Αφηρημένο

Ιστορικό

Devil προσώπου Όγκων Νόσων (DFTD) είναι μια μοναδική κλωνική καρκίνου που απειλεί το μεγαλύτερο σαρκοφάγο μαρσιποφόρο του κόσμου, το Τασμανίας διάβολος (

Sarcophilus harrisii

) με εξαφάνιση. Αυτή η μεταδοτική καρκίνο διέρχεται μεταξύ των επιμέρους διάβολοι από την εμφύτευση των κυττάρων κατά τη διάρκεια των κοινωνικών αλληλεπιδράσεων. Ο όγκος προέκυψε σε ένα κύτταρο Schwann ενός ενιαίου διαβόλου πάνω από 15 χρόνια και από τότε έχει επεκταθεί κλωνική, χωρίς να δείχνει σημάδια κυτταρική γήρανση? σε πλήρη αντίθεση με ένα σωματικό κύτταρο που εμφανίζει μια πεπερασμένη ικανότητα για την αντιγραφή, γνωστή ως «όριο Hayflick».

Μεθοδολογία /Κύρια Ευρήματα

Στην παρούσα μελέτη διερευνούμε το ρόλο του μήκους των τελομερών , μετρούμενη ως τελομερούς Number αντιγραφής (TCN), και η έκφραση της τελομεράσης και shelterin γονιδίου, καθώς και τη δράση της τελομεράσης στην διατήρηση υπερπολλαπλασιασμό κυττάρων Devil όγκου προσώπου (DFT). Τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι τα κύτταρα DFT έχουν σύντομη τελομερή. DFTD υπήκοοι τρίτων χωρών δεν διαφέρουν μεταξύ γεωγραφικών περιοχών ή μεταξύ των στελεχών. Ωστόσο, υπήκοος τρίτης χώρας έχει αυξηθεί την πάροδο του χρόνου. πολλαπλασιασμός Απεριόριστα κυττάρων είναι πιθανό να έχουν επιτευχθεί μέσω της παρατηρούμενης πάνω ρύθμιση της καταλυτικής υπομονάδας τελομεράσης (

TERT

) και ταυτόχρονη ενεργοποίηση των τελομεράσης. Up-ρύθμιση του κεντρικού στοιχείου της shelterin, η

TRF1

-intercating πυρηνικού παράγοντα 2 (

TINF2

) παρέχει DFT ένα μηχανισμό για την ομοιόσταση του μήκους των τελομερών. Η υψηλότερη έκφραση και των δύο

TERT

και

TINF2

μπορεί επίσης να προστατεύουν τα κύτταρα DFT από γενωμική αστάθεια και την ενίσχυση του πολλαπλασιασμού των όγκων.

Συμπεράσματα /Σημασία

κύτταρα DFT φαίνεται να παρακολουθεί και να ρυθμίζει το μήκος των επιμέρους τελομερών: τα δηλαδή μικρότερη τελομερή επιμηκύνονται με αυξητική ρύθμιση των γονιδίων τελομεράσης που σχετίζονται με? Οι πλέον τελομερή προστατεύονται από περαιτέρω επιμήκυνση από τα μέλη του συγκροτήματος shelterin, η οποία μπορεί να εξηγήσει την έλλειψη χωροταξικού και στέλεχος διακύμανση DFT αριθμό αντιγράφων των τελομερών. Η παρατηρούμενη κατά μήκος αύξηση στην έκφραση του γονιδίου σε δείγματα ιστού DFT και τη δράση της τελομεράσης σε κυτταρικές γραμμές DFT μπορεί να υποδεικνύουν μία επιλογή για πιο σταθερή όγκων με υψηλότερα πολλαπλασιαστικού δυναμικού

Παράθεση:. Ujvari Β, Pearse ΑΜ, Taylor R, S Pyecroft , Flanagan C, Gombert S, et al. (2012) τελομερούς Dynamics και της ομοιόστασης σε ένα Καρκίνο μεταδοτικές. PLoS ONE 7 (8): e44085. doi: 10.1371 /journal.pone.0044085

Επιμέλεια: Gabriele Saretzki, Πανεπιστήμιο του Νιούκαστλ, Ηνωμένο Βασίλειο

Ελήφθη: 14, Ιανουαρίου, 2012? Αποδεκτές: 31 Ιούλη του 2012? Δημοσιεύθηκε: 29, Αυγ, 2012

Copyright: © Ujvari et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτή η έρευνα χρηματοδοτήθηκε από το Ταμείο Eric Guiler (Αποθηκεύστε το Τασμανίας διάβολος προσφυγών): https://www.tassiedevil.com.au/tasdevil.nsf/Grants- -scholarships/F3F98304778C800ECA2576CB007D1E6B, και το Αυστραλιανό Συμβούλιο Έρευνας: https://www.arc.gov.au/. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

