα μικροσκόπιο όρθια αντίθεσης φάσης (T3.15A? Fisher Scientific)

Η

Α και Β:. Αν-ιντεγκρίνης υποδοχέα (Α) και C /ΕΒΡβ (Β) έδειξε αξιοσημείωτη αύξηση των επιπέδων mRNA σε απόκριση σε 20 μg /mL του epimorphin. C-F: Επιθηλιακά δεικτών όπως KLF4 (C), β-κατενίνης (D), occludin (Ε), και EpCAM (F) βρέθηκαν να είναι προς τα πάνω ρυθμισμένη με εξωγενή 20 μg /mL του epimorphin. G-J: Έκφραση των δεικτών μεσεγχυματικών TWIST1 (G), βιμεντίνη (H), dystroglycan (Ι) και Palladin (J) ρυθμίστηκαν προς τα κάτω μετά από αγωγή με epimorphin (20 μg /ml). Ωστόσο, όλα τα τέσσερα δείκτες μεσεγχυματικά (G-J) βρέθηκαν να ρυθμίζεται προς τα πάνω από 10 μg /mL του epimorphin (μέσο ± SD, η = 3) [*

ρ

& lt? 0,05 συγκρίσει με τον έλεγχο].

επιδράσεις της Epimorphin επί φαινότυποι γονιδιακής έκφρασης σε A1847

σε μια προσπάθεια να επιβεβαιωθεί περαιτέρω η επαγωγική επιδράσεις της epimorphin επί φαινοτυπικών τροποποιήσεις, ανοσοαποτύπωση και ELISA διεξήχθησαν για να προσδιοριστεί το προφίλ έκφρασης πρωτεΐνης του τόσο επιθηλιακών και μεσεγχυματικών δείκτες. Ποσοτική ανάλυση της πρωτεΐνης σε occludin A1847 έδειξαν ότι η θεραπεία με epimorphin υψηλότερη δόση αυξήθηκε occludin έκφρασης με πέντε πτυχώσεις (Εικ. 3) σε σύγκριση με τα μη επεξεργασμένα, σύμφωνα με το αποτέλεσμα που παρατηρείται με τα επίπεδα του mRNA (εικ. 2Ε). Ομοίως, παρόμοιες αυξήσεις ελήφθησαν για CK-19 και βλεννίνη-1 (Σχ. 3), και πάλι υπονοώντας ότι epimorphin αγωγή A1847 υποβάλλονται σε φαινοτυπικές αλλαγές που σχετίζονται με το ΚΟΑ. Ωστόσο, η έκφραση των γονιδίων μεσεγχυματικών, Palladin και βιμεντίνη (Σχήμα S1) αυξήθηκαν κατά 1- και 2 φορές, αντίστοιχα, σε A1847 κατεργάζεται με 10 μg /ml epimorphin, υποδεικνύοντας και πάλι ότι η επαγωγή της ΕΜΤ ή MET σε απόκριση σε epimorphin είναι αμφίδρομη ανάλογα με την εφαρμοζόμενη δόση. Εμείς επόμενη εκτελείται προσδιορισμούς ELISA για τον προσδιορισμό απελευθέρωση πρωτεϊνών που σχετίζονται με επιθηλιακά και μεσεγχυματικά φαινοτύπους. Είναι ενδιαφέρον ότι, η έκκριση της λαμινίνης (Σχ. 4Α), μια γλυκοπρωτεΐνη εξωκυτταρικής απαραίτητη για την ανάπτυξη των επιθηλιακών κυττάρων πολικότητας, βρέθηκε να είναι σημαντικά αυξημένα κατά την κατεργασία του A1847 με epimorphin. Αντιστρόφως, η παραγωγή του ΜΜΡ3 (Εικ. 4Β), ένας δείκτης μεσεγχυματικά σημαντικό για τον καρκίνο των κυττάρων εισβολής και της μετανάστευσης, βρέθηκε να μειώνεται μετά /mL θεραπεία epimorphin 20 μg αλλά έντονα αυξητικά σε 10 μg /mL. Λαμβανόμενα μαζί, αυτά τα δεδομένα καταδεικνύουν ότι υπάρχει προοδευτική δέσμευση των κυττάρων του όγκου των ωοθηκών προς ένα επιθηλιακό γενεαλογία όταν καλλιεργούνται με επαρκή δόση epimorphin.

