Αφηρημένο

Ιστορικό

Τα microRNAs (miRNAs) αποτελούν μια κατηγορία των μικρών μη-κωδικοποίησης RNA που ελέγχουν την γονιδιακή έκφραση με στόχευση mRNAs και την ενεργοποίηση είτε την καταστολή μετάφραση ή αποικοδόμηση RNA. Αναδυόμενες στοιχεία δείχνουν τη δυνατότητα συμμετοχής των αλλαγμένη ρύθμιση των miRNA στην παθογένεση του καρκίνου, και αυτά τα γονίδια πιστεύεται ότι λειτουργεί τόσο ως καταστολείς των όγκων και των ογκογονιδίων.

Μεθοδολογία /Κύρια Ευρήματα

Χρησιμοποιώντας μικροσυστοιχίες microRNA , έχουμε εντοπίσει αρκετές miRNAs έκτροπα που εκφράζονται σε ανθρώπινο ωοθηκών καρκινικούς ιστούς και κυτταρικές σειρές.

miR-221

ξεχωρίζει ως ιδιαίτερα αυξημένα miRNA στον καρκίνο των ωοθηκών, ενώ η

miR-21

και αρκετά μέλη του

7 ας-

οικογένειας βρίσκονται μειωτικά. Δημόσιες βάσεις δεδομένων χρησιμοποιήθηκαν για να αποκαλύψουν πιθανούς στόχους για τα υψηλά διαφορικά εκφρασμένων miRNAs. Για τον εντοπισμό πειραματικά μεταγραφές των οποίων η σταθερότητα μπορεί να επηρεασθεί από τις διαφορικά εκφραζόμενα miRNAs, επιμολύναμε πρόδρομος miRNAs σε ανθρώπινες καρκινικές κυτταρικές γραμμές και χρησιμοποιείται μικροδιατάξεις ολιγονουκλεοτιδίων για την εξέταση των αλλαγών στα επίπεδα mRNA. Είναι ενδιαφέρον, υπήρχε μικρή αλληλοεπικάλυψη μεταξύ της προβλεπόμενης και τα πειραματικά στόχους ή μονοπάτια, ή μεταξύ των πειραματικών στόχους /οδούς που λαμβάνεται χρησιμοποιώντας διαφορετικές κυτταρικές σειρές, επισημαίνοντας την πολυπλοκότητα της επιλογής στόχων των miRNAs.

Συμπέρασμα /Σημασία

Τα αποτελέσματά μας εντοπίσει αρκετά διαφορικά εκφρασμένων miRNAs στον καρκίνο των ωοθηκών και τον εντοπισμό δυνητικών μεταγραφές στόχο που μπορεί να ρυθμίζεται από τις miRNAs. Αυτά τα miRNAs και οι στόχοι τους μπορούν να έχουν σημαντικό ρόλο στην έναρξη και την ανάπτυξη του καρκίνου των ωοθηκών

Παράθεση:. Dahiya Ν, Sherman-Baust CA, Wang Τ-Ε, Davidson Β, Shih Ι-Μ, Zhang Y, et al. (2008) Έκφραση microRNA και ταυτοποίηση των Υποθετικά miRNA Στόχοι στον καρκίνο των ωοθηκών. PLoS ONE 3 (6): e2436. doi: 10.1371 /journal.pone.0002436

Επιμέλεια: Jörg Hoheisel, Deutsches Krebsforschungszentrum, Γερμανία

Ελήφθη: 4 Ιανουαρίου, 2008? Αποδεκτές: 6η Μαΐου 2008? Δημοσιεύθηκε: 18 Ιούν, 2008

Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της δήλωσης Creative Commons Public Domain που ορίζει ότι, μόλις τοποθετηθεί στο δημόσιο τομέα, το έργο αυτό μπορεί να αναπαραχθεί ελεύθερα, διανεμηθεί, μεταδοθεί, τροποποιηθεί, χτισμένο πάνω, ή ειδάλλως να χρησιμοποιηθεί από οποιονδήποτε για οποιονδήποτε νόμιμο σκοπό

Χρηματοδότηση:.. η έρευνα υποστηρίχθηκε από το εσωτερικό ερευνητικό πρόγραμμα του Εθνικού Ινστιτούτου Υγείας, Εθνικό Ινστιτούτο Γήρανσης

Οι ανταγωνιστικές ενδιαφέροντα:. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Τα microRNAs (miRNAs) είναι 21-23 νουκλεοτιδίων ρυθμιστικά RNA επεξεργασία 70-100 νουκλεοτιδίων φουρκέτα προ-miRNAs [1], [2]. Η miRNA ενσωματώνονται σε ένα συγκρότημα ριβονουκλεοπρωτεΐνης που ονομάζεται RNA επαγόμενη φίμωση σύμπλοκο (RISC) και να κατευθύνει την RISC στον στόχο mRNA [3]. Η δέσμευση του miRNA στον στόχο mRNA 5’UTR μπορεί μειορυθμίζει έκφραση γονιδίων μέσω αναστολής της μετάφρασης ή αυξημένη αποικοδόμηση RNA. Επιπλέον, πρόσφατα στοιχεία δείχνουν ότι miRNA μπορεί επίσης ρυθμίζουν προς τα πάνω τη μετάφραση κάτω από ορισμένες συνθήκες [4]. Εκατοντάδες miRNAs έχουν εντοπιστεί σε διάφορα είδη, συμπεριλαμβανομένων των

C. elegans

, τους ανθρώπους, και το εργοστάσιο

Arabidopsis thaliana

. Πιστεύεται ότι miRNAs θηλαστικών έχουν τη δυνατότητα να ρυθμίζουν τουλάχιστον 20-30% όλων των ανθρώπινων γονιδίων [5]. Κάθε miRNA μπορεί να στοχεύσει έως 200 μεταγραφές, άμεσα ή έμμεσα, και πολλαπλές miRNAs μπορούν να στοχεύσουν ένα συγκεκριμένο γονίδιο [6]. Ως εκ τούτου, η πιθανή ρυθμιστική κύκλωμα που παρέχεται από miRNA είναι εξαιρετικά περίπλοκη. Η έκφραση αρκετών miRNAs έχει δειχθεί ότι ρυθμίζεται εξελικτικά και αρκετές μελέτες έχουν δείξει ότι miRNA είναι υπεύθυνοι για τον καθορισμό της κυτταρικής τύχης. Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι miRNAs διαδραματίζουν σημαντικό ρόλο σε βασικές κυτταρικές λειτουργίες, συμπεριλαμβανομένου του χρόνου της κυτταρικής ανάπτυξης, αιματοποίηση, το μεταβολισμό του λίπους, οργανογένεση, απόπτωση, κυτταρικό πολλαπλασιασμό και διαφοροποίηση. Υπάρχουν επίσης ισχυρές ενδείξεις ότι οι miRNAs εμπλέκονται στην εμφάνιση και την εξέλιξη πολλών ασθενειών, συμπεριλαμβανομένου του καρκίνου [3].

