Αφηρημένο

Το στρες που επάγεται από παράγοντες μεταγραφής διαδραματίζουν κεντρικό ρόλο στην κυτταρική προσαρμογή σε περιβάλλον για τη διατήρηση της ομοιόστασης και την ακεραιότητα του γονιδιώματος. Ενεργοποίηση του παράγοντα μεταγραφής 3 (ATF3) επάγεται από μια ποικιλία άγχους και φλεγμονωδών καταστάσεων και υπερεκφράζεται σε πολλά είδη καρκινικών κυττάρων. Ωστόσο, μοριακών μηχανισμών που διέπουν τις πλειοτροπικές λειτουργίες της ATF3 έχουν παραμείνει άπιαστο. Εδώ χρησιμοποιήσαμε ανάλυση συστήματα για τον εντοπισμό του γονιδιώματος σε επίπεδο στόχων ATF3 που είτε προκαλείται από ένα αλκυλιωτικό παράγοντα μεθυλ μεθανοσουλφονικό (MMS) ή υπερ-εκφράζεται σε μια κυτταρική γραμμή όγκου του προστάτη LNCaP. Δείχνουμε ότι το άγχος που προκαλείται και σχετίζεται με καρκίνο ATF3 προσλαμβάνεται για 5984 και 1423 στόχους, αντίστοιχα, στο ανθρώπινο γονιδίωμα, το 89% εκ των οποίων είναι κοινά. Αξίζει να σημειωθεί ότι, οι στόχοι ATF3 είναι πολύ εμπλουτισμένο όχι μόνο για ATF /CRE μοτίβα, αλλά επίσης και θέσεις δέσμευσης του αρκετούς άλλους μεταγραφικούς παράγοντες στρες επαγόμενο δείχνει ένα εκτεταμένο δίκτυο των παραγόντων αντίδραση στο στρες στην μεταγραφική ρύθμιση των γονιδίων στόχων. Περαιτέρω ανάλυση των επιπτώσεων της ATF3 knockdown για τους στόχους αυτούς αποκάλυψε ότι το άγχος που προκαλείται από ATF3 ρυθμίζει γονίδια σε μεταβολικά μονοπάτια, του κυτταρικού κύκλου, απόπτωση, προσκόλληση κυττάρου και σηματοδότηση συμπεριλαμβανομένης της ινσουλίνης, ρ53, Wnt, και τις οδούς του VEGF. Καρκίνος που σχετίζεται ATF3 εμπλέκεται στη ρύθμιση της διακεκριμένα σύνολα γονιδίων σε διαδικασίες όπως η σηματοδότηση ασβέστιο, Wnt, ρ53 και τις οδούς του διαβήτη. Αξιοσημείωτα, το στρες που προκαλείται από ATF3 δεσμεύεται με το 40% των στόχων p53 και ενεργοποιεί προ-αποπτωτικά γονίδια όπως TNFRSF10B /DR5 και BBC3 /PUMA. Καρκίνος που σχετίζεται ATF3, αντίθετα, καταστέλλει αυτά τα προ-αποπτωτικών γονιδίων επιπλέον προς CDKN1A /ρ21. Στο σύνολό τους, τα δεδομένα μας αποκαλύπτουν ένα εκτεταμένο δίκτυο των μεταγραφικών παραγόντων στρες επαγόμενο και αποδεικνύουν ότι ATF3 έχει αντίθετες, κύτταρο πλαίσιο εξαρτώμενη επιπτώσεις στην γονιδίων στόχων p53 σε απάντηση βλάβες στο DNA και την ανάπτυξη του καρκίνου

Παράθεση:. Tanaka Υ, Nakamura Α, Μοριόκα MS, Inoue S, Tamamori-Adachi Μ, Yamada Κ, et al. (2011) Ανάλυση Συστημάτων του ATF3 σε αντίδραση στο στρες και τον καρκίνο Αποκαλύπτει αντίθετα αποτελέσματα στην Pro-αποπτωτικών γονιδίων στην p53 οδό. PLoS ONE 6 (10): e26848. doi: 10.1371 /journal.pone.0026848

Επιμέλεια: Fazlul H. Sarkar, Wayne State University School of Medicine, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 15 Αυγούστου 2011? Αποδεκτές: 4 Οκτωβρίου του 2011? Δημοσιεύθηκε: 26 του Οκτώβρη, 2011

Copyright: © 2011 Tanaka et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε εν μέρει με επιχορηγήσεις προς SK (18012015, 18055008 και 21590302) και επιχορήγηση για Υ.Τ. (20510183) από το Υπουργείο Παιδείας, Πολιτισμού, Αθλητισμού, Επιστημών και Τεχνολογίας, την Ιαπωνία. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Μεταγραφικοί παράγοντες παίζουν σημαντικό ρόλο στη χρονική ρύθμιση της έκφρασης γονιδίων σε διέγερση των ανθρώπινων κυττάρων ορό [1], [2]. Cellular προσαρμογή στις διάφορες συνθήκες περιβαλλοντικού στρες ρυθμίζεται επίσης από παράγοντες μεταγραφής που συν-συγχρονισμένα ρυθμίζουν την έκφραση των γονιδίων που εμπλέκονται στην διατήρηση της κυτταρικής ομοιόστασης και γενετική ακεραιότητα. Ένα τέτοιο σύστημα παίζει σημαντικό ρόλο όχι μόνο για την επιβίωση των φυσιολογικών κυττάρων, αλλά και την αντίσταση των καρκινικών κυττάρων σε μεταβολικές και γονοτοξικές καταπονήσεις. Ένα σημαντικό βήμα προς την κατανόηση των μοριακών μηχανισμών που διέπουν τις απαντήσεις στρες είναι η ταυτοποίηση των γονιδίων στόχων του κάθε παράγοντα μεταγραφής. Μελέτες σε ζυμομύκητες που απασχολούν γονιδιακής έκφρασης [3], [4] και πιο πρόσφατα ανάλυση συστημάτων με χρωματίνη ανοσοκαταβύθιση των μεταγραφικών παραγόντων [5] αποκάλυψαν ένα γονιδίωμα-δίκτυα ευρείας μεταγραφικών παραγόντων που ρυθμίζουν την έκφραση των γονιδίων που ενορχηστρώνουν κυτταρικού κύκλου, γονιδιακή μεταγραφή, πρωτεϊνική σύνθεση, και την επιδιόρθωση του DNA σε απόκριση σε MMS. Στα θηλαστικά, ο καταστολέας όγκων ρ53 παίζει έναν κεντρικό ρόλο στην απόκριση βλάβης DNA μέσω μεταγραφικό έλεγχο αρκετών εκατοντάδων γονιδίων [6], [7]. Είναι σημαντικό ότι, μόνο ένα μικρό υποσύνολο των στόχων ρ53 ενεργοποιούνται κάτω από ειδικές συνθήκες [8], υποδεικνύοντας ότι είτε πρόσδεση του ρ53 σε στόχους [9] – [11] ή trans-ενεργοποίηση δυναμικό των πρωτεϊνών ρ53 [12], [13] μπορεί να είναι επηρεάζονται από βοηθητικά μόρια.

