Abstract

μεταστατικά κύτταρα μεταναστεύουν από τη θέση του πρωτογενούς όγκου, μέσα από το στρώμα, στο αίμα και λεμφαγγείων, τελικά αποικισμό διάφορους άλλους ιστούς για να σχηματίσουν δευτερογενείς όγκους. Πολυάριθμες μελέτες έχουν γίνει για να προσδιορίσει τα ερεθίσματα που οδηγούν την μεταστατική καταρράκτη. Αυτό έχει οδηγήσει στην ταυτοποίηση των πολλαπλών βιοχημικών σημάτων που προάγουν τη μετάσταση. Ωστόσο, οι πληροφορίες σχετικά με το ρόλο των μηχανικών παραγόντων σε μετάσταση καρκίνου ήταν περιορισμένη στην επηρεάσει συμμόρφωσης. Είναι ενδιαφέρον ότι, το μικροπεριβάλλον του όγκου είναι πλούσια σε πολλούς τύπους κυττάρων, συμπεριλαμβανομένων ιδιαίτερα συσταλτική κύτταρα που είναι υπεύθυνα για την εκτεταμένη αναδιαμόρφωση και την παραγωγή του πυκνού εξωκυττάριας μήτρας που περιβάλλει το καρκινικό ιστό. Υποθέτουμε ότι οι μηχανικές δυνάμεις που παράγονται από την αναδιαμόρφωση δραστηριότητες των κυττάρων στο μικροπεριβάλλον του όγκου συμβάλει στην αποτελεσματικότητα εισβολής μεταστατικών κυττάρων. Εχουμε ανακαλύψει μία σημαντική διαφορά στην έκταση της εισβολής σε μηχανικά διεγερμένα στίχους μη διεγερμένα περιβάλλοντα καλλιέργειας κυττάρων. Επιπλέον, αυτή η ενισχυμένη μηχανικά εισβολή εξαρτάται από σύνθεση πρωτεΐνης υποστρώματος, και επηρεάζεται από την τοπογραφία. Τέλος, έχουμε βρει ότι η πρωτεΐνη κοφιλίνη είναι απαραίτητη για να ανιχνεύει τα μηχανικά ερεθίσματα που ενισχύει εισβολή. Καταλήγουμε στο συμπέρασμα ότι και άλλοι τύποι μηχανικών σημάτων στο μικροπεριβάλλον του όγκου, εκτός από την ακαμψία, μπορεί να ενισχύσει τις ικανότητες επεμβατική των καρκινικών κυττάρων

in vitro

. Προτείνουμε εξάλλου ότι

in vivo,

μη καρκινικά κύτταρα που βρίσκονται εντός του όγκου μικρο-περιβάλλον μπορεί να είναι ικανό να παρέχει την απαραίτητη μηχανικό ερέθισμα κατά την αναδιαμόρφωση της εξωκυττάριας ουσίας που περιβάλλει τον όγκο.

Παράθεση: Menon S, Beningo KA κυττάρων εισβολή (2011) Cancer ενισχύεται από Εφαρμοσμένη μηχανική διέγερση. PLoS ONE 6 (2): e17277. doi: 10.1371 /journal.pone.0017277

Επιμέλεια: Donald Gullberg, Πανεπιστήμιο του Μπέργκεν, Νορβηγία

Ελήφθη: 15 Αυγούστου, 2010? Αποδεκτές: 27 Ιανουαρίου 2011? Δημοσιεύθηκε: 17 Φεβ 2011

Copyright: © 2011 Menon, Beningo. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Οικονομική ενίσχυση παρέχεται από ένα Wayne State University Σχολή Ερευνών Grant σε ΚΑΒ και ένα βραβείο Graduate Research Πολιτειακό Πανεπιστήμιο Wayne και Ενίσχυση ταμείων στην SM. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Η καθοριστική στιγμή στην κατάταξη ενός όγκου ως καλοήθης ή κακοήθης έγκειται στην ικανότητα καρκινικών κυττάρων να παραβιάσει την βασική μεμβράνη. Η επέκταση της επεμβατικής δομών, όπως invadopodia, επιτρέπει στο κύτταρο όγκου να διεισδύσουν στην βασική μεμβράνη και διάμεσο στρώμα μέσω ενζυματικής και φυσικά μέσα [1] – [3]. Ωστόσο, το καρκινικό κύτταρο δεν θα πάει μακριά χωρίς την πρόσθετη ικανότητα να μεταναστεύουν. Η απόκτηση καρκινικά κύτταρα του επεμβατική και μεταναστευτικών ιδιοτήτων παρέχουν τα μέσα για να εισέλθουν και να βγείτε από το λεμφικό ή το αγγειακό σύστημα και να δημιουργήσουν δευτερογενείς όγκους σε ξένο ιστό, ολοκληρώνοντας έτσι την περίπλοκη αλληλουχία των γεγονότων εντός του καταρράκτη εισβολή-μετάσταση [4], [5] . Είναι αυτές οι δευτερογενείς όγκους που αντιπροσωπεύουν περισσότερο από το 90% των θανάτων από καρκίνο, αλλά η κατανόηση της εισβολής και της μετάστασης είναι ελλιπής. Μεγάλο μέρος της έρευνας έχει επικεντρωθεί στην εγγενή γενετικά και βιοχημικά παράγοντες που προκαλούν πρωτογενείς σχηματισμό όγκων και την επακόλουθη μετάσταση. Ωστόσο, πιο πρόσφατες μελέτες έχουν εντοπίσει τόσο σωματική όσο και βιοχημικών παραγόντων μέσα στο μικροπεριβάλλον του όγκου που συμβάλλουν επίσης στην εξέλιξη του καρκίνου [6], [7].