Σύγκριση μεταξύ ανθρώπινων καρκίνων και φυσιολογικών αντίστοιχά τους έχουν αποκαλύψει διακριτά προφίλ έκφρασης miRNA. Πράγματι, ένας αριθμός μελετών έχουν αναφέρει διαφορικά ρυθμίζονται miRNAs σε διάφορους τύπους καρκίνου, όπως ο καρκίνος του μαστού [7], ο καρκίνος του πνεύμονα [8], χρόνια λεμφοκυτταρική λευχαιμία [9], του καρκίνου του παχέος εντέρου [10], τα καρκινώματα του θυρεοειδούς [11], παγκρεατικό καρκίνο [12], καρκίνο κεφαλής και τραχήλου [5], του καρκίνου του προστάτη [13], αδενώματα της υπόφυσης [14], και τον καρκίνο των ωοθηκών [15] – [18]. Συλλογικά, οι μελέτες αυτές καταδεικνύουν ότι ορισμένα ανθρώπινα miRNAs απορυθμισμένη με συνέπεια στον ανθρώπινο καρκίνο, υποδηλώνοντας ένα ρόλο για αυτά τα γονίδια στην ογκογένεση. Ειδικές υπερ-έκφραση ή υπό έκφραση ορισμένων miRNAs έχει δειχθεί ότι συσχετίζεται με συγκεκριμένους τύπους όγκων [19]. Υπερεκφράζεται miRNAs θα μπορούσαν δυνητικά να στοχεύσει ογκοκατασταλτικά γονίδια, ενώ μειωτικά miRNAs θα ρυθμίζει θεωρητικά ογκογονίδια. Για παράδειγμα, το

ας-7

miRNAs, τα οποία είναι κάτω ρυθμίζονται στον καρκίνο του πνεύμονα, μπορεί να ρυθμίσει αρνητικά την ογκογονίδια RAS και HMGA2, παρέχοντας έναν μηχανισμό για την ρύθμιση προς τα άνω των εν λόγω ογκογονιδίων [8], [20], [ ,,,0],21]. Έτσι, τα μέλη της η

ας-7

οικογένεια λειτουργία βιολογικά ως καταστολείς των όγκων και η απώλεια τους αναμένεται να προωθήσει τον μετασχηματισμό και την εξέλιξη του όγκου. Αντίθετα, το ανθρώπινο σύμπλεγμα miRNA

miR-17-92

ενεργεί ως ογκογονίδιο στην Β-κυτταρικό λέμφωμα [22] και τον καρκίνο του πνεύμονα [23], και μπορούν να συνεργάζονται με

myc

[22] .

έχουν υπογραφές έκφραση Μοναδικό miRNA έχουν βρεθεί να σχετίζονται με βιο-μοριακά και προγνωστικές χαρακτηριστικά της ανθρώπινης καρκίνου του πνεύμονα και χρόνια λεμφοκυτταρική λευχαιμία [8], [24], υποδηλώνοντας ότι θα μπορούσε να χρησιμοποιηθεί miRNA υπογραφές για τον ορισμό βιολογικών ή κλινικά χαρακτηριστικά των ανθρώπινων καρκίνων. Η ανάπτυξη νέων δεικτών miRNA στο εγγύς μέλλον θα αποτελέσει έναν από τους κύριους στόχους στη μοριακή ιατρική ως προφίλ έκφρασης των miRNAs θα μπορούσε να χαρακτηρίσει καλύτερα φτωχά διαφοροποιημένα καρκινώματα σε σύγκριση με τους ταξινομητές μεταγραφή με βάση [19].

Υπάρχει ένας περιορισμένος αριθμός μελετών στη βιβλιογραφία σχετικά με τους ρόλους των miRNAs στον καρκίνο των ωοθηκών. Zhang et al. ανέφεραν γονιδιωματική μεταβολές υψηλής συχνότητας που περιλαμβάνει τα γονίδια miRNA σε 227 ανθρώπινου καρκίνου, ο καρκίνος του μαστού και μελάνωμα δείγματα ωοθήκης [15]. Σε μια άλλη μελέτη, 84 ιστούς (15 κανονική και 69 κακοήθη) και 5 κυτταρικές γραμμές αναλύθηκαν για μεταβολή στο προφίλ miRNA [16]. Τέλος, μια μελέτη αναλύει 10 όγκους των ωοθηκών και 10 διαφορετικούς φυσιολογικούς μάρτυρες αναφέρθηκε πρόσφατα [17]. Στην έκθεση αυτή, περιγράφουμε μια σειρά πειραμάτων για να φωτιστούν οι αλλαγές στην έκφραση miRNA στον καρκίνο των ωοθηκών και να προσδιοριστούν οι πιθανοί στόχοι των σχετικών υποψήφιων miRNAs.

Αποτελέσματα

miRNA πρότυπα έκφρασης στη ωοθηκών ιστούς

προφίλ έκφρασης miRNA προσδιορίστηκαν για 34 ιστούς των ωοθηκών (Πίνακας 1) καθώς και 10 κυτταρικές γραμμές καρκίνου των ωοθηκών. Ένα αθανατοποιημένο ανθρώπινο επιφανειακό επιθήλιο ωοθηκική κυτταρική γραμμή χρησιμοποιήθηκε ως μη-μετασχηματισμένο έλεγχο. Τα προφίλ έκφρασης προσδιορίστηκαν χρησιμοποιώντας miRCURY ™ LNA miRNA πίνακες. LNAs είναι μια κατηγορία διαμορφωτικά περιορισμένο ανάλογα νουκλεοτιδίου που αυξάνουν συγγένεια του ολιγονουκλεοτιδίου για συμπληρωματικό RNA ή DNA στόχο του. Η συστοιχία Exiqon miRNA είναι σήμερα το πιο ολοκληρωμένο σύνολο ανιχνευτών είναι διαθέσιμα σε μια πλατφόρμα συστοιχία και επιτρέπει μια σε βάθος ανάλυση της έκφρασης των miRNAs. Μετά τον υβριδισμό RNA και ανάλυση της σειράς, τα δείγματα συγκεντρωμένα ανάλογα με το προφίλ τους miRNA χρησιμοποιώντας την ιεραρχική αλγόριθμο του λογισμικού JMP 6.0.0. Σχήμα 1Α δείχνει ιεραρχική ανάλυση ομαδοποίησης των καρκινικών ιστών και κυτταρικών σειρών που βασίζεται στη συνολική έκφραση των miRNAs. Τα προφίλ που παρουσιάζονται είναι σε σχέση με κύτταρα ωοθηκών επιφάνεια επιθηλιακών (ΣΩΛΗΝΑ-Β κύτταρα). Τα δείγματα χωρίζονται σε τρεις κύριες ομάδες. Η μεσαία συστάδα αποτελείται εξ ολοκλήρου από όγκους (17 δείγματα), ενώ το αριστερό σύμπλεγμα περιέχει 2 κυτταρικές σειρές και 7 πρωτογενείς όγκους. Το δικαίωμα σύμπλεγμα είναι εμπλουτισμένο σε κυτταρικές σειρές και περιέχει 8 κυτταρικές σειρές από τα 18 μέλη του συμπλέγματος. Η ιεραρχική συσταδοποίηση επαναλήφθηκε στη συνέχεια με βάση ένα πολύ μικρότερο αριθμό γονιδίων και περιλαμβάνονται μόνο 70 πολύ εκφράζονται διαφορικά miRNA σε καρκινικούς ιστούς των ωοθηκών και κυτταρικές σειρές. Αυτή η ανάλυση ομαδοποίηση οδήγησε σε πολλαπλές συστάδες, αλλά και πάλι, οι κυτταρικές σειρές συγκεντρωμένοι σε 2 διαφορετικές ομάδες, ενώ οι πρωτογενείς ιστοί ομαδοποιήθηκαν μαζί (Σχήμα 1Β), προτείνοντας συγκεκριμένες διαφορές στην έκφραση μεταξύ miRNA ωοθηκών καρκινικούς ιστούς και κυτταρικές σειρές.

