Αφηρημένο

υποδοχέα ανδρογόνων (AR) εμπλέκεται στην ανάπτυξη και εξέλιξη των καρκίνων του προστάτη. Πάντως, οι μηχανισμοί με τους οποίους συμβαίνει αυτό παραμένουν ελλιπώς κατανοητή. Σε προηγούμενες εκθέσεις, ωολευκωματίνη κοτόπουλου παράγοντας ανάντη προαγωγέα μεταγραφής II (COUP-TF II) έχει προταθεί ότι παίζει ένα ρόλο στην ανάπτυξη του καρκίνου. Στην παρούσα μελέτη, ερευνήσαμε ένα υποθετικό ρόλο του COUP-TF II σε καρκίνους του προστάτη κατά τη διερεύνηση της επίδρασης επί του κυτταρικού πολλαπλασιασμού και ένα cross-talk μεταξύ COUP-TF II και AR. Η υπερέκφραση του II έχει ως αποτέλεσμα την αναστολή της ανδρογόνο-εξαρτώμενου πολλαπλασιασμού των κυττάρων καρκίνου του προστάτη COUP-TF. Περαιτέρω μελέτες δείχνουν ότι COUP-TF λειτουργίες II ως συν-καταστολέα της AR. Είναι καταστέλλει AR διενεργοποίηση επί υποκινητές στόχου που περιέχει το στοιχείο απόκρισης ανδρογόνων (ARE) με δοσο-εξαρτώμενο τρόπο. Επιπλέον, COUP-TF II αλληλεπιδρά φυσικά με AR

in vitro

και

in vivo.

Ενώνεται με αμφότερες την περιοχή δέσμευσης DNA (DBD) και το πεδίο σύνδεσης συνδετήρα (LBD) του AR και διαταράσσει το Ν /ο τερματικών αλληλεπίδραση του AR. Επιπλέον, COUP-TF II συναγωνίζεται με συνενεργοποιητές όπως ARA70, SRC-1, και να διαμορφώνει GRIP1 AR μετενεργοποίηση καθώς και την αναστολή της πρόσληψης του AR να ARE που περιέχουν προαγωγέα στόχος της. Στο σύνολό τους, τα ευρήματά μας υποδηλώνουν ότι COUP-TF II είναι ένα μυθιστόρημα συγκαταστολέας του AR, και να παρέχει μια εικόνα για το ρόλο του COUP-TF II σε καρκίνους του προστάτη

Παράθεση:. Song CH, Lee HJ, Πάρκο Ε , Lee K (2012) το κοτόπουλο Οβαλβουμίνη Upstream Promoter-Μεταγραφή Factor II ρυθμίζει αρνητικά τη μετενεργοποίηση των ανδρογόνων υποδοχέων στα κύτταρα του καρκίνου του προστάτη. PLoS ONE 7 (11): e49026. doi: 10.1371 /journal.pone.0049026

Επιμέλεια: Klaus Roemer, του Πανεπιστημίου του Saarland Ιατρική Σχολή, Γερμανία

Ελήφθη: 11 Ιουν, 2012? Αποδεκτές: 3 Οκτ, 2012? Δημοσιεύθηκε: 7 του Νοέμβρη 2012

Copyright: © 2012 Song et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτή η έρευνα υποστηρίχθηκε από τη Βασική Επιστήμη ερευνητικό πρόγραμμα μέσω του Εθνικού Ιδρύματος Ερευνών της Κορέας (NRF), που χρηματοδοτείται από το Υπουργείο Παιδείας, Επιστήμης και Τεχνολογίας (2012-0085). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Η φυσιολογική ανάπτυξη, διαφοροποίηση, και λειτουργία του προστάτη αδένα ρυθμίζονται σε μεγάλο βαθμό από τα ανδρογόνα, τα οποία δρουν μέσω του υποδοχέα ανδρογόνων (AR) [1], [2]. Η αναστολή της δράσης της AR, με οποιοδήποτε μέσο, ​​συμπεριλαμβανομένου του ευνουχισμού και αντι-ανδρογόνα θεραπεία, μπορούν να εμποδίσουν ή να καταργήσει όλες τις φάσεις της ανάπτυξης του προστάτη [3]. λειτουργία AR μπορεί να ρυθμίζεται από ενδοκυτταρικά μονοπάτια σηματοδότησης, παράγοντες μεταγραφής, πρωτεϊνών του κυτταρικού κύκλου, και άλλους παράγοντες, οι οποίοι τροποποιούν AR μεταγραφική δραστηριότητα ή παρέχουν μέσα για cross-talk μεταξύ ανδρογόνων και άλλων σημάτων [4]. Τα ανδρογόνα και AR παίζουν επίσης αναπόσπαστο ρόλο στην ανάπτυξη των όγκων του προστάτη [5], [6]. Η εξέλιξη του καρκίνου του προστάτη συμβαίνει μέσω της εναλλαγής της κανονικής άξονα ανδρογόνων από την απορύθμιση της δραστηριότητας AR μέσω καταρράκτες μεταγωγής σήματος, μεταβολές στην έκφραση AR coregulator, και μεταλλάξεις στο AR [7].