Το στρώμα που περιβάλλει έναν όγκο αλλάζει συνεχώς ως προς τη σύνθεση και τη δομή και το πρωτογενή κύτταρα όγκου να εξελιχθεί σε εισβολή και μετάσταση, μια διαδικασία που ονομάζεται stromagenesis [8], [9]. Το στρώμα του όγκου καθίσταται εμπλουτισμένη σε εξωκυττάρια μήτρα πρωτεΐνες (ECM) και μη νεοπλασματικά κύτταρα, συμπεριλαμβανομένων ινοβλαστών, μακροφάγων, λιποκύτταρα, περικύτταρα και [8] – [12]. Βιοχημική σηματοδότηση από το στρώμα προς τα κύτταρα όγκου μπορεί να προωθήσει τον πολλαπλασιασμό και διεισδυτικότητα. Για παράδειγμα, μακροφάγα που σχετίζονται με όγκους δημιουργία ενός EGF-CSF-1 παρακρινούς βρόχου σηματοδότηση με τα καρκινικά κύτταρα που προάγουν την κίνηση των καρκινικών κυττάρων [10]. Οι μηχανικές ιδιότητες του στρώματος μπορεί επίσης να ενισχύσει την εξέλιξη του όγκου. Για παράδειγμα, το στρώμα που περιβάλλει έναν όγκο είναι εμπλουτισμένο σε τόσο κολλαγόνου τύπου Ι και ινονεκτίνης, δημιουργώντας ένα πυκνότερο και μηχανικά άκαμπτος ιστός σε σύγκριση με φυσιολογικό ιστό [7]. Αυτή η αυξημένη ακαμψία ενισχύει τον πολλαπλασιασμό και τη διάδοση [13] των καρκινικών κυττάρων – [15]. Πρόσφατες μελέτες δείχνουν επίσης ότι φυσικώς τέντωμα φιμπρονεκτίνη μπορεί να προκαλέσει μια μηχανική οδού απόκρισης σε κανονικούς ινοβλάστες [16] – [18]. Δεδομένης της αυξημένη ποσότητα ινωδονεκτίνης στο στρώμα, αυτές οι παρατηρήσεις θα μπορούσε να προτείνει μια πιθανή μηχανισμό για τη μηχανική απόκριση των καρκινικών κυττάρων.

Υπάρχει ένας αριθμός μηχανικών δυνάμεων, εκτός από την αλλαγή στην συμμόρφωση, που μπορεί να επηρεάσουν το εξέλιξη του καρκίνου. Μια τέτοια δύναμη θα μπορούσε να προέρχεται από στρωματικά κινήσεις κύτταρο ή της δραστηριότητας αναδιαμόρφωση μήτρας των εξαιρετικά συσταλτικής κύτταρα του στρώματος, συμπεριλαμβανομένων των ινοβλαστών και μυοϊνοβλάστες. Οι μυοϊνοβλάστες δειχθεί ότι διαφοροποιούνται από φυσιολογικούς ινοβλάστες ιστό, και την παραγωγή και την αναδιαμόρφωση τους της ECM ενισχύει τον πολλαπλασιασμό και τη διάδοση των καρκινικών κυττάρων [19], [20]. Η συσσώρευση στρωματικών μυοϊνοβλαστών είναι ένα καθοριστικό χαρακτηριστικό της desmoplasia συνηθέστερα συνδέονται με διηθητικό καρκίνο του μαστού, γαστρεντερικού, των πνευμόνων, του παγκρέατος, και καρκινώματα πλακωδών κυττάρων για να αναφέρουμε μερικά [9]. Εκτός από το υψηλό επίπεδο παραγωγής κολλαγόνου τύπου Ι, οι μυοϊνοβλάστες προσδιορίζονται από την έκφρασή τους του άλφα-λείου μυός ακτίνης [7], [9], [21], [22]. Οι άλφα-λείου μυός ακτίνη συνεργάτες με μη μυ μυοσίνη να σχηματίσει ιδιαίτερα συσταλτικές microfilamentous μονάδες που τερματίζουν στην επιφάνεια ενός μυοϊνοβλάστη σε fibronexus [23]. Αυτά είναι χαρακτηριστικά γνωρίσματα της μυοϊνοβλαστών και σχηματίζουν ένα σύστημα μηχανο-μεταγωγής που λειτουργεί σε μέσα-έξω και εξωτερικό-σε ισχύ μετάδοσης [23] – [25]. Στην αναδιαμόρφωση του ECM εντός του στρώματος, οι μυοϊνοβλάστες παράγουν ένα μηχανικό ερέθισμα όπως ρυμουλκό και τραβήξτε στις ίνες [26]. Αυτό μας οδηγεί στο ερώτημα απευθυνόμαστε σε αυτή τη μελέτη. Θα μπορούσαν οι εφαρμοζόμενες μηχανικές δυνάμεις που δημιουργούνται από την αναδιαμόρφωση του ECM και τραβώντας την ECM από στρωματικά κύτταρα συμβάλλουν στις επεμβατικές ιδιότητες ενός καρκινικού κυττάρου; Μπορούν να παρέχουν ένα ερέθισμα «έλα εδώ» που θα ενθαρρύνει τα καρκινικά κύτταρα να αφήσουν τον όγκο;

Εδώ αναφέρουμε ότι ένα μηχανικό ερέθισμα της τράβηγμα και την απελευθέρωση εφαρμόζεται σε μια μήτρα κολλαγόνου

in vitro

κάνει πράγματι να ενισχύσει την εισβολή των καρκινικών κυττάρων σε ένα τρόπο που εξαρτάται από φιμπρονεκτίνη. Αυτή η ικανότητα φαίνεται να είναι μοναδική για τα καρκινικά κύτταρα που είναι γνωστό ότι είναι ιδιαίτερα επεμβατική, ως ελάχιστα επεμβατική και τα φυσιολογικά κύτταρα δεν ανταποκρίνονται κατά τον ίδιο τρόπο σε αυτό το ερέθισμα. Τέλος, χρησιμοποιώντας γονιδιακή σίγηση, εξακριβώθηκε ότι η κοφιλίνη, ένα φυσιολογικό συστατικό του invadopodia, απαιτείται για να ανιχνεύει αυτήν την μηχανική σήματος για βελτιωμένη εισβολή. Αυτή η μελέτη δείχνει ότι οι φυσικοί παράγοντες, πέρα ​​από τη συμμόρφωση, εμπλέκονται στην προώθηση των υφιστάμενων επεμβατική συμπεριφορά σε καρκινικά κύτταρα και ότι η μηχανική σήματα που μεταδίδονται από τη φυσική δραστηριότητα των κυττάρων εντός του στρώματος μπορεί να ενισχύσουν την πρόοδο του καρκίνου.

Υλικά και Μέθοδοι

Cell Culture,

ΗΤ1080 ανθρώπινων κυττάρων ινοσαρκώματος, κύτταρα μελανώματος B16F10 ποντικιού και εμβρυϊκές ινοβλάστες ποντικού (MEF) κύτταρα που χρησιμοποιούνται σε αυτή τη μελέτη, αγοράστηκαν από την ATCC και καλλιεργήθηκαν και διατηρήθηκαν σε μέσο Eagle τροποποιημένο κατά Dulbecco – υψηλή γλυκόζης (Sigma) και 10% FBS (Hyclone). Τα κύτταρα πέρασαν με θρυψινοποίηση χρησιμοποιώντας 0.25% θρυψίνη-EDTA, η αντίδραση τερματίζεται με πλήρες μέσο. Ο αριθμός πέρασμα οποιουδήποτε τύπου κυττάρου δεν υπερβαίνει τις οκτώ περάσματα.