Protein έκφραση των δεικτών που σχετίζονται με επιθηλιακά, π.χ. βλεννίνης-1, CK -19 και occludin αξιολογήθηκαν με ανοσοκηλίδωση και πυκνότητες μπάντα ποσοτικοποιήθηκαν με Image-J λογισμικού. Πτυχές αυξήσεις στην έκφραση της πρωτεΐνης του επεξεργασμένου (20 μg /ml epimorphin) έναντι μη επεξεργασμένου A1847: 2,5-πλάσια αύξηση για CK-19? 1,5-πλάσια αύξηση για μουκίνη-1, και αύξηση 4,5 φορές για occludin. β-ακτίνη χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης. (Σημαίνει ± S.D., η = 3). [*

σ

& lt? 0,05 σε σύγκριση με τον έλεγχο]

Η

Η έκκριση της λαμινίνη (επιθηλιακά δείκτη) και ΜΜΡ-3 (μεσεγχυματικά δείκτης) ήταν μέτρο με ELISA μετά από θεραπεία A1847 ωοθηκών. καρκινικά κύτταρα με epimorphin για 3 ημέρες (στα 10 ή 20 μg /ml). Η έκθεση σε epimorphin (/ml 20 μα) σημαντικά αυξημένη παραγωγή λαμινίνη και να οδηγήσει σε μείωση της έκκρισης των ΜΜΡ-3 σε σύγκριση με τον έλεγχο. Σε σύγκριση, η απελευθέρωση ΜΜΡ-3 ενισχύθηκε όταν A1847 κατεργάζεται με χαμηλότερη συγκέντρωση του epimorphin (10 μg /ml), και πάλι υποδεικνύοντας epimorphin μπορούν να επάγουν φαινοτυπικές αλλαγές στα καρκινικά κύτταρα των ωοθηκών σε έναν δοσο-εξαρτώμενο τρόπο (μέσο ± SD, η = 3 ) [*

σ

& lt? 0,05 σε σύγκριση με τον έλεγχο]

η

επιθηλιακή διαφοροποίηση σε απάντηση σε εξωγενείς Epimorphin

β-κατενίνης, ένας βασικός παράγοντας για την Wnt. μονοπάτι σηματοδότησης, έχει δειχθεί να προσδιοριστεί επιθηλιακών κυττάρων μοίρα κατά την εμβρυϊκή ανάπτυξη της ωοθήκης [23]. Απώλεια β-κατενίνης αργά στην εμβρυϊκή ανάπτυξη οδήγησε σε βαθιά ελαττώματα στα επιθηλιακά ωρίμανση σε ενηλικίωση [24]. Για να διερευνηθεί περαιτέρω αν η epimorphin μεσολάβηση ΜΕΤ συνδέεται με αυξημένη έκφραση του ενδογενούς β-κατενίνης, χρησιμοποιήσαμε ανοσοχρώση για β-κατενίνης για την αξιολόγηση της διαφοροποίησης επιθηλιακών κυττάρων του epimorphin επεξεργασμένου A1847. Τόσο ανεπεξέργαστων A1847 και OVCAR10 είχε λίγες β-κατενίνης-θετικά κύτταρα? αλλά έδειξε εξέχοντα επέκταση της περιοχής στο και γύρω από τις κυττάρου-κυττάρου διασταυρώσεις, κυρίως σε epimorphin επεξεργασμένου A1847 και OVCAR10 (Εικ. 5). Μια αύξηση στην β-κατενίνης-θετικών κυττάρων φαίνεται στο epimorphin επεξεργασμένου A1847 και OVCAR10 παριστάνεται μια μορφή δόσης-απόκρισης αυτών των κυττάρων σε 20 μg /mL epimorphin. Αυτή η πειραματική απόδειξη δείχνει σε ένα ρόλο για epimorphin σηματοδότηση στην επαγωγή της διαφοροποίησης β-κατενίνης η οποία μπορεί να είναι ένας σημαντικός καθοριστικός παράγοντας της επιθηλιακής γράμμωσης δέσμευση σε κύτταρα όγκου ωοθηκών. Επιπλέον, η ανάλυση FACS που προσδιορίζονται μια υπο-κλάσμα A1847 κυττάρων με απορυθμίζεται EpCAM (επιθηλιακό δείκτης) και ρυθμίζεται προς τα κάτω βιμεντίνης (μεσεγχυματικά δείκτη) μετά από αγωγή με 20 μg /mL epimorphin (Εικόνα S2 & amp? S3).

