Αφηρημένο

Icaritin, μια ένωση από το

Epimedium Γένος

, έχει επιλεκτική υποδοχέα οιστρογόνων (ER) ρύθμιση των δραστηριοτήτων, και κατέχουν δράση κατά των όγκων. Εδώ, εξετάσαμε icaritin επίδραση στην κυτταρική ανάπτυξη των ανθρώπινων κυττάρων καρκίνου του ενδομητρίου Hec1A και διαπίστωσε ότι icaritin ανέστειλε ισχυρά τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων Hec1A. Icaritin-ανέστειλε την ανάπτυξη των κυττάρων που σχετίζεται με αυξημένα επίπεδα ρ21 και ρ27 έκφρασης και μειωμένη cyclinD1 και cdk 4 έκφρασης. Icaritin επάγεται επίσης απόπτωση των κυττάρων συνοδεύεται από ενεργοποίηση κασπασών όπως αποδεικνύεται από την διάσπαση του ενδογενούς υποστρώματος Poly (ADP-ριβόζη) πολυμεράσης (PARP) και την απελευθέρωση κυτοχρώματος c, το οποίο καταργήθηκε με προ-επεξεργασία με τον αναστολέα παν-κασπάσης z-VAD-fmk. θεραπεία Icaritin επαγόμενη επίσης έκφραση των προ-αποπτωτική πρωτεΐνη Bax με ταυτόχρονη μείωση της έκφρασης Bcl-2. Επιπλέον, icaritin που προκαλείται από παρατεταμένη φωσφορυλίωση της εξωκυτταρικό σήμα ρυθμίζεται kinase1 /2 (η ΜΑΡΚ /ERK1 /2) σε κύτταρα Hec1A και U0126, μια κινάση συγκεκριμένη ΜΑΡ κινάσης (MEK1 /2) αναστολέα, μπλοκάρει την ενεργοποίηση των ERK1 /2 από icaritin και καταργήθηκε ο icaritin επαγόμενη αναστολή της ανάπτυξης και την απόπτωση. Τα αποτελέσματά μας έδειξαν ότι icaritin που προκαλείται από παρατεταμένη ERK 1/2 ενεργοποίηση και ανέστειλε την ανάπτυξη του καρκίνου του ενδομητρίου κυττάρων Hec1A, και παρείχε μια λογική για την προκλινική και κλινική αξιολόγηση των icaritin για ενδομητρίου θεραπεία του καρκίνου

Παράθεση:. Tong JS, Zhang QH , Huang Χ, Fu XQ, Qi ST, Wang YP, et al. (2011) Icaritin Αιτίες Παρατεταμένη ERK1 /2 Ενεργοποίηση και επάγει την απόπτωση στα ανθρώπινα κύτταρα του ενδομητρίου Ο καρκίνος. PLoS ONE 6 (3): e16781. doi: 10.1371 /journal.pone.0016781

Επιμέλεια: Syed Αζίζ, Health Canada, Καναδάς

Ελήφθη: 8 του Δεκέμβρη του 2010? Αποδεκτές: 14 Γενάρη του 2011? Δημοσιεύθηκε: 8 Μαρτίου 2011

Copyright: © 2011 Tong et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από το Major μέλος πρόγραμμα βασικής έρευνας της Κίνας να QY Sun (2011CB94451). Το έργο αυτό υποστηρίζεται επίσης από το DK070016 επιχορήγηση NIH να Z.Y. Wang και οι Νεμπράσκα καπνού Διακανονισμού Ιατροβιολογικών Ερευνών Βραβεία Πρόγραμμα (LB-595 και LB692) να Z.Y. Ο Wang. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

καρκίνο του ενδομητρίου είναι μια από τις πιο κοινές κακοήθειες θηλυκό πυέλου και είναι η τέταρτη πιο κοινή μορφή καρκίνου σε γυναίκες της Βόρειας Αμερικής πίσω του πνεύμονα, του μαστού, του παχέος εντέρου και του καρκίνου, με 42.160 νέες περιπτώσεις και 7.780 θανάτους εκτιμάται για το 2009 [ ,,,0],1], [2], [3]. Περίπου 81.500 γυναίκες που πλήττονται κάθε χρόνο στην Ευρωπαϊκή Ένωση και η συχνότητα αυξάνεται. Η μέση ηλικία εμφάνισης είναι τα 63 έτη, ενώ & gt? 90% των γυναικών είναι ηλικίας άνω των 50 [4]. Αν και οι ασθενείς με διάγνωση και θεραπευτική αγωγή για πρώιμο στάδιο νόσου του ιστολογία ενδομητριοειδές απολαμβάνουν σχετικά καλά ποσοστά επιβίωσης, οι ασθενείς με προχωρημένο (σταδίου ΙΙΙ ή IV, σύμφωνα με το νέο αναθεωρημένο σύστημα από τη Διεθνή Ομοσπονδία Γυναικολογίας και Μαιευτικής [ΦΥΓΩ]) ή υποτροπιάζοντα καρκίνο του ενδομητρίου έχουν φτωχή πρόγνωση [5]. Για τις γυναίκες με τη νόσο πρώιμο στάδιο, η χειρουργική επέμβαση με εξατομικευμένη χρήση του όγκου σε σκηνοθεσία ακτινοθεραπείας είναι θεραπευτική [6]. Για τις γυναίκες με προχωρημένο στάδιο της νόσου, δεν υπάρχει πραγματική πρότυπο της φροντίδας και παραδοσιακά αυτές οι γυναίκες αντιμετωπίζονται με χειρουργική επέμβαση, χημειοθεραπεία και ακτινοβολία, σε ένα ή περισσότερους συνδυασμούς. Στον καθορισμό των προηγμένων ή υποτροπιάζουσα νόσο, ιδιαίτερα όταν δεν είναι δεκτικά χειρουργική εκτομή, το σήμα κατατεθέν της θεραπείας ήταν η χημειοθεραπεία [7]. Παρά το γεγονός ότι πολλοί ασθενείς αρχικά απαντούν στη χημειοθεραπεία, την αντίσταση και όγκο υποτροπή τελικά να αναπτύξουν [5]. Έτσι, είναι επιτακτική ανάγκη για την ανάπτυξη νέων θεραπευτικών παραγόντων για την αποτελεσματική αντιμετώπιση αυτής της θανάσιμης ασθένειας.

