Αφηρημένο

Η έγκαιρη ανίχνευση των όγκων μπορεί να βελτιώσει σημαντικά την έκβαση της θεραπείας των όγκων. Μια από τις πιο συχνές ερωτήσεις στην απεικόνιση του καρκίνου είναι το πόσα κύτταρα μπορεί να ανιχνευθεί με μη επεμβατικό σε ένα ζωντανό ζώο. Αν και πολλοί παράγοντες περιορίζουν τέτοια ανίχνευση, αυξάνοντας η εκπομπή φωτός από τα κύτταρα είναι ένας από τους πιο αποτελεσματικούς τρόπους για την υπέρβαση αυτών των περιορισμών. Εδώ, περιγράφουμε την ανάπτυξη και αξιοποίηση ενός φορέα λεντοϊού που περιέχει ενισχυμένη λουσιφεράσης πυγολαμπίδα (

luc2

) γονίδιο. Οι προκύπτοντες κλώνοι απλού κυττάρου του μαστικού αδένα όγκου ποντικού (4Τ1-luc2) έδειξε σταθερή εκπομπή φωτός στην περιοχή των 10.000 φωτόνια /sec /κύτταρο. Σε ορισμένες περιπτώσεις, τα μεμονωμένα κύτταρα 4Τ1-luc2 εισάγεται κάτω από το δέρμα ενός

ηυ /ηυ

ποντίκι θα μπορούσε να ανιχνευθεί με μη επεμβατικό τρόπο χρησιμοποιώντας μία κάμερα CCD ψύχθηκε σε ορισμένες περιπτώσεις. Επιπλέον, δείξαμε ότι μόνο λίγα κύτταρα απαιτούνται για την ανάπτυξη όγκων σε αυτά τα ποντίκια και την εξέλιξη του όγκου μπορεί να παρακολουθείται αμέσως μετά τα κύτταρα εμφυτεύονται. Σημαντικά υψηλότερη δραστηριότητα της λουσιφεράσης σε αυτά τα κύτταρα μας επέτρεψε να ανιχνεύσει μικρομεταστάσεων σε δύο, συγγενικά Balb /c και

nu /nu

ποντίκια

Παράθεση:. Kim JB, Urban K, Cochran Ε, Lee S , Ang Α, ρύζι Β, et al. (2010) μη επεμβατική ανίχνευση ενός μικρού αριθμού κυττάρων του καρκίνου βιο-φωσφορισμού

In Vivo

. PLoS ONE 5 (2): e9364. doi: 10.1371 /journal.pone.0009364

Επιμέλεια: Αλέξανδρος Swarbrick, Garvan Institute of Medical Research, Αυστραλία

Ελήφθη: May 12, 2009? Αποδεκτές: 2η Ιανουαρίου, 2010? Δημοσιεύθηκε: 23, Φεβρουαρίου 2010

Copyright: © 2010 Kim et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο χρηματοδοτήθηκε εσωτερικά σε δαγκάνα βιοεπιστήμες και Momenta Pharmaceuticals. Οι χρηματοδότες παρέχονται αντιδραστήρια, της διαστημικής έρευνας και πόρους για αυτή τη μελέτη. Ωστόσο, οι συγγραφείς ασχολούνται αποκλειστικά με το σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή δεδομένων και αναλύσεις, ή την προετοιμασία του χειρογράφου. Δαγκάνα Βιοεπιστήμες και Momenta Biopharma συμφώνησε να δημοσιεύσει τα στοιχεία αυτά σε ένα επιστημονικό περιοδικό. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:. Jae-Beom Kim, Konnie Urban, Steve Lee, Bradley Ράις, Adam Bata, Kenneth Campbell, Richard καφέ, Alex Gorodinsky, Zhan Lu και ο Πέτρος Lassota είναι υπάλληλοι της δαγκάνας Επιστημών ζωής. Αυτός Zhou, Edward Cochran και Takashi Kei Kishimoto είναι υπάλληλοι της Momenta Pharmaceuticals Inc. Οι συγγραφείς συμφωνούν να PLoS ONE Πολιτική σχετικά με την κοινοχρησία των πολιτικών δεδομένων. Δεν υπάρχει καμία αίτηση για δίπλωμα ευρεσιτεχνίας που κατατέθηκε με τη χρήση των δεδομένων που λαμβάνονται από αυτή τη μελέτη.

Εισαγωγή

Ανίχνευση των όγκων σε πρώιμο στάδιο είναι κρίσιμης σημασίας για την αποτελεσματική θεραπεία των όγκων και για τη μελέτη ογκογένεση [1], [2] , [3]. Παραδοσιακά, η ανάπτυξη του όγκου εκτιμήθηκε με τη χρήση μηχανικών ή ηλεκτρονικών δαγκάνες να λάβει φυσικές μετρήσεις του υποδόριου ανθρώπινων όγκων που αναπτύσσονται σε ανοσοκατεσταλμένους ποντικούς [4]. Αυτή η μέθοδος είναι κατάλληλη, ωστόσο, μόνο για ψηλαφητών όγκων καλλιέργεια κάτω από το δέρμα των ζώων. Βαθύτερη μάζες όγκου, όπως οστεοσαρκώματα ενθυλακώνονται από το κόκαλο, δεν επιδέχονται άμεση φυσική μετρήσεις. Ακόμη και σε υποδόρια μοντέλα, βάρη όγκου δεν μπορεί να ποσοτικοποιηθεί με ακρίβεια χρησιμοποιώντας φυσικές μετρήσεις επειδή οίδημα και νεκρωτικές κέντρα θα συμβάλει στην αύξηση του μεγέθους του όγκου [5]. Ορθοτοπική μοντέλα στερεών όγκων παρακαμφθούν αυτά τα εμπόδια και να επιτρέψει αρκετά ακριβή εκτίμηση του φόρτου όγκου ζυγίζοντας τις αποκοπεί, «καθαριστεί» όγκους μετά τα ζώα θυσιάζονται. Κλασική ορθοτοπική μοντέλα είναι ανέφικτο για την αξιολόγηση της αποτελεσματικότητας των ενώσεων », δεδομένου ότι απαιτούν μεγάλο αριθμό ζώων που πρέπει να θυσιάζονται σε κάθε χρονικό σημείο. Ομοίως, ο εντοπισμός των όγκων και τον ποσοτικό προσδιορισμό του βάρους του όγκου σε μοντέλα μετάστασης ζήτησης εξαντλητική και κουραστική ιστολογικές αναλύσεις [6], [7], [8].