AR, ένα συνδέτη εξαρτώμενη παράγοντα μεταγραφής, ρυθμίζει την έκφραση των γονιδίων-στόχων, όταν ενεργοποιούνται από τα ανδρογόνα [1]. AR αποτελείται από τρία ξεχωριστά λειτουργικά πεδία: το Ν-τερματικό πεδίο ενεργοποίησης, ο τομέας μεσαία δέσμευσης DNA, και το πεδίο σύνδεσης Ο-τερματικό συνδέτη [8]. Το Ν-άκρο έχει δειχθεί ότι αλληλεπιδρά άμεσα με το Ο-άκρο σε ένα πρόσδεμα-εξαρτώμενο τρόπο, η οποία απαιτείται για την πλήρη μεταγραφική δυναμικό των AR [9]. Πριν από την έκθεση ανδρογόνων, AR προσδένεται σε ένα σύμπλεγμα συνοδό πολυ-πρωτεΐνης σε ανενεργή κατάσταση. δεσμευτική ανδρογόνων επάγει μία διαμορφωτική αλλαγή στην AR η οποία οδηγεί σε διάσταση από το συγκρότημα συνοδό, διμερισμό και μετατόπιση εντός του πυρήνα, έτσι σύνδεση προς AREs στις ρυθμιστικές περιοχές των γονιδίων στόχων [9] – [11]. AR μεταγραφική δραστηριότητα διαμορφώνεται από συνρυθμιστικών πρωτεΐνες. Το ARE δεσμευμένη ομοδιμερές AR στρατολογεί συνενεργοποιητές, όπως P160 και p300 /CBP, οι οποίες αλληλεπιδράσεις γέφυρα με το γενικό μηχανισμό μεταγραφής και να τροποποιήσουν τις ιστόνες, πραγματοποιώντας έτσι την ενεργοποίηση της έκφρασης γονιδίων [12] – [16]. Αντίθετα, μπορεί να προσλαμβάνει συγκαταστολείς αποακετυλάσης ιστόνης (HDAC) προς το σύμπλοκο AR, διατηρώντας έτσι τη δομή της χρωματίνης [17], [18]. Μπορούν επίσης να αναστέλλουν την λειτουργική αλληλεπίδραση των γενικών παραγόντων μεταγραφής με τον υποκινητή [16].

Οι ωαλβουμίνης κοτόπουλου ανάντη παράγοντες προαγωγό μεταγραφής (COUP-TFs) είναι ορφανοί μέλη της υπεροικογένειας πυρηνικών υποδοχέων που ενεργοποιούν ή καταστέλλουν γονίδιο μεταγραφή με άμεσα δεσμευτική αλληλουχία του DNA [19]. Υπάρχουν τρία μέλη της οικογένειας ανθρώπινου COUP-TF: COUP-TF Ι (NR2F1), COUP-TF II (NR2F2), και Erba που σχετίζονται με πρωτεΐνη 2 (NR2F6) [20]. COUP-TF Ι και II πρωτεΐνες COUP-TF είναι 95% ομόλογες και εξελικτικά συντηρημένη στην περιοχή πρόσδεσης του DNA, καθώς και το πεδίο σύνδεσης συνδετήρα, που διαφέρουν κυρίως στο Ν-άκρο (που επισκοπείται στο [19]). COUP-TF Ι περισσότερο εντόνως εκφρασμένο σε νευρωνικούς ιστούς του κεντρικού και περιφερικού νευρικού συστήματος, ενώ ο COUP-TF II είναι πιο υψηλή έκφραση σε αναπτυσσόμενα όργανα όπως ο πνεύμονας, νεφρό, πάγκρεας και τον προστάτη [20], [21]. Erba πρωτεΐνη που σχετίζεται 2 είναι λιγότερο συντηρημένη και λίγα είναι γνωστά για την έκφραση και τη λειτουργία [22] της.