ATF3 είναι μέλος της ATF /CREB οικογένειας των βασικών-φερμουάρ λευκίνης (β-Zip) πληκτρολογήστε μεταγραφικών παραγόντων [14] και είναι ένα εξαιρετικά ευέλικτο αισθητήρα άγχος για ένα ευρύ φάσμα συνθηκών συμπεριλαμβανομένης της υποξίας, hyponutrition, οξειδωτικό στρες, στρες ER, και διάφορα γονοτοξικό στρες [15], [16], καθώς και τις φλεγμονώδεις αντιδράσεις [17], [18]. ATF3 ενεργοποιείται επίσης από τη διέγερση ορού και κατάντη του c-myc [19], και είναι συχνά υπερεκφράζεται σε διάφορους όγκους συμπεριλαμβανομένων εκείνων του προστάτη [20], του μαστού [21], και τα λεμφώματα του Hodgkin [22]. Είναι σημαντικό, αρκετές γραμμές των αποδεικτικών στοιχείων έδειξε μια στενή σχέση μεταξύ ATF3 και σηματοδότησης ρ53 μονοπάτια. Έτσι, ATF3 επάγεται κατάντη της ρ53 κατά την βλάβη του DNA και λειτουργεί ως τελεστής της ρ53 μεσολάβηση κυτταρικό θάνατο [6], [23] – [25]. Επιπλέον, ATF3 ενισχύει ρ53 με απευθείας δεσμεύει και να αναστέλλει ubiquitilation της, πράγμα που σημαίνει ότι μπορεί να ATF3 ρυθμίζουν την δραστηριότητα της ρ53 [26], [27]. Επιπλέον, ATF3 φαίνεται να προσδώσει μια αρνητική ανάδραση με την οδό ρ53 από τα κάτω ρύθμιση

TP53

γονιδιακή έκφραση [28], επαναλαμβάνοντας μια παρόμοια ρύθμιση ανατροφοδότηση των φλεγμονωδών γονιδίων κυτταροκινών από ATF3 [17]. Επιβεβαιώνοντας μια τέτοια αρνητική ανάδραση μοντέλο, μια πρόσφατη μελέτη έδειξε ότι ATF3 επάγεται από κυκλοσπορίνη, ένα ανοσοποιητικό καταπιεστής, και προάγει τον καρκίνο του δέρματος από τα κάτω ρύθμιση

TP53

[29]. Λαμβανόμενες μαζί, αυτές οι μελέτες προτείνουν ότι ATF3 αλληλεπιδρά με την ρ53 μονοπάτι τόσο ως καθοδικός τελεστής του ρ53 μεσολαβεί κυτταρικό θάνατο και ως θετικό και αρνητικός ρυθμιστής της σηματοδότησης ρ53.

Μεταβολή σε αλληλεπίδραση μεταξύ ATF3 και μεταγραφή παράγοντες όπως όπως ρ53 σε διαφορετικό τύπο κυττάρων και /ή περιβαλλοντικές συνθήκες μπορεί εν μέρει να αντιπροσωπεύουν ξεχωριστές επιδράσεις της ATF3 στην κυτταρική μοίρα (δηλαδή προ-αποπτωτική ή προαγωγής ανάπτυξης για μη μετασχηματισμένα κύτταρα ή κακοήθη μετασχηματισμένα κύτταρα, αντίστοιχα) [21]. Προηγούμενη εργασία από το εργαστήριο μας έχει περιγραφεί επίσης πλειοτροπικές λειτουργίες ATF3 κάτω από διάφορες συνθήκες άγχους [18], [19], [25], [28], [30]. Εδώ πραγματοποιείται ανάλυση των συστημάτων των στόχων ATF3 και προσδιόρισε χιλιάδες θέσεις πρόσδεσης ATF3 στο γονιδίωμα. Δείχνουμε ότι ATF3 συνιστά εκτενώς επικαλυπτόμενων γονίδιο ρυθμιστικής δίκτυο με άλλους παράγοντες μεταγραφής στρες επαγόμενο και ρυθμίζει τον κυτταρικό κύκλο, κυτταρικό θάνατο, προσκόλληση, και πολλά μονοπάτια σηματοδότησης, συμπεριλαμβανομένων ρ53. Αξίζει να σημειωθεί ότι, ATF3 δεσμεύεται με το 40% των γνωστών στόχων του ρ53 και ρυθμίζει αποπτωτικό κυτταρικό θάνατο μέσω συν-ενεργοποίηση υποσυνόλου του προ-αποπτωτικών γονιδίων στρες απόκριση ενώ καταστολή τους ίδιους στόχους σε καρκινικά κύτταρα που εκφράζουν ιδιοσυστατικά ATF3. Πιθανοί μηχανισμοί εναλλαγή μεταξύ προ-επιβίωσης και προ-αποπτωτικών λειτουργίες ATF3 θα συζητηθεί.

Ανάλυση

Αποτελέσματα

Συστήματα προσδιορίζει χιλιάδες των στόχων ATF3 στο ανθρώπινο γονιδίωμα

Για την αναγνώριση γονιδιωματικής στόχοι ATF3, χρωματίνη ανάλυση ανοσοκαθίζησης διεξήχθη χρησιμοποιώντας HCT116 κυτταρική σειρά ανθρώπινου καρκίνου του παχέος εντέρου διεγείρεται από MMS και LNCaP καρκίνου του προστάτη κυτταρική γραμμή που εκφράζει ιδιοσυστατικά ATF3. Όπως αναφέρθηκε προηγουμένως [24], MMS κατεργασία των κυττάρων HCT116 που προκαλείται παροδική έκφραση ATF3 κορύφωση στις 6 ώρες μετά τη διέγερση (Εικ. 1Α), ενώ τα αυξημένα επίπεδα των πρωτεϊνών ATF3 ανιχνεύθηκαν μετά από 3 ώρες και έφθασε ένα μέγιστο επίπεδο στις 12 ώρες της διέγερσης (Σχ. 1Β). Γονιδιακό DNA παρασκευάστηκε από κύτταρα είτε HCT116 σε επεξεργασία με MMS για 6 ώρες ή μη επεξεργασμένα κύτταρα LNCaP, ανοσοκαταβυθίστηκαν με αντι-ATF3 αντισώματα, και υβριδοποιήθηκε σε ανθρώπινα συστοιχίες πλακόστρωση υποκινητή REFSEQ HG18 NimbleGen του. Στη συνέχεια, ανίχνευση κορυφών εκτελέστηκε με μοντέλο που βασίζεται σε ανάλυση της 2-χρώμα Arrays (MA2C) πακέτο [31], η οποία αποκάλυψε μια απροσδόκητα μεγάλο αριθμό στόχων ATF3 σε αποκοπής του 0,2% FDR (Σχ. S1A και S1B) . Εντοπίσαμε 5984 και 1423 στόχοι ATF3 σε MMS επεξεργασμένα HCT116 κύτταρα και κύτταρα LNCaP, αντίστοιχα, 1.269 (δηλαδή 89%) εκ των οποίων κουρεύεται μεταξύ των δύο μοντέλων. (Εικ. 1 C). Εμείς δεν ανίχνευσε στόχους για το χρωμόσωμα Υ από HCT116 συνάδει με γυναικεία προέλευσή του. Έχουμε επίσης προσδιορίσει επιτυχώς δεκατρείς στόχους ATF3 το οποίο είχε προηγουμένως δειχθεί ότι ρυθμίζεται από ATF3 σε διάφορους τύπους κυττάρων.