Μη επεμβατική ολόκληρο βιοφωταύγειας σώμα απεικόνισης (BLI) επιτρέπει επαναλαμβανόμενες , σε πραγματικό χρόνο

in vivo

παρακολούθηση της ανάπτυξης του όγκου σε πειραματόζωα, ανεξάρτητα από τις θέσεις του όγκου. Σε αντίθεση με φθορισμό, BLI επιδεικνύει ελάχιστη σήματα παρασκήνιο από τα ζωικούς ιστούς [9]. Ως εκ τούτου, μπορεί να ανιχνεύσει BLI σχετικώς ασθενή σήματα με υψηλό λόγο σήματος προς υπόβαθρο. Λόγω της προσαρμοστικότητάς της, BLI έχει υιοθετηθεί για τη μελέτη προκλινική αποτελεσματικότητα των υποψήφιων φαρμάκων [10], [11], [12], [13], καθώς και τις διάφορες πτυχές της βιολογίας των θηλαστικών μέσω δοκιμασιών ρεπόρτερ [14], [15].

Πρόσφατα, πυγολαμπίδα (

Photinus pyralis

) λουσιφεράσης ανασχεδιασμένη για την περαιτέρω βελτιστοποίηση της έκφραση σε κύτταρα θηλαστικών. Σε σύγκριση με τις προηγούμενες γενιές λουσιφεράσης, η νέα έκδοση (

luc2

) παραδίδει περισσότερο από τέσσερις φορές αύξηση στην εκπομπή φωτός η οποία επιτεύχθηκε με την βελτιστοποίηση κωδικονίου και την άρση των δυνητικών θέσεων δέσμευσης παράγοντα μεταγραφής [16]. Εμείς ως αίτημα ότι η ατομική καρκινικά κύτταρα μπορούσαν να ανιχνευθούν

in vivo

με την αξιοποίηση της αυξημένης βιοφωτισμός του

luc2

. Για το σκοπό αυτό, έχουμε μηχανικής ένα βραδέος ιού φορέα όπου

luc2

έκφραση καθοδηγείται μέσω του υποκινητή της ανθρώπινης ubiquitin C [17]. Το κατασκεύασμα στη συνέχεια σταθερά επιμολυσμένα εντός του μαστικού κυτταρική γραμμή όγκου 4Τ1 ποντικού [18], [19]. Αρκετές σταθερό, μονοκύτταρους κλώνοι (4Τ1-luc2) στη συνέχεια απομονώθηκαν με εκπομπή φωτός στην περιοχή των 10.000 φωτόνια /sec /κύτταρο. Εδώ, αναφέρουμε ότι, τουλάχιστον σε ορισμένες περιπτώσεις, η ανίχνευση ενός μόνο των καρκινικών κυττάρων

in vivo

χρησιμοποιώντας μία από αυτές luc 2-σημασμένο κλώνους επιτεύχθηκε. Δείχνουμε επίσης την ανάπτυξη των όγκων από μόνο λίγα κύτταρα εμφυτεύονται σε

ηυ /ηυ ποντικούς και

ανίχνευση μεταστάσεων σε συγγενικά ποντίκια Balb /c. Για καλύτερη γνώση μας, αυτή είναι η πρώτη αναφορά ανίχνευση ενός μόνο βιοφωταυγούς κύτταρο

in vivo

χρησιμοποιώντας μία μέθοδο μη επεμβατική απεικόνιση. Τέτοια φωτεινά κύτταρα μπορούν να χρησιμοποιηθούν αποτελεσματικά για την παρακολούθηση της αποτελεσματικότητας των υποψήφιων φαρμάκων σε μοντέλα μετάστασης και ορθοτοπική μοντέλα όγκων, για την παρακολούθηση μεταστατικό μετανάστευση των καρκινικών κυττάρων, και μπορούν να χρησιμοποιηθούν επίσης για να εξακριβωθεί με ακρίβεια αν οποιαδήποτε υπολειμματική νόσος παραμένει μετά τη θεραπεία.

Αποτελέσματα

Δημιουργία ενός φορέα συστήματος λεντοϊών και Stable 4Τ1-luc2 Κυτταρικές Γραμμές

ένα λεντοϊού φορέας που περιέχει την πυγολαμπίδα

luc2

γονίδιο συζευγμένο με έναν υποκινητή ανθρώπινης ubiquitin C κατασκευάστηκε για να δημιουργηθούν σταθερές bioluminescent καρκινικές κυτταρικές γραμμές [16], [17], [18]. Όγκου μαστού ποντικού 4Τ1 κύτταρα στη συνέχεια επιμολύνθηκαν με τον φορέα λεντοϊού και επιλεγμένα σταθεροί κλώνοι χρησιμοποιώντας πουρομυκίνη (4Τ1-luc2). Οκτώ κλώνοι επιλέχθηκαν για περαιτέρω αναλύσεις και δραστηριότητες της λουσιφεράσης τους παρακολουθήθηκαν για τέσσερις εβδομάδες χωρίς δείκτη επιλογής. Αν και υπήρχαν διαφοροποιήσεις μεταξύ των κλώνων, η πλειοψηφία τους κλώνους που εκπέμπεται πάνω από 3.000 φωτόνια /sec /κύτταρο του φωτός. Λαμβάνοντας υπόψη ότι οι περισσότερες κυτταρικές σειρές επισημαίνονται με τις προηγούμενες γενιές της λουσιφεράσης εκπέμπουν λιγότερα από 250 φωτόνια /sec /κύτταρο, οι κλώνοι luc2 μας παρουσίασαν σημαντικά υψηλότερο επίπεδο εκπομπής φωτός [20]. Παραδόξως, ένας κλώνος (C26) αρχικά εκπέμπονται όσο 52.000 φωτόνια /sec /κύτταρο αλλά εκπομπής φωτός του μειώθηκε σε 6.400 φωτόνια /sec /κυττάρων μετά από τέσσερις εβδομάδες (Σχήμα S1 Α). Για να επιβεβαιώσετε ότι δεν αλλοίωση της κυτταρικής φυσιολογίας συνέβη κατά τη διάρκεια της διαδικασίας σήμανσης /κλωνοποίησης, συγκρίναμε τις κλώνων με τις αρχικές γονική 4Τ1 κύτταρα σε διάφορα επίπεδα. Κατ ‘αρχάς, εξετάσαμε τα πρότυπα ανάπτυξης. Από τα οκτώ αρχικά επιλεγμένων κλώνων, επιλέξαμε δύο γραμμές (C27 και C38) και σε σύγκριση με τα πρότυπα ανάπτυξης τους στις γονικών 4Τ1 κύτταρα. Και οι δύο γραμμές είχαν παρόμοιους χρόνους διπλασιασμού των γονικών κυττάρων (12,6 ώρες χρόνος διπλασιασμού για τους δύο κλώνους, έναντι 12,0 ωρών για τα αρχικά κύτταρα 4Τ1).