COUP-TF αλληλεπιδρά με άλλους πυρηνικούς υποδοχείς, συμπεριλαμβανομένων υποδοχέων οιστρογόνων (ER), τον υποδοχέα ρετινοειδούς Χ (RXR) , περοξυσώματος υποδοχείς που ενεργοποιείται από πολλαπλασιαστή (ΡΡΑΚ), και ο υποδοχέας βιταμίνης D (VDR) [23] – [27]. Σε γενικές γραμμές, COUP-TF αναστέλλει την μεταγραφική δραστικότητα άλλων πυρηνικών υποδοχέων με τον ανταγωνισμό για θέσεις δέσμευσης του DNA τους ή με ετεροδιμερισμό με τον εταίρο ετεροδιμερές υποδοχέα ρετινοειδούς Χ πυρηνικών υποδοχέων κατηγορίας II, εμποδίζοντας έτσι την έκφραση του γονιδίου [28]. Επιπλέον, όπως και του υποδοχέα θυρεοειδούς ορμόνης και υποδοχέα ρετινοϊκού οξέος, unliganded DNA δεσμευμένο COUP-TF I καταστέλλει την έκφραση του γονιδίου από μια ενεργή περιοχή σίγηση μέσα στην περιοχή σύνδεσης συνδετήρα που στρατολογεί συγκαταστολείς (δηλαδή, NCoR και SMRT), μια διαδικασία που ονομάζεται ενεργό καταστολή [29]. Τέλος, COUP-TF μπορεί επίσης καταστέλλει μεταγραφή με απευθείας σύνδεση προς το πεδίο σύνδεσης συνδετήρα πυρηνικών υποδοχέων ορμόνης (μετακαταστολή? [30], [31]). Σε προηγούμενες αναφορές, COUP-TF σχετιζόταν με την ανάπτυξη των διαφόρων καρκίνου, συμπεριλαμβανομένου του καρκίνου του μαστού [24], [32] – [34], ο καρκίνος του πνεύμονα, και των επινεφριδίων εξέλιξης του καρκίνου [35] – [37].

στην παρούσα μελέτη, δείχνουμε ότι COUP-TF II καταστέλλει τη μετενεργοποίηση των AR σε κύτταρα καρκίνου του προστάτη, με αποτέλεσμα την αναστολή της κυτταρικής ανάπτυξης εξαρτώμενων από ανδρογόνα. COUP-TF II συνδέεται άμεσα AR, εμποδίζοντας το τερματικό αλληλεπίδραση N /C του AR. Επιπλέον, COUP-TF II αναστέλλει τον συνδετήρα που προκαλείται από την πρόσληψη του AR στον υποκινητή PSA και ανταγωνίζεται με συνενεργοποιητές AR να διαμορφώνει AR διενεργοποίηση. Όλοι μαζί, τα αποτελέσματά μας δείχνουν COUP-TF II ως ένα ισχυρό AR συγκαταστολέας και να παρέχει μια εικόνα για το ρόλο του COUP-TF II σε καρκίνους του προστάτη.

Υλικά και Μέθοδοι

Αντιδραστήρια

τα αντισώματα για AR (sc-815), PSA (sc-7638), ΗΑ (sc-7392), GFP (sc-9996), και α-τουμπουλίνης (sc-5286) ελήφθησαν από την Santa Cruz Biotechnology, Inc . και αντισώματος για AR (PG-21, 06-680) ελήφθη από EMD Millipore Corporation. Αντισώματος για COUP-TF II (PP-H7147-00), η οποία δεν αναγνωρίζει COUP-TF Ι [19], αγοράστηκε από τον Περσέα Πρωτεομική Inc. Ραδιοσημασμένη θυμιδίνης ([μεθυλο

3Η] -θυμιδίνης, ειδική δραστηριότητα 80 Ci /mmol) ελήφθη από την Perkin Elmer Life Science. Trichostation Α αγοράστηκε από την Sigma-Aldrich Co., και βουτυρικό νάτριο και νικοτιναμιδίου (NIC) αγοράστηκαν από την Calbiochem.