(Α) RT-PCR ανάλυση των ATF3 σε κύτταρα HCT116 σε επεξεργασία με 50 ng ml MMS /. (Β) Ανάλυση Western blot των πρωτεϊνών ATF3 σε MMS επεξεργασμένα HCT116 κύτταρα. (Γ) Κοινή και μοναδική στόχους της ATF3 στα κύτταρα HCT116 και τα κύτταρα LNCaP.

Η

Μοτίβα των μεταγραφικών παραγόντων που σχετίζονται με άγχος υπερεκπροσωπούνται στους στόχους ATF3

ATF3 θα μπορούσαν να προσληφθούν για να στόχους της, είτε με απ ‘ευθείας σύνδεση με μία αλληλουχία αναγνώρισης συναινετική TGACGTCA ή εναλλακτικά με την αλληλεπίδραση με άλλους μεταγραφικούς παράγοντες συμπεριλαμβανομένου ενός μεγάλου αριθμού από b-Ταχ πρωτεΐνες [14], [32]. Για να εκτιμηθεί εάν η ATF /CRE μοτίβο ή οποιαδήποτε άλλα μοτίβα παράγοντα μεταγραφής είναι εμπλουτισμένα μεταξύ των πιθανών στόχων ATF3, ο αριθμός των προαγωγών στους στόχους ATF3 περιέχει τουλάχιστον ένα χτύπημα ενός δεδομένου μοτίβο στη βάση δεδομένων TRANSFAC αναλύθηκε με την P-Match αλγόριθμο (Εικ. S2). Ο Πίνακας 1 συνοψίζει τον εμπλουτισμό ενός δεδομένου μοτίβο όπως αντιπροσωπεύεται από τον αριθμό των υποκινητών σε στόχους ATF3 περιέχουν το μοτίβο αφαιρείται από τον αριθμό των υποκινητών σε ένα σύνολο φόντο γονίδιο που περιέχει το ίδιο μοτίβο. Όπως ήταν αναμενόμενο, ATF /θέσεις δέσμευσης CRE ήταν οι πιο εμπλουτισμένη μοτίβα σε στόχους ATF3 (

σ

-τιμή για HCT116-συγκεκριμένους στόχους: 3,76 × 10

-40 έως 4,34 × 10

-22,

σ

-τιμή για κοινούς στόχους των HCT116 και τα κύτταρα LNCaP: μηδέν έως 4,20 × 10

-6). Επιπλέον, η φυσική απόσταση μεταξύ προβλεπόμενες αλληλουχίες ATF /CRE του μοτίβου σάρωσης και ATF3 κορυφές της ανάλυσης τσιπ μέσα σε ένα εύρος από μερικές εκατοντάδες ζεύγη βάσης (δηλαδή κοντά στην επίλυση της ανάλυσης μάρκας) για την πλειονότητα των στόχων ATF3 (Εικ . 2). Αντίθετα, δεν υπήρχε καμία τέτοια συσχέτιση μεταξύ μη συνδεδεμένων γονιδίων BRCA1 και GATA1 μοτίβα και ATF3 κορυφές (Εικ. 2). Λαμβανόμενα μαζί, αυτά τα δεδομένα υποδηλώνουν έντονα ότι η πλειοψηφία των κορυφών ATF3 της ανάλυσης τσιπ μπορεί να εξηγηθεί από την άμεση σύνδεση του ATF3 να μοτίβων ATF /CRE.

Κατανομή φυσική απόσταση μεταξύ ATF /CRE, BRCA1, και GATA1 μοτίβα για τους στόχους ATF3 από κορυφές ATF3 προσδιορίζονται με ανάλυση chip. κορυφές ATF3 συμπίπτουν σε μεγάλο βαθμό με ATF /CRE μοτίβα, αλλά δεν δείχνουν συσχέτιση με άσχετες BRCA1 και GATA1 μοτίβα.

Η

Κατά περίεργο τρόπο, η σάρωση μοτίβο αποκάλυψε επίσης ότι σημεία σύνδεσης των άλλων μεταγραφικών παραγόντων στρες επαγόμενο ήταν ιδιαίτερα υπερεκπροσωπούνται σε στόχους ATF3 σε απόκριση προς βλάβη DNA (Πίνακας 1). Αυτά περιλαμβάνονται κύριους ρυθμιστές του ER στρες (DDIT3, NF-E1), υποξία (HIF-1 Α), UV στρες (USF2, RFX1), το οξειδωτικό στρες (γ-ETS), και βλάβες στο DNA (ΝΡ-Υ, E2F, EGR- 1, FOXJ2, SP1). Αξίζει να σημειωθεί ότι τα μέλη της οικογένειας των β-Zip (ΑΡ-1, DDIT3 και USF2) έχουν τη δυνατότητα να ετεροδιμερίσει με ATF3 [33] και Sp1 έχει αναφερθεί ότι αλληλεπιδρά φυσικά με ATF3 [34]. Συνεπώς, είναι πιθανό ότι ATF3 προσλαμβάνεται σε ένα υποσύνολο των στόχων του μέσω σύνδεσης με άλλους μεταγραφικούς παράγοντες στρες επαγόμενο.

ATF3 ρυθμίζει διακριτές βιολογικές διαδικασίες για την αντιμετώπιση του στρες και καρκίνου

Αφού διαπιστώθηκε πιθανούς στόχους του ATF3 στο γονιδίωμα, δίπλα στοχεύσαμε να προσδιορίσει εκείνα τα γονίδια τα οποία η έκφραση ρυθμίζεται από ATF3. Για το σκοπό αυτό, εκτιμήσαμε την επίδραση της ATF3 knockdown με siRNA (Σχ. 3Α) για τα πρότυπα γονιδιακής έκφρασης σε 0, 6, 12, και 24 ώρες μετά τη διέγερση με MMS χρησιμοποιώντας Agilent Σύνολο Ανθρώπινο Γονιδίωμα Microarray. Μετά την ομαλοποίηση των συστοιχιών χρησιμοποιώντας μία ομάδα από το σπίτι κρατώντας γονιδίων (Εικ. S3A), τα δύο τρίτα των γονιδίων (δηλαδή 28.872 ανιχνευτές από 43.925) βρέθηκε να εκφράζεται πάνω από τα επίπεδα υποβάθρου σε HCT116 κύτταρα (Σχ. S3b). Αντίθετα, το 90% των στόχων ATF3 εκφράστηκαν πάνω από τα επίπεδα υποβάθρου, γεγονός που υποδηλώνει ότι ATF3 συνδέει επιλεκτικά με ενεργά μεταγράφεται γονίδια. Σε παγκόσμιο επίπεδο, η σύγκριση των σημάτων (log

2 αναλογία) μεταξύ ελέγχου και νοκ ντάουν κύτταρα αποκάλυψε μια περιορισμένη επίπτωση της ATF3 ρύθμισης προς τα κάτω για μεταγραφικό (Εικ. S3b και S3C).