Εισβολή Πίνακες

Για να δημιουργήσετε μια κουλτούρα καλά για παχύ (1 mm) πίνακες, ένας ενεργοποιημένος καλυπτρίδα [27] συνδέθηκε με γράσο κενού στον πυθμένα ενός πιάτου καλλιέργειας (Nunclon) εντός του οποίου είχε διάτρητοι μια τρύπα 20 mm.

Η μήτρα αποτελείται από 2,5 mg /ml (ή 4,5 mg /ml, Εικόνα S2) κολλαγόνου τύπου Ι (PureColl και Nutragen, Advanced Biomatrix), 20 μg /ml ινωδονεκτίνης (Sigma) και 4 μλ 1-2 μm καρβοξυλιωμένων παραμαγνητικών σφαιριδίων (Polysciences Inc.). Το ρΗ του μίγματος ρυθμίστηκε στο 7,4 ± 0,2 με 0,1 Ν ΝαΟΗ και 10Χ PBS. Για την «κολλαγόνο μόνο» υποστρώματα, τα πάντα εκτός από ινονεκτίνη προστίθεται στο μίγμα μήτρας. Όλα τα συστατικά ήταν παγωμένο και αναμίχθηκαν σε 4 ° C. 500 μΐ του διαλύματος μήτρας προστέθηκαν σε ένα παγωμένο καλλιέργεια καλά, και 25 mm καλυπτρίδα έπεσαν επί του μίγματος πηκτής για να ληφθεί μια επίπεδη επιφάνεια. Για τον πολυμερισμό, το διάλυμα μήτρα τοποθετήθηκε στους 37 ° C για 30 λεπτά. Μετά τον πολυμερισμό, 3 ml μέσου προστέθηκε στα υποστρώματα και η κορυφή καλυπτρίδα αφαιρέθηκε. Τα υποστρώματα κατόπιν αποστειρώνεται σε ένα απαγωγό καλλιέργεια κάτω από υπεριώδες φως για 15 λεπτά σε απόσταση 25 ιντσών από την πηγή φωτός.

Εισβολή Δοκιμασία

Τα κύτταρα σπάρθηκαν σε 1.5 × 10

4 κύτταρα /ml σε αποστειρωμένο μήτρας και αφέθηκαν να προσκολληθούν για 1 ώρα στους 37 ° C /5% CO

2. Για κάθε πείραμα, ένας seeded μήτρα επωάζεται στους 37 ° C /5% CO

2 1.5 cm πάνω από ένα μαγνήτη σπάνιας γαίας από 12.100 Gauss (25 mm σε διάμετρο και 5,5 mm σε πάχος). Ένα δεύτερο seeded μήτρα επωάζεται έξω από το μαγνητικό πεδίο. Ο μαγνήτης περιστράφηκε κάτω από την καλλιέργεια στους 160 rpm (2.6 Ηζ) σε ένα τροχιακό πεδίο 2 cm σε τροχιακό αναδευτήρα (Barnstead Thermolyne, Roto Mix-Type 50800). Αυτή η συχνότητα περιστροφής διατηρήθηκε η ίδια για όλες τις δοκιμασίες που περιγράφονται. Η δοκιμασία εισβολή πραγματοποιήθηκε επίσης με το μαγνήτη περιστρέφεται σε χαμηλότερες συχνότητες (8 και 90 rpm (0,13 και 1,5 Hz)) όπως υποδεικνύεται. Η κυτταρική απόκριση καταγράφηκε για 25 τυχαία επιλεγμένα πεδία μικροσκοπίου σε 24 ώρες χρησιμοποιώντας αντικειμενικό φακό 10Χ φάση σε Όλυμπο IX81 μικροσκόπιο. Οι αριθμοί κυττάρων καταγράφηκαν σε οκτώ βήματα των 100 μm /βήμα εντός του ζ-επίπεδο της μήτρας. Ποσοστό εισβολή υπολογίστηκε ως το ποσοστό του εισέβαλαν κυττάρων σε σύγκριση με το συνολικό αριθμό των κυττάρων. Η στατιστική ανάλυση πραγματοποιήθηκε με τη χρήση των δύο ουρών Students t-test

Το πεπτίδιο πειράματα αναστολέα διεξήχθησαν ως ανωτέρω.? 1,5 × 10

4 κύτταρα /ml σπάρθηκαν επάνω σε υποστρώματα που ακολουθείται από 100 μg /ml του πεπτιδίου GRGDS ή GRGES (έλεγχος) πεπτίδιο (Bachem Americas Inc.) αιωρήθηκε σε νερό. Ποσοστό εισβολή υπολογίστηκε 24 ώρες μετά την έναρξη της διέγερσης.

Ανοδική Invasion Δοκιμασία

φρεάτια καλλιέργειας χωρίς τα υποστρώματα παρασκευάστηκαν όπως περιγράφεται παραπάνω. Ωστόσο, τα κύτταρα πρώτα σπάρθηκαν κατευθείαν επάνω στο γυαλί καλυπτρίδα επικαλυμμένα με ένα λεπτό στρώμα του κολλαγόνου τύπου Ι (200 μg /ml) και ινονεκτίνη (62,5 μg /ml) πριν από επικάλυψη της μήτρας. Τα κύτταρα αφέθηκαν να προσκολληθούν όλη τη νύκτα σε μέσο στους 37 ° C και 5% CO

2. Το μέσο απομακρύνθηκε και τα κύτταρα στη συνέχεια επιστρώθηκαν με το μη πολυμερισμένο μήτρα κολλαγόνου /φιμπρονεκτίνης, όπως περιγράφεται παραπάνω. Media αντικαταστάθηκε ακόλουθο πολυμερισμό. Για κάθε πείραμα, ένας seeded υπέρθεση μήτρα καλλιεργήθηκε 1,5 cm κάτω από μια σπάνια γη μαγνήτης του 12.100 Gauss (25 mm σε διάμετρο και 5,5 mm σε πάχος) και ένα δεύτερο διατηρήθηκε εκτός του μαγνητικού πεδίου. Ο μαγνήτης περιστράφηκε πάνω από την καλλιέργεια πραγματοποιήθηκε σε μια στάση που διατίθενται στην τροχιακό αναδευτήρα (Barnstead Thermolyne, Roto Mix-Type 50800) και περιστράφηκε στις 160 rpm (2.6 Ηζ) σε ένα τροχιακό τομέα των 2 εκατοστών. Τοις εκατό εισβολή και στατιστική ανάλυση που περιγράφεται παραπάνω.

ακτίνη Αποπολυμερισμός

ΗΤ1080 κύτταρα σπάρθηκαν πάνω σε υποστρώματα κολλαγόνου /φιμπρονεκτίνης. Αφού τα κύτταρα είχαν προσκολληθεί και να εξαπλωθεί επί των υποστρωμάτων, 2 μΜ κυτοχαλασίνης Β (Sigma) επαναιωρείται σε DMSO ή ένα αντίστοιχο όγκο DMSO προστέθηκε σε ξεχωριστές πλάκες. Αυτά στη συνέχεια χρησιμοποιούνται απευθείας για τον προσδιορισμό εισβολής.