Icaritin (Εικ. 1Α) είναι ένα υδρολυτικό προϊόν του icariin από

Epimedium

, μια παραδοσιακή κινεζική φυτικό φάρμακο. Icaritin παρουσιάζει πολλά φαρμακολογικές και βιολογικές δραστηριότητες, όπως η διέγερση της νευρωνικής και καρδιακών διαφοροποίηση [8], [9], ενίσχυση της οστεοβλαστικής και κατέστειλε διαφοροποίηση οστεοκλαστικής και δραστηριότητα [10], πρόληψη των στεροειδών σχετίζεται με οστεονέκρωση [11], η αναστολή της ανθρώπινης καρκίνωμα του προστάτη ανάπτυξη PC-3 κυττάρου [12], η επαγωγή του ανθρώπινου προστατικού λείου μυός κυττάρων απόπτωση μέσω ERK1 /2 μονοπατιού [13], και νευροπροστατευτικές επιδράσεις [14]. Προηγουμένως, είχε αναφερθεί ότι icaritin παρουσιάζει δραστικότητα οιστρογόνου-όπως σε κύτταρα υποδοχείς οιστρογόνων θετικού καρκίνου του μαστού MCF-7 σε συγκεντρώσεις υπο-μικρομοριακή [15]. Σε μικρογραμμομοριακή κλίμακα, εν τούτοις, icaritin ανέστειλε την ανάπτυξη του καρκίνου του προστάτη PC-3 κύτταρα [12]. Αυτά τα αποτελέσματα έδειξαν ότι icaritin έχει τόσο αγωνιστή και ανταγωνιστή ανάλογα με τη συγκέντρωση και μπορεί να λειτουργεί ως ρυθμιστής υποδοχέα οιστρογόνου να ρυθμίζει την κυτταρική ανάπτυξη. Ωστόσο, δεν υπάρχουν αναφορές σχετικά με τη δραστηριότητα της icaritin κατά του καρκίνου του ενδομητρίου.

(Α) Η χημική δομή της icaritin. (Β) Επιπτώσεις της icaritin για την αναστολή της ανάπτυξης των κυττάρων Hec1A. Τα κύτταρα διατηρήθηκαν σε ελεύθερο ερυθρού φαινόλης μέσου με ορό εμβρύου 2,5% απογυμνωμένο με ενεργό άνθρακα για 24 ώρες, και στη συνέχεια υποβλήθηκε σε επεξεργασία με την υποδεικνυόμενη συγκέντρωση του icaritin. Τα κύτταρα συλλέχθηκαν σε διαφορετικά χρονικά σημεία, όπως η υποδεικνυόμενη και ο πολλαπλασιασμός δυναμικό εκτιμήθηκε με ανάλυση ΜΤΤ. Αποτελέσματα οκτώ ανεξάρτητα πειράματα κατά μέσο όρο και η μέση ± SEM. *,

P

& lt?. 0.05 σε σύγκριση με τα κύτταρα ελέγχου

Η

μιτογόνο ενεργοποιημένη πρωτεΐνη (ΜΑΡ) κινάσες συμμετέχουν σε διάφορες κυτταρικές λειτουργίες όπως πολλαπλασιασμό κυττάρων, κυτταρική διαφοροποίηση, την κυτταρική κινητικότητα, και κυτταρικό θάνατο [16]. Υπάρχουν τρεις κύριες οικογένεια ΜΑΡΚ υποομάδες: εξωκυτταρικό σήμα ρυθμιζόμενη kinase1 /2 (ERK1 /2), c-Jun Ν-τελική του στρες-ενεργοποιημένης πρωτεΐνης kinases1 /2 (JNK1 /2) και ο ρ38 πρωτεϊνικών κινασών. Οι καταρράκτες σηματοδότησης που περιλαμβάνουν την JNK και ρ38, που ενεργοποιείται από εξωκυτταρικά σήματα στρες, εμπλέκονται στην κυτταρική διαφοροποίηση και την απόπτωση [17], [18]. Προηγούμενες μελέτες έχουν δείξει ότι παροδική ενεργοποίηση του ERK1 /2 παίζει έναν κεντρικό ρόλο στον κυτταρικό πολλαπλασιασμό και ότι υπέστη ενεργοποίηση ERK1 /2 επάγει αναστολή του κυτταρικού κύκλου και τη διαφοροποίηση [19], [20]. Στην παρούσα μελέτη, αποδείξαμε εδώ ότι η ενεργοποίηση των ERK1 /2 σηματοδοτικό μονοπάτι μεσολαβεί icaritin απόπτωση των κυττάρων Hec1A.

Στην παρούσα μελέτη, διαπιστώσαμε ότι icaritin πυροδότησε μια μιτοχόνδριο μεσολάβηση Hec1A κύτταρα απόπτωσης και υπέστη ενεργοποίηση του ERK1 /2 μονοπάτι /ΜΑΡΚ. Τα αποτελέσματά μας πρότεινε ότι icaritin μπορεί να είναι χρήσιμη ως αντικαρκινικός παράγοντας σε ενδομητρίου θεραπεία του καρκίνου.

Αποτελέσματα

Icaritin αναστέλλει την ανάπτυξη του καρκίνου του ενδομητρίου κυττάρων Hec1A

Προηγουμένως, είχε αναφερθεί icaritin ανέστειλε ισχυρά την ανάπτυξη κυττάρων καρκίνου του προστάτη PC-3, κύτταρα καρκίνου του μαστού και κύτταρα ηπατώματος HepG2 [12], [15], [21]. Αποφασίσαμε να εξετάσει την επίδραση της icaritin στην ανάπτυξη του ενδομητρίου κυττάρων Hec1A. Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με διάφορες συγκεντρώσεις icaritin για 12 ώρες, 24 ώρες, και 48 ώρες, και την ανάπτυξη των κυττάρων μετρήθηκε με την δοκιμασία ΜΤΤ. Βρήκαμε ότι υπήρξε μια δοσοεξαρτώμενη και χρονοεξαρτώμενη μείωση της ανάπτυξης των κυττάρων σε επεξεργασία με Hec1A icaritin (Εικ. 1Β), υποδεικνύοντας ότι icaritin αναστέλλει τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων Hec1A.

Για την ανίχνευση του μηχανισμού υποκείμενων icaritin επαγόμενη διακοπή του κυτταρικού κύκλου, εξετάστηκαν κύριους ρυθμιστές G1 φάση, όπως κυκλίνη D1 /cdk4 και αναστολείς κινάσης εξαρτώμενης από κυκλίνη WAF1 /p21 και KIP1 /ρ27. Όπως φαίνεται στο Σχ. 2Α, icaritin θεραπεία οδήγησε σε αξιοσημείωτη μείωση των επιπέδων έκφραση της κυκλίνης D1 και cdk4 και την αύξηση του WAF1 /ρ21 και KIP1 έκφρασης /ρ27 σε σύγκριση με τα κύτταρα σε αγωγή με φορέα (Σχ. 2Β). Αυτά τα δεδομένα έδειξαν ότι icaritin ήταν σε θέση να επάγει αναστολή του κυτταρικού κύκλου και να ρυθμίζουν τελεστές συνδέονται με τον κύκλο.