(Α) HCT116 κύτταρα μορφομετατράπηκαν είτε με siRNA για ATF3 (siATF3) ή ως κωδικοποιημένο siRNA (siControl) και υποβλήθηκε σε επεξεργασία με MMS για 0, 3, και 6 ώρες. Πλήθος πρωτεϊνών ATF3 αναλύθηκε με κηλίδα Western με β-ακτίνη ως έλεγχο φόρτισης. MMS επάγει ATF3 στους 3 και 6 ώρες μετά τη διέγερση, η οποία είναι σημαντικά εμποδίζεται από siATF3. αναπαράσταση (Β) Heat χάρτη των επιπέδων γονιδιακής έκφρασης σε 0, 6, 12, και 24 ώρες μετά τη διέγερση MMS για γνωστών στόχων του ATF3 (άνω πάνελ) ή παράγοντες μεταγραφής οι οποίες δεσμεύουν μοτίβα υπερεκπροσωπούνται σε στόχους ATF3 (κάτω πίνακας). Σήματα κανονικοποιούνται εναντίον εκείνων που κατά το χρόνο 0 της siControl και τα σχετικά επίπεδα ή αναλογία μεταξύ siATF3 /siControl είναι χρώμα που κωδικοποιείται από 2

-2,5-2

2.5.

Η

Περαιτέρω ανάλυση του τσιπ -identified στόχοι ATF3 έδειξε ότι η έκφραση του 6-30% γονιδίων επηρεάστηκαν από ATF3 knockdown παρακάτω 0.8-φορές ή μεγαλύτερο από 1,2 φορές σε διαφορετικά χρονικά σημεία μετά από διέγερση MMS. Για τον προσδιορισμό των βιολογικών διεργασιών που ρυθμίζονται από ATF3, χαρτογράφηση οδός διεξήχθη χρησιμοποιώντας DAVID [35] για ένα υποσύνολο των στόχων ATF3 είτε κατάντη είτε πάνω ρυθμισμένα με ATF3 knockdown (τροποποιημένο ακριβής δοκιμασία του Fisher

ρ-τιμή

& lt? 0.1). Όπως συνοψίζεται στον Πίνακα 2, το στρες που προκαλείται από ATF3 συσχετίστηκε με διάφορες κυτταρικές διαδικασίες όπως μεταβολικές οδούς (σάκχαρα, αμινοξέα, λιπίδιο), αναβολικές και καταβολικές διαδικασίες (στεροειδές και φολικού οξέος βιοσύνθεσης, ubiquitilation, του κύκλου της ουρίας), την παραγωγή ενέργειας (κύκλος TCA , οξειδωτική φωσφορυλίωση), του κυτταρικού κύκλου, απόπτωση, προσκόλληση, κυτταροσκελετού, και τα μονοπάτια σηματοδότησης (ErbB, p53, ινσουλίνη, Wnt, VEGF).

Η

στη συνέχεια, για τον εντοπισμό πιθανών στόχων του ATF3 στο σχετίζονται με τον καρκίνο ATF3, πραγματοποιήσαμε ATF3 knockdown και έκφραση προφίλ χρησιμοποιώντας κύτταρα LNCaP (Εικ. S4). ανάλυση χαρτογράφησης Pathway του γονιδίου υποσύνολα είτε ρυθμισμένα προς τα κάτω (& lt? 0,8 φορές) ή πάνω ρυθμισμένα (& gt? 1,2 φορές) με knockdown του ATF3 συνοψίζεται στον Πίνακα 3. εκφράζεται ιδιοσυστατικά ATF3 σε κύτταρα LNCaP φαίνεται να εμπλέκονται στην βιολογική διεργασίες μάλλον διαφορετικές από εκείνες στις αποκρίσεις στρες συμπεριλαμβανομένης κυτταρικής προσκόλλησης, σακχαρώδη διαβήτη, και σηματοδότηση (ErbB, ρ53, Wnt, ασβέστιο) με μικρή συσχέτιση με μεταβολικές διεργασίες. Λαμβανόμενα μαζί, αυτά τα δεδομένα υποδεικνύουν ότι οι μεταβολικές πορείες, του κυτταρικού κύκλου, απόπτωση, και ινσουλίνη και VEGF σηματοδότηση είναι μοναδικά στόχοι του στρες που προκαλείται από ATF3, ενώ ο σακχαρώδης διαβήτης και σηματοδότηση ασβέστιο, αλλά όχι του κυτταρικού κύκλου και της απόπτωσης, είναι μοναδικά στόχοι ATF3 εκφράζονται σε τα καρκινικά κύτταρα. Η πιθανή σχέση μεταξύ ATF3 και οδός διαβήτη όπως διαπιστώθηκε στη μελέτη μας είναι συνεπής με μια πρόσφατη μελέτη δείχνει ότι ATF3 ενεργοποιείται σε παχύσαρκα λιπώδη κύτταρα συμβάλλουν στην αντίσταση στην ινσουλίνη μέσω κάτω ρύθμιση της αδιπονεκτίνης και GLUT4 μεταφορέα γλυκόζης [36].

DNA βλάβη που προκαλείται ATF3 ενεργοποιεί ένα υποσύνολο των προ-αποπτωτικών γονιδίων του p53 μονοπάτι

Στοιχεία της οδού p53 ως πιθανός στόχος της ATF3 μας ώθησε να αναλύσει περαιτέρω ρύθμιση των γονιδίων στόχων p53 από ATF3 . Πρώτα ανέλυσε πόσοι από παλαιότερα γνωστό στόχων p53 [6] είναι επίσης στόχοι της ATF3 σε δοκιμασία ChIP μας. Βρήκαμε ότι το άγχος που προκαλείται από ATF3 προσλήφθηκε σε όσο το 40% (δηλαδή 97/244) των στόχων p53, γεγονός που συνεπάγεται για την πρώτη φορά που ένα μεγάλο μέρος των στόχων p53 μπορεί να είναι μεταγραφικά συν-ρυθμίζονται από ATF3. Στη συνέχεια, αξιολογείται ο αντίκτυπος της ATF3 knockdown στην έκφραση των κοινών στόχων του ATF3 και ρ53 σε διάφορα χρονικά σημεία μετά από διέγερση των κυττάρων HCT116 με MMS. Όπως φαίνεται από χάρτη θερμότητας στο Σχ. 4Α (αναλογία σημάτων σε siControl και siATF3), οι περισσότεροι από αυτούς είναι ελαφρώς κάτω-ρυθμίζονται με νοκ ντάουν ATF3 συμπεριλαμβανομένων των προ-αποπτωτικών γονιδίων, όπως BBC3 /PUMA, TNFRSF10A /DR4 και TNFRSF10B /DR5.