κοφιλίνη Νοκ ντάουν

CFL1 siGENOME SMARTpool και siRNA (Dharmacon RNAi Τεχνολογίας, Thermo Scientific) Off-στόχου χρησιμοποιήθηκαν για να φιμώσουν την έκφραση κοφιλίνη και ως μάρτυρες , αντίστοιχα. RNA εισήχθησαν σε κύτταρα με nucleofection χρησιμοποιώντας ένα Amaxa Nucleofector II και λύσεις από Kit T. Οι πρωτεΐνες εκχυλίστηκαν για ανάλυση Western από σιγήσει και ΗΤ1080 κύτταρα μάρτυρες χρησιμοποιώντας ένα ρυθμιστικό τριπλό απορρυπαντικό λύσης (100 mM Tris-Cl, 300 mM NaCl, 0,5% νάτριο δεοξυχολικό, 0.2% SDS, 2% Nonidet Ρ 40) που περιέχει κοκτέιλ αναστολέα πρωτεάσης (Sigma) σε 24, 48 ώρες και 72 ώρες μετά nucleofection να επιβεβαιώσουν knockdown. Αντι-κοφιλίνη μονοκλωνικό αντίσωμα, ab54532 (Abcam) και HRP-σημασμένο αντίσωμα αντι-ποντικού (Amersham) χρησιμοποιήθηκαν για την ανίχνευση των κηλίδων Western και ανιχνεύθηκαν με ECL Plus Western Blotting Αντιδραστηρίων Ανίχνευσης (Amersham).

Εισβολή δοκιμασία χρησιμοποιώντας κοφιλίνη siRNA και Cytochalasin Β κατεργασμένης ΗΤ1080 κύτταρα

δοκιμασία εισβολή έγινε με χρήση ελέγχου siRNA και κοφιλίνη siRNA κύτταρα επεξεργασμένα ΗΤ1080. Δεδομένου κοφιλίνη knockdown είναι αποτελεσματικός 48 ώρες μετά nucleofection, τα κατεργασμένα κύτταρα σπάρθηκαν επάνω σε υποστρώματα στο χρονικό σημείο των 48 ωρών. Αφού τα κύτταρα είχαν προσκολληθεί, ένας seeded μήτρα για κάθε μία από τις συνθήκες τοποθετήθηκε πάνω από το μαγνήτη που περιστρέφεται με 160 στροφές ανά λεπτό (2,6 Hz), ενώ το άλλο τοποθετείται έξω από το μαγνητικό πεδίο. Η δοκιμασία εκτελέστηκε επίσης χρησιμοποιώντας κυτοχαλασίνη Β ή DMSO επεξεργασμένα κύτταρα. Σε κάθε περίπτωση, ένας seeded μήτρα παρεσχέθη μαγνητική διέγερση στα 160 rpm (2.6 Ηζ) ενώ η άλλη μήτρα τοποθετήθηκε έξω από το μαγνητικό πεδίο. Η κυτταρική απόκριση για καθεμία από τις τέσσερις προϋποθέσεις μετρήθηκε 24 και 48 ώρες μετά την έναρξη της διέγερσης. Ποσοστό εισβολή υπολογίστηκε και στατιστική ανάλυση πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας μια δίπλευρη Student t-test.

Western Blot ινονηκτίνης έκκριση κατά ΗΤ1080 κύτταρα

1,5 × 10

4 κύτταρα /ml ΗΤ1080 κύτταρα αναπτύχθηκαν σε μέσο ελεύθερο ορού DMEM και σπάρθηκαν πάνω από κολλαγόνο μόνο μήτρες, που παρασκευάζεται όπως περιγράφεται παραπάνω, και η τυπική δοκιμασία εισβολή πραγματοποιήθηκε. Μετά από 24 ώρες διέγερσης, οι καλλιέργειες αποξέστηκαν σε σωλήνα μικροφυγοκέντρησης που περιείχε 2 mg /ml του κολλαγενάσης τύπου 4 (Worthington Biochemical Corporation) σε Hanks ‘Balanced Salt Solution (Gibco, Invitrogen). Η μήτρα κολλαγόνου διαλυτοποιείται επί 10 λεπτά με ήπια ανακίνηση του σωλήνα στους 37 ° C και τα κύτταρα κατακρημνίστηκαν με φυγοκέντρηση σε 2000 rpm για 5 λεπτά, το υπερκείμενο χρησιμοποιήθηκε για ανάλυση. Κυτταρικά εκχυλίσματα κυττάρων ΗΤ1080 και MEF κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε τρυβλία καλλιέργειας πολυστερίνη 100 mm έως 80% συρροή σε διάστημα 48 ωρών παρασκευάστηκαν επίσης. Η εκχύλιση κυτταρική λύση και η πρωτεΐνη διεξήχθησαν όπως περιγράφεται παραπάνω. Τυπική SDS-PAGE εκτελέστηκε χρησιμοποιώντας 30 μg ολικής πρωτεΐνης από κυτταρικά εκχυλίσματα MEF και ΗΤ1080 και 35 μΙ εναιωρήματος κολλαγενάση. Western blots παρασκευάστηκαν και διερευνήθηκαν με μονοκλωνικό ποντικού [IST-9] για να ινονεκτίνη (1:300), ab6328 (Abcam) σε 5% γάλα σε TBS που ακολουθείται από ένα HRP κατσίκας αντι-ποντικού Ig (BD Pharmingen) δευτερεύον αντίσωμα (1: 1000) και ανιχνεύεται ως ανωτέρω.