Δέντρο που παράγεται από την ανάλυση διασποράς των ωοθηκών καρκινικούς ιστούς και κυτταρικές σειρές με βάση (Α) όλες τις ελεγχόμενες miRNAs σε ιστούς και κυτταρικές σειρές, και (Β) διαφορικά ρυθμιζόμενη miRNAs (Διπλώστε αλλαγή & gt? 2.0 ή & lt? 0.5 σε μεγαλύτερη από 60 % των δειγμάτων) σε ιστούς και κυτταρικές σειρές σε σύγκριση με τις κανονικές ελέγχου ΣΩΛΗΝΑ-Β κύτταρα.

η

Χρησιμοποιώντας ανάλυση κύριων συνιστωσών (PCA) βρήκαμε ότι η παγκόσμια έκφραση των miRNAs θα μπορούσε να διακρίνει τους όγκους του καρκίνου των ωοθηκών από κυτταρικές γραμμές καρκίνου ωοθηκών (Εικόνα 2). Η μη ογκογόνα ελέγχου ΣΩΛΗΝΑ-B παρουσίασαν επίσης ένα μοναδικό πρότυπο έκφρασης, διακριτή από αμφότερες τις κυτταρικές σειρές και ιστούς.

Δύο-διαστάσεων PCA δείχνει ότι η παγκόσμια πρότυπα έκφρασης miRNA είναι διαφορετικά σε κυτταρικές γραμμές καρκίνου ωοθηκών (αναφέρεται στην μπλε ), τους ιστούς του καρκίνου των ωοθηκών (υποδεικνύεται με πράσινο χρώμα), καθώς και οι μη-ογκογόνο ΣΩΛΗΝΑ-Β κύτταρα (με κόκκινο χρώμα).

η

διαφορικά εκφράζονται miRNAs

στη συνέχεια εντοπίστηκαν miRNAs που ήταν διαφορικά εκφράζεται μεταξύ μη νεοπλασματικών και νεοπλασματικών δείγματα (Σχήμα 3Α, Πίνακας 2). Μόνο miRNAs που τροποποιήθηκαν τουλάχιστον 2 φορές σε τουλάχιστον 60% των δειγμάτων θεωρήθηκαν σημαντικές υποψηφίων. Χρησιμοποιώντας αυτά τα αυστηρά κριτήρια, εντοπίσαμε 25 ρυθμίζεται προς τα πάνω και 31 μειωτικά miRNAs μεταξύ ελέγχου και καρκινικούς ιστούς. Παρομοίως, εντοπίσαμε 5 απορυθμίζεται και 23 μειωτικά miRNAs σε κυτταρικές γραμμές καρκίνου ωοθηκών σε σύγκριση με μη νεοπλασματικά ΣΩΛΗΝΑ-Β κύτταρα. 14 miRNAs έχουν απελευθερωθεί σε δύο ιστούς και κυτταρικές σειρές και παρατίθενται στο Σχήμα 3Α. Ο αριθμός των miRNAs που έδειξε προς τα κάτω ρύθμιση σε δείγματα όγκου (n = 31), καθώς και σε κυτταρικές γραμμές καρκίνου (n = 23) ήταν υψηλότερες από τον αριθμό των προς τα πάνω ρυθμισμένη (n = 25 σε ιστούς όγκων, η = 5 σε κυτταρικές σειρές) miRNAs . Αυτό είναι σε συμφωνία με προηγούμενα δημοσιευμένες μελέτες miRNA προφίλ, οι περισσότεροι εκ των οποίων έχουν δείξει αρνητική ρύθμιση των miRNAs να είναι πιο συχνές από ό, τι ρύθμιση προς τα πάνω στον καρκίνο [8], [13], [19], [25], [26].

(Α) Το διάγραμμα Venn δείχνει τον αριθμό miRNAs εκφράζονται διαφορικά σε κυτταρικές σειρές των ωοθηκών, σε ιστούς του καρκίνου των ωοθηκών και στις δύο. Για κάθε κατηγορία, οι miRNAs αυξημένα (υποδεικνύονται με κόκκινο) και μειωτικά (υποδεικνύεται με πράσινο χρώμα) υποδεικνύεται κάτω από το διάγραμμα. (Β) Το διάγραμμα Venn δείχνει τον αριθμό των διαφορικά εκφρασμένων miRNAs που προσδιορίζονται στην παρούσα μελέτη και τον αριθμό των miRNAs αταξινόμητους σε 3 προηγούμενες μελέτες για τον καρκίνο των ωοθηκών. Τα miRNAs στην κοινή αναγράφεται κάτω από το διάγραμμα και χρωματική κωδικοποίηση (κόκκινο: αυξημένα? πράσινο: μειωμένη)

Η

miR-221

ήταν η πιο ιδιαίτερα αυξημένα miRNA. και στις δύο ιστούς και κυτταρικές σειρές (9 φορές και 7 φορές αντίστοιχα), ενώ

miR-21

μειώθηκε σημαντικά σε δύο τύπους δείγματος (3-φορές και 9 φορές, αντίστοιχα) (Πίνακας 2). Μεταξύ των διαφόρων

7 ας-

μέλη της οικογένειας,

ας-7ε

και

ας-7f

έδειξε περισσότερο από 2 φορές την απορρύθμιση σε τουλάχιστον 60% των δειγμάτων όγκου . Το άλλο

ας-7

μέλη της οικογένειας (

ας-7g

,

ας-7η

,

ας-7c

,

ας-7a -e

,

ας-7i

,

ας-7α

,

ας-7b

δεν ρυθμίζεται προς τα κάτω, όπως σταθερά, αλλά κάθε μία από αυτές βρέθηκε μειώθηκε 2 φορές σε περισσότερο ή σε τουλάχιστον 20% των όγκων. Συνολικά, 94% των όγκων είχε τουλάχιστον ένα

ας-7

μέλος της οικογένειας ρυθμίζεται προς τα κάτω τουλάχιστον 2-φορές. οι κυτταρικές σειρές παρουσίασαν αρνητική ρύθμιση του

ας-7

μέλη της οικογένειας, καθώς και.