Τα ανεπεξέργαστα και 20 μg /mL epimorphin επεξεργασμένου A1847 και OVCAR10 αναλύθηκαν για β-κατενίνης, δείκτης της διαφοροποίησης επιθηλιακών, με ανοσοχρώση. β-κατενίνης (πράσινο), DAPI (μπλε) και να συγχωνεύσει (πράσινο νέον) σε μη επεξεργασμένα A1847 (Α-Γ) και OVCAR10 (G-Ι)? epimorphin επεξεργασμένου A1847 (D-F) και OVCAR10 (J-L). Η ανοσοχρώση ανάλυση έδειξε αυξημένη έκφραση β-κατενίνης-θετικών κυττάρων σε epimorphin επεξεργασμένα A1847 (D & amp? F) και epimorphin επεξεργασμένο OVCAR10 (J & amp? L). Υπήρχαν άφθονα β-κατενίνης θετικών κυττάρων σε και γύρω από τις κυττάρου-κυττάρου διασταυρώσεις epimorphin επαγόμενης A1847 και OVCAR10 (F & amp? L) σε σύγκριση με μη επεξεργασμένους μάρτυρες (C & amp? Ι).

Η

Βιωσιμότητας Κυττάρων και αννεξίνη-V δραστηριότητα κατά τη διάρκεια καρβοπλατίνη απόπτωση σε Epimorphin έλαβαν συμπλέγματα OCC

για να καθοριστεί εάν η καρβοπλατίνη μπορεί επιλεκτικά να σκοτώσει τα καρκινικά κύτταρα των ωοθηκών με περισσότερα επιθηλιακά-όπως μορφολογίες, συγκρίναμε την ικανότητα των καρβοπλατίνη να προκαλεί κυτταρικό θάνατο μετά epimorphin- θεραπεία. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 6, καρβοπλατίνη μόλυβδο έκθεσης σε μια σημαντική μείωση του αριθμού των βιώσιμων κυττάρων μετά epimorphin επάγεται ΜΕΤ για A1847 (

σ

= 0,005) (Σχ. 6Α) και Α2780 (

ρ

= 0,007) (Σχ. 6Β) σε σύγκριση με τους ελέγχους. Αν και η τάση ήταν παρόμοια, η αλλαγή στην ευαισθησία σε OVCAR10 (Εικ. 6C) με ή χωρίς epimorphin δεν ήταν στατιστικώς διαφορετική (

σ

= 0,170), πιθανώς λόγω της έλλειψης κλίμακα δόσης στο υψηλότερο άκρο του το εύρος για τη σχεδίαση και μοντελοποίηση των δεδομένων απόκρισης. Σημασμένα με φθοριοχρώμιο αννεξίνης V χρησιμοποιήθηκε για την ταυτοποίηση αποπτωτικά κύτταρα [25], [26]. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 6D-6F, επαγωγή απόπτωσης παρατηρήθηκε στα τρία συμπλέγματα OCC epimorphin αγωγή, συμπεριλαμβανομένης της περισσότερο κυτταρική γραμμή καρβοπλατίνη ανθεκτική, OVCAR10 σε σύγκριση με τα μη επεξεργασμένα συμπλέγματα OCC. Το ποσοστό των αποπτωτικών κυττάρων αυξήθηκε σε κύτταρα epimorphin επεξεργασμένα με αυξανόμενες συγκεντρώσεις της καρβοπλατίνης (Σχ. 6D-6F). Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι τα συμπλέγματα OCC με χαρακτηριστικά μεσεγχυματικά γίνονται πιο ευαίσθητα στην καρβοπλατίνη απόπτωση μετά epimorphin συσχετισμένη διαφοροποιούνται σε επιθηλιακά κατάσταση που μοιάζει. Σημαντικά, όταν αξιολογήθηκε χρησιμοποιώντας 10 μg /ml του epimorphin, η οποία αποτυγχάνει να επάγεται ΜΕΤ, οι τρεις κυτταρικές σειρές καρκίνου των ωοθηκών αξιολογηθεί (δηλαδή, A1847, Α2780 και OVCAR10) έδειξαν αυξημένη αντίσταση στην καρβοπλατίνη, όπως μετράται με CellTiter® Blue (Σχήμα S4). Τα αποτελέσματα αυτά υπογραμμίζουν ότι η αντιστροφή της EMT μπορεί να χρησιμεύσει για να βοηθήσει στην περαιτέρω ευαισθητοποίηση των υποτροπή της νόσου σε πρώτης γραμμής θεραπείες. Δεδομένου ότι αυξημένα κυτταρικού πολλαπλασιασμού θα μπορούσε να επηρεάσει δραματικά την καρβοπλατίνη αντίσταση και πλατίνα φάρμακα μόνο βλάβη κυττάρων κατά τη διάρκεια της φάσης S του κυτταρικού κύκλου, έχουν οδηγίες μετρήσεις κυττάρων χρησιμοποιώντας ένα αιματοκυτταρόμετρο έχουν πραγματοποιηθεί για την παρακολούθηση του πολλαπλασιασμού στο τέλος της καλλιέργειας. Μικρή έως καθόλου αλλαγή στα ποσοστά κυτταρικής ανάπτυξης παρατηρήθηκε για epimorphin επεξεργασμένο σε σύγκριση με τα μη επεξεργασμένα συμπλέγματα OCC (τα δεδομένα δεν φαίνονται)