το μεγαλύτερο σαρκοφάγο μαρσιποφόρο στον κόσμο, ο διάβολος της Τασμανίας (

Sarcophilus harrisii

) έχει γίνει πρόσφατα απειλείται με εξαφάνιση λόγω της μοναδικής μεταδοτικών καρκίνο, ασθένεια όγκων προσώπου των δαιμόνων (DFTD) [1], [ ,,,0],2], [3]. Πριν από την εμφάνιση της νόσου, οι διάβολοι ήταν κοινή σε όλη την Τασμανία. Ωστόσο, από την πρώτη παρατήρηση του DFTD το 1996, η ασθένεια έχει εξαπλωθεί σε ολόκληρη την πολιτεία νησί, με αποτέλεσμα πληθυσμός μειώνεται έως και 90 [3]%. Η νόσος εμφανίζεται τώρα σε πάνω από το 80% της γεωγραφικής σειρά του διαβόλου, και η ταχεία μείωση του πληθυσμού οδήγησε στην διάβολος της Τασμανίας που αναφέρονται ως απειλούμενα από διεθνείς (Διεθνής Ένωση για τη Διατήρηση της Φύσης [4]), καθώς και των εθνικών και κρατικών αρχών [ ,,,0],5].

DFTD μεταδίδεται μεταξύ των ατόμων από το δάγκωμα κατά τη διάρκεια των κοινωνικών αλληλεπιδράσεων [6] και εκδηλώνεται στο ακαθάριστο κακοήθεις όγκους γύρω από τη στοματική κοιλότητα, με συχνές μεταστάσεις σε άλλα όργανα [7], [8]. Λόγω της πείνας, δευτερογενείς λοιμώξεις και τις αποτυχίες των οργάνων, διάβολοι συνήθως υποκύπτουν στην ασθένεια εντός 6 μηνών από την εμφάνιση όγκων [1], [7]. Κυτταρογενετική αναλύσεις αποκάλυψαν ότι DFTD προκαλείται από ένα απατεώνων κλωνική κυτταρική γραμμή [9], που είναι πιθανόν προέρχεται από κύτταρα της νευρικής ακρολοφίας γράμμωσης (κύτταρα Schwann) [8], [10]. Αν και DFTD διαθέτει ένα εξαιρετικά αναδιατάχθηκαν γονιδίωμα, και χαρακτηρίζεται από νεοπλασματικά ειδικό σύμπλοκο μετατοπίσεις και χρωμοσωματικών αναδιατάξεων, η κυτταρική γραμμή είναι αξιοσημείωτα (χρωμόσωμα) σταθερούς [9]. Πρόσφατα, ωστόσο, τέσσερις, στενά συνδεδεμένα αλλά έχουν διακριτές καρυοτυπικά στελέχη DFT έχουν ταυτοποιηθεί, γεγονός που υποδηλώνει ότι ο όγκος εξελίσσεται [11], [12]. Παρά τις τέσσερις ξεχωριστές DFT στελέχη, γενετικές μελέτες χρησιμοποιώντας μικροδορυφόρων και ανοσο-γονίδιο δείκτες απέδειξαν ότι Devil Όγκων Προσώπου κύτταρα (DFT) είναι γενετικά ταυτόσημα [10], [13], [14], [15].

από την εμφάνισή τους το 1996 [9] κύτταρα DFT έχουν υποστεί τη συνεχή διαίρεση και πολλαπλασιασμό σε χιλιάδες διάβολοι χωρίς να εξαντλήσουμε την ικανότητά τους για αναπαραγωγή και να θέτει σε κίνδυνο την γονιδιωματική τους σταθερότητα. Αντίθετα, κανονικά ανθρώπινα σωματικά κύτταρα εμφανίζουν έναν πεπερασμένο ικανότητα για αναδιπλασιασμό, γνωστή ως «όριο Hayflick» [16]. Δηλαδή, μετά από ένα δεδομένο αριθμό διαιρέσεων, τα κύτταρα εξαντλούν δυναμικό αντιγραφής τους λόγω συντομευμένη τελομερή και εισάγετε μια κατάσταση γνωστή ως κυτταρική γήρανση. Σε υπερπολλαπλασιαστικές ασθένειες, όπως η ογκογένεση, όταν τελομερών φθοράς φτάσει σε κρίσιμο επίπεδο, τα κύτταρα εισέρχονται σε ένα στάδιο της σύλληψης της ανάπτυξης αναφέρονται ως «κρίση» [17], [18], [19]. Με up-ρύθμιση ή την επανενεργοποίηση του τελομερών ένζυμο τερματική τρανσφεράση (τελομεράση), τα καρκινικά κύτταρα είναι σε θέση να βγει από την «κρίση» κατάσταση και να διατηρήσουν τελομερή που είναι ελαφρώς μεγαλύτερο από ό, τι εκείνα που παρατηρήθηκαν κατά τη διάρκεια της «κρίσης» [17], [20].