Αποτελέσματα

Στατική μελέτη του μηχανικές Δοκιμασία εισβολή

Ο στόχος αυτής της μελέτης ήταν να καθοριστεί αν εφαρμοστεί μηχανική διέγερση, όπως αυτές που προσομοιώνουν η εκ νέου μοντελοποίηση της εξωκυττάριας μήτρας, θα μπορούσε να ενισχύσει τη διαδικασία της εισβολής. Για την αντιμετώπιση υπόθεση μας, σχεδιάσαμε ένα νέο σύστημα δοκιμασίας όπου μηχανική διέγερση θα μπορούσε να εφαρμοστεί σε περίπτωση απουσίας εκκρίνεται βιοχημικών παραγόντων. Η πρόθεσή μας ήταν να δημιουργήσουμε μια δοκιμασία που χρησιμοποιείται εμπορικά διαθέσιμα εξαρτήματα, που απαιτούνται στάνταρ εξοπλισμό, με την προϋπόθεση του ελέγχου των βιοχημικών και μηχανικών παραμέτρων, όλα σε ένα πλαίσιο που θα ήταν οπτικά συμβατό με ένα συνηθισμένο μικροσκόπιο φθορισμού. Επιλέξαμε να χρησιμοποιήσουμε έναν κολλαγόνου τύπου Ι μήτρα που συνήθως χρησιμοποιούνται για δοκιμασίες εισβολή, ο συλλογισμός ότι το στρώμα είναι πολύ εμπλουτισμένο σε αυτή την εξωκυτταρική πρωτεΐνη μήτρας. Καρβοξυλιωμένου φθορισμού παραμαγνητικά μικρο-σφαιρίδια ενσωματωμένα εντός της μήτρας για να παρέχει μηχανική διέγερση. Για να παραχθεί μία παροδική μαγνητική έλξη, χωρίς την ανάγκη για ένα μέγεθος micron ηλεκτρο-μαγνήτη, μπορούμε να περιστραφεί ένα μαγνήτης από σπάνιες γαίες σε ένα περιστρεφόμενο ανάμεικτη κάτω από την καλλιέργεια, ενώ η καλλιέργεια αιωρείται πάνω από το μαγνήτη (Σχήμα 1Α). Ολόκληρο το σύστημα καλλιέργειας μπορεί να διατηρηθεί μέσα σε ένα επωαστήρα πρότυπο καλλιέργειας ιστού (Σχήμα 1Β, C).

α) σαφώς δημιουργείται σε ένα δίσκο καλλιέργειας 60 mm και γεμίζουν με ένα κολλαγόνο τύπου Ι μήτρα /ινωδονεκτίνης που περιέχει 2 μm παραμαγνητικά σφαιρίδια. Τα κύτταρα εμβολιάζονται επί της επιφανείας της μήτρας και είτε καλλιεργήθηκαν εκτός ενός μαγνητικού πεδίου ή από καλλιέργεια 1,5 cm πάνω από ένα περιστρεφόμενο μαγνήτη σπάνιας γαίας. Κατά την διέγερση, τα κύτταρα εισβάλλουν στην μήτρα. Β) πλάκα 60 mm με μία οπή 20 mm που διανοίχτηκε σε αυτό, με ένα ενεργοποιημένο επικάλυμμα κολλημένο στο κάτω μέρος, δημιουργεί μια καλά για τη μήτρα. Γ) Η καλλιέργεια αιωρείται πάνω από ένα μαγνήτης από σπάνιες γαίες τοποθετήθηκαν σε τροχιακό αναδευτήρα μέσα σε ένα τυπικό επωαστήρα κυτταρικής καλλιέργειας 1,5 εκατοστά. Δείτε την ενότητα μεθόδους για λεπτομέρειες.

Η

Για να βεβαιωθείτε ότι ο μαγνήτης ήταν ικανό να παράγει αρκετή μαγνητική δύναμη και ότι τα ενσωματωμένα σφαιρίδια ανταποκρίθηκαν στην δύναμη σε ένα παροδικό τρόπο, χρησιμοποιήσαμε ένα magnometer για τη μέτρηση της μαγνητικής δύναμη σε καθορισμένες πειραματικές αποστάσεις. Ανακαλύψαμε μια μαγνητική χάντρα σε ένα σταθερό σημείο εντός του κέντρου της καλλιέργειας θα μπορούσε να υποβάλλεται σε μία περιοχή από 500 έως 80 Gauss ως μαγνήτης από σπάνιες γαίες περιστρέφεται 1,5 cm κάτω από την κάψα καλλιέργειας ενώ ολοκληρώνει μια τροχιά του 2 cm σε 160 rpm (2,6 Ηz) (Σχήμα 2Α). Προσομοίωση σε αυτές τις αποστάσεις κάτω από το μικροσκόπιο οδήγησε σε μετατοπίσεις χάντρα περίπου 0,5-5 μm (Σχήμα 2Β, Movie S1, S2 Ταινία). Χάντρες παρατηρήθηκαν να αναπηδήσει πίσω στην αρχική τους θέση στο επίπεδο χ-γ μετά ο μαγνήτης απομακρύνθηκε, ενδεικτική της στερεώσεώς τους επί του πλέγματος κολλαγόνου και διατήρηση της ακεραιότητας του δικτύου γέλης. Για να προσδιοριστεί η φυσιολογική σημασία αυτής της μετατόπισης, αναγνωρίσαμε ότι θα μπορούσαμε να υπολογίσει το ποσό της δύναμης που εφαρμόζεται επί του σφαιριδίου από το μαγνήτη, ωστόσο, μια πιο απτή δοκιμή θα ήταν να παρατηρήσει κύτταρα ΥΠΟΙΟ επέκταση και ανάσυρση επεκτάσεις εντός ενός ελεγχόμενου συστήματος πολιτισμό μας. Καταγράψαμε μετατοπίσεις χάντρα στο επίπεδο χ-γ από τα κυτταρικά επεκτάσεις των MEF κύτταρα, που κυμαίνονται από 0.08-5.1 μm (Σχήμα 2C, Ταινία S3). Αυτή είναι μια συντηρητική σύγκριση με τους τύπους των μετατοπίσεων που θα μπορούσε να συμβεί στο στρώμα δεδομένου ότι η πιο συσταλτικές τύπο κυττάρων που βρέθηκε εκεί, οι μυοϊνοβλάστες, παράγουν σημαντικά μεγαλύτερη δύναμη από ένα MEF [28], [29].