ας-7f

ήταν μειωτικά περισσότερο από 4 φορές σε κυτταρικές σειρές, ενώ η

ας-7η

και

ας-7a- e

ήταν επίσης μειώθηκε σημαντικά (πάνω από 2,3 φορές και 2 φορές, αντίστοιχα).

στη συνέχεια συνέκριναν τα διαφορικά ρυθμιζόμενη miRNAs των ωοθηκών που προσδιορίζονται στην παρούσα μελέτη με εκείνα που αναφέρθηκαν σε τρεις προηγούμενες μελέτες [15] -.. [17] από ένα σύνολο 136 miRNAs βρέθηκαν απορυθμισμένη στις προηγούμενες μελέτες, 16 εντοπίστηκαν επίσης στη μελέτη μας (Εικόνα 3Β) από αυτά τα 16 miRNAs, 9 ρυθμίστηκαν προς τα κάτω (

ας-7η

,

miR-106b

,

miR-122a

,

miR-141

,

miR-183

,

miR-195

,

miR-200a

,

miR-335, mir424

) και 7 υπερεκφράζεται (

miR-100

,

miR-199α

,

miR -296

,

miR-29a

,

miR-29γ

,

miR-99a, mir-494

). Είναι ενδιαφέρον, αναφέρουμε 56 miRNAs που δεν έχουν προηγουμένως βρεθεί απελευθερωθεί σε καρκίνο των ωοθηκών (Εικόνα 3Β).

Προβλεπόμενη στόχους γονίδιο γονιδίων miRNA

miRNAs μπορεί να ρυθμίσει ένα μεγάλο αριθμό γονιδίων στόχων και αρκετών βάσεις δεδομένων βασίζονται σε διάφορες αλγόριθμοι είναι διαθέσιμα για την πρόβλεψη των στόχων των επιλεγμένων miRNAs. Στόχου Σάρωση 3.0 και PicTar χρησιμοποιήθηκαν για την πρόβλεψη των στόχων του γονιδίου της απελευθερωμένης miRNAs που προσδιορίζονται στην παρούσα μελέτη. Ο Πίνακας 2 παραθέτει το top 3 προβλέψει στόχους, σύμφωνα τόσο με Target Σάρωση και PicTar για κάθε διαφορικά εκφρασμένων miRNAs. Υπήρχε μικρή επικάλυψη μεταξύ των στόχων που προσδιορίζονται με τις δύο διαφορετικές βάσεις δεδομένων και μόνο 7 στόχους (FAM44B, BACH1, BCL6, HMGA2, CALU, FGF2, και TNKS2) για 7 miRNAs (

οικογένειας let-7

,

miR-98

,

miR-155

,

miR-195

,

miR-346

,

miR-206

,

miR-335

) μοιράστηκαν μεταξύ αυτών των δύο βάσεων δεδομένων, όταν εξετάστηκαν οι 3 πρώτες στόχους.

Πειραματική αναγνώριση των στόχων των miRNAs

Για να μελετήσει περαιτέρω τους πιθανούς στόχους των βασικών miRNAs των ωοθηκών, υπερεκφράσαμε

miR-34γ

,

miR-98

,

miR-424

, και

ας-7f

σε 2 κυτταρικές σειρές καρκίνου των ωοθηκών (BG -1 και ΟΣΕ-101).

miR-424

και

ας-7f

ρυθμίστηκαν προς τα κάτω και στις δύο ιστούς και κυτταρικές σειρές (Σχήμα 3Α), ενώ

miR-34c

και

miR-98

βρέθηκαν κατιούσα ρύθμιση σε ιστούς του καρκίνου των ωοθηκών και σε κυτταρικές σειρές, αντίστοιχα. Το Σχήμα 4 δείχνει την επιτυχή υπερ-έκφραση των miRNAs 72 ώρες μετά την επιμόλυνση. Στη συνέχεια χρησιμοποιείται Illumina μικροσυστοιχίες για να διερευνήσει τις αλλαγές σε επίπεδο mRNA μετά την υπερέκφραση αυτών των υποψηφίων. Πίνακες 3 και 4 απαριθμούν τις μεταγραφές που έγιναν πιο σημαντικά μεταβληθεί μετά από υπερ-έκφραση των miRNAs στην BG-1 και κυτταρικές σειρές UCI-101, αντίστοιχα. Είναι ενδιαφέρον ότι, οι πίνακες αυτοί περιλαμβάνουν γονίδια όπως

GPX3, MCM7, MSN

που έχουν προηγουμένως εμπλακεί στον καρκίνο των ωοθηκών. Ανάμεσα στα σημαντικά μεταβληθεί γονίδια (απόλυτη Ζ-δείκτης & gt? 1.5), υπάρχουν 10 γνωστά γονίδια του καρκίνου (

MSN, Pim1, CBL, COL1A1, COX6C, EVI1, EXT1, HLXB9, PTPN11, TCEA1

), 4 όγκων γονίδια καταστολής (

HIF1A, CAV1, GADD45A, PTTG1IP

), 26 γονίδια του κυτταρικού κύκλου (

ACAT2, CDK5, FDPS, ID 1, LLGL1, MAD2L1, ANLN, ATAD2, C12orf48, CD9, ECT2, GADD45A, GSTO1, HSPD1, IPO7, KNTC2, KRT18, MRPS17, NUDT1, PFN1, PRKCA, SFRP1, SKP2, SNRPA1, VAMP8, WEE1

), και 6 γονίδια που εμπλέκονται στην αναδιάταξη της χρωματίνης (

ASF1A, GCN5L2, ATAD2, CBX2 , CBX4, NCOA3

). Πολύ μικρή επικάλυψη βρέθηκε μεταξύ της προβλεπόμενης (Pictar και Target Scan) και την πειραματική στόχους. Είναι ενδιαφέρον ότι, οι πειραματικές στόχοι διέφεραν ανάλογα με την κυτταρική σειρά που χρησιμοποιείται, γεγονός που υποδηλώνει μια σημαντική επιρροή της μοριακής υπόβαθρο για την επιλογή στόχου miRNA. Για να επικυρώσετε τα δεδομένα Illumina, RT-PCR πραγματοποιήθηκε στις 8 γονίδια βρέθηκαν να είναι οι στόχοι του

ας-7f

(

KIF1A, ASS, FDPS, NTS

σε ΟΣΕ-101 κύτταρα, και

ΤΡΡ1, EEF1A2, ESM1, VIM

, σε κύτταρα BG-1) (Σχήμα 5). Βρήκαμε ότι, ενώ οι απόλυτες τιμές ήταν διαφορετικές, οι τάσεις ήταν οι ίδιες.