τα τελομερή είναι ριβονουκλεοπρωτεΐνης σύμπλοκα στα άκρα των ευκαρυωτικών χρωμοσωμάτων απαραίτητη για τη ρύθμιση των κυττάρων διάρκεια ζωής [18]. κύριες λειτουργίες τους είναι να διασφαλιστεί η σωστή διαχωρισμό των χρωμοσωμάτων κατά τη διάρκεια της μίτωσης, και για την πρόληψη της σύντηξης των χρωμοσωμάτων και την ταυτόχρονη αναστολή του κυτταρικού κύκλου, που προκαλείται από το τέλος των χρωμοσωμάτων που αντιμετωπίζονται ως DNA διπλό σκέλος διαλείμματα [21]. Στα σπονδυλωτά, συμπεριλαμβανομένων Τασμανίας διάβολοι, τελομερή αποτελούνται από μεταβλητούς αριθμούς διδύμων επαναλήψεων (νουκλεοτίδια TTAGGG) δεσμεύεται από έναν εξειδικευμένο πολυπρωτεϊνικό σύμπλεγμα γνωστό ως shelterin [22], [23]. Τελομερούς ομοιόσταση μήκος σε βλαστικής γραμμής και καρκινικά κύτταρα επιτυγχάνεται μέσω της αρνητικής ανάδρασης του βρόγχου του συγκροτήματος shelterin και τελομερών ένζυμο τερματική τρανσφεράση [24]. Η τελομεράση είναι ενεργοποιημένη στο πολυδύναμα εμβρυϊκά και ενήλικα βλαστικά κύτταρα, για να συλλάβει την προοδευτική φθορά των τελομερών μέσω της προσθήκης ΤΤΑΟΟΟ επαναλαμβάνει στο 3 ‘σκέλος των χρωμοσωμάτων [24]. Οι περισσότερες κυτταρικές σειρές ανθρώπινων όγκων έχουν σταθερές ρυθμίσεις των τελομερών, τα οποία επιτυγχάνονται με την αρνητική ρύθμιση της τελομεράσης από το σύμπλοκο shelterin [25]. Το συγκρότημα shelterin αποτελείται από τρεις υπομονάδες shelterin:

TRF1, trf2

και

POT1

, τα οποία συνδέονται μεταξύ τους με τρεις επιπλέον πρωτεΐνες

TPP1, RAP1

και

TINF2

.

TINF2

(

TRF1

-interacting πυρηνικού παράγοντα 2, ή που ονομάζεται επίσης

TRF1

-Interacting Πυρηνική πρωτεΐνη 2 (

TIN2

)) κατέχει κεντρική θέση στο συγκρότημα πρωτεΐνη, παρέχοντας μια γέφυρα μεταξύ των υποσυνιστωσών του shelterin (για ανασκόπηση βλέπε [26]). Έχει αποδειχθεί ότι η χαμηλή έκφραση του

TINF2

έχει αποσταθεροποιητική επίδραση στην shelterin [27], [28]. Χάρη στην κεντρική και κρίσιμο ρόλο του

TINF2

»(

TIN2

) στη σταθερότητα shelterin επιλέξαμε να μετρηθεί η έκφραση του γονιδίου αυτού, ως πληρεξούσιος της δραστηριότητας shelterin.

Η συσσώρευση shelterin κατά μήκος της συστοιχίας τελομερή επαναλαμβανόμενη αποτρέπει την περαιτέρω τελομεράσης που προκαλείται επιμήκυνση των τελομερών [23]. Ανθρώπινα μελέτες για τον καρκίνο έχουν δείξει ότι η από κοινού προς τα πάνω ρύθμιση της έκφρασης της τελομεράσης και τα γονίδια του συμπλόκου shelterin μπορεί να διευκολύνει τη σταθεροποίηση των καρκινικών κυττάρων, εμποδίζοντας την ενεργοποίηση των αποκρίσεων βλάβης του DNA, όπως απόπτωση [27]. Σε περίπου 85% των ανθρώπινων καρκίνων, δραστικότητα τελομεράσης έχει αποδειχθεί ότι διευκολύνει την κακοήθη εξαλλαγή διατηρώντας δυναμικό αντιγραφής [29], [30]. Στο υπόλοιπο 10-15% των καρκίνων, την πρόληψη της απώλειας των τελομερών επιτυγχάνεται με την απουσία της δράσης της τελομεράσης, μέσω ενός μηχανισμού ανασυνδυασμού με μεσολάβηση μεταγωγής πρότυπο γνωστό ως εναλλακτική λύση επιμήκυνση των τελομερών (ALT) [31]. Ως εκ τούτου, τα καρκινικά κύτταρα είναι σε θέση να ξεφύγουν από την απόπτωση και ως εκ τούτου διατηρούν άπειρη ικανότητα αναπαραγωγής.