Επίσης εξετάσαμε άλλες κρίσιμες παραμέτρους της κυτταρικής φυσιολογίας, συμπεριλαμβανομένων των επιπτώσεων της κατανάλωσης ΑΤΡ . Από λουσιφεράση χρησιμοποιεί ένα μόριο ΑΤΡ για την παραγωγή κάθε φωτόνιο φωτός, υψηλά επίπεδα εκπομπής φωτός θα μπορούσε να είναι επιζήμια για το μεταβολισμό του κυττάρου λόγω της εξάντλησης της πισίνας ΑΤΡ της. Για να ελεγχθεί αν η υψηλή παραγωγή φωτός επηρεάζει κυτταρική φυσιολογία, παρατηρήσαμε την ανάπτυξη των κυττάρων για τέσσερις ημέρες με την παρουσία υψηλών συγκεντρώσεων του υποστρώματος λουσιφεράσης, D-λουσιφερίνη (150 και 300 μg /ml /ημέρα). Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι, με την παρουσία του D-λουσιφερίνης, 4Τ1-luc2 κλώνοι έδειξαν παρόμοια πρότυπα ανάπτυξης με εκείνα των κυττάρων που καλλιεργούνται χωρίς D-λουσιφερίνης και να τα γονικά 4Τ1 κύτταρα (Σχήμα S1B, C, D). Αυτό υποδηλώνει ότι τα κύτταρα 4Τ1-luc2 μπορεί να αντέξει την κατανάλωση της ATP που απαιτούνται για την υψηλή εκπομπή φωτός χωρίς σημαντική επίδραση στην πισίνα ATP του κυττάρου.

Από τον κλώνο C26 έδειξε μείωση της δραστηριότητας της λουσιφεράσης την πάροδο του χρόνου, προσπαθήσαμε στο δεύτερο γύρο περιορισμένης αραίωσης μόνο κύτταρο κλωνοποίησης από το αρχικό μικτό πληθυσμό. Επελέγησαν τέσσερα φωτεινά κλώνους και δραστηριότητες της λουσιφεράσης τους (εκπομπή φωτός) παρακολουθήθηκαν για έξι εβδομάδες χωρίς πίεση επιλογής (Σχήμα 1Α, Β). Όλοι οι κλώνοι που παράγονται αρχικά πάνω από 40.000 φωτόνια /sec /κύτταρο? τότε η εκπομπή φωτός μειώθηκε σε 10.000 φωτόνια /sec /κυττάρων, και σταθεροποιήθηκε σε αυτό το επίπεδο. Παρέμεινε σταθερή για τέσσερις εβδομάδες σε απουσία πουρομυκίνης (Σχήμα 1Β). Από αυτούς τους κλώνους, επελέγη ο κλώνος 1Α4 (4Τ1-luc2-1A4) για περαιτέρω μελέτες. Το πρότυπο ανάπτυξης της 4Τ1-luc2-1A4 ήταν συγκρίσιμη με εκείνη των πατρικών 4Τ1 κύτταρα παρουσία ή απουσία D-λουσιφερίνης (Σχήμα 1 C, D, E). Για την αντιμετώπιση της αιτίας της αρχικής μείωσης της εκπομπής φωτός σε 4Τ1-luc2-1A4 κλώνος, εκτελέσαμε περιορισμένη καλλιέργεια αραίωσης σε πλάκες 96 φρεατίων. Όταν τα κύτταρα αυξήθηκαν έως περίπου 25% συρροή, εξετάσαμε την έκφραση λουσιφεράσης από bioluminescent απεικόνισης. Κάθε φρεάτιο που περιέχει κύτταρα έδειξαν δραστικότητα λουσιφεράσης. Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι η αρχική μείωση της δραστηριότητας της λουσιφεράσης δεν οφείλεται στην απώλεια της λουσιφεράσης έκφραση σε ορισμένα κύτταρα του κλώνου (Σχήμα S2).

(Α) Δημιουργία 4Τ1-luc2-1A4 κύτταρα. μαστικού όγκου 4Τ1 κύτταρα Mouse επιμολύνθηκαν με ένα φορέα που περιέχει λεντοϊού ενισχυμένη λουσιφεράση 2 υπό τον έλεγχο του υποκινητή της ανθρώπινης ubiquitin C [16], [18]. Πουρομυκίνη ανθεκτικοί κλώνοι απομονώθηκαν και εκφράσεις λουσιφεράσης τους υποβλήθηκαν σε διαλογή με βιοφωταύγεια. Δύο γύρους κλωνοποίησης που δημιουργούνται 4 απλού κυττάρου κλώνους 4Τ1-luc2. Λουσιφεράσης δραστηριότητες μετρήθηκαν χρησιμοποιώντας ένα IVIS Spectrum (Binning: med, στάση στ: 1 φορά, η έκθεση: 1 sec). Ένα τυπικό βιοφωτισμός εικόνα τη δοκιμή σταθερότητας της έκφρασης λουσιφεράσης δείχνεται. Σύνολο ροής (φωτόνια /sec) προσδιορίστηκε ποσοτικά χρησιμοποιώντας Ζώντας λογισμικό Image 3.0. επιλέχθηκε και χρησιμοποιήθηκε για περαιτέρω μελέτες κλώνο 4Τ1-luc2-1A4. (Β) Σταθερότητα λουσιφεράσης δραστηριότητας τεσσάρων 4Τ1-luc2 κλώνων. Τα κύτταρα αναπτύχθηκαν για 6 εβδομάδες σε κανονικό μέσο χωρίς πουρομυκίνη και εκπομπή φωτός τους παρακολουθούνταν εβδομαδιαία. Όλοι οι κλώνοι έδειξαν περισσότερο από 7000 φωτόνια /sec /κύτταρο εκπομπής φωτός καθ ‘όλη τη διάρκεια της δοκιμής. καμπύλες (Γ) Ανάπτυξη του 4Τ1-luc2-1A4 κλώνο και γονικών 4Τ1 κύτταρα. Τα κύτταρα αναπτύχθηκαν για 4 ημέρες σε κανονικό μέσο ανάπτυξης χωρίς πουρομυκίνη. Σύνολο αριθμοί κυττάρων συναρτήσει του χρόνου χαράχθηκαν σε λογαριθμική κλίμακα. Αμφότερες οι κυτταρικές γραμμές έδειξαν παρόμοια μοντέλα ανάπτυξης και οι χρόνοι διπλασιασμού. (D, E) Ανάπτυξη της 4Τ1-luc2-1A4 κλώνο και γονικών 4Τ1 κύτταρα παρουσία του D-λουσιφερίνης. Τα κύτταρα τράφηκαν με D-λουσιφερίνης μία φορά την ημέρα (150 μg /ml /ημέρα, D) ή δύο φορές την ημέρα (300 μg /ml /ημέρα, E), αντίστοιχα, συλλέγονται σε κάθε χρονικό σημείο και μετρήθηκαν. Παρουσία της υπέρβασης της D-λουσιφερίνης δεν επηρέασε τις συνολικές πρότυπα ανάπτυξης των κυττάρων 4Τ1-luc2.