πλασμίδια και Κατασκευή

Τα πλασμίδια έκφρασης θηλαστικών του AR ποντικιού (pcDNA3-AR ), pcDNA3-ARA70, pcDNA3-ρ300, pSG5HA GRIP1, και pCR3.1 SRC-1, και MMTV-Luc και PSA-Luc πλασμίδια ανταποκριτές έχουν περιγραφεί προηγουμένως [38]. Η pPBARE × 7-tk-Luc δομήθηκε με εισαγωγή των οκτώ αντίγραφα του στοιχείου απόκρισης ανδρογόνου υποδοχέα (ARE) του probasin ποντικού γονιδίου (ΡΒ). ΗΑ-tagged ποντίκι COUP-TF II δομήθηκε με εισαγωγή του

Msl

I /

Xho

Ι-πέψη θραύσματος από pCR3.1-ποντικιού COUP-TF II σε

Eco

RV /

Xho

Ι-πέψη ΗΑ με επισύναψη επιτόπου φορέα pcDNA3 (pcDNA3HA). GFP-COUP-TF II και II πλήρους μήκους GST-COUP-TF υποκλωνοποιήθηκαν με την εισαγωγή του

Eco

RI /

Xho

Ι-πέψη θραύσματος από pcDNA3HA-COUP-TF II σε

Xma

Ι-πέψη φορέα pEGFP-C1 και

Eco RI

/

Xho

Ι-πέψη φορέα pGEX4T-1, αντίστοιχα. GST-COUP-TF II μήκος και τη διαγραφή μεταλλάξεις πλήρη, AF1, DBD + μεντεσέ (DBDH), και ΔAF1 περιοχές, κατασκευάστηκαν από την αυτο-απολίνωση του

Sma

I /

Xho

Ι- ,

Sph

I /

Xho

Ι, και

Eco

RI /

Sma

Ι-πέψη θραύσματος από GST-COUP-TF II πλήρους μήκους , αντίστοιχα. Τα πλασμίδια έκφρασης θηλαστικών VP-AR1-660 και GAL-AR624-919 και ο δημοσιογράφος κατασκευάσει 5XGAL4-Luc3 (αρχικά από τον Δρ Donald McDonnell) είχαν την καλοσύνη να παρέχονται ως δώρα από τον Dr Elizabeth M. Wilson (Πανεπιστήμιο της Βόρειας Καρολίνας) [39 ].

Παρασκευή ανασυνδυασμένου αδενοϊού

Για την έκτοπη έκφραση του ποντικού COUP-TF II, χρησιμοποιήθηκε ένα αδενοϊικό σύστημα χορήγησης [40]. Εν συντομία, το cDNA COUP-TF II κλωνοποιήθηκε σε pAdTrack-CMV φορέα μεταφοράς. Ο ομόλογος ανασυνδυασμός πραγματοποιήθηκε με μετασχηματισμό των ικανών κυττάρων adEasy-BJ5138 με pAdTrack-CMV-COUP-TF II μαζί με φορέα αδενοϊού φορέα γονιδίου. Επελέγησαν Οι ανασυνδυασμένοι ιοί, ενισχύθηκε σε κύτταρα ΗΕΚ 293, και καθαρίστηκε με χλωριούχο καίσιο φυγοκέντρηση πυκνότητας. Viral τίτλοι μετρήθηκαν χρησιμοποιώντας αδενο-X ταχεία τίτλου (BD Biosciences) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή.

Κυτταροκαλλιέργεια και παροδική επιμόλυνση Δοκιμασία

COS-7 και PPC-1 κύτταρα διατηρήθηκαν σε ϋυΐββοοο ελάχιστο βασικό μέσο (ϋΜΕΜ) (Life Technologies, Inc.) συμπληρωμένο με 10% FBS και 100 μονάδες /ml πενικιλλίνη /στρεπτομυκίνη. LNCaP κύτταρα (American Type Culture Collection) διατηρήθηκαν σε μέσο RPMI 1640 (Life Technologies Inc.) συμπληρωμένο με 10% FBS, 100 μονάδες /ml πενικιλλίνης /στρεπτομυκίνης και 2 mM L-γλουταμίνη.