(Α) θερμότητα αναπαράσταση χάρτη των επιπέδων γονιδιακής έκφρασης σε 0, 6, 12, και 24 ώρες μετά τη διέγερση MMS για κοινούς στόχους ATF3 και ρ53. Σήματα κανονικοποιούνται εναντίον εκείνων που κατά το χρόνο 0 της siControl και τα σχετικά επίπεδα ή αναλογία μεταξύ siATF3 /siControl είναι χρώμα που κωδικοποιείται από 2

-2,5-2

2.5. Τα γονίδια συγκεντρωμένα σύμφωνα με τα πρότυπα έκφρασης μετά τη διέγερση MMS: ένα, έντονα ενεργοποιημένο? β, έντονα καταπιεσμένη, γ, ασθενώς ενεργοποιημένο? d, μικτή? e, ασθενώς κατασταλεί. Τα περισσότερα γονίδια είναι ασθενώς κάτω-ρυθμίζονται από ATF3 knockdown, ενώ DNMT1 αποτελεί εξαίρεση που ρυθμίζεται προς τα πάνω με ATF3 knockdown. (Β) Η ποσοτική ανάλυση RT-PCR του ATF3 και προ-αποπτωτικών στόχων του ρ53. Τα επίπεδα έκφρασης σε siATF3-επιμολυσμένα κύτταρα (διαγραμμισμένο ράβδοι) υποδεικνύονται σε σχέση με εκείνες του ελέγχου (ανοιχτές ράβδοι). μικρογραφία αντίθεσης (C) Φάση των κυττάρων HCT116 μετά από αγωγή με 50 ng /ml MMS για 12 ώρες υπό την παρουσία siControl ή siATF3. (Δ) Αριθμός των ζωντανών κυττάρων HCT116 μετά από αγωγή με 50 ng /ml για MMS 0, 8, 12, και 24 ώρες παρουσία του siControl (ανοικτοί κύκλοι) ή siATF3 (κλειστοί κύκλοι). (Ε) Η ενεργοποίηση της κασπάσης 3, όπως μετράται με διασπασμένων προϊόντων της. κύτταρα HCT116 διαμολύνθηκαν με siControl ή siATF3 και υποβλήθηκε σε επεξεργασία με 50 ng /ml MMS για 0, 3, 6, και 12 ώρες. εκχυλίσματα ολόκληρων κυττάρων υποβλήθηκαν σε ανάλυση κηλίδας Western χρησιμοποιώντας αντισώματα έναντι ATF3, β-ακτίνη, κασπάσης 3, και διασπάται κασπάση 3. Arrowhead υποδεικνύει διασπασμένη κασπάση 3 το προβλεπόμενο μοριακό βάρος.

Η

Για να αξιολογηθεί περαιτέρω η λειτουργία του ATF3 στην έκφραση του γονιδίου-στόχου p53, πραγματοποιήσαμε ποσοτική ανάλυση RT-PCR του προ-αποπτωτικών γονιδίων σε MMS-διεγερμένα κύτταρα προ-επιμολυσμένα είτε με έλεγχο siRNA ή siATF3. Όπως φαίνεται στο Σχ. 4Β, ATF3 νοκ ντάουν προκάλεσε μείωσε σημαντικά την επαγωγή της TNFRSF10A /DR4, TNFRSF10B /DR5 και BBC3 /PUMA με επεξεργασία MMS. Στη συνέχεια αναλύσαμε επιδράσεις της εκτοπικά εκφραζόμενη ATF3 σε γονίδια-στόχους της ρ53 χρησιμοποιώντας λουσιφεράση ρεπόρτερ που φιλοξενούν εγγύς υποκινητές με ένα μοτίβο ATF /CRE όπως απεικονίζεται στο Σχ. 5Α. Η συν-επιμόλυνση των HCT116 κυττάρων με ρεπόρτερ λουσιφεράσης και φορείς έκφρασης ATF3 οδήγησε σε σημαντική ενεργοποίηση του TNFRSF10B /DR5, GADD45A, BBC3 /Puma, και DDIT4 (Εικ. 5Β), σε συμφωνία με τα δεδομένα μικροσυστοιχίας που δείχνουν ότι ATF3 knockdown προκαλείται εξασθενημένα έκφραση αυτών των γονιδίων (Σχ. 4Α). Αντίθετα, το γονίδιο βιμεντίνη, η οποία καταστέλλεται με κατεργασία MMS (Εικ. 4Α), δεν ενεργοποιήθηκε σημαντικά από έκτοπη έκφραση της ATF3 (Εικ. 5Β).

(Α) Η DR5-λουσιφεράσης κατασκεύασμα ανταποκριτή που περιέχει ένα θραύσμα DR5 προαγωγέα από -1226 (θέση PstI) για 1 (AUG κωδικόνιο) το οποίο υποκλωνοποιήθηκε εντός PICAGENE PGV-B2. Οι ATF /CRE μοτίβα (ATF) και μοτίβο p53 (p53) που υποδεικνύεται. (Β) Διπλή δοκιμασίες λουσιφεράσης για TNFRSF10B /DR5, GADD45A, BBC3 /PUMA, DDIT4 και VIM. κύτταρα HCT116 διαμολύνθηκαν με κάθε ανταποκριτή και διεγείρονται με 50 ng /MMS ml για 12 ώρες. Firefly δραστηριότητα λουσιφεράσης ομαλοποιήθηκε με την δραστηριότητα λουσιφεράσης CMV-Renilla. (C) διπλή δοκιμασία λουσιφεράσης χρησιμοποιώντας άγριου τύπου ή ATF3

– /-. Εμβρυϊκούς ινοβλάστες ποντικού (ΥΠΟΙΟ)

Η

Για να διευκρινιστεί η λειτουργία της ATF3

in vivo

, πήραμε πλεονέκτημα του ATF3-ανεπαρκή ποντίκια ιδρύθηκε πρόσφατα στο εργαστήριο μας ([37]). Mouse εμβρυϊκούς ινοβλάστες διαμολύνθηκαν με DR5 ρεπόρτερ λουσιφεράσης και διεγείρονται με MMS. Είναι ενδιαφέρον ότι, η απώλεια της ATF3 προκάλεσε σημαντικά μειωμένα επίπεδα δραστηριότητας προαγωγέα βασικής DR5 όπως φαίνεται στο Σχ. 5C, υποδηλώνοντας ότι η έκφραση της βασικής DR5 εξαρτιόταν από ATF3. Επιπλέον, MMS επαγόμενη ενεργοποίηση του DR5 προαγωγού μειώθηκε περίπου κατά το ήμισυ σε ATF3

– /- κύτταρα σε σύγκριση με τα κύτταρα άγριου τύπου, υποδηλώνοντας ότι το DNA βλάβη που προκαλείται από την ενεργοποίηση του DR5 ήταν εν μέρει εξαρτάται από ATF3. Στο σύνολό τους, αυτά ζημιογόνων και να αποκτήσουν-του-λειτουργία μελέτες δείχνουν ότι ATF3 ενεργοποιεί επιλέξτε στόχοι της p53.