Η

Μη-επεμβατική ανίχνευση μικρούς αριθμούς κυττάρων σε

nu /nu

ποντίκια

Επειδή τα κύτταρα 4Τ1-luc2 έδειξε εξαιρετικά υψηλή εκπομπή φωτός, είμαστε δίπλα προσπάθησε να ανιχνεύσει μικρές ποσότητες αυτών των κυττάρων

in vivo

. Αρχικά, οι 4Τ1-luc2-1A4 κύτταρα παρασκευάστηκαν χρησιμοποιώντας μία μέθοδο σειριακή αραίωση και εμφυτεύθηκαν σε αμφότερες τις πλευρές του θηλυκού ηυ /ηυ ποντίκια (Σχήμα 2). Διαφορετικές αριθμοί κυττάρων εμφυτεύτηκαν σε κάθε θέσεων εμφύτευσης. Έξι εμφυτεύσεις πραγματοποιήθηκαν για κάθε αριθμό κυττάρων (3, 5, 10, και 50 κύτταρα). εικόνες βιοφωτισμός ελήφθησαν αμέσως μετά τις εμφυτεύσεις. Χρησιμοποιώντας μια εξαιρετικά ευαίσθητη ψύχεται κάμερα CCD, ήμασταν σε θέση να ανιχνεύσει τόσο λίγα όσο 3 κύτταρα σε αυτό το πείραμα (Σχήμα 2Α-D, κόκκινο διακεκομμένη κύκλοι). Σε ορισμένες περιπτώσεις, ωστόσο, δεν εντοπίζονται τυχόν νόημα σήματα από τις θέσεις της εμφύτευσης (Σχήμα 2Α-D, κίτρινο διακεκομμένη κύκλοι). Αυτό θα μπορούσε να αποδοθεί σε κυτταρικό θάνατο αμέσως μετά την εμφύτευση ή για την εγγενή μεταβλητότητα της μεθόδου σειριακής αραίωσης όταν η προβλεπόμενη αριθμός των κυττάρων είναι πολύ μικρή (Σχ 2Α-D, κίτρινο κύκλοι). Ξεχωριστά, πήραμε PC3M-Luc-C6, που ήταν ένα από τα φωτεινότερα κυτταρικές σειρές (-250 φωτόνια /sec /κύτταρο) που παράγονται από την εταιρεία μας μέχρι τώρα (με τη χρήση πολλαπλών γύρων των επιμολύνσεων από pGL3) και σε σύγκριση με 4Τ1-luc2-1A4 κύτταρα , εμφυτεύοντας τόσο σε SCID-bg ποντίκια (Σχήμα S3). Τα αποτελέσματα δείχνουν ότι τα βιοφωταυγή σήματα από 10

2 4Τ1-luc2-1A4 κυττάρων σε γούνινο ποντίκια ήταν εύκολα ανιχνεύσιμη, ενώ δεν ανιχνεύθηκε σήμα από τον ίδιο αριθμό κυττάρων PC3M-Luc-C6.

( AD) Ορίζεται αριθμοί κυττάρων εμφυτεύθηκαν υποδορίως σε ραχιαία περιοχές πλευρό θηλυκών ηυ /ηυ ποντικούς [1]. Κάθε ποντικός έλαβε δύο εμφυτεύσεις. Ένθετα δείχνουν τον αριθμό των κυττάρων που εμφυτεύονται. D-λουσιφερίνης εγχύθηκε σε ποντικούς αμέσως μετά την εμφύτευση και βιοφωταυγή εικόνες λήφθηκαν (t = 0) με τη χρήση ενός IVIS Φάσμα (FOV? Α, ενδοχείαση? Στάση μικρό, στ? Φορά 1, η έκθεση? 5 λεπτά). (Ε-Η) Μετά από 6 ώρες από την εμφύτευση, όλα τα ποντίκια επανα-απεικονίστηκαν χρησιμοποιώντας τις ίδιες ρυθμίσεις του IVIS Spectrum (t = 6 ώρες). Κόκκινοι κύκλοι αντιπροσωπεύουν τις θέσεις εμφύτευσης που είχε βιοφωταυγή σήματα υψηλότερα από autoluminescence. Κίτρινοι κύκλοι δείχνουν τις θέσεις εμφύτευσης που δεν παράγουν κανένα νόημα σήματα πιθανόν να οφείλεται στο άμεσο θάνατο των κυττάρων. (Ι) συσχέτιση μεταξύ του αριθμού των εμφυτευμένων κυττάρων και του συνολικού ροή από τις θέσεις εμφύτευσης. Σημάτων βιοφωτισμού ποσοτικοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας το λογισμικό Image Living 3,0 και παρίσταται γραφικώς έναντι του αριθμού των κυττάρων. Η μετρούμενη ένταση του βιοφωταύγεια ήταν ευθέως ανάλογη με τον αριθμό των εμφυτευμένων κυττάρων. Οι αστερίσκοι (*) υποδεικνύουν autoluminescence ιστό.

Η

Έξι ώρες μετά τις εμφυτεύσεις, έχουμε εκ νέου απεικονίζεται το ίδιο σύνολο των ζώων (Σχήμα 2Ε-Η). Όπως αναμενόταν, με βάση το εχθρικό περιβάλλον μετά την εμφύτευση, 4 θέσεις των θέσεων εμφύτευσης κυττάρων 10- και 50 έχασαν αρχικά σήματα bioluminescent τους (Σχ 2G, Η). Παραδόξως, όμως, ήμασταν σε θέση να ανιχνεύσει σήματα από 3- και 5 θέσεις εμφύτευσης κυττάρων (Σχήμα 2Ε, F). Οι αναλύσεις μας από τις εικόνες που λαμβάνονται αμέσως μετά την εμφύτευση (t = 0) δείχνουν ότι η συνολική ροή από τις θέσεις εμφύτευσης ήταν ευθέως ανάλογη με τον αριθμό των κυττάρων εμφυτευμένων (Εικ 2I). Αυτό είναι σύμφωνο με τα άλλα δεδομένα (δεν φαίνεται) η οποία αποδεικνύει γραμμική σχέση μεταξύ της εκπομπής φωτός και ο αριθμός των κυττάρων που απλώθηκαν

in vitro

. Με βάση αυτά τα αποτελέσματα, έδειξαν ότι η μέτρηση βιοφωταύγεια είναι ένας εύλογος μέθοδος για να επιτευχθεί μη επεμβατική παρακολούθηση της ανάπτυξης όγκων σε πρώιμο στάδιο

in vivo

.