KIF1A

και

ASS

βρέθηκαν αυξημένα σε ΟΣΕ-101, ενώ η

FDPS

και

NTS

ρυθμίστηκαν προς τα κάτω σε αυτά τα κύτταρα.

TFF1

και

EEF1A2

επιβεβαιώθηκαν να είναι αυξημένα σε BG-1, ενώ η

ESM1

και

VIM

ρυθμίστηκαν προς τα κάτω.

προ

miR-34γ

,

Pre-miR-98

, προ

miR-424

, προ

ας-7f

ήταν υπερεκφράζεται σε BG-1 και ΟΣΕ-101. Τα προϊόντα για καθένα από τα miRNAs δεικνύεται εις διπλούν για τις δύο κυτταρικές γραμμές που χρησιμοποιούνται. Σημαντική υπερέκφραση των miRNAs επιβεβαιώνεται. RT-PCR του 18S RNA εμφανίζεται για κάθε κατάσταση για να αποδείξουν ίση φόρτωση.

Η

Οι μεταγραφές που προσδιορίζονται από συστοιχίες Illumina να τροποποιηθεί μετά από ας-7f υπερέκφραση επικυρώνονται με RT-PCR. Διπλώστε αλλαγές για τα γονίδια

KIF1A, ASS, FDPS, NTS

(σε ΟΣΕ-101 κύτταρα), και

TFF1

,

EEF1A2, ESM1, VIM

(σε BG-1 τα κύτταρα) που φαίνονται και να επιβεβαιώσετε τις αλλαγές που προσδιορίζονται από συστοιχίες Illumina.

η

η χρήση αυτών των πειραματικών στόχων ως σημείο εκκίνησης (Πίνακας 3 και Πίνακας 4), χρησιμοποιήσαμε Ingenuity Ανάλυση Pathway (IPA) για να αποκαλύψει πιθανούς ασθένειες , μοριακές λειτουργίες, οργανικών συστημάτων, και κανονικών μονοπατιών που σχετίζονται με την έκφραση αυτών των miRNAs σε BG-1 (Πίνακας 5) και UCI-101 (Πίνακας 6). Δεν αποτελεί έκπληξη, η ανάλυση που προσδιορίζονται «καρκίνος» ως την κύρια ασθένεια που σχετίζεται με αυτά τα πρότυπα έκφρασης σε αμφότερες τις κυτταρικές σειρές. νόσος GI επίσης κοινώς. Είναι ενδιαφέρον ότι, κυτταρική κίνηση, του κυτταρικού κύκλου, και καρδιαγγειακών οι λειτουργίες των συστημάτων που βρίσκονται συχνά να σχετίζονται με αυτά τα πρότυπα έκφρασης. Υπήρξε μικρή συνοχή στις κανονικές οδούς που εντοπίστηκαν μέσω του ΜΠΒ και εκτός για τη σηματοδότηση της ιντεγκρίνης (που βρίσκονται παρακάτω miR34c ή έκφραση miR98 στην BG-1), καμία από τις κανονικές οδούς βρέθηκε πάνω από μία φορά στους Πίνακες 5 και 6. Συνεπώς, η παρούσα ανάλυση υποδηλώνει ότι ενώ οι γενικές πορείες που επηρεάζονται από

miR-34γ

,

miR-98

,

miR-424

, και

ας-7f

έκφραση σε αυτά τα δύο οι κυτταρικές γραμμές που σχετίζονται με τον καρκίνο, οι ακριβείς μοριακές οδοί στοχοθετημένων είναι μεταβλητά και εξαρτώνται από την κυτταρική γραμμή και τις miRNAs. Αυτό δείχνει και πάλι το υψηλό επίπεδο πολυπλοκότητας της επιλογής στόχων των miRNAs και ρύθμιση.

Η

Η

Συζήτηση

Προηγούμενες μελέτες έχουν δείξει ότι οι συγκεκριμένες miRNA υπογραφές έκφραση σε διάφορους ανθρώπινους καρκίνους μπορεί να συνδέεται με τη διάγνωση, την πρόγνωση και την ανταπόκριση θεραπεία [27]. Επιπλέον έχει προταθεί ότι συγκεκριμένες miRNAs μπορούν να έχουν κρίσιμους ρόλους στην έναρξη ή /και την πρόοδο των ανθρώπινων καρκίνων μέσω των αποτελεσμάτων τους σε διάφορες μοριακές οδοί. Μια καλύτερη κατανόηση της έκφρασης miRNA στον καρκίνο μπορεί να αποκαλύψει νέες μοριακές οδοί, ή νέων μηχανισμών ενεργοποίησης για γνωστές οδούς. Χρησιμοποιώντας τη συστοιχία Exiqon miRNA, την πιο ολοκληρωμένη σειρά miRNA διαθέσιμο, έχουμε λάβει υπογραφές έκφραση miRNA στον καρκίνο των ωοθηκών και προσδιόρισε διάφορες miRNAs εκφράζονται διαφορικά σε καρκίνο των ωοθηκών ιστούς και κυτταρικές σειρές, καθώς επίσης υποθετική στόχοι για αρκετά από αυτά τα miRNAs.