α) ένα μαγνήτης από σπάνιες γαίες τοποθετείται 1,5 cm κάτω από μια μήτρα παράγει ένα πεδίο κλίσης κυμαίνεται από 500g έως 80g εντός της μήτρας καθώς περιστρέφεται σε τροχιά 2 εκατοστά. Μια παραμαγνητικό σφαιρίδιο στη θέση Χ θα λάβουν μια μαγνητική δύναμη του 500G, ~300G και ~200G όταν ο μαγνήτης τροχιά στις θέσεις Ρ1, Ρ2 και Ρ3 αντίστοιχα. Β) σειρά τεσσάρων εικόνων που απεικονίζουν την μετατόπιση των σφαιριδίων από τον μαγνήτη όταν διατηρείται σε σταθερή θέση εντός της τροχιάς. Οι συστάδες των σφαιριδίων να ανταποκρίνεται στο μηχανικό ερέθισμα και δείχνει μια μετατόπιση θέσης έχουν οριοθετηθεί χρησιμοποιώντας έναν κύκλο, ένα τετράγωνο και ένα βέλος. Από αριστερά προς τα δεξιά, η εικόνα η μία είναι έξω από το μαγνητικό πεδίο, ενώ ο δεύτερος και τρίτος εικόνες ελήφθησαν με τον μαγνήτη που πραγματοποιήθηκε στις θέσεις Ρ1 και Ρ2 αντίστοιχα. Η τελική εικόνα δείχνει τα σφαιρίδια επιστρέφουν στην αρχική τους θέση μετά την απομάκρυνση του μαγνήτη. Γ) ΥΠΟΙΟ κυτταρικές επεκτάσεις προκαλέσει φθορισμού μετατόπιση χάντρα. Τέσσερις εικόνες (0, 15, 30 και 60 λεπτά) από ένα ενιαίο επίπεδο εστίασης επιλέχθηκαν από μία σειρά 30 εικόνων φάσης λαμβάνονται κάθε 2 λεπτά από ένα MEF κύτταρο εντός μιας μήτρας κολλαγόνου /ινονεκτίνη. Τα περιγράμματα των κυττάρων και τα αντίστοιχα φθορισμού εικόνες χάντρα δείξει. Μια μετατόπιση χάντρα που υφίσταται σκιαγραφείται χρησιμοποιώντας ένα λευκό ορθογώνιο κουτί. Ο χώρος μέσα στο κουτί από τις τέσσερις εικόνες έχει διευρυνθεί και εμφανίζεται με ένα χάρακα ένθετο για να δείξει τη μετατόπιση χάντρα με μεγαλύτερη σαφήνεια. Η αντίθεση των μεγεθυσμένων εικόνων έχουν αλλάξει ώστε να αντικατοπτρίζει καλύτερα τη θέση της χάντρας σε κάθε περίπτωση. Mag. Bar = 10 μm.

Η

μηχανική διέγερση Ενισχύει την διείσδυση των κυττάρων του καρκίνου

Επεμβατική δομές έχουν προηγουμένως περιγραφεί στις δύο εγγενώς φυσιολογικά επεμβατική κύτταρα και σε εκείνους που έχουν αποκτήσει επεμβατική ιδιότητά τους κατά τη διάρκεια της εξέλιξης του καρκίνου [30]. Εμείς αιτιολογημένη ότι ήταν απίθανο ότι η μηχανική διέγερση θα προκαλέσει μια προηγουμένως μη επεμβατική τύπου κυττάρων να εισβάλουν και ως εκ τούτου θα δοκιμαστεί κύτταρα είναι γνωστό ότι είναι εξαιρετικά διεισδυτικά σε σύστημα προσδιορισμού μας. Εμείς επιλέξαμε να ελεγχθεί η ανθρώπινη ινοσαρκώματος ΗΤ1080 κυτταρική γραμμή και το μελάνωμα ποντικιού Β16Ρ10 κυτταρική γραμμή, ενώ η μη επεμβατική ΥΠΟΙΟ κυτταρική σειρά υπηρέτησε ως έλεγχος.

Αυτοί οι τύποι κυττάρων ελέγχθηκαν ατομικά για την ικανότητά τους να ανταποκριθούν στην μηχανική διέγερση παρέχεται στη δοκιμασία. Εν συντομία, τα κύτταρα σπάρθηκαν επί παρασκευάζονται μήτρες, όπως περιγράφεται στις μεθόδους, και αφέθηκαν να προσκολληθούν για 30 λεπτά πριν από την έναρξη της διέγερσης. Τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε μήτρες ταυτόσημης σύνθεσης, αλλά δεν υποβλήθηκε σε μαγνητική διέγερση, χρησιμοποιήθηκαν ως μάρτυρες. Τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν πάνω σε μήτρες που στερούνται μαγνητικά σφαιρίδια, αλλά υποβλήθηκε σε μαγνητική διέγερση χρησίμευσε ως επιπρόσθετοι έλεγχοι. Εισβολή παρατηρήθηκε κάτω από το μικροσκόπιο που αρχίζει από 5 μm από την επιφάνεια σε βάθος 800 μm εντός της μήτρας (Σχήμα 3Α). Ο αριθμός των εισβολής και μη εισβάλλοντα κύτταρα μετρήθηκαν μετά από 24 ώρες διέγερσης και υπολογίζεται ως το εισβολή τοις εκατό.

Α) κύτταρα ινοσαρκώματος ΗΤ1080 σπάρθηκαν επάνω σε κολλαγόνο τύπου Ι μήτρες /ινονηκτίνης που περιέχουν παραμαγνητικά σφαιρίδια και καλλιεργήθηκαν είτε υπό μαγνητική διέγερση ή χωρίς διέγερση. Ένα συνδυασμένο φάσης και φθορισμού εικόνα ενός μηχανικά διεγερμένα καλλιέργειας υπέρθεση. Τα στερεά βέλος σε ένα κύτταρο το οποίο έχει εισβάλει. Το διακεκομμένο βέλος υποδεικνύει μια δεύτερη κύτταρο μέσα σε ένα άλλο εστιακό επίπεδο. Τα κενά βέλος δείχνει σε ένα φθορίζοντα παραμαγνητικό σφαιρίδιο. Mag. Bar = 50 μm. Β) Εισβολή των κυττάρων ΗΤ1080 υπό μηχανικά διεγερμένα και μη διεγερμένα συνθήκες διεξήχθη σε μήτρες που περιέχουν είτε κολλαγόνου τύπου Ι (2,5 mg /ml) ή αμφότερα κολλαγόνου τύπου Ι και ινονεκτίνης, ή κολλαγόνου /φιμπρονεκτίνη παρουσία ή απουσία του RGD πεπτιδίου. 25 πεδία κύτταρα μετρήθηκαν 24 ώρες μετά την σπορά σε πολλαπλές βάθη εντός κάθε μήτρας που ξεκινούν 5 μm κάτω από την επιφάνεια της μήτρας και προχωρώντας προς το απώτατο βάθος 800 μm. Το ποσοστό της εισβολής κυττάρων ήταν 2 φορές υψηλότερη σε διεγερμένες καλλιέργειες σε σύγκριση με τους ελέγχους (

P

& lt? 0,05) σε μήτρες που περιέχουν τόσο πρωτεΐνες ECM. Παρόμοια αποτελέσματα ελήφθησαν όταν οι GRGES πεπτίδιο ελέγχου προστέθηκαν στα μέσα ενημέρωσης. Η επί τοις εκατό εισβολή ήταν περίπου η ίδια με ή χωρίς διέγερση όταν φιμπρονεκτίνη ήταν απούσα. Η προσθήκη του πεπτιδίου GRGDS οδήγησε επίσης σε αναστολή της ενισχυμένης εισβολής μετά από μηχανική διέγερση. Γ) Ένα 20-πλάσια διαφορά στη συχνότητα της διέγερσης δεν επηρεάζει το ποσοστό του κυτταρικού εισβολής. Το ποσοστό των κυττάρων που εισβάλλουν 24 ώρες μετά τη διέγερση στο μαγνητικό ταχύτητες περιστροφής των 8, 90 και 160 rpm (0,13, 1,5 και 2,6 Hz). Μια ασήμαντη διαφορά βρέθηκε μεταξύ κύτταρα που διεγείρονται σε 8 και 160 rpm (