Ανίχνευση ενός ενιαίου βιο-φωσφορισμού 4Τ1-luc2 Κυττάρου

In vivo

Η

μετά την επιβεβαίωση της μη-επεμβατική ανίχνευση των τριών κυττάρων

in vivo

, εμείς οι ίδιοι καλούνται να ανιχνεύσουν ένα ενιαίο 4Τ1-luc2-1A4 κυττάρων μετά υποδόρια εμφύτευση. Για να εξαλειφθεί το πειραματικό σφάλμα και να προσθέσει ακρίβεια στον προσδιορισμό του αριθμού των εμφυτευμένων κυττάρων, χρησιμοποιήσαμε ένα μικροπιπέττα για να εμφυτεύσει ένα ενιαίο 4Τ1-Luc-2-1A4 κύτταρο. Πρώτον, τα κύτταρα 4Τ1-luc2-1A4 θρυψινοποιήθηκαν και επιστρώθηκαν σε ένα τρυβλίο καλλιέργειας κυττάρων. Στη συνέχεια, τα μεμονωμένα κύτταρα συνελήφθησαν και εμφυτεύεται χρησιμοποιώντας μια μικροπιπέτα στον υποδόριο υποδοχές γίνονται στις περιοχές πλευρό των ποντικών. Οι ποντικοί χωρίστηκαν σε δύο ομάδες: τέσσερα ποντίκια εμφυτεύθηκαν με απλά κύτταρα, και τέσσερις άλλοι ποντικοί εμφυτεύθηκαν με 10 κύτταρα το καθένα (Σχήμα S4C, D). Τα ζώα στη συνέχεια υποβλήθηκαν σε απεικόνιση βιοφωταύγειας αμέσως μετά την εμφύτευση. Σε ορισμένες περιπτώσεις, ήμασταν σε θέση να ανιχνεύσουν ένα ενιαίο 4Τ1-luc2-1A4 κυττάρων (Σχήμα 3Α-C και το Σχήμα S4A, Β). Σε κάθε μία από τις τρεις ανεξάρτητες, διαδοχικές εικόνες του ίδιου απλού κυττάρου εμείς κατέγραψε συνολική ροή που κυμαίνεται από 460 να 528 φωτόνια /sec. Γραμμή προφίλ αναλύσεις του εγγεγραμμένου ροής από ένα μόνο κύτταρο αποκάλυψε ένα λόγο σήματος προς υπόβαθρο της 6 προς 1, με το σήμα που προέρχεται σαφώς από την περιοχή εμφύτευσης (Σχήμα 3Δ, E). Ως εκ τούτου, κατέληξε στο συμπέρασμα ότι η βιοφωταύγειας σήμα πράγματι προέρχεται από ένα και μόνο 4Τ1-luc2-1A4 κυττάρων. Η έλλειψη σήματος από τα άλλα τρία τοποθεσίες σε κάθε ομάδα θα μπορούσε να αποδοθεί σε ταχύ θάνατο κυττάρου.

(Α-Ο) βιο-φωσφορισμού σήματος ενός ενιαίου 4Τ1-luc2-1A4 κύτταρο

in vivo

. Ένα ενιαίο κύτταρο εμφυτεύεται στην πλάτη ενός

ηυ /ηυ

ποντίκι. D-λουσιφερίνης εγχύθηκε μέσα στο ποντίκι ενδοπεριτοναϊκώς και ελήφθησαν βιοφωταυγείς εικόνες χρησιμοποιώντας ένα IVIS Spectrum (FOV? C, binning? Μικρό, στάση f? 1, χρόνος έκθεσης? 5 λεπτά). Εικόνες για την προ- και μετα-λουσιφερίνης έγχυσης που φαίνεται στο πάνελ (Α) και (Β), αντίστοιχα. Μεγεθυμένη εικόνα της διακεκομμένης περιοχής από τον πίνακα (Β) παρουσιάζεται στον πίνακα (C). Η διακεκομμένη κύκλος αντιπροσωπεύει το σήμα μόνο κύτταρο. Ο αστερίσκος (*) υποδεικνύει το σήμα υποβάθρου από το έντερο. (D, E) Γραμμή προφίλ ανάλυση του σήματος μόνο κύτταρο. Η εκπομπή φωτός παραστάθηκε γραφικά κατά μήκος της γραμμής που φαίνεται στον πίνακα (Δ). Peak σήμα στον πίνακα (Ε) αντιπροσωπεύει την εκπομπή φωτός από ένα μόνο 4Τ1-luc2-1A4 κύτταρο. (Στ) την ανάπτυξη των όγκων από πέντε 4Τ1-luc2-1A4 κύτταρα. Τα κύτταρα εμφυτεύθηκαν υποδορίως (χρήση μικροπιπέτας) στην περιοχή ραχιαία πλευρά ενός

ηυ /ηυ

ποντίκι. Bioluminescent εικόνες ελήφθησαν την πρώτη πριν από την D-λουσιφερίνης ένεση (Pre-λουσιφερίνης). Το ζώο στη συνέχεια απεικονίστηκε την ημέρα 0 έως την ημέρα 42. (G) Παρακολούθηση της ανάπτυξης του όγκου από 5 κύτταρα 4Τ1-luc2-1A4. Bioluminescent σήματα ποσοτικά με τη χρήση Ζώντας λογισμικό Image και καταγράφεται σε μετρήσεις φυσικής όγκο του όγκου από ένα παχύμετρο. Όγκος δεν ήταν προφανής μέχρι την ημέρα 27 μετά την εμφύτευση ενώ βιοφωταύγειας σήματα ανιχνεύθηκαν από την ημέρα 0. Σημείωση ότι η συνολική ροή απεικονίστηκε γραφικά σε λογαριθμική κλίμακα. (Η) την ανάπτυξη των όγκων από 10 κύτταρα 4Τ1-luc2-1A4. Τα κύτταρα εμφυτεύθηκαν υποδορίως (χρήση μικροπιπέτας) στο πίσω μέρος ενός

ηυ /ηυ

ποντίκι. Το σήμα υποβάθρου δείχνεται στο προ-D-λουσιφερίνη εικόνα ένεση (Pre-λουσιφερίνη). Η ανάπτυξη του όγκου παρακολουθήθηκε επί 40 ημέρες χρησιμοποιώντας ένα IVIS Spectrum και πάχος. (Ι) Παρακολούθηση της ανάπτυξης του όγκου από 10 κύτταρα 4Τ1-luc2-1A4. Οι όγκοι των όγκων μετρήθηκαν χρησιμοποιώντας ένα παχύμετρο και καταγράφεται σε βιοφωταυγή σήματα τα οποία προσδιορίστηκαν ποσοτικά χρησιμοποιώντας Living λογισμικό Image. Όγκος δεν ήταν προφανής μέχρι την ημέρα 29 μετά την εμφύτευση. Αντιθέτως, βιοφωταυγή σήματα ήταν διαφορετικές από την ημέρα 0 της εμφύτευσης.