DNA βλάβη που προκαλείται ATF3 ευαισθητοποιεί τα κύτταρα σε κυτταρικό θάνατο

Για να αξιολογηθεί βιολογική σημασία των διασυνοριακών -Συζητήστε μεταξύ ATF3 και ρ53, εμείς επόμενο αναλύσαμε την επίδραση της ATF3 knockdown στη βιωσιμότητα των κυττάρων μετά από διέγερση με MMS. Όπως απεικονίζεται στο Σχ. 4C και 4D, υπήρξαν ένας μεγαλύτερος αριθμός κυττάρων HCT116 επιμολυσμένα με siATF3 από εκείνα επιμολυσμένα με siRNA ελέγχου μετά την επεξεργασία MMS. Αυτή η διαφορά στον αριθμό των κυττάρων θα μπορούσαν να αντανακλούν είτε την αυξημένη ανάπτυξη των κυττάρων ή μειωμένη κυτταρικό θάνατο. Για την αντιμετώπιση αυτού του ζητήματος, αναλύσαμε την ενεργοποίηση της κασπάσης 3, ένα σήμα κατατεθέν της αποπτωτικό κυτταρικό θάνατο, με κηλίδα Western. Όπως απεικονίζεται στο Σχ. 4Ε, knockdown του ATF3 προκάλεσε μείωση στην ενεργοποίηση της κασπάσης 3, όπως κρίνεται από την παραγωγή διασπασμένη κασπάση 3. Αυτά τα δεδομένα είναι συνεπή με ATF3 διαμεσολαβούμενη ενεργοποίηση της προ-αποπτωτικών γονιδίων (Εικ. 4Β, Σχ. 5) και υποδεικνύουν έντονα ότι το DNA βλάβη που προκαλείται ATF3 συμβάλλει στο στρες που προκαλείται από τον κυτταρικό θάνατο με συν-ενεργοποίηση ενός υποσυνόλου των γονιδίων στόχων του ρ53.

Καρκίνος σχετιζόμενη ATF3 προάγει τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων και αναστέλλει την απόπτωση

Είναι ενδιαφέρον, knockdown του ATF3 σε LNCaP κύτταρα προκάλεσε αύξηση της ρ21 πρωτεΐνες (Εικ. 6Α) ταυτόχρονα με τη μείωση της κυτταρικής ανάπτυξης (Εικ. 6Β). Αυτά τα ευρήματα είναι συνεπή με προηγούμενες αναφορές που υποδηλώνει ένα ρόλο του ATF3 στον πολλαπλασιασμό των κυττάρων του καρκίνου [20], [22], [38] και c-Myc επαγόμενη κυτταρική ανάπτυξη [19]. Επιπλέον, οι τρέχουσες ανάλυση ATF3-ρυθμιζόμενη οδών σε κύτταρα LNCaP (Πίνακας 3Β) ανέφερε ότι τόσο πολλοί όπως 13 γονίδια στο μονοπάτι ρ53 μπορεί να ενεργοποιηθεί από ATF3. Για να αξιολογηθεί η επίδραση της ATF3 επί ρ53-μεσολαβούμενη κυτταρικού θανάτου, πραγματοποιήσαμε ποσοτική ανάλυση RT-PCR του προ-αποπτωτικών γονιδίων σε μονοπάτι ρ53. Όπως απεικονίζεται στο Σχ. 6C, ATF3 knockdown προκάλεσε αυξητική ρύθμιση του FAS, TNFRSF10B /DR5, BBC3 /Puma, και CASP10 καθώς CDKN1A /ρ21, υποδηλώνοντας ότι ATF3 ρυθμίζει αρνητικά p53-επαγόμενο κυτταρικό θάνατο και ενισχύει τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων μέσω αναστολής της έκφρασης του p21.

(Α) ανάλυση Western blot των ATF3 και ρ21 σε κύτταρα LNCaP επιμολυσμένα με siControl ή siATF3 με β-ακτίνη ως έλεγχο φόρτισης. (Β) Αριθμός βιώσιμων κυττάρων σε 0, 3, και 5 ημέρες μετά τη διαμόλυνση με siControl (ανοιχτοί κύκλοι) ή siATF3 (κλειστοί κύκλοι). (Γ) Ποσοτική RT-PCR ανάλυση των προ-αποπτωτικών γονιδίων σε ρ53 μονοπάτι και ρ21 μετά την επιμόλυνση. Επίπεδα έκφρασης σε siATF3 (διαγραμμισμένο μπάρες) σε σχέση με εκείνες του siControl (ανοιχτό μπαρ) υποδεικνύονται.

Η

Συζήτηση

Δείξαμε ότι το DNA βλάβη που προκαλείται ATF3 συνδέεται με σχεδόν το ένα τρίτο από τους δικαιούχους του ανθρώπου REFSEQ. Αναγνώριση ενός τόσο μεγάλου αριθμού των στόχων δεν είναι εξαιρετική, δεδομένου ότι E2F1 και MYC είναι γνωστό να προσληφθούν σε & gt? 20.000 και & gt? 17.000 στόχους, αντίστοιχα, στο ανθρώπινο γονιδίωμα [39], και INO4 μαγιά έχει αναφερθεί ότι συνδέονται με 1078 στόχοι κατά την διέγερση MMS [5]. Ο αριθμός των στόχων του καρκίνου που σχετίζεται με ATF3 ήταν μικρότερη από εκείνη του DNA βλάβη που προκαλείται ATF3, αντανακλώντας ίσως τόσο υψηλότερα επίπεδα και μεγαλύτερη πολλαπλάσια επαγωγή του ATF3 σε απόκριση MMS από εκείνες που επιτυγχάνονται με knockdown του ATF3 σε κύτταρα LNCaP (τα δεδομένα δεν φαίνονται) . Παρ ‘όλα αυτά, η δοκιμασία ήταν αξιοσημείωτα συνεπής επειδή το 89% των στόχων σε κύτταρα LNCaP βρέθηκαν επίσης σε MMS επεξεργασμένα HCT116 κύτταρα και έντεκα από 41 προηγουμένως γνωστών στόχων ATF3 συμπεριλαμβανομένων EGR1 [40] και θα μπορούσαν να ταυτοποιηθούν HIF-2A [30]. Μια έρευνα του ATF3 τσιπ επόμενα δεδομένα της βάσης δεδομένων ΚΩΔΙΚΟΠΟΙΗΣΗ (https://hgdownload.cse.ucsc.edu/goldenPath/hg19/encodeDCC/wgEncodeHaibTfbs/) δείχνει επίσης ότι σημαντικά ποσοστά των στόχων ATF3, δηλαδή 37,6% (768/2041 ) σε Κ562 (λευχαιμία), 71,9% (742/1032) στην HepG2 (συκώτι) και 76,2% (809/1062) στην Η1-ανθρώπινα εμβρυϊκά βλαστοκύτταρα (εμβρυϊκά βλαστοκύτταρα), είναι κοινές με 2711 στόχους σε GM12878 (λεμφοβλαστοειδείς), η οποία θα μπορούσε να θεωρηθεί ως συντηρητική στοιχεία που παρατίθενται παραλλαγές τσιπ seq ποιότητας των δεδομένων (η οποία επηρεάζει την ευαισθησία της ανίχνευσης κορυφής) και διαφορά στο τύπους ιστών.