Η κυτταρική σειρά DFTD έχει συνεχώς τη διαίρεση και την προσαρμογή στο μικροπεριβάλλον του κάθε διαφορετικού υποδοχής για πάνω από 15 χρόνια. Ως εκ τούτου, αυτή η κλωνική μεταδιδόμενη ασθένεια παρέχει μια άνευ προηγουμένου ευκαιρία να μελετήσει την εξέλιξη των κυττάρων του καρκίνου και την εξέλιξη

in vivo

. Αυξημένη γνώση της ομοιόστασης των τελομερών σε αυτό το μεταδοτικών καρκίνος μπορεί να δώσει νέες ιδέες για το πώς DFT κύτταρα επιτευχθεί και να διατηρηθεί υπερπολλαπλασιαστική τις δυνατότητές τους και μπορεί να μας βοηθήσει να κατανοήσουμε την προέλευση, σωματικά εξέλιξη και εξαιρετική επιτυχία αυτής της παρασιτικής κλωνική γενεαλογία. Επιπλέον, τόσο

TERT

και

TINF2

έχουν προταθεί ως πιθανοί θεραπευτικοί στόχοι σε ανθρώπινο καρκίνο [32], [33] και αυξάνοντας την κατανόηση του ρόλου αυτών των γονιδίων σε Devil προσώπου Όγκων Νόσων μπορεί να ανοίξει νέες προοπτικές για τη θεραπεία της νόσου.

στην παρούσα μελέτη επικεντρώθηκε στο ρόλο του μήκους των τελομερών, ποσοτικά ως Αριθμοί τελομερούς Αντιγραφή (εφεξής TCN) σε υπερπλασία των δειγμάτων DFT. Ως εκπροσώπους τους για τη δράση της τελομεράσης σε δείγματα καρκινικού ιστού μελετήσαμε την έκφραση της καταλυτικής υπομονάδας τελομεράσης (

TERT

) και ένα από τα κύρια συστατικά της shelterin, η

TRF1

-intercating πυρηνικού παράγοντα 2 (

TINF2

). Επιπλέον, χρονικές μεταβολές στη δράση της τελομεράσης ήταν ποσοτικά σε πέντε κυτταρικές σειρές DFT.

Αποτελέσματα

(α) το μήκος των τελομερών Κομμάτι περιορισμού αναλύει

τελομερούς θραύσμα περιορισμού (TRF) μήκους ήταν αναλύθηκαν σε δύο πρωτογενείς και metastastatic όγκων, καθώς και δείγματα σπλήνας από τέσσερα Τασμανίας διάβολοι (συνολικά 12 δείγματα). Ήμασταν σε θέση να ορίσετε το μήκος των τελομερών σε όλα τα 12 δείγματα ως περιοριστική πέψη παράγονται αρκετές επαναλαμβανόμενες TRF-κηλίδες σε διάφορα μήκη (που κυμαίνονται από Να επιλεκτικές δυνάμεις διατήρηση της ισορροπίας του μήκους των τελομερών ή να επιλέξετε για τα καρκινικά κύτταρα με τη μεγαλύτερη τελομερή; Θα αυξηθεί

TERT

,

TINF2

γονιδιακής έκφρασης, η δραστηριότητα της τελομεράσης και πλέον τελομερή να οδηγήσει στην ανάπτυξη μιας πιο σταθερή μορφή DFT με μεγαλύτερη ανάπτυξη και πολλαπλασιαστικού δυναμικού;