Είκοσι τέσσερις ώρες πριν από την επιμόλυνση, τα κύτταρα τοποθετήθηκαν σε πλάκες 24 φρεατίων και επιμολύνθηκαν με την υποδεικνυόμενη ποσότητα πλασμίδια έκφρασης, ένα κατασκεύασμα ανταποκριτή και την έκφραση lacZ ελέγχου πλασμίδιο pCMVß χρησιμοποιώντας το SuperFect (Qiagen) ή αντιδραστήριο επιμόλυνσης Lipo2000 (Invitrogen). Οι συνολικές ποσότητες των φορέων έκφρασης διατηρήθηκαν σταθερές με την προσθήκη κατάλληλων ποσοτήτων του απεμπλουτισμένου φορέα. Εικοσιτέσσερις ώρες μετά την επιμόλυνση, το μέσο αντικαταστάθηκε με φρέσκο ​​μέσο που περιέχει 10% απογυμνωμένο με ενεργό άνθρακα ορό και είτε DHT ή όχημα. Τα κύτταρα συλλέχθηκαν 24 ώρες μετά την προσθήκη ορμόνης, και λουσιφεράση και β-γαλακτοσιδάση δραστηριότητες προσδιορίστηκαν όπως περιγράφηκε προηγουμένως [41]. Τα επίπεδα δραστικότητας λουσιφεράσης κανονικοποιήθηκαν προς την έκφραση lacZ.

RT-PCR και qRT-PCR

Ολικό RNA εξήχθη από τον προστάτη με διάλυμα αντιδραστηρίου Tri (Molecular Research Center, Inc.) . Για RT-PCR, 1 μg ολικού RNA μεταγράφηκε αντίστροφα και ενισχύθηκε με PCR με COUP-TF II-ειδικούς εκκινητές, οι οποίοι ενισχύουν ένα θραύσμα 650 bp που εκτείνεται ORF. Ποσοτική ανάλυση της έκφρασης του γονιδίου PSA σε κύτταρα LNCaP μολυσμένα με AdGFP ή AdCOUP-TF II αξιολογήθηκε με qRT-PCR με PSA-ειδικούς εκκινητές, οι οποίοι ενισχύουν μία περιοχή 517 bp που εκτείνεται ORF, χρησιμοποιώντας ένα κιτ SYBR Green PCR και Rotor-Gene RG3000 σύστημα PCR σε πραγματικό χρόνο (Corbett Research). Ως εσωτερικός έλεγχος, οι αντιδράσεις PCR διεξήχθησαν επίσης με χρήση β-ακτίνης-ειδικούς εκκινητές, οι οποίοι ενισχύουν μία περιοχή 362 bp που εκτείνεται το εξώνιο 4. Το ολιγονουκλεοτίδιο αλληλουχίες ήταν ως εξής: προς τα εμπρός 5′-AAGCTGTACAGAGAGGCAGGA-3 ‘και αντίστροφος 5’-AGAGCTTTCCGAACCGTGTT- 3 ‘για COUP-TF II? προς τα εμπρός 5’-GGCCAGGTATTTCAGGTCAG-3 ‘και αντίστροφος 5′-CCACGATGGTGTCCTTGATC-3′ για το PSA? και διαβιβάζει 5’-GAGACCTTCAACACCCCAGCC -3 ‘και αντίστροφη 5′-CCGTCAGGCAGCTCATAGCTC -3’ για την β-ακτίνη.