Αξίζει να σημειωθεί ότι, δέστρες θέσεις διαφόρων άλλων παραγόντων μεταγραφής που προκαλείται από βλάβη του DNA (ΝΡ Υ, E2F, ΥΥ1 /NF-E1, FOXJ2, SP1), UV ακτινοβολία (USF2, RFX1), και το οξειδωτικό στρες (γ-ETS) ήταν σημαντικά υπερεκπροσωπούνται στους στόχους ATF3 (Πίνακας 1) δείχνει ένα εκτεταμένο δίκτυο από αυτά παράγοντες αντίδραση στο στρες (Εικ. S6). Μια πιθανή εξήγηση για μια τέτοια σύμπτωση των παραγόντων μεταγραφής σχετίζεται με το στρες είναι ότι ATF3 ενδέχεται συνεργούν με αυτούς τους παράγοντες μεταγραφής για να ρυθμίζουν την έκφραση του γονιδίου-στόχου. Εναλλακτικά, ATF3 στόχους που προσδιορίζονται από την ανάλυση ChIP μπορεί να περιλαμβάνουν έμμεση σύνδεση της ATF3 μέσω της αλληλεπίδρασης με άλλους μεταγραφικούς παράγοντες στρες που προκαλείται. Πράγματι, ATF3 είναι μέλος μιας μεγάλης οικογένειας παραγόντων μεταγραφής τύπου bZIP, συμπεριλαμβανομένων εκείνων που προσδιορίζονται στην παρούσα μελέτη (δηλ ΑΡ-1, DDIT3, και USF2), τα οποία σχηματίζουν ομο- και ετερο-διμερή με διαφορετικές συγγένειες με παραλλαγές των συναίνεση ATF /CRE μοτίβο [32]. Επιπλέον, Sp1 διαπιστώθηκε κατά την τρέχουσα ανάλυση είναι γνωστό ότι αλληλεπιδρά φυσικά με ATF3 [33], [34]. Περαιτέρω μελέτες θα πρέπει να προσδιοριστεί ο ρόλος των παραγόντων μεταγραφής στρες-επαγώγιμους, ιδίως εκείνων που δεν είναι γνωστό ότι αλληλεπιδρά με ATF3 πριν, στη σύνδεση του ATF3 για στόχευση γονιδίων.

Η τρέχουσα μελέτη υποδεικνύει ότι η επίδραση της ATF3 σε κάθε έκφραση του γονιδίου-στόχου δεν είναι όλα-ή-κανένα αποτελέσματα. Μάλλον, οι επιδράσεις του ATF3 σε πολλά, αλλά επιλεγμένα γονίδια, όπως αυτά που εμπλέκονται σε κυτταρικό θάνατο του κυτταρικού κύκλου και, συλλογικά ανήλθε σε βιολογικά σημαντικά αποτελέσματα ως κυτταρικό θάνατο για ATF3 σε αντίδραση στο στρες (Εικ. 4C-Ε) ή την ανάπτυξη των κυττάρων του καρκίνου που σχετίζεται ATF3 (Εικ. 6Β). Επιπλέον, νοκ ντάουν η μελέτη μας δείχνει ότι μόνο το 6-30% των πιθανών στόχων του ATF3 άμεσα ρυθμίζονται από ATF3 σύμφωνα με τις προηγούμενες εκθέσεις δείχνουν ότι μόνο το 25% των στόχων p53 [6], το 26% των στόχων STAT1 [41], και 11% των στόχων του παράγοντα μεταγραφής ζυμομύκητα επηρεάζονται από γονίδιο knockdown [5]. Αρκετοί μηχανισμοί έχουν προταθεί για ρ53 να εξηγήσει γιατί μόνο ένα υποσύνολο των πιθανών στόχων ανταποκρίνονται σε χειρισμούς της ρ53, συμπεριλαμβανομένων επιγενετικών μέλη των γονιδίων στόχων, πληρότητα υποκινητή με RNA πολυμεράσες, και την πρόσληψη των απαραίτητων συν-παράγοντες [42]. Παρόμοιοι μηχανισμοί μπορεί να ευθύνονται για το γονίδιο-εκλεκτικά αποτελέσματα της ATF3. Εναλλακτικά, πολλαπλές μορφές των συγκροτημάτων ATF3, όπως ετερο-διμερή με διαφορετικές πρωτεΐνες bZIP, μπορεί να αποτελούν τη βάση διαφορικά αποτελέσματα της ATF3 για γονιδίων στόχων.

Κατά τα τελευταία αρκετά χρόνια, ένας αυξανόμενος αριθμός μελετών έχουν δείξει ότι ATF3 έχει πλειοτροπική λειτουργίες ανάλογα με το περιεχόμενο των κυττάρων. Είναι σημαντικό, η μελέτη μας έδειξε ότι το άγχος που προκαλείται από ATF3 και σχετίζονται με τον καρκίνο ATF3 έχουν αντίθετες επιδράσεις στην ρ53 και Wnt οδούς: οδός p53 ενεργοποιείται σε απόκριση στρες (Εικ. S5) σύμφωνο με τη λειτουργία του ATF3 σε ρ53-μεσολαβούμενη κυτταρικού θανάτου [6 ], [23] – [25], ενώ Wnt οδός ενεργοποιείται σε καρκίνο όπως αναφέρθηκε προηγουμένως σε μια μελέτη σχετικά με ATF3 διαγονιδιακά ποντίκια ανάπτυξη όγκων του μαστού [43]. Θα μπορούσε κανείς να υποστηρίξει ότι η διαφορά στο γενετικό υπόβαθρο ή /και τύπους ιστών μεταξύ των κυττάρων HCT116 και LNCaP κύτταρα θα μπορούσαν να έχουν επηρεάσει τη λειτουργία της ATF3. Πράγματι, ATF3 φαίνεται να παίζει διακριτούς ρόλους σε διαφορετικούς ιστούς: ATF3 δρα ως καταστολέας όγκων σε καρκίνο του παχέος εντέρου [24], [44], ενώ είναι ογκογόνος σε καρκίνο του προστάτη [20], του καρκίνου του μαστού [21], ο καρκίνος του δέρματος [29] , και Hodgkin λέμφωμα [22]. Τα ευρήματά μας στα κύτταρα HCT116 (κόλον) και τα κύτταρα LNCaP (προστάτη) συνάδουν με μια τέτοια υπόθεση.