(Α) κύτταρα Hec1A υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με την υποδεικνυόμενη συγκέντρωση του icaritin για 24 ώρες. Τα επίπεδα της κυκλίνης D1 και cdk4 προσδιορίστηκαν με κηλίδα western. Τα επίπεδα πρωτεΐνης του β-ακτίνης μετρήθηκαν επίσης ως έλεγχοι. κύτταρα (Β) Hec1A υποβλήθηκαν σε αγωγή με την υποδεικνυόμενη συγκέντρωση του icaritin για 24 ώρες. Τα επίπεδα του p21 και p27 προσδιορίστηκε με κηλίδα western. τα επίπεδα της πρωτεΐνης β-ακτίνης μετρήθηκαν επίσης ως μάρτυρες.

Η

Icaritin διεγείρει τα κύτταρα Hec1A απόπτωση

επόμενο τεστ αν icaritin προκαλεί επίσης αποπτωτικό κυτταρικό θάνατο σε ανθρώπινα καρκινικά κύτταρα του ενδομητρίου Hec1A. κύτταρα Hec1A υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με icaritin και απόπτωση προσδιορίστηκε με δύο διαφορετικές μεθόδους. Όπως φαίνεται στο Σχ. 3Α, ο αριθμός των TUNEL θετικών κυττάρων αυξήθηκε με αυξημένες συγκεντρώσεις icaritin. Νουκλεοσώματος κατακερματισμό, ένας δείκτης της απόπτωσης, προσδιορίστηκε με την κυτταρική Death Detection ELISA επιβεβαίωσε περαιτέρω ότι επάγεται icaritin απόπτωση των κυττάρων σε μια δόση και το χρόνο εξαρτώμενο τρόπο (εικ. 3Β). Επιπλέον, ένα V-χρώσης αννεξίνης κατέδειξε επίσης ότι icaritin επάγεται αποπτωτικό κυτταρικό θάνατο, αλλά όχι σε κύτταρα νέκρωση Hec1A (Σχ. 3C).

(Α) Απεικόνιση των αποπτωτικών κυττάρων με τη δοκιμασία TUNEL σε κύτταρα Hec1A. κατακερματισμού (Β) DNA αξιολογήθηκε χρησιμοποιώντας ένα κύτταρο κιτ Death Detection ELISA. Τα δεδομένα εκφράζονται ως μέση ± SEM τριών ξεχωριστών πειραμάτων. *,

P

& lt? 0,05 σε σύγκριση με τα κύτταρα ελέγχου. (Γ) Η αποπτωτική κατάσταση προσδιορίστηκε με τη μέθοδο χρώσης αννεξίνη V /PI. Ποσοστά αρνητικό (βιώσιμα) κύτταρα, V-θετικό (πρώιμων αποπτωτικών) κυττάρων αννεξίνη, κύτταρα ΡΙ-θετικό (νεκρωτική), ή αννεξίνη V και ΡΙ διπλά θετικά (αργά αποπτωτικά) κύτταρα εμφανίζονται (μέσος όρος τριών ανεξάρτητων πειραμάτων) με ένα ανάλυση κυτταρομετρίας ροής.

η

δόση και το χρόνο που εξαρτάται από επιδράσεις του icaritin στην πρωτεολυτική ενεργοποίηση της κασπάσης-3 και κασπάσης-9 εξετάστηκαν επίσης. Όπως φαίνεται στο Σχ. 4Α, icaritin θεραπεία οδήγησε σε σημαντική αύξηση στην ενεργό μορφή της κασπάσης-3 και κασπάσης-9 σε κύτταρα Hec1A. Η ενεργοποίηση των κασπασών σε κατεργασμένα icaritin κύτταρα Hec1A επιβεβαιώθηκε περαιτέρω με ανίχνευση της διάσπασης της PARP, ενός ενδογενούς υποστρώματος ενεργοποιημένου κασπάσης-3 και μια σφραγίδα της απόπτωσης. Όπως φαίνεται στο Σχ. 4Β, κατεργασία των κυττάρων με Hec1A icaritin οδήγησε σε διάσπαση της PARP σε ένα θραύσμα 85 kDa. Επιπλέον, εξετάσαμε την υποκυτταρική εντόπιση του κυτοχρώματος c για να προσδιοριστεί αν η οδός μιτοχόνδρια εμπλέκεται σε icaritin επαγόμενη απόπτωση. Ανοσοφθορισμός του κυτοχρώματος c οπτικοποιήθηκε με ένα ομοεστιακό μικροσκόπιο λέιζερ. Αφού τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 10 μΜ icaritin για 24 ώρες, το πρότυπο χρώσης του κυτοχρώματος c έγινε διάχυτη και θολή (Εικ. 4C), σε αντίθεση με το συμπαγές, πλάκα-όπως εμφάνιση του κυτοχρώματος c στα κύτταρα ελέγχου που έλαβαν θεραπεία με όχημα, υποδεικνύοντας την απελευθέρωση του κυτοχρώματος c από τα μιτοχόνδρια στο κυτταρόπλασμα στα κύτταρα icaritin φάρμακο.

(Α) κύτταρα Hec1A υποβλήθηκαν σε αγωγή με την υποδεικνυόμενη συγκέντρωση icaritin ή τα υποδεικνυόμενα χρονικά σημεία, συνολικής κυτταρικής εκχυλίσματα παρασκευάστηκαν και υποβλήθηκαν σε κηλίδωση Western δοκιμασία για να μετρηθούν τα επίπεδα διασπαστεί-κασπάσης-3 και διασπάστηκε-κασπάση-9. Τα επίπεδα πρωτεΐνης του β-ακτίνης μετρήθηκαν επίσης ως έλεγχοι. κύτταρα (Β) Hec1A υποβλήθηκαν σε αγωγή με την υποδεικνυόμενη συγκέντρωση icaritin ή δεικνυόμενα χρονικά σημεία, τα συνολικά κυτταρικά εκχυλίσματα παρασκευάστηκαν και υποβλήθηκαν σε δοκιμασία κηλίδος Western χρησιμοποιώντας αντισώματα έναντι PARP. Τα επίπεδα πρωτεΐνης του β-ακτίνης μετρήθηκαν επίσης ως έλεγχοι. κύτταρα (C) Hec1A μονιμοποιήθηκαν και επισημάνθηκαν για κυτοχρώματος c (κόκκινο) και DNA (μπλε). (D) κύτταρα Hec1A προκατεργάστηκαν με 10 μΜ Ζ-VAD-fmk για 1 ώρα, που ακολουθήθηκε με 10 μΜ icaritin για 24 ώρες, και κατάτμηση του DNA και τη δραστηριότητα της κασπάσης-3 προσδιορίστηκε. Τα δεδομένα εκφράζονται ως μέση ± SEM τριών ξεχωριστών πειραμάτων. *,

P

& lt? 0,05 σε σύγκριση με τα κύτταρα ελέγχου. κύτταρα (Ε) Hec1A προκατεργάστηκαν με 10 μΜ Ζ-VAD-fmk για 1 ώρα, που ακολουθήθηκε με 10 μΜ icaritin για 24 ώρες. Πρωτεϊνικά εκχυλίσματα παρασκευάστηκαν και υποβλήθηκαν σε δοκιμασία κηλίδος Western, χρησιμοποιώντας αντίσωμα έναντι PARP. τα επίπεδα της πρωτεΐνης β-ακτίνης μετρήθηκαν επίσης ως μάρτυρες.