Από της η πρώτη εμφάνιση πριν από 15 χρόνια, DFTD έχει περάσει μέσα από χιλιάδες διάβολοι, σκοτώνοντας σχεδόν το 80% των ζώων, χωρίς να υποστούν την κυτταρική γήρανση. DFTD αποτελεί, συνεπώς, ένα από τα παλαιότερα φυσικά ζουν, και συνεχώς περάστηκαν κυτταρικές σειρές στη φύση. Έχουμε δείξει ότι η δυναμική αλληλεπίδραση μεταξύ του συμπλόκου τελομεράσης και shelterin είναι απαραίτητη για την επιτυχία αυτής της παρασιτικής, μεταδοτικής καρκίνο. Επιλογή προώθησε την εξέλιξη των κυττάρων DFT με αυξημένο αριθμό τελομερών αντίγραφο καθώς και η αυξημένη γονιδιακή έκφραση και δράση της τελομεράσης, τα οποία μπορεί τελικά να οδηγήσει σε ταχύτερη αναπτυσσόμενο όγκο. DFTD παρέχει ένα ισχυρό πρότυπο σύστημα για την κατανόηση ογκογένεσης όχι μόνο στην άγρια ​​πανίδα, αλλά και σε ανθρώπινους καρκίνους. Περαιτέρω μελέτες επικεντρώνονται στην κατανόηση της ακριβής μηχανισμός της συντήρησης των τελομερών και της ρύθμισης στα κύτταρα DFT θα οδηγήσει σε καλύτερη κατανόηση της εξελικτικής στρατηγικών και μηχανισμών που διέπουν και τη διατήρηση της απεριόριστης πολλαπλασιαστικού δυναμικού των καρκινικών κυττάρων.

Υλικά και Μέθοδοι

(α) δείγματα

δείγματα ιστών συλλέχθηκαν από 17 τοποθεσίες σε όλη την Τασμανία (Bothwell, Bronte Park, Buckland, Fentonbury, Forestier, Freycinet, Hamilton, Mt William, Narawntapu, Railton, Ravenswood, Reedy Marsh, Sorell, St. Marys, Weegena, Wisedale και Δυτική Pencil Pine, Σχήμα 1) από τα μέλη του Παιδαγωγικού Τμήματος Δημοτικής Βιομηχανιών, πάρκα, Νερό και το Περιβάλλον (DPIPWE) από ευθανασία DFTD επηρεάζονται διάβολοι και αποθηκεύονται στα Εργαστήρια Υγεία των ζώων (DPIPWE) . Η έρευνα διεξήχθη με την έγκριση από την DPIPWE (Παιδαγωγικό Τμήμα Δημοτικής Βιομηχανιών, πάρκα, Νερό και Περιβάλλον, Τασμανία) ζώο ηθική comitte, των ζώων Δεοντολογίας No: 101 2010/11. Λάβαμε δείγματα ιστού από 48 διαβόλους. Είχαμε πρόσβαση σε σπλήνα και πρωτογενή όγκο, καθώς και δείγματα μετάσταση από τέσσερα διαβόλους. 51 πρωτογενείς όγκους, πέντε μεταστάσεις, τέσσερα και πέντε πνεύμονα δειγμάτων DNA σπλήνα χρησιμοποιήθηκαν στις αναλύσεις (Σχήμα 2).

Προκειμένου να διερευνηθεί η γεωγραφική /χωρική διακύμανση στον αριθμό αντιγράφων των τελομερών, τα δείγματα χωρίστηκαν σε τρεις γεωγραφικές περιφέρειες (Ανατολική = διανομής πριν από το 2003, Κεντρική = κατανομή μεταξύ 2003-2005 και βορειοδυτική = κατανομή μεταξύ 2005-2007) με βάση τη χρονική /χωρική εξέλιξη της DFTD σε όλη την Τασμανία [40]. Είχαμε πληροφορίες για τα συγκεκριμένα στελέχη των 45 δείγματα όγκων και να χρησιμοποιηθούν αυτά τα δείγματα για τη διερεύνηση αντίγραφο των τελομερών διακύμανση αριθμός μεταξύ στελεχών DFT.

Χρονική διακύμανση στα ποσοστά φθοράς των τελομερών βασίστηκε σε αριθμό αντιγράφων που παρατηρήθηκε σε δείγματα που συλλέχθηκαν το 2006, το 2007 , και το 2010 (Ν = 51). Λόγω των διαδικασιών συλλογής δειγμάτων ήμασταν σε θέση να εξάγει RNA από πέντε σπλήνα και 11 (5 από το 2007 και 6 το 2010) δείγματα πρωτογενούς όγκου τα οποία στη συνέχεια αναλύθηκαν με την ποσοτική Real-Time PCR μόνο. ​​

Η δράση της τελομεράσης δοκιμασίες διεξήχθησαν επί πέντε λύθηκαν DFT δείγματα κυτταρική γραμμή που λαμβάνεται από DPIPWE. κυτταρικές γραμμές όγκου δημιουργήθηκαν και διατηρήθηκαν στους DPIPWE σύμφωνα με τις περιγραφές του Pearse et al 2012 [11]. Οι πέντε κυτταρικές σειρές που προέρχονται από δείγματα όγκων που συλλέγονται κατά το 2003, 2006, 2007, 2010 και 2011.