AF:. A1847, Α2780, και OVCAR10 υποβλήθηκαν σε αγωγή με 20 μg /mL epimorphin για 3 ημέρες. Μετά από 3 ημέρες, epimorphin-κατεργασμένων και μη κατεργασμένων συμπλέγματα OCC καλλιεργήθηκαν εις τριπλούν με σειριακές δόσεις καρβοπλατίνης για επιπλέον 3 ημέρες. Η βιωσιμότητα των κυττάρων ποσοστώθηκε χρησιμοποιώντας δοκιμασία CellTiter Blue® (A-C). Η απόπτωση προσδιορίστηκε ποσοτικά χρησιμοποιώντας δοκιμασία γκουάβα νεξίνη (D-F). Α-Ο: IC

50 τιμές δείχνουν την καρβοπλατίνη επαγόμενη απώλεια κυτταρικής βιωσιμότητας περισσότερο στις τρεις συμπλέγματα OCC epimophin επεξεργασμένο από τους χωρίς θεραπεία ελέγχους με δοσο-εξαρτώμενο τρόπο. D-F: Ανίχνευση των αποπτωτικών αποκρίσεων βρέθηκε να αυξάνει σε όλα τα τρία συμπλέγματα OCC epimorphin αγωγή με αυξανόμενες συγκεντρώσεις σισπλατίνης σε σύγκριση με εκείνες των μη επεξεργασμένων ελέγχων. Τα δεδομένα ομαλοποιήθηκαν με τους ελέγχους και εκπροσωπούνται ως μέσο ± S.D. [*

σ

& lt? 0,05 σε σύγκριση με τον έλεγχο]. Εικόνες των αποπτωτικών κυττάρων συνελήφθησαν σε μεγέθυνση 10Χ, με τουλάχιστον 3 εικόνες ανά καλά, χρησιμοποιώντας ένα μικροσκόπιο όρθια αντίθεσης φάσης. (T3.15A? Fisher Scientific)

Η

Συζήτηση

Τοποθέτηση απόδειξη υποστηρίζει τον κρίσιμο ρόλο της EMT στην ενορχήστρωση εμβρυογένεση, την αναγέννηση των ιστών, και τη μετάσταση του καρκίνου [1] – [3], [16], [27], [30] – [35]. Οι γενετικές μεταβολές και μορφολογικές αλλαγές διαμορφώνονται κατά τη διάρκεια της μετάστασης του καρκίνου, όπως η απώλεια των επιθηλιακών κυττάρων ταυτότητα (π.χ., occludin και EpCAM) και την απόκτηση των χαρακτηριστικών μεσεγχυματικών (π.χ., βιμεντίνη και TWIST1) [1] – [3], [27]. Στην ανάπτυξη, την ΕΜΤ και την αντίστροφη διαδικασία, ΜΕΤ αποτελούν ουσιαστικό μηχανισμό για τη ρύθμιση των φαινοτυπική πλαστικότητα η οποία χαρακτηρίζεται ως κυτταρικών και μοριακών γεγονότων που εμπλέκονται στην αλληλομετατροπή μεταξύ επιθηλίου και μεσεγχύματος κατά την εμβρυϊκή συναρμολόγησης και αναδιαμόρφωση. Ωστόσο, στον καρκίνο, φαινοτυπική πλαστικότητα θα μπορούσε να επηρεάσει την εξέλιξη του όγκου και την αποτελεσματικότητα του φαρμάκου μέσω της διατήρησης του μεσεγχυματικά, επεμβατική φαινοτύπου των κυττάρων του όγκου που έχουν υποβληθεί σε EMT σε απόκριση σε μία ποικιλία εξωκυτταρικών ερεθισμάτων ή παραγώγων της ανάπτυξης.