Η

Για να προσδιοριστεί περαιτέρω ο ρόλος της ενεργοποίησης της κασπάσης σε icaritin απόπτωση, έχουμε επεξεργασμένα κύτταρα Hec1A με τον αναστολέα παν-κασπάσης z-VAD-fmk (10 μΜ) πριν icaritin θεραπεία. Ο αναστολέας παν-κασπάσης z-VAD-fmk προεπεξεργασία κατήργησε δραστικότητα κασπάσης-3 και μειωμένη icaritin επαγόμενη απόπτωση όπως μετράται με την νουκλεοσώματος κατακερματισμό σε κύτταρα Hec1A (Εικ 4D & amp?. Ε). Αυτά τα αποτελέσματα υποδεικνύουν έντονα ότι η ενεργοποίηση του καταρράκτη κασπάσης ήταν απαραίτητη για icaritin απόπτωση στα κύτταρα Hec1A.

Icaritin ρυθμίζει την έκφραση των Bcl-2 πρωτεϊνών της οικογένειας σε κύτταρα Hec1A

Η αντι-αποπτωτική Bcl-2 είναι ένας ισχυρός ανταγωνιστής της μιτοχονδριακής οδού της απόπτωσης που ξεκίνησε από μια ποικιλία από εξω- και ενδοκυτταρικές καταπονήσεις. Αποφασίσαμε να δοκιμαστούν τα αποτελέσματα της icaritin στην έκφραση των αντι-αποπτωτικών πρωτεϊνών Bcl-2 και τα προ-αποπτωτικών πρωτεϊνών Bax στα κύτταρα Hec1A με ανάλυση κηλίδος Western. Όπως φαίνεται στο Σχ. 5, icaritin αυξήθηκε τα επίπεδα έκφρασης Bax ενώ μειωμένη έκφραση Bcl-2 σε δόση και χρονικά εξαρτώμενο τρόπο, υποδεικνύοντας ότι icaritin ρυθμίζει επίσης τα επίπεδα έκφρασης των Bcl-2 οικογένεια πρωτεϊνών για τη διευκόλυνση αποπτωτικό κυτταρικό θάνατο που επάγεται από icaritin.

(Α) κύτταρα Hec1A υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με την υποδεικνυόμενη συγκέντρωση του icaritin, συνολικής κυτταρικής εκχυλίσματα παρασκευάστηκαν και υποβλήθηκαν σε δοκιμασία κηλίδος Western για να μετρηθούν τα επίπεδα του Bcl-2 και Bax. Τα επίπεδα πρωτεΐνης του β-ακτίνης μετρήθηκαν επίσης ως έλεγχοι. κύτταρα (Β) Hec1A υποβλήθηκαν σε αγωγή με τις υποδεικνυόμενες icaritin χρονικά σημεία του icaritin, συνολικής κυτταρικής εκχυλίσματα παρασκευάστηκαν και υποβλήθηκαν σε δοκιμασία κηλίδος Western για να μετρηθούν τα επίπεδα του Bcl-2 και Bax. Τα επίπεδα πρωτεΐνης του β-ακτίνης μετρήθηκαν επίσης ως έλεγχοι.

Η

Icaritin επάγει παρατεταμένης /2 ενεργοποίηση ERK1 σε κύτταρα Hec1A

Cellular καταπονήσεις και ερεθίσματα επάγουν απόπτωση των κυττάρων μέσω παρατεταμένης ενεργοποίησης του ΜΑΡΚ μονοπάτια σηματοδότησης [22], [23]. Εξετάσαμε έτσι την ενεργοποίηση της ΜΑΡΚ ERK1 /2, JNK και p38 μετά τη θεραπεία icaritin. Όπως φαίνεται στο Σχ. 6Α, τα επίπεδα φωσφορυλίωση των ERK1 /2 αυξήθηκαν μετά τη θεραπεία icaritin, το οποίο τελευταίων είκοσι τέσσερις ώρες. Ωστόσο, δεν παρατηρήθηκαν σημαντικές μεταβολές των επιπέδων έκφρασης και φωσφορυλίωσης του ρ38 και ΙΝΚ μετά icaritin αγωγή (σχήμα 6Β & amp?. C). Αυτά τα αποτελέσματα πρότειναν ότι παρατεταμένη ενεργοποίηση του ΜΑΡΚ /ΕΚΚ εμπλέκεται σε icaritin επαγόμενη αναστολή της ανάπτυξης και απόπτωσης σε κύτταρα HecA1.

κύτταρα Hec1A υποβλήθηκαν σε αγωγή με την υποδεικνυόμενη συγκέντρωση icaritin ή το ενδεικνυόμενο χρονικό διάστημα, συνολικής κυτταρικής εκχυλίσματα παρασκευάστηκαν και υποβλήθηκαν σε δοκιμασία κηλίδος Western για να μετρηθούν τα επίπεδα του φωσφορυλιωμένες μορφές των ERK1 /2 (Α), JNK (Β) και p38 (C). Οι μεμβράνες ανιχνεύθηκαν και πάλι με αντισώματα έναντι συνολικού ERK1 /2, JNK και ρ38 για ομαλοποίηση.

Η

Το μονοπάτι σηματοδότησης ERK1 /2 εμπλέκεται στην icaritin επαγόμενη απόπτωση σε Hec1A

από εξετάστηκαν αν η icaritin επαγόμενη παρατεταμένη ενεργοποίηση της οδού σηματοδότησης ERK1 /2 παίζει ένα ρόλο στην αναστολή της ανάπτυξης και την απόπτωση. Όπως φαίνεται στο Σχ. 7Α & amp? Β, επάγεται icaritin κύτταρο απόπτωση αποτελεσματικά καταργήθηκε με U0126, ένας ισχυρός αναστολέας του ΜΕΚ1 /2, αλλά ο αναστολέας ρ38 SB203580 και JNK αναστολέα SP600125 δεν είχε καμία επίδραση, υποδεικνύοντας ότι η ενεργοποίηση του ERK1 /2 σηματοδότηση εμπλέκεται το icaritin επαγόμενη απόπτωση. Παρομοίως, ERK1 /2 αναστολή από ειδικό αναστολέα της θα μπορούσε να ανταγωνισθεί αποτελεσματικά icaritin επαγόμενη κασπάσης-3 δραστικότητα (Σχ. 7C). Επιπλέον, δοκιμασία κηλίδος Western αποκάλυψε ότι U0126 ανέστειλε παρατεταμένη 2 ενεργοποίηση ERK1 /και διάσπαση της ΡΑΚΡ σε icaritin αγωγή (Σχ. 7D), ενώ ο αναστολέας κασπάσης z-VAD-fmk είχε καμία επίδραση στην icaritin επαγόμενη ενεργοποίηση του ERK1 /2 (Σχ . 7Ε). Αυτά τα αποτελέσματα κατέδειξαν ότι οι προ-αποπτωτικά αποτελέσματα του icaritin σε κύτταρα Hec1A διαμεσολαβείται από την παρατεταμένη ενεργοποίηση του μονοπατιού ERK1 /2 σηματοδότηση.