(β) η εκχύλιση του DNA, οι μετρήσεις των τελομερών μήκους θραύσματος και αντίγραφο των τελομερών αριθμό ποσοτικοποίηση

Γονιδιακό DNA απομονώθηκε από δείγματα ιστού με εκχύλιση φαινόλης-χλωροφορμίου. Δείγμα ποσότητα και την ποιότητα του DNA μετρήθηκε χρησιμοποιώντας ένα NanoDrop Φασματοφωτόμετρο (NanoDrop Technologies, Wilmington, DE).

(γ) αναλύει τελομερούς περιορισμού μήκους θραύσματος (TRFL)

τελομερούς θραύσμα περιορισμού (TRF) μήκους ποσοτικοποιήθηκε με υβριδισμό κηλίδας Southern ακολουθώντας το πρωτόκολλο που περιγράφεται στο Telo TAGGG TL Assay Kit (Roche, Indianapolis, ΙΝ), με τη χρήση σταθερής ηλεκτροφόρηση πεδίου. Μετά πέψη γονιδιωματικού DNA με ένα μίγμα

Hinf

Ι και

Rsa

Ι ένζυμα περιορισμού για να απομακρυνθεί αλληλουχία-ποικιλόμορφη DNA από το κεντρομερές πλευρά των τελομερών, το μήκος των τελομερών αναλύθηκε σε πηκτώματα αγαρόζης, η οποία έτρεξαν για 4 ώρες σε 5 V /cm. Τα θραύσματα TRF σημάνθηκαν με σημασμένο ανιχνευτή digoxigen, και οι εικόνες TRF συνέχεια αναπτύχθηκαν σε φιλμ χημιφωταύγειας υψηλής απόδοσης (Amersham Bioscience, Waukesha, WI).

(δ) ποσοτική PCR του σχετικού αριθμού αντιγράφων των τελομερών

σχετικός αριθμός τελομερούς επανάληψης αντίγραφο αναλύθηκε με ποσοτική PCR (Q-PCR) όπως περιγράφεται από Cawthon [41]. Τελομερών ειδικούς εκκινητές εγκρίθηκαν από Cawthon [41], TEL1: 5′-GGTTTTTGAGGGTGAGGGTGAGGGTGAGGGTGAGGGT -3 ‘? TEL2, 5’-TCCCGACTATCCCTATCCCTATCCCTATCCCTATCCCTA -3 ‘.

RPLP0

(ονομάζεται επίσης

36Β4

) γονιδίου επιλέχθηκε ως γονίδιο μοναδικού αντιγράφου ακολουθώντας τη μεθοδολογία της Cawthon [41], και την ενιαία παρουσία αντίγραφο αυτού του γονιδίου στο γονιδίωμα Τασμανίας Διάβολος [42] επιβεβαιώθηκε με την αναζήτηση στο γονιδίωμα για εναλλακτικές αντίγραφα του γονιδίου. Δεν υπάρχει εναλλακτική

RPLP0

αντίγραφα ή ψευδογονίδια βρέθηκαν.

γονίδιο RPLP0

ειδικών εκκινητών σχεδιάστηκαν με βάση την αλληλουχία του γονιδιώματος Τασμανίας [42], με τη χρήση του δικτυακού τόπου Primer3Plus (https://www.bioinformatics.nl/cgi-bin/primer3plus/primer3plus.cgi),

RPLP0_F

: 5′-CTTCCCGTTCACCAAAGAAG -3 ‘και

RPLP0_R

: 5′-TGTTCTGGACTGGCAAAGTG -3′. Οι Q-PCR αντιδράσεις διεξήχθησαν στο RotorGene6000 (Qiagen, Germantown, MD) σε 15 μl ολικού όγκου, που περιέχει 7,5 μΙ Qiagen 2xQuantifast SYBR Green PCR κύριο μείγμα (Qiagen, Germantown, MD), 0.5 μΜ εμπρόσθιοι και αντίστροφοι εκκινητές (η βέλτιστες συγκεντρώσεις εκκινητή) και 1 μΐ gDNA (1 ng /μl συγκέντρωση). συνθήκες Q-PCR δημιουργήθηκαν σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή: 95 ° C για 5 λεπτά μετουσίωση που ακολουθείται από 40 κύκλους των 95 ° C για 15 s και 60 ° C για 30 s (θερμοκρασία ανόπτησης). σήμα φθορισμού αποκτήθηκε στη θερμοκρασία ανόπτησης. Πρότυπες καμπύλες παράχθηκαν χρησιμοποιώντας σειριακή 1:05 (