Η

ανάπτυξη όγκων από μικρούς πληθυσμούς των 4Τ1-luc2 Cells

Μετά την ανίχνευση ενός μόνο κυττάρου

in vivo

, τα ποντίκια εμφυτευμένα με 1-50 κύτταρα παρακολουθούνται για παρατεταμένη χρονική περίοδο για την ανίχνευση πιθανών ανάπτυξη του όγκου. Υποθέσαμε ότι εμφύτευση του μεγαλύτερους αριθμούς κυττάρων θα παρακάμψει το πρόβλημα ότι εχθρικά περιβάλλοντα μετά την εμφύτευση παρόν σε μικρότερες αριθμούς κυττάρων. Δεδομένου ότι οι διαδικασίες εμφύτευσης ρουτίνα όγκου χρησιμοποιούν 0,5 έως 10 εκατομμύρια κύτταρα σε μοντέλα υποδόριου όγκου, δεν περιμέναμε όγκους να προκύψουν από μια τέτοια μικρό αριθμό κυττάρων. Προς έκπληξή μας, δύο ποντικοί που είχαν εμφυτευτεί με 5 και 10 κύτταρα αναπτύχθηκαν συμπαγείς όγκους. Συνεχίσαμε για την εικόνα αυτών των ποντικών, και όταν οι όγκοι έγινε προφανής, μπορούμε επίσης φυσικά μετρούμενες διαστάσεις τους με τη χρήση τυποποιημένων δαγκάνες. Οι όγκοι που προκύπτουν από την 5-κυττάρου και 10-κυττάρου εμφυτεύσεις δεν μπορούσε να ανιχνευθεί με παχύμετρο πριν από την ημέρα 27 και ημέρα 29, αντίστοιχα (Σχήμα 3G, Ι). Ωστόσο, μη επεμβατική απεικόνιση ορατού φωτός, μας επέτρεψε να ανίχνευση και την ποσοτικοποίηση φορτία όγκου συνεχώς από τη στιγμή της εμφύτευσης (Σχήμα 3F, Η). Αυτά τα δεδομένα δείχνουν σαφώς ότι η ανάπτυξη του όγκου μπορεί να παρακολουθηθεί χρησιμοποιώντας μη επεμβατική απεικόνιση βιοφωταύγειας συντομότερο κύτταρα εμφυτεύονται σε ένα ζώο, ακόμα και όταν τόσο λίγα όπως πέντε κύτταρα εμφυτεύονται.

μεταστάσεις 4Τ1-luc2-1A4 Cells σε συγγενικά ποντίκια Balb /C από την ορθοτοπική εμφύτευση στο λίπος του μαστού Pad

Για να δοκιμαστεί μεταστατικές ιδιότητες των 4Τ1-luc2-1A4 κύτταρα, εμείς ορθοτοπικά εμφυτευμένων κυττάρων αυτών σε μαστικά λιπώδη σώματα θηλυκών ηυ /ηυ ποντίκια ( 5 × 10

5 κύτταρα ανά ποντικό, η = 9). Οι πρωτογενείς όγκοι αυξήθηκαν γρήγορα και αναπτύχθηκε μεταστατικές αλλοιώσεις που θα μπορούσαν να ανιχνευθούν χρησιμοποιώντας απεικόνιση βιοφωταύγειας κατά την ημέρα 27 (Σχήμα 4). Για να επιβεβαιωθεί η μετάσταση των καρκινικών κυττάρων στους πνεύμονες, απομονώσαμε ιστούς των πνευμόνων κατά την ημέρα 27 μετά την εμφύτευση και πήραν

ex vivo

εικόνων (Σχήμα 4Β). Επιπλέον, πραγματοποιήσαμε ιστολογικές αναλύσεις σχετικά με φορμόλη-διατηρημένα, παραφίνη τομές ιστών. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι υπεζωκότα και υποϋπεζωκοτική εντόπισή περιοχές των πνευμόνων είχαν διεισδύσει με φύλλα πτωχά διαφοροποιημένα νεοπλασματικών κυττάρων καταδεικνύοντας ότι bioluminescent απεικόνισης μπορεί να ανιχνεύσει αποτελεσματικά μικρομεταστάσεων σε ένα ποντίκι (Σχήμα 4C, D). Ωστόσο, είναι δύσκολο να προβούμε σε εικασίες ακριβώς πόσα κύτταρα κατοικούσαν στα μετάσταση καρκινικών μαζών με βάση την εκπομπή φωτός εγγραφεί

in vivo

δεδομένου ότι το εκπεμπόμενο φως είναι εξασθενημένο και διάσπαρτα ανάλογα με την πορεία που παίρνει μέσα από τους ιστούς, και η ακριβής θέση αυτών των όγκων δεν έχει διευκρινιστεί.

(Α) Γυναίκα nu /nu ποντίκια εμβολιάστηκαν με 5 × 10

5 4Τ1-luc2-1A4 κυττάρων ορθοτοπικά μέσα από τους κοιλιακούς του μαστού τακάκια λίπους [1] . Bioluminescent εικόνες ελήφθησαν κατά μήκος. Κατά μετά την εμφύτευση ημέρα 27, μικρομεταστάσεις ανιχνεύθηκαν σε πνεύμονες (βέλη) (Β) Οι πνεύμονες απομονώθηκε κατά την ημέρα 27 και μετά την εμφύτευση

ex vivo

εικόνα λήφθηκε. ιστούς (C, D) Lung μονιμοποιήθηκαν σε φορμαλίνη και εγκλείστηκαν σε παραφίνη. Η &? Χρώση Ε εκτελέστηκε και αναλύθηκαν. Πίνακας D η διακεκομμένη περιοχή στον πίνακα Γ

Η

Στη συνέχεια, επιβεβαίωσε την ανίχνευση μεταστάσεων από βιοφωταύγεια μέσω φυσικών ανατομή. Δημιουργήσαμε μια δεύτερη ομάδα ποντικιών Balb /c, στου οποίου λίπος του μαστού μαξιλάρια που εμφυτεύεται 5.0 × 10

4 4Τ1-luc2-1A4 κύτταρα (n = 16). Πρωτογενή όγκοι τότε εκτομή την ημέρα μετά την εμφύτευση 10 να σταματήσει την ανάπτυξη των όγκων στο λιπώδη επιθέματα, και βιοφωταυγή εικόνες λήφθηκαν σε διάφορες μετα-εκτομή (PR) χρονικά σημεία (PR-ημέρες 5, 8, 12, 15, 19, 22). Τα στοιχεία μας έδειξαν ότι οι όγκοι με μεταστάσεις σε δευτερογενείς θέσεις στο σώμα και συνέχισαν να αναπτύσσονται εκεί (Σχήμα 5Α). Η ανάπτυξη του όγκου παρακολουθήθηκε διαμήκως ποσοτικοποιώντας σήματα βιοφωτισμός από ολόκληρο το σώμα (Σχήμα 5Β). Τα αποτελέσματα έδειξαν συνεχή αύξηση της εκπομπής φωτός πριν και μετά την εκτομή των πρωτοπαθών όγκων, επιβεβαιώνοντας ότι η παρακολούθηση σήματα βιοφωταύγεια είναι ένας ιδανικός τρόπος για να παρακολουθείτε τις μεταστάσεις των όγκων.