(Α) κύτταρα Hec1A υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με icaritin παρουσία ή απουσία 10 μΜ U0126, 10 μΜ SP600125, ή 40 μΜ SB203580 για 24 ώρες, η κυτταρική ανάπτυξη προσδιορίστηκε με ΜΤΤ. Οι ράβδοι αντιπροσωπεύουν τη μέση τιμή ± SEM τριών ξεχωριστών πειραμάτων. *,

P

& lt? 0,05 σε σύγκριση για την ομάδα icaritin-θεραπεία. κύτταρα (Β) Hec1A υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με icaritin παρουσία ή απουσία 10 μΜ U0126, 10 μΜ SP600125, ή 40 μΜ SB203580 για 24 ώρες, και κατάτμηση του DNA προσδιορίστηκε. Τα δεδομένα εκφράζονται ως μέση ± SEM τριών ξεχωριστών πειραμάτων. *,

P

& lt? 0,05 σε σύγκριση με icaritin-επεξεργασμένα κύτταρα. (C) κύτταρα Hec1A υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με icaritin παρουσία ή απουσία 10 μΜ U0126, 10 μΜ SP600125, ή 40 μΜ SB203580 για 24 ώρες, και δραστικότητα κασπάσης-3 προσδιορίστηκε με δοκιμασία κασπάση-Glo. Τα δεδομένα εκφράζονται ως μέση ± SEM τριών ξεχωριστών πειραμάτων. *,

P

& lt? 0,05 σε σύγκριση με icaritin-επεξεργασμένα κύτταρα. κύτταρα (D) Hec1A προκατεργάστηκαν ή όχι σε προεπεξεργασία με 10 μΜ U0126 συνέχεια προστέθηκε με DMSO (φορέας) ή 10 μΜ icaritin για 12 ώρες, 24 ώρες αντίστοιχα. Πρωτεϊνικά εκχυλίσματα παρασκευάστηκαν και υποβλήθηκαν σε δοκιμασία κηλίδος Western για να μετρηθούν τα επίπεδα φωσφορυλιωμένου ERK1 /2. Τα επίπεδα πρωτεΐνης της ERK1 /2 Μετρήθηκαν επίσης ως έλεγχοι. κύτταρα (Ε) Hec1A προκατεργάστηκαν ή όχι σε προεπεξεργασία με 10 μΜ U0126 συνέχεια προστέθηκε με DMSO (φορέας) ή 10 μΜ icaritin για 12 ώρες, 24 ώρες αντίστοιχα. εκχυλίσματα πρωτεΐνης παρασκευάστηκαν και η διάσπαση της PARP αναλύθηκε με Western μπουλόνι. Τα επίπεδα πρωτεΐνης του β-ακτίνης μετρήθηκαν επίσης ως έλεγχοι. (F) Hec1A κύτταρα υποβλήθηκαν σε προεπεξεργασία με ή χωρίς z-VAD-fmk (10 μΜ) επωάστηκαν περαιτέρω με 10 μΜ icaritin για 24 ώρες. Πρωτεϊνικά εκχυλίσματα παρασκευάστηκαν και υποβλήθηκαν σε δοκιμασία κηλίδος Western για να μετρηθούν τα επίπεδα φωσφορυλιωμένου ERK1 /2. τα επίπεδα πρωτεΐνης του ERK1 /2 μετρήθηκαν επίσης ως μάρτυρες.

Η

Συζήτηση

Εδώ, έχουμε αποδείξει ότι icaritin, μια ένωση καθαρίζεται από φαρμακευτικό φυτό Epimedium, προκαλεί αναστολή της ανάπτυξης και αποπτωτικό κυτταρικό θάνατο σε ανθρώπινα κύτταρα καρκίνου του ενδομητρίου Hec1A σε μία δόση και χρονο-εξαρτώμενη τρόπο.

είναι καλά τεκμηριωμένο ότι εξέλιξη του κυτταρικού κύκλου είναι δυναμικά και ρυθμίζεται αυστηρά από σύμπλοκα που περιέχουν κυκλίνες cdks και τα οποία είναι κρίσιμα για την κανονική εξέλιξη του κυτταρικού κύκλου και αδρανοποίηση αυτών των πρωτεϊνών οδηγεί σε αναστολή του κυτταρικού κύκλου [24], [25], [26]. Οι παρατηρούμενες ανασταλτικά αποτελέσματα του icaritin στην έκφραση της κυκλίνης D1 και CDK4 σε κύτταρα Hec1A πρότεινε ότι icaritin μπορεί να συλλάβει τον κυτταρικό κύκλο σε μία συγκεκριμένη φάση. της CDK ρυθμίζεται επίσης από τους αναστολείς CDK όπως WAF1 /ρ21 και των οικογενειών KIP1 /ρ27 πρωτεϊνών. Εδώ, δείξαμε επίσης ότι icaritin επαγόμενη τα επίπεδα έκφρασης του WAF1 /p21 και KIP1 /ρ27.