P

& gt? 0,05). Τα δεδομένα αντιπροσωπεύουν τρία ανεξάρτητα πειράματα, 25 πεδία. Δ) κολλαγόνο Τύπου Ι μήτρες /ινονηκτίνης που περιέχουν paramagnetc σφαιρίδια προ-διεγέρθηκαν για 24 ώρες. Αυτές οι μήτρες στη συνέχεια σπείρονται με κύτταρα ΗΤ1080 και μετρήθηκαν 24 ώρες μετά την σπορά, κατά την διάρκεια της οποίας περιόδου τόσο η προ-διεγερμένα και οι πλάκες ελέγχου δεν διεγέρθηκαν (αριστερό πάνελ). Αυτές οι καλλιέργειες στη συνέχεια είτε συνεχίστηκε είτε τοποθετείται πάνω από τον μαγνήτη (δεξί πάνελ), δεδομένα που ελήφθησαν 24 ώρες μετά τη διέγερση. Τα δεδομένα αντιπροσωπεύουν δύο ανεξάρτητες δοκιμασίες 15 πεδία των κυψελών σε μία περιοχή βάθος 800 μm. Δίπλευρη ανάλυση χρησιμοποιώντας Student t-test.

Η

Αρχικά σπαρμένα κύτταρα μας σε μήτρες αποτελούνται μόνο του κολλαγόνου τύπου Ι. Κατά τη διέγερση δεν παρατηρήσαμε αυξημένη εισβολή (που κυμαινόταν μεταξύ 5 και 10% εισβολή σε διεγερμένα και μη διεγερμένα καλλιέργειες). Ωστόσο, όχι μόνο είναι κολλαγόνο τύπου Ι άφθονη στο στρώμα, αλλά η σύνδεση της ECM πρωτεΐνη ινωδονεκτίνη κολλαγόνο είναι εμπλουτισμένο [7], [31]. Έτσι, σε σύγκριση μήτρες που αποτελείται από το κολλαγόνο μόνο με εκείνα των δύο κολλαγόνου και ινονεκτίνης, με και χωρίς διέγερση. Υπό αυτές τις συνθήκες, παρατηρήσαμε μια σημαντική διαφορά στον αριθμό των κυττάρων σε εισβάλλοντας μηχανικά διεγερμένα στίχους μη διεγερμένα περιβάλλοντα καλλιέργειας για τα επεμβατική τύπους κυττάρων όταν μήτρες κολλαγόνου /ινονηκτίνη χρησιμοποιήθηκαν (Εικόνα 3Β). Μια αύξηση κατά δύο φορές του ποσοστού της εισβολής κυττάρων στο διεγερμένα (23%) σε σύγκριση με το μη-διεγερμένα μήτρα (10%) παρατηρήθηκε με συνέπεια σε αυτές τις καλλιέργειες (Ρ & lt? 0,05). Αυτά τα αποτελέσματα έδειξαν ότι ένα εφαρμοζόμενο ερέθισμα ήταν ικανές να ενισχύσουν την εισβολή των καρκινικών κυττάρων, αλλά απαιτείται παρουσία ινονηκτίνης για τη μηχανική απόκριση. Επιπλέον, βρήκαμε ότι μη επεμβατική MEF κύτταρα απέτυχαν να εισβάλουν τόσο με την παρουσία ή απουσία μηχανικής διέγερσης σε μήτρες κολλαγόνου /ινωδονεκτίνη, γεγονός που υποδηλώνει την ανάγκη για ένα κύτταρο να έχει μια προκαθορισμένη ικανότητα για εισβολή.

να επιβεβαιώσουν τη σημασία της ινονεκτίνης για τη μηχανική ανταπόκριση που ανέστειλε τις αλληλεπιδράσεις κυττάρου-φιμπρονεκτίνης με RGD ανασταλτικά πεπτίδια. Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε αγωγή με το πεπτίδιο GRGDS ή ένα πεπτίδιο GRGES ελέγχου μετά την σπορά πάνω στις μήτρες κολλαγόνου /ινονεκτίνη. Η επί τοις εκατό εισβολή ήταν φυσιολογική παρουσία του πεπτιδίου GRGES ελέγχου (28% με διέγερση και 13% χωρίς διέγερση), ενώ μηχανικά διεγείρεται εισβολή ανεστάλη από το πεπτίδιο RGD (9% με διέγερση και 11,5% χωρίς διέγερση, Ρ & gt? 0,05). Τα αποτελέσματα αυτά δεν υποστηρίζουν μόνο το γεγονός ότι η ινονηκτίνη είναι αναγκαία για την μηχανικά διεγερμένη εισβολή, αλλά δείχνουν το επίπεδο «βασική» του ~ 10% εισβολή παρατηρήθηκαν σε κολλαγόνου /φιμπρονεκτίνη (μη διεγερμένα) και κολλαγόνο (διεγερμένα και μη διεγερμένα) καλλιέργειες είναι φιμπρονεκτίνης ανεξάρτητη. Επιπλέον, αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι οποιαδήποτε ινωδονεκτίνης που εκκρίνεται από τα κύτταρα ΗΤ1080 σε μήτρες (αν και μη ανιχνεύσιμο από στύπωμα Western? Σχήμα S1). Έχει επηρεάσει λίγο για τη μηχανική απόκριση

Λόγω της ετερογένειας των τύπων κυττάρου και κυττάρου αριθμούς εντός του στρώματος ήταν ασαφές σε ποια συχνότητα θα πρέπει να εφαρμοστεί το ερέθισμα. Για να καθοριστεί εάν η συχνότητα της διέγερσης σφαιριδίου ήταν ένας παράγοντας στην ενισχυμένη εισβολή, προσαρμόσαμε την ταχύτητα του περιστρεφόμενου μαγνήτη, περιστρέφονται με ταχύτητες των 8, 90 και 160 rpm ή 0,13, 1,5, και 2,6 Hz, αντίστοιχα. Το ποσοστό των εισβολή δεν διέφερε σημαντικά μεταξύ των καλλιέργειες που διεγείρονται σε 8 και 160rpm (

P

& gt? 0,05? Εικόνα 3C). Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι, μέσα σε μια 20-πλάσια φάσμα συχνοτήτων, ενισχυμένη εισβολή σε απάντηση μηχανική διέγερση είναι ανεπηρέαστη.