Πρωτογενής επιθηλιακό ωοθηκικό καρκίνοι είναι ως επί το πλείστον εξαιρετικά ευαίσθητα σε θεραπείες με βάση την πλατίνα. Επιπλέον, υποτροπιάζουσα ασθένεια ανταποκρίνεται συχνά σε πρόσθετες γύρους της χημειοθεραπείας? Ωστόσο, το διάστημα χωρίς εξέλιξη μικραίνει μετά από κάθε κύκλο, καθώς αυξάνεται χημειοαντίσταση μέχρις ότου η ασθένεια γίνεται ανίατη. Οι μηχανισμοί που οδηγούν σε ανθεκτικότητα στο φάρμακο είναι πολύπλοκα? Ωστόσο, πρόσφατες μελέτες δείχνουν ότι η EMT συνδέεται στενά με την ανταπόκριση στη θεραπεία και τη γενική ή την επιβίωση χωρίς εξέλιξη. Πιστεύεται ότι εγγενείς παράγοντες που προέρχονται από το μικροπεριβάλλον του όγκου επάγει επιθηλιακή συμπλέγματα OCC να υποστούν βαθιές φαινοτυπικές μετατροπή από επιθηλιακά (στρογγυλό σχήμα) προς μεσεγχυματικά (ατρακτοειδή) μορφολογία συνεπής με EMT [16], [27], [30] – [ ,,,0],35]. Πρόσφατες μελέτες έχουν αποκαλύψει ότι οι συμπλέγματα OCC με επιθηλιακά χαρακτηριστικά είναι πιο ευαίσθητα σε χημειοθεραπευτικά σχήματα σε σύγκριση με μεσεγχυματικά κύτταρα όγκου [1], [2]. Ωστόσο, τα επιθηλιακά συμπλέγματα OCC υποβάλλονται EMT είναι πιθανόν να διεγείρουν επίκτητη αντοχή και να μην αποκρίνεται στις συμβατικές θεραπείες ναρκωτικών [1] – [3], [35]. Έτσι, Υποθέτουμε ότι αντιστροφή του φαινοτύπου EMT θα μπορούσε να βοηθήσει να ξεπεράσει την αντίσταση λευκόχρυσου που συνδέονται με.

μερικές στρατηγικές έχουν χρησιμοποιηθεί για την προώθηση της μετατροπής του καρκίνου του μεσεγχυματικών κυττάρων προς ένα περισσότερο επιθηλιακά φαινότυπο όπως χαρακτηρίζεται από την απώλεια των μεσεγχυματικών φαινοτυπικά χαρακτηριστικά και η απόκτηση των επιθηλιακών δεικτών [28] – [30]. Park και οι συνεργάτες [28] έδειξαν ότι η έκτοπη microRNAs έκφρασης (miRNAs), όπως miR-200, μπορεί να οδηγήσει σε αυξητική ρύθμιση της Ε-καδερίνης σε καρκινικές κυτταρικές σειρές και μειωμένη κινητικότητα μέσω στόχευση των Ε-καδερίνης μεταγραφικοί καταστολείς,

ZEB1

(TCF8 /δEF1) και

ZEB2

(1 [SIP1] /ZFXH1B SMAD-πρωτεΐνη αλληλεπίδρασης) μεταγραφές. Ανέφεραν επίσης μια σημαντική συσχέτιση μεταξύ της E-cadherin και την έκφραση του miR-200 σε δύο σειρές δειγμάτων ασθενών προέρχονται από πρωτογενή ορώδες θηλώδους καρκίνου των ωοθηκών [28]. Παρόμοια αποτελέσματα έχουν αναφερθεί, όταν miR-429 υπερεκφράζεται στα μεταστατικά καρκινικά κύτταρα των ωοθηκών [29].