Σε πολλούς τύπους κυττάρων, η απόπτωση χαρακτηρίζεται από την παραγωγή θραυσμάτων DNA μέσω της δράσης των ενδογενών ενδονουκλεασών [27] , [28]. Το DNA των αποπτωτικών κυττάρων διασπάται σε πολυμερή 180-200 θραυσμάτων bp, που αντιστοιχεί στο μέγεθος ολιγονουκλεοσωματικής. Ως εκ τούτου, το DNA αποπτωτικών κυττάρων συνήθως μεταναστεύει ως μια σκάλα από 180-200 bp πολυμερών σε μια γέλη αγαρόζης. Η μέθοδος Terminal deoxynucleotidy τρανσφεράσης βιοτίνη-dUTP Nick End Labeling (ΤΟΥΝΕΛ) προσδιορίζει αποπτωτικών κυττάρων in situ με χρήση τρανσφεράσης τερματικού δεοξυνουκλεοτιδυλική (TdT) για να μεταφέρει βιοτίνη-dUTP σε αυτά τα διαλείμματα σκέλος των διασπαστεί DNA [29]. Ο προσδιορισμός ELISA δοκιμασία των κυτοπλασμικών θραυσμάτων DNA ιστόνης που σχετίζονται με (μονο- και oligonucleosomes) μετά από κυτταρικό θάνατο που επάγεται [30]. Annexin V χρησιμοποιείται για τον ποσοτικό προσδιορισμό του ποσοστού των κυττάρων μέσα σε έναν πληθυσμό που είναι ενεργά υφίστανται απόπτωση. Στηρίζεται στην ιδιότητα των κυττάρων να χάσουν μεμβράνη ασυμμετρία στα πρώτα στάδια της απόπτωσης. Σε αποπτωτικών κυττάρων, η φωσφατιδυλοσερίνη φωσφολιπιδίου μεμβράνη (PS) μετατοπίζεται από την εσωτερική φύλλο της μεμβράνης πλάσματος προς την εξωτερική φυλλάδιο, εκθέτοντας έτσι PS με το εξωτερικό περιβάλλον. Αννεξίνης V είναι μια εξαρτώμενη από το ασβέστιο πρωτεΐνη δέσμευσης φωσφολιπιδίων που έχει μια υψηλή συγγένεια για PS, και είναι χρήσιμη για την ταυτοποίηση αποπτωτικά κύτταρα με εκτεθειμένο PS. Ιωδιούχου προπιδίου (ΡΙ) είναι ένα πρότυπο κυτταρομετρίας ροής καθετήρα βιωσιμότητα και χρησιμοποιείται για τη διάκριση βιώσιμα από μη βιώσιμα κύτταρα. Βιώσιμων κυττάρων με άθικτη μεμβράνη εξαιρούν ΡΙ, ενώ οι μεμβράνες των νεκρών και κατεστραμμένων κυττάρων είναι διαπερατή σε PI. Τα κύτταρα που θεωρούνται βιώσιμα είναι αννεξίνη V και αρνητικά PI? κύτταρα τα οποία είναι σε πρώιμη απόπτωση είναι Αννεξίνη V θετική και αρνητική ΡΙ? κύτταρα που είναι στα τέλη της απόπτωσης είναι αμφότερα αννεξίνης V και θετική ΡΙ? και τα κύτταρα που βρίσκονται σε νεκρωτικές είναι αννεξίνη V αρνητικές και PI αρνητικά [31]. Η μέθοδος χρώσης αννεξίνη V /PI διακρίνει κύτταρα απόπτωσης και τα κύτταρα νέκρωση. Στην παρούσα μελέτη, τα κύτταρα Hec1A υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με icaritin και απόπτωση αναλύθηκε χρησιμοποιώντας δοκιμασία TUNEL και ELISA. Επιπλέον, μια δοκιμασία αννεξίνη V-δεσμευτική έδειξε ότι icaritin που προκαλείται από τη θεραπεία απόπτωση αλλά όχι νέκρωση στα κύτταρα Hec1A.

Τα μιτοχόνδρια διαδραματίζουν κεντρικό ρόλο στη μεταγωγή του σήματος απόπτωσης [32]. Η παρατήρηση του icaritin διαμεσολαβούμενη ενεργοποίηση της κασπάσης-9, κασπάσης-3, η επακόλουθη διάσπαση της PARP και απελευθέρωση του κυτοχρώματος c, καθώς και το αποτέλεσμα ότι ο αναστολέας παν-κασπάσης z-VED-FMK αποκλειστεί σχεδόν εντελώς icaritin επαγόμενη απόπτωση σε κύτταρα Hec1A, υποδηλώνοντας ότι η μιτοχονδριακή μεσολάβηση μονοπάτι αλληλουχίας κασπάσης διαδραματίζει έναν πολύ σημαντικό ρόλο στην icaritin επαγόμενη απόπτωση [33].

οικογένειας Bcl-2 πρωτεϊνών, συμπεριλαμβανομένης της Bcl-2 και Bcl-2 που σχετίζονται με τα μέλη της οικογένειας όπως Bcl-xL, Bad και Bax, παίζει σημαντικό ρόλο στη ρύθμιση της απόπτωσης. Μπορούν να ενεργοποιούν ή αναστέλλουν την απελευθέρωση των κατάντη παράγοντες, όπως το κυτόχρωμα C, η οποία οδηγεί στην ενεργοποίηση της κασπάσης-3 και PARP στην εκτέλεση της απόπτωσης [34]. Bax εξασκεί προ-αποπτωτική δραστηριότητα με μετατόπιση από το κυτοσόλιο στο μιτοχόνδρια, όπου επάγει την απελευθέρωση κυτοχρώματος c, ενώ Bcl-2 ασκεί αντι-αποπτωτική δραστηριότητα, τουλάχιστον εν μέρει, με αναστολή της μετατόπισης του Βαχ στα μιτοχόνδρια [35] . Προφανώς, η αναλογία των θετικών και των αντι-αποπτωτική έκφραση πρωτεΐνης, όπως Βαχ /Bcl-2, είναι κρίσιμη για την επαγωγή της απόπτωσης, και αποφασίζει την επιδεκτικότητα των κυττάρων να υποστούν απόπτωση [36]. Στην παρούσα μελέτη, δείξαμε ότι η θεραπεία των κυττάρων με Hec1A icaritin οδήγησε σε σημαντική μείωση στην πρωτεΐνη Bcl-2 και η αύξηση στην πρωτεΐνη Bax, μετατοπίζοντας έτσι την αναλογία Βαχ /Bcl-2 προς όφελος της απόπτωσης. Λαμβανόμενα μαζί, τα αποτελέσματά μας έδειξαν ότι icaritin ρυθμίζει τα επίπεδα έκφρασης της οικογένειας Bcl-2, επάγει το κυτόχρωμα απελευθέρωσης C και trigs κασπάσης-εξαρτώμενη αποπτωτικό κυτταρικό θάνατο.