GST pull-down Δοκιμασία

GST, μεταλλάξεις τομέα GST-AR, και GST -COUP-TF μεταλλάξεις διαγραφής II εκφράστηκαν σε

Ε. coli

κύτταρα BL21 και απομονώθηκε με χάντρες γλουταθειόνης-Sepharose-4B (Pharmacia, Biotech ΑΒ). Ακινητοποιημένα πρωτεΐνες σύντηξης GST στη συνέχεια επωάστηκαν με [

35S] μεθειονίνη-σημασμένου COUP-TF II ή AR πρωτεΐνες που παράγονται από

in vitro

μετάφραση χρησιμοποιώντας το ΤΝΤ-συζευγμένο σύστημα μεταγραφής-μετάφρασης (Promega). Οι αντιδράσεις δέσμευσης εκτελέστηκαν σε 250 μΙ GST-ρυθμιστικό διάλυμα πρόσδεσης (20 mM Tris-HCI σε ρΗ 7,9, 250 mM NaCl, 10% γλυκερόλη, 0,05% ΝΡ-40, 5 mM MgCl

2, 0.5 mM EDTA, 1 mM DTT, και 1.5% BSA) επί μία νύκτα στους 4 ° C. Τα σφαιρίδια πλύθηκαν πέντε φορές με 1 ml ρυθμιστικού διαλύματος GST-δέσμευσης. Οι δεσμευμένες πρωτεΐνες εκλούστηκαν με την προσθήκη 20 μΙ ρυθμιστικού διαλύματος δείγματος SDS-PAGE, και αναλύθηκαν με SDS-PAGE και αυτοραδιογραφία [41].

Για να προσδιοριστεί παρεμβαίνοντας με την αλληλεπίδραση που συμβαίνει μεταξύ DBD και LBD του AR από COUP-TF II, πραγματοποιήσαμε ανάλυση του ανταγωνισμού pull-down GST. Ακινητοποιημένο πρωτεΐνες LBD GST-AR επωάστηκαν με [

35S] μεθειονίνη AR AF1DBDh πρωτεΐνες που παράγονται από

in vitro

μετάφραση. Για την ανάλυση του ανταγωνισμού, 2, 5, και 10-πλάσια περίσσεια

in vitro

μεταφρασμένο COUP-TF II πρωτεΐνες προστέθηκε μαζί με ραδιοεπισημασμένο πρωτεΐνες AR AF1DBDh.

Συνανοσοκατακρήμνιση και Ανάλυση Western Blot

In vivo

Συνανοσοκατακρήμνιση δοκιμασία διεξήχθη με κύτταρα PPC-1 επιμολύνθηκαν με 5 μg του AR και 5 μg του GFP-COUP-TF II πλασμίδια έκφρασης. Τα επιμολυσμένα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 10 ηΜ DHT ή όχημα για 4 ώρες μετά την επιμόλυνση και συλλέχθηκαν με RIPA ρυθμιστικό λύσης κυττάρου (50 mM Tris-HCl σε ρΗ 8.0, 150 mM NaCl, 1% ΝΡ-40, 1 μg /ml απροτινίνη, 0.1 μg /ml λευπεπτίνη, 1 μg /ml πεπστατίνη, 0.1 mM PMSF). Ολόκληρο κυτταρικό λύμα (800 μg) επωάσθηκε με 20 μΙ πρωτεΐνης Α /Ο συν πολτού χαντρών αγαρόζης (Santacruz) να αποκλείσει μη ειδικής σύνδεσης και στη συνέχεια φυγοκεντρήθηκε. Το υπερκείμενο διαιρέθηκε σε δύο ίσα μέρη. Μία μερίδα επωάστηκε με 2 μg του αντισώματος αντι-AR (sc-815) και το άλλο επωάστηκε με 2 μg αντι-ΟΡΡ αντίσωμα (sc-9996) επί μία νύκτα στους 4 ° C. Κάθε τμήμα επωάστηκε περαιτέρω για άλλες 4 ώρες μετά την προσθήκη 20 μΙ πρωτεΐνης Α /Ο συν πολτού χαντρών αγαρόζης (Santacruz). Αγαρόζη σφαιρίδια πλύθηκαν τέσσερις φορές το καθένα με ρυθμιστικό διάλυμα RIPA στους 4 ° C, και οι δεσμευμένες πρωτεΐνες διαχωρίστηκαν με SDS-PAGE. Πρωτεΐνες στα πηκτώματα μεταφέρθηκαν σε μεμβράνη νιτροκυτταρίνης Protran μεταφορά (Schleicher και Schuell Bioscience), και υποβλήθηκε σε ανάλυση κηλίδας Western με αντι-AR (sc-815) και αντισώματα αντι-GFP (sc-9996). Σήματα στη συνέχεια ανιχνεύθηκαν με ένα κιτ ECL (Amersham Pharmacia).