(Α) Μεταστάσεις του 4Τ1-luc2-1A4 όγκων σε Balb /c ποντίκια. 5,0 × 10

4 κύτταρα ορθοτοπικά εμφυτεύθηκαν σε μαστικά λιπώδη σώματα των ποντικών (n = 16) [1]. Κοιλιακή Εικόνες ελήφθησαν σε τρία χρονικά σημεία μετά την εμφύτευση (ΡΙ-ημερών: 4, 7, 8). Πρωτογενή όγκοι αποκόπηκαν σε ΡΙ-ημέρα 10 και οι εικόνες ελήφθησαν και πάλι σε διάφορα χρονικά σημεία μετά την εκτομή (PR-ημερών: 5, 8, 12, 15, 19, 22). Τα δύο αντιπροσωπευτικά ποντίκια (C1M2 και C4M4) εμφανίζονται. Η φαινομενική μείωση των σημάτων βιοφωταύγεια στο PR-12η ημέρα οφείλεται στην αναπροσαρμογή της κλίμακας χρώματος γραμμή (βλέπε πίνακα Β). Πρωτογενής όγκου χρονικό σημείο εκτομή υποδεικνύεται από την κόκκινη γραμμή που χωρίζει τις εικόνες πριν και pot-εκτομή. (Β) Οικόπεδα σημάτων βιοφωτισμός έναντι του χρόνου για τα ποντίκια C1M2 και C4M4. Ολόκληρο σήματα σώμα βιοφωτισμός ποντικών C1M2 (μπλε γραμμές) και C4M4 (πορτοκαλί γραμμές) ποσοτικοποιήθηκαν και απεικονίζονται σε μια λογαριθμική κλίμακα. Οι ποσοτικοποιήσεις των σημάτων βιοφωτισμού πριν και μετά την εκτομή των πρωτοπαθών όγκων δείχνονται.

Η

Συζήτηση

ξενομεταμόσχευση λουσιφεράσης-επισημασμένου καρκινικά κύτταρα είναι ευρέως αποδεκτή σε μοντέλα μετάστασης και σε ορθοτοπική μοντέλα. Όπως συζητήθηκε παραπάνω, απεικόνιση βιοφωταύγειας λουσιφεράσης-επισημασμένου καρκινικά κύτταρα έχει το πρόσθετο πλεονέκτημα σε σχέση με τις παραδοσιακές μεθόδους εκτίμησης φορτίου όγκου κατά το ότι επιτρέπει μη επεμβατική ανίχνευση και ποσοτικοποίηση των όγκων σε ζώντα ζώα ως μέσο αξιολόγησης της αποτελεσματικότητας φαρμάκου [21], [22 ], [23]. Παρά το γεγονός ότι οι ιστοί συνεισφέρουν κανονικά λίγο υπόβαθρο στην απεικόνιση βιοφωταύγειας, αυξάνοντας την εκπομπή φωτός από τα κύτταρα του ενδιαφέροντος είναι πάντοτε επιθυμητή, δεδομένου ότι βελτιώνει την ευαισθησία της ανίχνευσης καρκινικών κυττάρων. Αυξημένη ευαισθησία επιτρέπει μικρότερους αριθμούς κυττάρων όγκου που υπάρχουν στα πρώτα στάδια της εξέλιξης του όγκου που πρόκειται να ανιχνευθεί. Αυτό έχει θεωρητικά σημαντική κλινική σημασία δεδομένου ότι η έγκαιρη διάγνωση, σε συνδυασμό με την έγκαιρη θεραπεία, έχει συσχετιστεί με καλύτερη πρόγνωση. Τα εργαλεία που περιγράφονται εδώ επιτρέπουν σε κάποιον να συγκρίνει την αποτελεσματικότητα ενός δεδομένου φαρμακολογική παρέμβαση σε πρώιμο στάδιο πρωτοπαθείς όγκους, πρωτοπαθείς όγκους προχωρημένο στάδιο, και μεταστάσεις.

Εδώ αναφέρουμε την ανάπτυξη ενός λαμπρού 4Τ1-luc2 κυτταρική σειρά χρησιμοποιώντας ενισχυμένη λουσιφεράσης (

luc2

) και λεντοϊού τεχνολογίας. Στην προσπάθειά μας για την ανίχνευση μικρών αριθμών κυττάρων, χρησιμοποιήσαμε αρχικά μια μέθοδο σειριακή αραίωση και θα μπορούσε να ανιχνεύσει τα κάτω έως 3 κύτταρα

in vivo

. Ενθαρρυμένοι από αυτά τα αποτελέσματα, εμείς οι ίδιοι καλούνται να ανιχνεύσει ένα μόνο κύτταρο 4Τ1-luc2-1A4 μετά την υποδόρια εμφύτευση μέσω μικροέγχυσης. Επειδή το σήμα από ένα κύτταρο βρισκόταν σε εγγύτητα με το έντερο, η οποία επιδεικνύει ένα εγγενές, έστω και μεταβλητή αυτόματη βιοφωταύγεια, εικόνες μας μεμονωμένων κύτταρα περιέχουν και τα δύο, σήματα από το κύτταρο, καθώς και φόντο από το έντερο (Σχήμα 3Β). Ωστόσο, όπως φαίνεται στις εικόνες του 5- και 10- κύτταρα, όταν οι αριθμοί των κυττάρων αυξήθηκε, τα σήματα από τα κύτταρα ξεπέρασαν γρήγορα τα σήματα υποβάθρου από το έντερο. Κατά τη διάρκεια της προετοιμασίας αυτού του χειρογράφου, ο Ραμπίνοβιτς

et al

. έδειξε την ανίχνευση τριών μηχανικής ποντικού Τ λεμφοκύτταρα

in vivo

σε υποδόρια μεταμόσχευση [24]. Αν και η εφαρμογή του κομψό σύστημα που περιγράφεται από Ραμπίνοβιτς

et al

. αναπτύχθηκε για να επιτευχθεί αποτελεσματική μεταγωγής για ένα συγκεκριμένο υπότυπο κύτταρο, έχουμε μηχανικής μια απλή, καθολική διάνυσμα για τη μεταγωγή διαφόρων τύπων πολλαπλασιαζόμενα και μη πολλαπλασιαζόμενα κύτταρα. Επιπλέον, στο καλύτερο της γνώσης μας, η έκθεσή μας είναι η πρώτη που δείχνει την ανίχνευση ενός μόνο βιοφωταυγούς καρκινικών κυττάρων

in vivo

.

Επειδή υψηλό επίπεδο έκφρασης λουσιφεράσης αυξάνει την ευαισθησία των κυττάρων ανίχνευση σε ζώντα ζώα, αυτή η τεχνολογία μπορεί να εφαρμοστεί απευθείας σε πρωτογενές κύτταρο και βλαστικών κυττάρων ανίχνευση