Έχουμε εντοπίσει συνολικά 70 miRNAs απελευθερωμένης στην ωοθηκών ιστούς και 14 από αυτούς έχουν έκτροπα που εκφράζονται σε κυτταρικές σειρές καρκίνου των ωοθηκών (Εικόνα 3Α). Συνολικά, υπήρχαν σχετικά λίγα miRNAs βρίσκονται σε κοινό μεταξύ αυτής της μελέτης και προηγούμενες μελέτες (Εικόνα 3Β). Υπάρχουν αρκετές πιθανές εξηγήσεις για αυτή την διαφορά. Πρώτον, η πλατφόρμα συστοιχία χρησιμοποιείται για την αναγνώριση των miRNA είναι διαφορετική και μπορεί να δώσει διαφορετικά σχήματα. Δεύτερον, το υλικό που χρησιμοποιείται ως κανονικός έλεγχος είναι διαφορετικό από αυτό που χρησιμοποιήθηκε σε προηγούμενες μελέτες και η επιλογή των κανονικών είναι γνωστό ότι επηρεάζει το αποτέλεσμα της ανάλυσης γονιδίου χαρακτηρισμού [28]. Χρησιμοποιήσαμε αθανατοποιημένα επιφάνεια επιθηλιακών κυττάρων των ωοθηκών, ενώ δύο από τις τρεις άλλες μελέτες miRNA ωοθηκών χρησιμοποιείται ολόκληρο ωοθήκες. Πιστεύουμε ότι ολόκληρο χύδην ιστός των ωοθηκών δεν είναι η πλέον κατάλληλη κανονικό έλεγχο ως η ωοθήκη αποτελείται από διάφορους τύπους κυττάρων και ότι το επιθήλιο αντιπροσωπεύει μόνο ένα μικρό κλάσμα του ωοθηκικού ιστού. Η χρήση ενός κυτταρικού στελέχους αθανατοποιημένη έχει επίσης μειονεκτήματα, αλλά πιστεύουμε ότι είναι μια καλύτερη προσέγγιση των φυσιολογικών επιθηλιακών ιστών ωοθήκης από το μίγμα υπάρχει σε ολόκληρο ωοθήκες. Σε κάθε περίπτωση, η ανεξάρτητη επικύρωση των προτύπων έκφρασης είναι ζωτικής σημασίας, ανεξάρτητα από την πηγή του φυσιολογικού ιστού ή όγκων που χρησιμοποιήθηκαν στη μελέτη.

Εντοπίζουμε

ας-7f

ως ιδιαίτερα κατιούσα ρύθμιση και στις δύο κυτταρικές γραμμές και όγκους. Έκφραση των διαφόρων

ας-7 έχουν

miRNAs αναφερθεί ότι ρυθμίζεται προς τα κάτω σε καρκίνους του μαστού [7], καρκίνους του πνεύμονα [29], τον καρκίνο του θυρεοειδούς [11], του καρκίνου του προστάτη [13], και του καρκίνου των ωοθηκών [15 ] – [17]. Μια ένωση μεταξύ

ας-7

κατιούσα ρύθμιση και κακή πρόγνωση έχει αναφερθεί σε ανθρώπινο πνεύμονα [29] και του καρκίνου του μαστού [7]. Η διαπίστωση ότι η

ας-7

οικογένεια miRNAs ρυθμίζει την έκφραση του ογκογονιδίου οικογένεια RAS παρέχει μια πιθανή μοριακή βάση για το ρόλο του

ας-7

miRNAs σε ανθρώπινο καρκίνο [20].

ας-7

Ως εκ τούτου, θεωρείται ότι είναι ένα ογκοκατασταλτικό miRNA και, περιέργως,

ας-7

γονίδια χάρτη σε τόπους διαγράφονται σε πολλαπλούς τύπους καρκίνου, συμπεριλαμβανομένου του καρκίνου των ωοθηκών [20]. Επιπλέον,

ας-7f

έχει αναφερθεί ότι προάγουν την αγγειογένεση μέσω στόχευσης αντι-αγγειογενετική γονίδια [30]. Η παρούσα εργασία, καθώς και μια προηγούμενες εκθέσεις [15] – [17] δείχνει ότι τα μέλη της η

ας-7

οικογένεια αλλοιώνονται με καρκίνο των ωοθηκών δείχνουν ότι

ας-7

μπορεί να αντιπροσωπεύει ένα σημαντικό παίκτης σε αυτή την ασθένεια. Θα είναι σημαντικό να προσδιοριστούν

ας-7

κατάντη στόχους που σχετίζονται με ογκογένεση των ωοθηκών.

Η πιο σταθερά και εξαιρετικά υπερεκφράζεται miRNA σε δύο ιστούς και κυτταρικές σειρές καρκίνου των ωοθηκών ήταν

miR-221

(Πίνακας 2).

miR-221

έχει αποδειχθεί να είναι ιδιαίτερα ρυθμίζεται αυξητικά σε καρκίνους του παγκρέατος [12], σε γλοιοβλάστωμα [31] και είχε εμπλακεί στον καρκίνο του θυρεοειδούς [32].

miR-221

έχει αποδειχθεί για να στοχεύσετε το ογκογονίδιο KIT [33], καθώς και το ογκοκατασταλτικό p27kip1 [34].

Ενώ

miR-21

υπερέκφραση έχει παρατηρήθηκαν σε αρκετές μορφές καρκίνου, που περιλαμβάνει το γλοιοβλάστωμα [31], του καρκίνου του μαστού [7], [35], ο καρκίνος του πνεύμονα [8], παγκρεατικό καρκίνο [36], τα ανθρώπινα κακοήθη cholangiocyte κυτταρικές γραμμές [37] και του καρκίνου του παχέος εντέρου [38], βρήκαμε αυτό το γονίδιο πολύ μειωτικά σε δείγματα μας. Ως Μάλιστα,

miR-21

ήταν η πιο σημαντική κατιούσα ρύθμιση miRNA στον καρκίνο των ωοθηκών, όταν τα δεδομένα μας κατά μέσο όρο σε όλες τις δειγμάτων και κυτταρικών σειρών. Το εύρημά μας είναι αντι-διαισθητικό, δεδομένου ότι έχει διαπιστωθεί ότι

miR-21

προς τα κάτω ρύθμιση σχετίστηκε με αυξημένη απόπτωση και μειωμένη πολλαπλασιασμό των κυττάρων [35].

miR-21

προτάθηκε να λειτουργεί ως ογκογονίδιο διαμόρφωση ογκογένεση μέσω της ρύθμισης των γονιδίων, όπως BCL2 [35], PTEN [37] και PDCD4 [39]. Αυτή τη στιγμή διερεύνηση των πιθανών στόχων του

miR-21

στα κύτταρα μας, καθώς και οι πιθανοί λόγοι πίσω από ρύθμιση προς τα κάτω της στο σύστημά μας. Είναι πιθανό ότι οι στόχοι ορισμένων miRNAs θα μπορούσε να είναι ιστο-ειδική, πράγμα που θα εξηγούσε τις διαφορές στους ρόλους των διαφόρων miRNA σε διαφορετικούς ιστούς.