Επεμβατική κύτταρα αντιμετωπίζουν φυσικά εμπόδια εντός του ιστού ή του όγκου στρώμα συνδετικού και είναι πιθανό να ακολουθήσει το δρόμο της ελάχιστης αντίστασης [32]. Επιπλέον, είναι πιθανό να εισβάλουν κατά μήκος διαδρομών στις οποίες έχουν μήτρα που συνδέεται διαλυτών παραγόντων έχουν κυκλοφορήσει [19], [33] – [36]. Με βάση αυτή τη γνώση, θα ήταν σημαντικό να εξασφαλιστεί ότι κανένας από αυτούς τους παράγοντες συνέβαλαν στην αυξημένη εισβολή παρατηρείται σε δοκιμασία μας.

Ένας τρόπος με τον οποίο μήτρα μας θα μπορούσε να δημιουργήσει μονοπάτια της ελάχιστης αντίστασης για την κυτταρική εισβολή θα είναι μέσα από μια μόνιμη αναδιαμόρφωση που δημιουργείται από την κίνηση των ενσωματωμένων σφαιρίδια. Για να ελεγχθεί αυτή η πιθανότητα, έχουμε προ-διεγερμένα των μητρών πάνω από το περιστρεφόμενο μαγνήτη για 24 ώρες πριν από την σπορά των κυττάρων. Μετά από 24 ώρες καλλιέργειας με τις προ-διεγερμένα μήτρες, αλλά εκτός του μαγνητικού πεδίου, δεν παρατηρήσαμε αυξημένη εισβολή (Σχήμα 3D, αριστερό πάνελ). Επιπλέον, το μέσο του προ-διεγείρονται μήτρα δεν άλλαξε πριν από την σπορά των κυττάρων. Αυτό εξαλειφθεί το δυναμικό ότι διαλυτοί παράγοντες στη μήτρα είχαν απελευθερώνεται από την τράβηγμα των σφαιριδίων στη μήτρα και συμβάλλοντας στην αυξημένη εισβολή. Ωστόσο, όταν αυτά τα ίδια κυτταροκαλλιέργειες αναπτύχθηκαν σε προ-διεγερμένα μήτρα στη συνέχεια δόθηκε μαγνητική διέγερση, αυξημένη εισβολή παρατηρήθηκε ξανά (Σχήμα 3D, δεξιό πλαίσιο). Λαμβανόμενα μαζί, αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι οποιαδήποτε αναδιαμόρφωση ή απελευθέρωση διαλυτών παραγόντων από την μήτρα, λόγω της κίνησης των μαγνητικών σφαιριδίων δεν συμβάλλει στην αυξημένη εισβολή παρατηρούμε μετά από μηχανική διέγερση.

Η εισβολή αντίδραση είναι αυξημένη εάν το ερέθισμα είναι Δημοσιεύθηκε από Top ή Bottom

Η διάσταση του περιβάλλοντος είναι γνωστό ότι επηρεάζουν την κυτταρική συμπεριφορά. Συγκεκριμένα, τα κύτταρα ΗΤ1080 δειχθεί να αλλάξουν την ταχύτητα μετανάστευσή τους και την επιμονή σε τρεις διαστάσεις [37]. Σε αρχικά πειράματα μας, τα κύτταρα σπείρονται στην κορυφή του πλέγματος, εισβάλλοντας από την κορυφή προς τα κάτω, αρχίζοντας έτσι σε δύο διαστάσεις και κινείται σε τρεις. Για να αντιμετωπιστεί η επίδραση της διάστασης σε μηχανικές εισβολή αλλάξαμε τον προσανατολισμό του ερεθίσματος, ώστε τα κύτταρα θα εισβάλουν προς τα πάνω. Για να γίνει αυτό, θα εμβολιάζονται πρώτα των κυττάρων σε κολλαγόνο /ινονηκτίνη επικαλυμμένες καλυπτρίδες πριν την επάλειψη και πολυμερισμό του ινωδονεκτίνης διάλυμα κολλαγόνου //μαγνητικά σφαιρίδια πάνω τους (Σχήμα 4Α). Το μαγνητικό πεδίο στη συνέχεια εφαρμόστηκε στην κορυφή της καλλιέργειας με περιστροφή του μαγνήτη πάνω από την στατική καλλιέργεια (Σχήμα 4Β). Μετά από 24 ώρες διέγερσης, βρήκαμε τα κύτταρα εισέβαλαν εξίσου καλά όπως έκαναν όταν σπάρθηκαν πάνω από τις μήτρες πριν από τη διέγερση (6% εισβολή σε μη διεγερμένα και 13% σε διεγερμένες καλλιέργειες) (Σχήμα 4Β). Ωστόσο, βρήκαμε κατά 48 ώρες η διαφορά μεταξύ μη διεγερμένων εισβολή και διεγείρονται εισβολή ήταν ακόμη μεγαλύτερη, έτσι ώστε το 12% των κυττάρων εισέβαλαν σε μη διεγερμένα έναντι 41% εισβολή στις διεγερμένες καλλιέργειες. Έτσι, μια ακόμη μεγαλύτερη αύξηση της εισβολής λαμβάνει χώρα στην απόκριση προς μηχανική διέγερση που εφαρμόζεται όταν τα κύτταρα άρχισαν σε ένα τρισδιάστατο περιβάλλον.

Α) κύτταρα ινοσαρκώματος ΗΤ1080 σπάρθηκαν επί ενός κολλαγόνου /ινονηκτίνης επικαλυμμένες coverglass στο κάτω μέρος του φρεατίου. Αφού τα κύτταρα είχαν προσκολληθεί, ένα κολλαγόνο τύπου Ι διαλύματος /ινωδονεκτίνης που περιέχει μικροσφαιρίδια παραμαγνητικά αποτέθηκε επί των κυττάρων και αφήνεται να πολυμεριστεί. Οι καλλιέργειες είτε υποβλήθηκαν σε μαγνητική διέγερση ή καλλιεργούνται εκτός του μαγνητικού πεδίου. Β) Ο μαγνήτης περιστρέφεται πάνω από την καλλιέργεια ως κύτταρα αρχίζουν να εισβάλουν επάνω μέσα στην μήτρα. Γ) ΗΤ1080 κύτταρα σπάρθηκαν επί ενός επικαλυμμένου καλυπτρίδα κολλαγόνο ινονεκτίνη και επικαλύπτονται με μία μήτρα κολλαγόνου /φιμπρονεκτίνη καλλιεργήθηκαν είτε παρουσία ή απουσία ενός μαγνητικού πεδίου. Ποσοστό εισβολή υπολογίστηκε 24 και 48 ώρες μετά την διέγερση από τρεις ανεξάρτητες μελέτες (15 πεδία μετρήθηκαν ανά καλλιέργεια).