χρωματίνης Ανοσοκαθίζηση (μάρκας) Δοκιμασία

LNCaP κύτταρα αναπτύχθηκαν σε RPMI 1640 που περιέχει 10% απογυμνωμένο με ενεργό άνθρακα ορό μολύνθηκαν είτε με AdCOUP -tF II ή AdGFP, και τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 10 ηΜ DHT ή όχημα για 6 ώρες. Τα κύτταρα από σταυροειδείς δεσμούς με 1% φορμαλδεΰδη, και σε επεξεργασία για προσδιορισμό ChIP όπως περιγράφηκε προηγουμένως [42]. αντίσωμα αντι-AR (PG-21) χρησιμοποιήθηκε για ανοσοκαθίζηση. Ανοσοκαταβυθισμένες DNA και εισροών-διασπασμένο DNA υποβλήθηκαν σε PCR χρησιμοποιώντας ένα συγκεκριμένο ζεύγος εναρκτήρα (προς τα εμπρός: 5′-CATGTTCACATTAGTACACCTTGCC-3 ‘και αντίστροφος: 5′-TCTCAGATCCAGGC TTGCTTACTGTC-3′), το οποίο ενισχύει μια περιοχή 315 bp που καλύπτει την θέση δέσμευσης AR της περιοχής ενισχυτή PSA [43]. Ως αρνητικός έλεγχος, οι αντιδράσεις PCR εκτελέστηκαν χρησιμοποιώντας ένα ζεύγος εκκινητών της ακτίνης (προς τα εμπρός: 5’-GAGACCTTCAACACCCCAGCC-3 ‘και αντίστροφος: 5′-CCGTCAGGCA GCTCATAGCTC-3’), το οποίο ενισχύει μια περιοχή 362 bp που εκτείνεται εξόνιο 4 της β- γονίδιο της ακτίνης.

ανοσοφθορισμού

Η ημέρα πριν από την επιμόλυνση, ΔΕΗ-1 απλώθηκε πάνω σε καλυπτρίδες επικαλυμμένες με ζελατίνη. RFP-tagged AR και GFP-tagged COUP-TF II διαμολύνθηκε παροδικά χρησιμοποιώντας αντιδραστήριο SuperFect (Qiagen). Μετά από 4 ώρες, φρέσκο ​​μέσο προστέθηκε στα κύτταρα. Είκοσι τέσσερις ώρες μετά την επιμόλυνση, τα κύτταρα τροφοδοτήθηκαν με φρέσκο ​​μέσο με 10 ηΜ DHT ή όχημα και επωάστηκαν για άλλες 4 ώρες. Τα κύτταρα στη συνέχεια πλύθηκαν τρεις φορές με ψυχρό PBS και σταθεροποιήθηκαν με 2% παραφορμαλδεΰδη για 10 λεπτά. Σταθερή κύτταρα τοποθετήθηκαν σε γυάλινες πλάκες και παρατηρήθηκαν κάτω σάρωσης με λέιζερ συνεστιακό μικροσκόπιο (LSM 5 PASCAL Laser Scanning Microscope, Zeiss).

θυμιδίνης

LNCaP κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε πλάκες 24 φρεατίων σε μια πυκνότητα 2 × 10

4 κύτταρα ανά φρεάτιο και μολύνθηκαν με είτε AdCOUP-TF II ή AdGFP σε 10% απογυμνωμένο με ενεργό άνθρακα ορό μέσο που παρέχεται. Μετά κάθεται όλη τη νύχτα, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 10 ηΜ DHT για 24 ώρες και στη συνέχεια σε στιγμιαία σήμανση με [

3Η] -θυμιδίνης (10 μCi /ml, ειδική δραστικότητα 80 Ci /mmol, PerkinElmer Life Sciences, Norwalk, CT) για 4 ώρες. Τα κύτταρα συλλέχθηκαν σε ένα φίλτρο μικροϊνών υάλου (Whatman, Inc., Florham Park, NJ) και εντατικά πλένεται με αποσταγμένο νερό. Η ενσωμάτωση θυμιδίνης στο DNA μετρήθηκε με απαρίθμηση των φίλτρων με ένα μετρητή σπινθηρισμού.