Άλλα miRNAs βρέθηκαν εκφράζονται διαφορικά σε αμφότερες ιστούς και κυτταρικές σειρές είναι

miR-146b

,

miR-508

,

miR-106b

,

miR-134

,

miR-155

,

miR-346

,

miR-422Α

,

miR-424

,

miR-519a

,

miR-648

,

miR-662

. Αρκετά από αυτά τα miRNAs έχουν εμπλακεί σε άλλες κακοήθειες ή στον έλεγχο της ανάπτυξης και της απόπτωσης. Για παράδειγμα,

miR-134

μειωτικά την κυτταρική ανάπτυξη, και

miR-155

αυξημένη ανάπτυξη κυττάρου σε κύτταρα καρκινώματος του πνεύμονα, Α549 [40]. Η συμβολή του καθενός από αυτούς τους παίκτες να ωοθηκική καρκινογένεση μένει να καθοριστεί.

miR-34γ

πρόσφατα έχει αποδειχθεί ότι είναι ένας μεταγραφικός στόχος της p53 [41], [42] και μπορεί να καταστέλλουν τον πολλαπλασιασμό και το σχηματισμό αποικιών σε μαλακό άγαρ σε νεοπλασματικά επιθηλιακών κυττάρων των ωοθηκών [42]. Είναι ενδιαφέρον, βρήκαμε

miR-34γ

απελευθερωθεί σε ιστούς του καρκίνου των ωοθηκών και το εύρημα αυτό υποδηλώνει ότι

miR-34γ

μπορεί να διαδραματίσει έναν ρόλο στην ωοθηκών ογκογένεση μέσω του ρόλου της στην οδό ρ53.

Λόγω της ιδιαιτερότητας ιστού των miRNAs, διαφορετικά σύνολα miRNAs είναι πιθανόν να ρυθμίζεται προς τα πάνω ή προς τα κάτω ρυθμισμένη σε καρκίνους διαφορετικών κυτταρικών προελεύσεων, αν και έχει αναφερθεί ότι η miRNA υπογραφές διαφορετικών τύπων καρκίνου ειδικά επιθηλιακών θα μοιράζονται ορισμένα μεμονωμένα miRNAs [ ,,,0],38]. Από τα miRNAs που αναφέρθηκαν εδώ να εκφράζονται διαφορικά σε καρκίνο των ωοθηκών, αρκετές έχουν υποστεί παρόμοια απελευθερωθεί σε άλλους καρκίνους. Συνολικά, 31 miRNAs που προσδιορίζονται στην παρούσα μελέτη έχουν αναφερθεί επίσης απορυθμισμένη σε άλλο καρκίνο (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Επιπλέον, 16 miRNAs προσδιορίζονται εδώ έχουν αναφερθεί προηγουμένως για να μεταβληθεί σε καρκίνο των ωοθηκών (Εικόνα 3b). Ακόμη πιο ενδιαφέρον, εντοπίζουμε 56 miRNAs που δεν έχουν προηγουμένως βρεθεί εκφράζονται διαφορικά σε καρκίνο των ωοθηκών. Αυτά τα miRNA μπορεί να διαδραματίσει έναν ρόλο στην ωοθηκών ογκογένεση και στο στάδιο της έρευνας.

Για να εντοπίσει πιθανούς στόχους των διαφορικά εκφρασμένων miRNAs στον καρκίνο των ωοθηκών ψάξαμε δύο μεγάλες βάσεις δεδομένων, PicTar και Target σάρωσης. Βρήκαμε ότι υπήρχε πολύ μικρή επικάλυψη μεταξύ των προβλεπόμενων στόχων του κάθε αλγορίθμου. Πράγματι, μόνο 7 (FAM44B, BACH1, BCL6, HMGA2, CALU, FGF2, και TNKS2) προέβλεψε στόχους μοιράστηκαν μεταξύ των δύο αυτών βάσεων δεδομένων. Αυτό το αποτέλεσμα απεικονίζει τις καλά τεκμηριωμένες δυσκολίες πρόβλεψη στόχων για miRNA [43]. Επιπλέον, είναι πιθανό ότι οι στόχοι μπορεί να εξαρτάται από το κυτταρικό περιβάλλον, (σχετικές αναλογίες των διαφόρων πιθανών στόχων μπορούν να επηρεάσουν αυτά που είναι πιθανότερο να ρυθμίζεται προς τα κάτω) προσθέτοντας ένα άλλο στρώμα της πολυπλοκότητας στην επιλογή στόχου miRNA. Προκειμένου να διερευνηθεί πειραματικά τις αλλαγές στα επίπεδα mRNA, έχουμε υπερ-εκφράζεται 4 διαφορετικούς υποψηφίους miRNA (

miR-98

,

miR-424

,

miR-34c

και

ας-7ί

) σε 2 κυτταρικές σειρές και να αξιολογηθούν τα επίπεδα μεταγραφής με τη χρήση ενός ολιγονουκλεοτιδίου σειρά Illumina. Σαφώς, αυτή η προσέγγιση μπορεί να εντοπίσει μόνο miRNA στόχους που έχουν μεταβάλει τα επίπεδα mRNA (σε αντίθεση με τους στόχους αναστολή της μετάφρασης), αλλά έχει προηγουμένως δειχθεί ότι miRNAs μπορούν ρυθμίζουν προς τα κάτω τα επίπεδα ενός μεγάλου αριθμού αντιγράφων [44]. Ενώ μερικές από τις μεταγραφές μεταβληθεί δεν μπορεί να εκπροσωπεί άμεσα τους στόχους του αντίστοιχου miRNA, περαιτέρω ανάλυση των επιμέρους υποψήφιων mRNAs μπορεί να παράσχει αποδεικτικά στοιχεία ως προς το εάν εκπροσωπούν άμεσα ή δευτερεύοντες στόχους. Εφευρετικότητα Διαδρομή Ανάλυση των στόχων αποκάλυψε μια σειρά από μονοπάτια και το σύστημα ενδέχεται να ρυθμίζονται από τις υπερεκφράζεται miRNAs (Πίνακας 5 και Πίνακας 6). Είναι ενδιαφέρον ότι, οι προβλεπόμενες οδοί δεν ήταν συνεπείς μεταξύ των κυτταρικών γραμμών 2 και πάλι πρότειναν ότι η επιλογή στόχου miRNA και, ως εκ τούτου, η λειτουργία miRNA εξαρτάται σε μεγάλο βαθμό ιστού.