Η οικογένεια του MAPKs, ERK, SAPK /JNK1 /2 και ρ38, παίζει κεντρικό ρόλο στον κυτταρικό πολλαπλασιασμό, διαφοροποίηση, επιβίωση, και την απόπτωση, συμπεριλαμβανομένων των εξωκυτταρικών ρυθμιζόμενης kinase1 /2 [37], [38]. Γενικά, η παροδική ERK1 /2 ενεργοποίηση συμβαίνει ταχέως και παρακμή με 30-45 min, η οποία θεωρείται ότι οδηγεί σε κυτταρικό πολλαπλασιασμό και την επιβίωση [39], αλλά επίμονη ή παρατεταμένης ενεργοποίησης ERK1 /2 που διαρκούν περισσότερο από 12 ώρες εμπλέκεται στην κυτταρική διαφοροποίησης και του θανάτου [40], [41], [42], [43]. Οι διπλές δραστηριότητες των ERK1 /2 και στις δύο κυτταρικές πολλαπλασιασμού και κυτταρικού θανάτου μπορεί να εξηγηθεί από αρκετές πρόσφατες ευρήματα που καταδεικνύουν ότι φωσφορυλιωμένη ERKs μπορεί να παράγει διαφορετικά αποτελέσματα, ανάλογα με τη διάρκεια της συσσώρευσης ERK στον πυρήνα [44], [45]. Πρόσφατα, έχει αναφερθεί ότι η παρατεταμένη ενεργοποίηση ERK είχε εμπλακεί σε ασβέστιο επαγόμενη απόπτωση των επιθηλιακών κυττάρων του φακού [46]. Αρκετές μελέτες έχουν δείξει ότι icaritin επάγει την ενεργοποίηση της ERK και p38 κινάσης σε εμβρυϊκά βλαστικά κύτταρα και νευρωνικά κύτταρα [8], [14]. Chen et al. ανέφεραν ότι icaritin επάγει αναστολή της ανάπτυξης και την απόπτωση των ανθρώπινων καρκίνου του προστάτη PC-3 κύτταρα μέσω της οδού ERK1 /2 σηματοδότηση [13]. Εδώ βρήκαμε επίσης ότι η επαγόμενη από icaritin παρατεταμένη ενεργοποίηση της ERK1 /2, αλλά όχι JNK και ρ38 σε κύτταρα Hec1A. U0126, ένας ειδικός αναστολέας της ΜΕΚ (ΜΑΡΚ /ΕΚΚ κινάσης), ουσιαστικά μπλοκάρει icaritin επαγόμενη ERK1 /2 ενεργοποίηση και εξασθενημένου icaritin επαγόμενη απόπτωση, υποδηλώνοντας ότι η παρατεταμένη ενεργοποίηση της /2 οδό σηματοδότησης ERK1 είναι ένας από τους μηχανισμούς.

Εν κατακλείδι, διαπιστώσαμε ότι icaritin ανέστειλε την ανάπτυξη των κυττάρων και την επαγωγή απόπτωσης σε κύτταρα Hec1A. Μελετήσαμε επίσης των υποκείμενων μηχανισμών που εμπλέκονται στην icaritin απόπτωση. Τα αποτελέσματά μας έδειξαν ότι icaritin επαγόμενη αναστολή της κυτταρικής ανάπτυξης περιλαμβάνει τις μειώσεις της κυκλίνης D1 και η έκφραση πρωτεΐνης CDK4 και επαγωγές έκφρασης πρωτεΐνης ρ21 και ρ27. Τα αποτελέσματά μας έδειξαν επίσης ότι icaritin επαγόμενη απόπτωση περιλαμβάνει την ενεργοποίηση της κασπάσης-3 και κασπάσης-9 και την απελευθέρωση του κυτοχρώματος c. Βρήκαμε ότι υπέστη 2 ενεργοποίηση /ERK1 απαιτήθηκε για icaritin επαγόμενη απόπτωση. Τα αποτελέσματά μας παρείχε μια ορθολογική ότι icaritin θα μπορούσε να αναπτυχθεί ως ένα εν δυνάμει αντικαρκινικό παράγοντα κατά του ανθρώπινου καρκίνου του ενδομητρίου.

Υλικά και Μέθοδοι

Υλικά και αντιδραστήρια

Icaritin με καθαρότητα μέχρι έως 99,5% ήταν από τον Δρ Κουν Meng (shenogen Pharma Co Πεκίνο, Κίνα). Ένα διάλυμα παρακαταθήκης (10 μΜ) παρασκευάστηκε με διάλυση icaritin σε DMSO (Sigma, St Louis, ΜΟ, USA) και αποθηκεύτηκαν στους -20 ° C. ΜΤΤ, ϋΑΡΙ, U0126, SP600125, SB203580, και ο αναστολέας παν-κασπάσης (Ζ VAD-fmk-) αγοράστηκαν από την Calbiochem (San Diego, CA). Αντίσωμα για διασπασμένης κασπάσης-3 αγοράστηκε από την Cell Signaling (Beverly, ΜΑ). Αντισώματα έναντι ERK1 /2, φωσφο-ERK1 /2, p38, φωσφο-ρ38, JNK, φωσφο-ΙΝΚ, ρ21, ρ27, κυτόχρωμα c, Bcl-2, Βαχ, διασπασμένη κασπάση-9, κυκλίνη D1, cdk4, PARP και β ακτίνης αγοράστηκαν από την Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA). FITC Annexin V ανίχνευσης απόπτωσης Kit I αγοράστηκε από την Becton Dickinson (PharMingen).

Cells πολιτισμό και το δοκίμιο του πολλαπλασιασμού των κυττάρων

Το ανθρώπινο καρκίνο του ενδομητρίου κυτταρική σειρά Hec1A ελήφθη από τον Dr. Li-Hui Γουέι (Πανεπιστήμιο του Πεκίνου Λαϊκή Hospital, Πεκίνο) και καλλιεργήθηκαν σε μέσο Eagle τροποποιημένο κατά Dulbecco (Gibco-BRL, USA) μέσο με 10% ορό εμβρύου μόσχου (Hyclone, UT), 5 μg /ml ινσουλίνη, και διατηρήθηκαν στους 37 ° C σε υγροποιημένη ατμόσφαιρα 5% CO

2. Media θα αλλάξει σε ελεύθερο ερυθρού φαινόλης μέσο με 2,5% απογυμνωμένο με ενεργό άνθρακα ορό εμβρύου μόσχου για 24 ώρες πριν από τα πειράματα που χρειάζονται.

Τα κύτταρα σπάρθηκαν σε 96 φρεατίων πιάτο σε μία τελική συγκέντρωση 1 × 10

4 κύτταρα /φρεάτιο και επωάστηκαν σε μέσο DMEM που περιείχε 10% FCS για 24 ώρες. Στη συνέχεια, κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε ερυθρού φαινόλης-ελεύθερο DMEM (Gibcol-BRL, Η.Π.Α.) με 2,5% απογυμνωμένο με ενεργό άνθρακα ορό εμβρύου μόσχου (Biochrom AG, Γερμανία) που ακολουθείται από κατεργασία με διάφορες συγκεντρώσεις icaritin για 12 ώρες, 24 ώρες, και 48 h. Το μέσο απομακρύνθηκε και φρέσκο ​​μέσο προστέθηκε σε κάθε φρεάτιο μαζί με 20 μΐ διαλύματος ΜΤΤ (5 mg /ml). Μετά από 4 ώρες επώασης, 150 μΐ DMSO προστέθηκαν σε κάθε φρεάτιο. Οι πλάκες διαβάστηκαν σε μήκος κύματος 490 nm χρησιμοποιώντας έναν αναγνώστη μικροπλακών (Bioteck Powerwave

TM, USA). Οκτώ αναδιπλασιάζω φρεάτια χρησιμοποιήθηκαν για κάθε θεραπεία, και τα πειράματα επαναλήφθηκαν τρεις φορές.