RPLP0

) και 1:10 (τελομερούς) αραιώσεις ενός σύνθετου δείγματος που περιέχει ίσα μέρη του DNA από σπλήνα και καρκινικό ιστό εκχυλισμάτων. Όλες οι αραιώσεις εκτελέστηκαν εις τριπλούν. Πρότυπες καμπύλες είχε ένα R

2 & gt? 0.985 (

RPLP0

αντίδρασης: R

2 = 0,985 και τελομερούς αντίδραση R

2 = 0,997) και περιείχε τουλάχιστον τέσσερις (αντίδραση τελομερούς) ή πέντε (

RPLP0

αντίδρασης) αραιώσεις από τη σειρά αραίωσης με μία γραμμική δυναμική περιοχή τουλάχιστον 3 τάξεις μεγέθους και είχε αποδόσεις PCR μεταξύ 1.3 και 1.1 (αντίστοιχα). Όλα τα δείγματα έγιναν εις τετραπλούν, και όλες οι τιμές Cq για αγνώστους έπεσαν εντός της γραμμικής ποσοτικά εύρος των κατάλληλων πρότυπων καμπυλών. Το πρόγραμμα Rest [43] χρησιμοποιήθηκε για να υπολογιστεί το κανονικοποιημένο αλλαγή φορές του γονιδίου στόχου σε σύγκριση με το γονίδιο αναφοράς. Αυτό το πακέτο πρόγραμμα διορθώνει επίσης για διαφορετικές αποδόσεις αντίδρασης. Η στατιστική σημαντικότητα (P & lt? 0,05).. Προσδιορίστηκε από ένα ζευγάρι Wise Σταθερή Ανακατανομή τυχαιοποίηση © Τεστ όπως περιγράφεται από Pfaffl

et al

[43]

(ε) η εκχύλιση RNA και την ποσοτικοποίηση της έκφρασης της τελομεράσης με ποσοτική RT-PCR

RNA εκχυλίστηκε από δείγματα ιστών χρησιμοποιώντας ένα συνδυασμό ΤπζοΙ (Sigma, St. Louis, ΜΟ) και κιτ Qiagen RNeasy μίνι (Qiagen, Germantown, MD). ποιότητα και την ποσότητα του RNA ποσοτικοποιήθηκαν επί Agilent 2100 BioAnalyzer (Agilent, Santa Clara, CA). Γενωμικό DNA απομακρύνθηκε από τα δείγματα RNA από το κιτ ϋΝΑση Ι AMPD1 (Sigma, St. Louis, ΜΟ) και cDNA συνετέθη με το QuantiTect Reverse Transcription Kit (Qiagen, Germantown, MD). συγκεκριμένο γονίδιο της τελομεράσης εκκινητών που εκτείνονται εξόνιο όρια σχεδιάστηκαν στην καταλυτική υπομονάδα πρωτεΐνης του διαβόλου

TERT

γονιδίου, χρησιμοποιώντας την ιστοσελίδα Primer3Plus (https://www.bioinformatics.nl/cgi-bin/primer3plus/primer3plus.cgi)

TERT

-F: 5′-TGCTGTAGTCCAGAAGAATGC -3 ‘, και

TERT

-R: 5′-TGCAGGGAAGAGGTTTCTTG -3′.

TRF1

-interacting πυρηνικού παράγοντα 2 (

TINF2

) εκκινητές που σχεδιάστηκαν σε όλη εξώνια 6 και 7

TINF2

-F: 5′-TTGCCCTGACTCAGTATTGC -3 ‘, και

TINF2

-R: 5′-GGATCCTGGAAAACTTGCTC -3 ‘. Δύο γονίδια,

GAPDH

(

qGAPDH

) και

GUSB

(

qGUSB

) χρησιμοποιήθηκαν ως γονίδια κανονικοποιητής μετά την περιγραφή του Murchison et al. [ ,,,0],10], [14]:

qGAPDHf

: 5′-GACTCAACCACGTATTCGGCTC -3’and

qGAPDHr

: 5′-ATATGATTCCACCCATGGCAAGTTCAA -3 ‘?