Μεταβολές της ρυθμιστικής λειτουργίας του ATF3 τονίζεται από το εύρημά μας ότι ATF3 απαιτείται τόσο για την ενεργοποίηση και την καταστολή των pro -apoptotic γονίδια όπως BBC3 /PUMA και TNFRSF10B /DR5 σε αντίδραση στο στρες και τον καρκίνο. Αξίζει να σημειωθεί ότι, αντίθετα αποτελέσματα από ATF3 στην έκφραση της κυκλίνης D1 έχουν τεκμηριωθεί προηγουμένως: ATF3 συνδέεται με ΑΡ-1 μοτίβο και ενεργοποιεί κυκλίνης D1 σε κύτταρα που διεγείρονται με μιτογόνο ηπατώματος ποντικού [45], ενώ συνδέεται με ATF ιστοσελίδα /CRE και καταστέλλει κυκλίνης D1 σε ινοβλάστες ποντικού που διεγείρονται από τον ορό [46]. Στη βιβλιογραφία, υπάρχουν άφθονες προηγούμενα μεταγραφικών παραγόντων που έχουν πλαίσιο που εξαρτώνται από αντίθετες λειτουργίες για την ανάπτυξη του καρκίνου ([47] και αναφορά σ ‘αυτό). KLF4, για παράδειγμα, ενεργοποιεί p21 και p53 καταστέλλει τα οποία αμφότερα καταστέλλονται με ενεργοποιημένο Ras οδηγεί σε διακοπή της ανάπτυξης εν τη απουσία του Ras ή μετασχηματισμού του φαινοτύπου παρουσία Ras. Εναλλακτικά, μια πρόσφατη μελέτη έχει δείξει ότι Kruppel-σαν παράγοντας 5 (KLF5) απαιτείται για τη μεταγραφή MYC σε πολλαπλασιαζόμενα επιθηλιακά κύτταρα αλλά είναι απαραίτητη για TGFb διαμεσολαβούμενη καταστολή του MYC [48]. Διαφορική σύνδεση του KLF5 να ανασταλτικών στοιχείο TGFβ παρουσία ή απουσία του ΤΟΡβ προτάθηκε ως μηχανισμός των αντίθετα αποτελέσματα. Περαιτέρω μελέτες θα πρέπει να καθορίσει εάν οι συνδυασμοί των ATF3 και άλλων παραγόντων μεταγραφής να αλλάξετε τη λειτουργία της ATF3 σε συγκεκριμένους στόχους.

Η αντίσταση των καρκινικών κυττάρων σε διάφορες συνθήκες στρες παραμένει ένα σημαντικό ζήτημα. Ωστόσο, οι γνώσεις μας για τον ρόλο των μηχανημάτων απόκρισης κυτταρικού στρες στην αντίσταση του καρκίνου στην υποξία [49] ή χημειοθεραπευτικών παραγόντων [50] εξακολουθεί να είναι περιορισμένη. Η ανακάλυψή μας ότι ATF3 έχει αντίθετα αποτελέσματα επί προ-αποπτωτικών γονιδίων υποδηλώνει ότι πρέπει να λαμβάνεται πρόνοια να είτε να ενισχύσει ή να μπλοκάρει τη λειτουργία του ATF3 σε μια νέα προσέγγιση για την θεραπεία του καρκίνου. Περαιτέρω κατανόηση του μηχανισμού μεταγωγής της λειτουργίας ATF3 ως μεταγραφικός ενεργοποιητής ή καταστολέας θα μπορούσε να βοηθήσει στην ανάπτυξη στρατηγικών για το χειρισμό επιλεκτικά ένα υποσύνολο των γονιδίων-στόχων ATF3 να βοηθήσει την θεραπεία καρκίνων χημειοθεραπείας ανθεκτικά.

Υλικά και Μέθοδοι

Ηθική δήλωση

Όλες οι εργασίες των ζώων εγκρίθηκε και διεξάγεται σύμφωνα με τις κατευθυντήριες γραμμές των επιτροπών των πειραμάτων σε ζώα και ανασυνδυασμένου DNA πειράματα του Τόκιο Ιατρική και Οδοντιατρική του Πανεπιστημίου (License Νο 2.010 – 205).

πλασμίδια

δημοσιογράφους λουσιφεράσης για DR5 [51], GADD45A [52], PUMA [53], και vimentin [54] ήταν ευγενικό δώρα από τον Dr. Toshiyuki Sakai (Κιότο Νομαρχιακό Πανεπιστήμιο, Ιαπωνία), Δρ Kazuhiro Daino (Εθνικό Ινστιτούτο ραδιολογικής Επιστημών, Ιαπωνία), Δρ Jian Yu (Το Ογκολογικό Κέντρο Johns Hopkins, USA), και Δρ Σούζαν Rittling (Το Ινστιτούτο Forsyth, USA), αντίστοιχα. Η ανταποκριτή λουσιφεράσης DR5 ανακατασκευάστηκε με υποκλωνοποίηση ενός θραύσματος DR υποκινητή από PstI (-1226) προς το AUG κωδικόνιο σε φορέα PICAGENE PGV-Β2 (Toyo Β-Net Co, Ltd, Japan). Ο φορέας έκφρασης pCI-ATF3 περιγράφηκε προηγουμένως [55].

Κυτταρική καλλιέργεια

Ανθρώπινο ορθοκολικού κύτταρα HCT116 καρκινώματος και τα κύτταρα LNCaP καρκινώματος του προστάτη λήφθηκαν από την American Type Culture Collection (USA). Σαράντα οκτώ ώρες πριν από τη διέγερση με MMS, το μέσο καλλιέργειας των κυττάρων HCT116 αντικαταστάθηκαν με το μέσο που περιέχει 0,25% FCS. Εικοσιτέσσερις ώρες αργότερα, τα κύτταρα HCT116 διαμολύνθηκαν είτε με έλεγχο siRNA ή siATF3 χρησιμοποιώντας το αντιδραστήριο Χ-tremeGENE siRNA επιμόλυνση. ON-TARGETplus siRNA SMART πισίνα από Dharmacon χρησιμοποιήθηκε για νοκ ντάουν της ATF3.