in vivo

, συμπεριλαμβανομένου του καρκίνου βλαστικών κυττάρων [25], [26], [27]. Η τεχνολογία φακοϊού μπορεί ενδεχομένως να αποδειχθούν χρήσιμοι για βλαστικά κύτταρα επισήμανση δεδομένου ότι μπορεί να μειωθεί σημαντικά το χειρισμό και την καλλιέργεια αυτών των κυττάρων. Τα αποτελέσματά μας έδειξαν ότι τόσο λίγα όσο 5 και 10 κύτταρα μπορούν να αναπτυχθούν και οι όγκοι μορφή στα ζώα. Οι όγκοι αυτοί μπορεί να παρακολουθείται χρησιμοποιώντας απεικόνιση βιοφωτισμός από την ημέρα της εμφύτευσης. Προηγουμένως, τα κύτταρα 4Τ1 μετασχηματίστηκαν με λουσιφεράση και μεταστάσεις όγκου τους οπτικοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας οπτική απεικόνιση [28]. Ενώ αυτή η μελέτη έδειξε μη επεμβατική παρακολούθηση της μεταστάσεων όγκων, η παρούσα μελέτη επιτρέπει την έγκαιρη ανίχνευση μεταστάσεων του όγκου, και επιτρέπει μετά την διαδικασία σχηματισμού όγκου δεξιά από την εμφύτευση κυττάρων (Ημέρα 0 έναντι 6 εβδομάδες). Επιπλέον, τα αποτελέσματα μας δείχνουν ότι η επισήμανση και παρακολούθηση των καρκίνων αυξάνεται από ένα μόνο καρκίνο βλαστικών κυττάρων είναι εφικτό. Επιπλέον, η τεχνολογία αυτή θα μπορούσε επίσης να εφαρμοστεί γενικότερα να ακολουθήσει την μοίρα ενός μόνο βλαστοκύτταρο εμφυτευτεί σε ένα ζώο. Επιπλέον, η διαδικασία της διαλογής φαρμάκων είτε για μικρά μόρια ή βιολογικών που στοχεύουν καρκινικά βλαστικά κύτταρα μπορεί να επισπευσθεί σημαντικά από βιοφωταύγεια επιτρέπει ακόλουθη ανάπτυξη των όγκων

in vivo

εβδομάδες πριν γίνει ψηλαφητή.

Έντονα φωταύγειας κύτταρα παρέχουν επίσης ένα καλύτερο μέσο ανίχνευσης μικρομεταστάσεων σε ένα ζώο, καθιστώντας έτσι τα μοντέλα μετάστασης πιο ακριβή και επιτρέποντας μοντέλα πρόβλεψης που θα χρησιμοποιηθεί για την αξιολόγηση των υποψήφιων φαρμάκων που στοχεύουν στην καταπολέμηση της μετάστασης. Όταν 4Τ1-luc2-1A4 κύτταρα εμφυτεύθηκαν σε συγγενή ποντίκια Balb /c, ήμασταν σε θέση να ανιχνεύει τις πολλαπλές μικρομεταστάσεων σε δευτερογενείς θέσεις. Όταν πρωτογενείς όγκοι αφαιρέθηκαν χειρουργικά στους 27 ημέρες μετά την εμφύτευση, θα μπορούσαμε να ακολουθήσουμε την ανάπτυξη των μικρών, μεταστατικών όγκων σε απουσία του εξουσιάζοντας σήματος από τον πρωτογενή όγκο. Φωτεινότερη κύτταρα μπορεί να μειώσει το χρόνο και την προσπάθεια που απαιτείται για τον εντοπισμό μάζες όγκου σε ένα ζώο και μπορεί επίσης να είναι πολύτιμη για τη μελέτη μικροπεριβάλλοντα όγκων, ιδιαίτερα όταν συνδυάζονται με άλλες μη επεμβατικές αναγνώσεις φθορισμού που βασίζεται.

Μέχρι σήμερα, έχουμε επισημασμένο πάνω από δώδεκα κυτταρικές σειρές όγκων ανθρώπου και ποντικού με τη χρήση του περιγράφεται βραδέος ιού σύστημα (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Όλα τα επισημασμένα κυτταρικές γραμμές έδειξαν σημαντικά υψηλότερη έκφραση λουσιφεράσης σε σύγκριση με τις κυτταρικές γραμμές σημάνθηκαν με προηγούμενης γενιάς λουσιφεράσης και συμβατικές μεθόδους διαμόλυνσης (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Ένα άλλο πλεονέκτημα αυτών των προσφάτως κατασκευασμένες κυτταρικές σειρές είναι ότι δεν επιλογή αντιβιοτικού για να διατηρηθεί σταθερή έκφραση λουσιφεράσης. Σε αντίθεση με τις δημοφιλείς υποκινητές ιών όπως SV40 ή CMV, προαγωγέα ανθρώπινη ουβικιτίνη C είναι πιο ανθεκτικά σε γονιδιακή σίγηση σε κύτταρα θηλαστικών [29]. Έχουμε χρησιμοποιήσει την τεχνολογία μας για την επισήμανση επιτυχώς προσκολλημένα, καθώς κυτταρικό εναιώρημα γραμμές, και πιστεύουμε ότι αποτελεί ένα καθολικό εργαλείο για την αποτελεσματική εισαγωγή της λουσιφεράσης σε σχεδόν κάθε κύτταρο. Δεδομένου ότι οι φορείς λεντοϊών μπορεί να εισάγει γονίδια ενδιαφέροντος σε διαίρεση, καθώς και μη-διαιρούμενα κύτταρα, η τεχνολογία μας μπορεί να εφαρμοστεί εύκολα για την επισήμανση όχι μόνο τα βλαστικά κύτταρα, αλλά πρακτικά οποιαδήποτε κύτταρα που προέρχονται από ασθενείς, οι οποίες στη συνέχεια μπορούν να χρησιμοποιηθούν για την έρευνα ή για διαγνωστικούς σκοπούς.

Υλικά και Μέθοδοι

Δημιουργία φορέας λεντοϊού

Ενισχυμένη λουσιφεράσης 2 (

luc2

) cDNA ήταν από το φορέα pGL4.20 (Promega, WI ) [16]. Λουσιφεράσης 2 cDNA αποκόπηκε με Hind III & amp? Xba Ι και συνδέθηκε σε φορέα pUB6-V5-HisB (Invitrogen, CA). Ένα θραύσμα που παράγεται από Bgl II και BstB Ι πέψη του pUB6-luc2 συνδέθηκε σε έναν τροποποιημένο φορέα pLPCX (Clontech, CA). Ένας φορέας λεντοϊού που φέρει ανθρώπινο υποκινητή της ουβικιτίνης C και luc2 cDNA δημιουργήθηκε με εισαγωγή Bgl II & amp? EcoR Ι θραύσμα από παραπάνω κατασκευάσματος σε Bcl Ι & amp? EcoR Ι του τροποποιημένου φορέα pLKO.1 (Sigma-Aldrich, ΜΟ) [18], [19].

Cell Culture

μαστού ποντικού κυτταρική γραμμή όγκου αδένα 4Τ1 ελήφθη από την ATCC (Manassas, VA). Τα κύτταρα αναπτύχθηκαν σε υψηλής γλυκόζης μέσο RPMI 1640 (ΑΤΟΟ). κύτταρα PC-3M-Luc-C6 αναπτύχθηκαν σε ελάχιστο βασικό μέσο (ATCC) (Για συμπληρωματικά στοιχεία) [30]. Όλα τα μέσα συμπληρώθηκαν με 10% εμβρυϊκό βόειο ορό (Hyclone, UT) χωρίς αντιβιοτικά. Καμπύλες ανάπτυξης δημιουργήθηκαν με σπορά 50.000 κυττάρων σε φιάλες Τ25. Σε κάθε χρονικό σημείο, τα κύτταρα θρυψινοποιήθηκαν και μετρήθηκαν χρησιμοποιώντας ένα αυτόματο απαριθμητή κυττάρων (Nexcelom, ΜΑ).