Ανάλυση Western Blot

κηλίδος Western έγινε όπως περιγράφηκε προηγουμένως [47], [48]. Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε αγωγή με την υποδεικνυόμενη συγκέντρωση του icaritin για τον υποδεικνυόμενο χρόνο σε ερυθρού φαινόλης-ελεύθερο DMEM (Gibcol-BRL, Η.Π.Α.) με 2,5% απογυμνωμένο με ενεργό άνθρακα ορό εμβρύου μόσχου (Biochrom AG, Γερμανία). Τα κύτταρα συλλέχθηκαν σε παγωμένο PBS, και τα κυτταρικά εκχυλίσματα παρασκευάστηκαν σε ρυθμιστικό διάλυμα RIPA με αναστολέα πρωτεϊνάσης κοκτέιλ από την Sigma (St.Louis, ΜΟ). Οι συγκεντρώσεις πρωτείνης των κυτταρικών λυμάτων προσδιορίστηκε και βράζεται με ρυθμιστικό φόρτωσης πηκτής για 10 λεπτά στους 100 ° C. Δείγματα που περιέχουν 30 μg ολικής πρωτεΐνης ηλεκτροφορήθηκαν σε 10% πηκτώματα SDS-πολυακρυλαμιδίου και μεταφέρθηκαν σε μεμβράνη PVDF (Millipore, Temecula, CA). Μετά τη μεταφορά, η μεμβράνη μπλοκαρίστηκαν σε TBST (TBS που περιέχει 0.1% Tween 20) που περιέχει 5% αποβουτυρωμένο γάλα για 2 ώρες, ακολουθούμενη από επώαση όλη τη νύκτα στους 4 ° C με κατάλληλη πρωτοταγή αντισώματα. Μετά από πλύση τρεις φορές σε TBST, οι μεμβράνες επωάστηκαν για 1 ώρα στους 37 ° C με τα κατάλληλα δευτερεύοντα αντισώματα συζευγμένα με υπεροξειδάση χρένου 1:2000. Τέλος, οι μεμβράνες οπτικοποιούνται χρησιμοποιώντας το σύστημα ανίχνευσης ενισχυμένης χημειοφωταύγειας (Amersham, Piscataway, NJ).

TUNEL Δοκιμασία

Πιθανά DNA κατακερματισμός εξετάστηκε με χρώση φθορισμού από το TUNEL (Terminal Τρανσφεράσης dUTP Nick τέλος Σήμανση) κιτ ανίχνευσης απόπτωσης (Beyotime Biotech, Κίνα) ακολουθώντας τις οδηγίες του κατασκευαστή. Εν συντομία, τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε αποστειρωμένα γυάλινα coverlips μονιμοποιήθηκαν με 4% παραφορμαλδεΰδη σε PBS για 10 λεπτά, και στη συνέχεια διαπερατά με 0,4% Triton Χ-100 για 10 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. Τα κύτταρα επωάστηκαν με ένα μίγμα αντίδρασης που περιέχει βιοτίνη-dUTP και το τρανσφεράσης τερματικού δεοξυνουκλεοτιδυλική (TdT) για 60 λεπτά και στη συνέχεια με το διάλυμα αβιδίνης-FITC για 30 λεπτά στο σκοτάδι. DAPI προστέθηκε στην συνέχεια για την πυρηνική χρώση. Μικροσκοπική ανάλυση πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας ένα μικροσκόπιο συνεστιακό λέιζερ σάρωσης (Zeiss LSM 710 META, Germany).

ανίχνευσης απόπτωσης με τη Μέθοδο Ανοσοροφητική ποσοτικού προσδιορισμού κυτταρικού θανάτου Enzyme-Linked

Για ELISA, τα κύτταρα σπάρθηκαν σε πλάκες των 96 φρεατίων (1 χ 10

4 κύτταρα /φρεάτιο) υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με icaritin, τότε αποπτωτικά κύτταρα αξιολογήθηκαν με χρήση κυττάρων κιτ Death Detection ELISA (Roche Diagnostics, Mannhein, Germany) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Φωτομετρική ανοσοδοκιμασία ενζύμου χρησιμοποιήθηκε για να προσδιοριστεί ποσοτικά ο σχηματισμός κυτταροπλασματικής θραυσμάτων DNA ιστόνης που σχετίζονται με τη μορφή mononucleosomes μετά την απόπτωση των κυττάρων. Η απορρόφηση στα 405 nm μετρήθηκε ως ο δείκτης των αποπτωτικών κυττάρων. Το μήκος κύματος αναφοράς ήταν 490 nm. Ο παράγοντας εμπλουτισμού (συνολική ποσότητα της απόπτωσης) υπολογίστηκε διαιρώντας την απορρόφηση του δείγματος (Α405 nm) από την απορρόφηση των ελέγχων χωρίς θεραπεία (Α490 nm).

δοκιμασίες αννεξίνης V /PI για απόπτωση

για αννεξίνης V /δοκιμασίες ΡΙ, τα κύτταρα χρωματίστηκαν με Αννεξίνη V-FITC και ΡΙ, και αξιολογήθηκαν για την απόπτωση με κυτταρομετρία ροής σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή (BD PharMingen, San Diego, CA, USA). Εν συντομία, 1 × 10

6 κύτταρα πλύθηκαν δύο φορές με PBS, και χρωματίστηκαν με 5 μΙ αννεξίνης V-FITC και 10 μΙ PI (5 μg /ml) σε 1 ml ρυθμιστικού διαλύματος πρόσδεσης για 15 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου στο σκοτάδι. Τα αποπτωτικά κύτταρα προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας ένα κυτταροφθοριόμετρο Becton-Dickinson FACScan (Mansfield, ΜΑ, USA).

ανοσοφθορισμού χρώση

χρώση ανοσοφθορισμού χρησιμοποιήθηκε για να αναλυθεί η υποκυτταρική κατανομή του κυτοχρώματος c σε κύτταρα Hec1A επαγόμενη από Icaritin. Τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν επί αποστειρωμένα γυάλινα coverlips μονιμοποιήθηκαν με 4% παραφορμαλδεΰδη σε PBS για 10 λεπτά. Μετά από διαπερατά με 0,4% Triton Χ-100 για 10 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου, τα κύτταρα αποκλείστηκε σε 4% BSA-PBS συμπληρωμένο για 1 ώρα και επωάστηκε όλη τη νύκτα στους 4 ° C με αντίσωμα αντι-κυτοχρώματος c. Μετά από πλύση τρεις φορές σε PBS, τα κύτταρα επισημάνθηκαν με δευτερογενές αντίσωμα συζευγμένο με TRITC. DAPI προστέθηκε στην συνέχεια για την πυρηνική χρώση.