Όταν συγκρίθηκαν οι προβλεπόμενες στόχους (που λαμβάνεται με PicTar και Target Scan) με τα πειραματικά στόχους που λαμβάνεται με Illumina μικροσυστοιχιών, παρατηρήσαμε καμία επικάλυψη. Αυτό θα μπορούσε να οφείλεται σε διάφορους λόγους. Πρώτον, οι αλγόριθμοι για την αναγνώριση των στόχων miRNA μπορεί κατά προτίμηση να προσδιορίσει τους στόχους που έχουν ως αποτέλεσμα μεταγραφική καταστολή, η οποία προφανώς δεν θα προσδιορίζονται από πείραμα μικροσυστοιχιών μας. Επιπλέον, όπως συζητήθηκε προηγουμένως, είναι πιθανόν ότι οι στόχοι miRNA είναι ιστο-ειδικά. Σε συμφωνία με αυτή τη δυνατότητα είναι το γεγονός ότι οι στόχοι προσδιορίσαμε πειραματικώς ήταν εντελώς διαφορετική στις δύο κυτταρικές σειρές που χρησιμοποιήσαμε. Είναι ενδιαφέρον ότι, τα περισσότερα από τα υψηλά επάνω ρυθμιζόμενης και κάτω ρυθμιζόμενη (top 10) γονίδια έχουν ήδη αναφερθεί ότι έχουν ρόλους σε καρκίνο ή άλλες κυτταρικές δραστηριότητες που σχετίζονται με τον καρκίνο (Πίνακας 3 και 4), όπως GSTP1 [45], [46], HIF-1 [47], [48], και SGK [49].

σε αυτή τη μελέτη έχουμε εντοπίσει miRNAs εκφράζονται διαφορικά σε καρκίνο των ωοθηκών. Ως πρώτο βήμα για τον καθορισμό των ρόλων τους στην ωοθηκική καρκινογένεση, έχουμε αρχίσει να προσδιορίσει τους στόχους αυτών των miRNAs. Δείχνουμε ότι η προβλεπόμενη στόχοι είναι διαφορετικοί από το πειραματικό και ότι πειραματικές στόχοι ποικίλλουν ανάλογα με τον κυτταρικό υπόβαθρο στο οποίο εκφράζονται miRNAs. Ως εκ τούτου, θα είναι σημαντικό για τη μελέτη μεθοδικά το καθένα miRNAs σε διάφορα μοντέλα, προκειμένου να αποσαφηνίσει τους ρόλους τους στον καρκίνο των ωοθηκών. Επιπλέον, ένας συνδυασμός υπερέκφραση /στόχευσης εκδηλώσεις με miRNA μαζί με την τεχνολογία δέσμης πρωτεΐνης θα είναι κρίσιμης σημασίας στον προσδιορισμό της miRNA: mRNA παίκτες του καρκίνου των ωοθηκών. Η εικόνα που είναι πιθανό να προκύψουν είναι ένα εξαιρετικά πολύπλοκο σύνολο αλληλεπιδράσεων μεταξύ των miRNAs και mRNAs στόχο. Η καλύτερη κατανόηση αυτών των οδών θα μας φέρει ακόμα πιο κοντά στην κατανόηση του μοριακού μηχανισμού που διέπουν αυτή την ασθένεια και ελπίζουμε σε νέες προσεγγίσεις για την ανίχνευση και τη θεραπεία.

Υλικά και Μέθοδοι

Γραμμές κυττάρων και ιστών δείγματα

ωοθηκών σειρές καρκίνου BG-1, UCI-101, Hey, OVCA420, OVCA432, OVCA433, OVCAR2, OVCAR3 και OVCAR5 κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε μέσο ανάπτυξης McCoy 5Α (Invitrogen) συμπληρωμένου με 10% ορό εμβρύου βοός ( FBS) και αντιβιοτικά (100 μονάδες /ml πενικιλλίνη και 100 μg /ml στρεπτομυκίνη). Ο καρκίνος των ωοθηκών κυτταρική γραμμή OV90 καλλιεργήθηκε σε MCBD 105 μέσο (Sigma) + Medium 199 (Invitrogen) συμπληρωμένο με 15% FBS και αντιβιοτικά. HOSE-Β, μια κυτταρική γραμμή ωοθηκών επιφάνεια επιθηλιακών αθανατοποιημένα με Ε6 και Ε7 [50], καλλιεργήθηκε σε RPMI1640 συμπληρωμένο με 10% FBS, αντιβιοτικά και 5 ng /ml EGF. Δεκαοκτώ κατεψυγμένα πρωτογενείς καρκίνους των ωοθηκών ελήφθησαν μέσω της Συνεργατικής Ανθρωπίνων Ιστών Δίκτυο Γυναικολογικής Ογκολογίας του Ομίλου (Νοσοκομείο Παίδων, Columbus, ΟΗ). Επιπλέον, εννέα κατεψυγμένα δείγματα πρωτογενούς καρκίνου των ωοθηκών και επτά δείγματα RNA (από την πρωτογενή τους ιστούς του καρκίνου των ωοθηκών) ελήφθησαν από το Τμήμα Παθολογίας του The Johns Hopkins Ιατρικών Ιδρυμάτων (Βαλτιμόρη, MD). Η ιστολογική ταξινόμηση όλων των ιστών παρουσιάζεται στον Πίνακα 1 και όλα τα δείγματα βρέθηκαν να περιέχουν περισσότερο ότι το 80% των καρκινικών κυττάρων

εξαγωγή RNA & amp.? ποσοτικοποίηση

Το ολικό RNA ελήφθη χρησιμοποιώντας ΤπζοΙ (Invitrogen, Carlsbad, CA) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Το RNA ποσοτικά και αξιολογήθηκε χρησιμοποιώντας το RNA 6000 Nano Kit και 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies UK Ltd, West Lothian, UK).

miRNA υβριδοποίησης μικροσυστοιχιών

miRCURY ™ LNA miRNA Πίνακες (Exiqon), που αποτελείται από ανιχνευτές ελέγχου, ανιχνευτές αναντιστοιχία και 1458 ανιχνευτές σύλληψης, το ιδανικό ταίρι ανιχνευτές για όλα τα miRNA σε όλους τους οργανισμούς, όπως σχολιασμένο miRBase Release 8.1, Ιούλιος 2006 (ανθρώπινα miRBase 8,2 καλύπτεται επίσης) χρησιμοποιήθηκαν σε αυτή τη μελέτη. Οι ανιχνευτές σύλληψης καλύπτουν το 92,3% των miRNAs σχολιασμένο miRBAse 9.0. Οι ανιχνευτές ελέγχου περιλαμβάνει 10 ακίδα στο ανιχνευτές ελέγχου για να εξασφαλιστεί η βέλτιστη επισήμανση και την υβριδοποίηση, οκτώ αρνητικές ανιχνευτές σύλληψης και δώδεκα ανιχνευτές σύλληψης που υβριδοποιούνται σε μικρό πυρηνικό RNA. επισήμανσης RNA και υβριδοποίηση ολοκληρώθηκε σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Εν συντομία, RNA από κάθε δείγμα σημάνθηκε με Cy3 χρησιμοποιώντας miRCURY ™ LNA miRNA κιτ επισήμανσης Array. Μετά την επισήμανση, τα δείγματα φορτώθηκαν στο slide μικροσυστοιχία και επωάζονται 16-18 ώρες στους 60 ° C.