qGUSBf

: 5′-CTGCTGCCTATTATTTCAAGAC -3’and

qGUSBr

: 5′-CAAGATCCAATTCAGGCTTAG -3 ‘. Οι Q-PCR αντιδράσεις διεξήχθησαν στο RotorGene6000 (Qiagen, Germantown, MD) σε 15 μl ολικού όγκου, που περιέχει 7,5 μΙ Qiagen 2xQuantifast SYBR Green PCR κύριο μείγμα (Qiagen, Germantown, MD), 0.5 μΜ εμπρόσθιοι και αντίστροφοι εκκινητές (η βέλτιστες συγκεντρώσεις εκκινητή) και 1 μΐ cDNA (5 ng /μl συγκέντρωση). Ανάστροφης μεταγραφάσης αρνητική και cDNA αρνητικά δείγματα τρέχουν παράλληλα με τα δείγματα cDNA ως μάρτυρες για την ανίχνευση γενωμική μόλυνση DNA και σχηματισμών διμερούς αρχικού τεμαχίου. συνθήκες Q-PCR δημιουργήθηκαν σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή: 95 ° C για 5 λεπτά μετουσίωση που ακολουθείται από 40 κύκλους των 95 ° C για 15 s και 60 ° C για 30 s (θερμοκρασία ανόπτησης, AT). σήμα φθορισμού αποκτήθηκε στο AT. Για να αξιολογηθεί η ειδική ενίσχυση τελική ανάλυση καμπύλης τήξης (από την ΑΤ έως 99 ° C) προστέθηκε υπό συνεχείς μετρήσεις φθορισμού. Πρότυπες καμπύλες παράχθηκαν χρησιμοποιώντας σειριακές αραιώσεις 1:05 ενός σύνθετου δείγματος που περιέχει ίσα μέρη των δειγμάτων cDNA που παράγεται από σπλήνα και του όγκου του RNA ιστού εκχυλισμάτων. Όλες οι αραιώσεις εκτελέστηκαν εις τριπλούν. Πρότυπες καμπύλες είχε ένα R

2 & gt? 0,99 (

GUSB

αντίδρασης: R

2 = 0,998,

TERT

αντίδρασης: R

2 = 0.990 και

TINF2

αντίδρασης: R

2 = 0,993) και περιείχε τουλάχιστον τέσσερις (

TERT

αντίδραση) ή πέντε (

GUSB

και

TINF2

αντιδράσεις) αραιώσεις από η σειρά αραίωση με ένα γραμμικό δυναμικό εύρος τουλάχιστον 3 τάξεις μεγέθους και είχαν αποδόσεις PCR μεταξύ 0,98 και 1,4 (

GUSB

: 1.1,

TERT

: 1.4 και

TINF2

: 0,98). Όλα τα δείγματα έγιναν εις τετραπλούν, και όλες οι τιμές Cq για αγνώστους έπεσαν εντός της γραμμικής ποσοτικά εύρος των κατάλληλων πρότυπων καμπυλών. Το πρόγραμμα Rest [43] χρησιμοποιήθηκε για να υπολογιστεί το κανονικοποιημένο αλλαγή φορές του γονιδίου στόχου σε σύγκριση με το γονίδιο αναφοράς. Αυτό το πακέτο πρόγραμμα διορθώνει επίσης για τις διάφορες αποδόσεις αντίδρασης. Η στατιστική σημαντικότητα (P & lt? 0,05) προσδιορίστηκε από ένα ζευγάρι Wise Σταθερή Ανακατανομή τυχαιοποίηση © Τεστ όπως περιγράφεται από Pfaffl

et al

[43]

(στ) προσδιορισμό της τελομεράσης

τελομεράσης μετρήθηκε χρησιμοποιώντας το κιτ ανίχνευσης τελομεράσης TRAPEZE-RT (Millipore, Bedford, ΜΑ). Τα κύτταρα λύθηκαν σε 200 μΙ ρυθμιστικού CHAPS, και η περιεκτικότητα σε πρωτεΐνες ποσοτικοποιήθηκε με χρήση της Pierce BCA Protein Assay Kit (Thermo Scientific, Rockford, IL). Δείγματα κυτταρολύματος (250 ng πρωτεΐνης /φρεάτιο) αναλύθηκαν εις τριπλούν. Πρότυπα, δείγματα αδρανοποιημένου, και οι αντιδράσεις μη πρότυπο συμπεριλήφθηκαν επίσης στην ανάλυση ως έλεγχοι ποιότητας. ενισχύσεις σε πραγματικό χρόνο έγιναν με ένα πολύχρωμο σύστημα ανίχνευσης PCR RotorGene6000 σε πραγματικό χρόνο (Qiagen, Germantown, MD). Πρότυπη καμπύλη παράχθηκε από το πρότυπο ελέγχου TSR8 ακολουθώντας τις οδηγίες του κατασκευαστή.