αποικίας μαλακού άγαρ Σχηματισμός

LNCaP κύτταρα μολύνθηκαν είτε με AdCOUP-TF II ή AdGFP σε 10% απογυμνωμένο με ενεργό άνθρακα ορό παρέχεται μέσο. Μετά από 24 ώρες μόλυνση, τα κύτταρα θρυψινοποιήθηκαν και σπάρθηκαν στα 5 χ 10

3 κύτταρα σε 0.35% άγαρ πάνω στρώμα άγαρ 0,7% σε δίσκους καλλιέργειας έξι φρεατίων. Φρέσκο ​​πλήρες μέσο ανάπτυξης ή απογυμνωμένο με ενεργό άνθρακα ορό μέσο που περιέχει απουσία ή παρούσης 1 ηΜ ϋΗΤ αλλάχθηκε κάθε 2 ημέρες για 2 εβδομάδες. Αποικίες μεγαλύτερη από τη διάμετρο 300 mm βαθμολογήθηκαν.

Στατιστική Ανάλυση

Μια στατιστική ανάλυση έγινε με τη χρήση t-test του Student με το λογισμικό σύστημα PRISM για τα Windows. Σε όλες τις περιπτώσεις πιθανότητα τιμών (P) κάτω από 0,05 θεωρήθηκαν σημαντικές.

Αποτελέσματα

COUP-TF II υπερέκφραση καταστέλλει τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων του καρκίνου του προστάτη

COUP-TF II είναι εκφράζεται υψηλά στα μεσεγχυματικά διαμερίσματα των αναπτυσσόμενων οργάνων, συμπεριλαμβανομένου του προστάτη [20], [21]. Επιπλέον, COUP-TF II έχει προταθεί ότι παίζουν ρόλο στην ανάπτυξη του καρκίνου [24], [32], [33], [35] – [37]. Ως εκ τούτου, αρχικά διερευνήθηκε η έκφραση του COUP-TFs σε κυτταρικές σειρές καρκίνου του προστάτη και επίσης έναν ρόλο στον πολλαπλασιασμό των κυττάρων καρκίνου του προστάτη. COUP-TF II ήταν ιδιαίτερα εκφράζεται σε ένα φυσιολογικό κύτταρο προστάτη γραμμή, RWPE1, αλλά η έκφραση της ήταν δύσκολα ανιχνεύσιμη ή πολύ χαμηλή περιεκτικότητα σε κυτταρικές σειρές καρκίνου του προστάτη, τόσο ανδρογόνο-εξαρτώμενη και ανεξάρτητη από ανδρογόνο (Σχήμα 1Α).

(Α) COUP-TF έκφραση II σε κυτταρικές σειρές καρκίνου ανθρώπινου προστάτη. επίπεδα έκφρασης πρωτεΐνης του COUP-TF II προσδιορίστηκαν με ανάλυση κηλίδας Western των ολικών πρωτεϊνών χρησιμοποιώντας αντι-COUP-TF II, αντι-AR (sc-815), και αντι-α-τουμπουλίνης αντισώματα. τα επίπεδα έκφρασης του mRNA του COUP-TF II προσδιορίστηκαν με RT-PCR του συνολικού RNA. Η έκφραση της τουμπουλίνης και β-ακτίνη χρησιμοποιήθηκε ως ένας εσωτερικός έλεγχος. (Β) COUP-TF II αναστέλλει την ανάπτυξη των καρκινικών κυττάρων του προστάτη. Προσδιορισμού σχηματισμού αποικίας μαλακού άγαρ διεξήχθη με πλήρες μέσο ανάπτυξης (αριστερός πίνακας) ή με μέσο που περιέχει απογυμνωμένο με ενεργό άνθρακα ορό και συμπληρωμένο με ή χωρίς 1 ηΜ ϋΗΤ (δεξί πάνελ). LNCaP κύτταρα μολύνθηκαν με AdGFP ή AdCOUP-TF II για 24 ώρες, και υποβλήθηκαν σε επεξεργασία για προσδιορισμό σχηματισμού αποικίας, όπως αναφέρεται στο «Υλικά και Μέθοδοι». Αποικίες μεγαλύτερη από τη διάμετρο 300 mm βαθμολογήθηκαν. Τα δεδομένα είναι αντιπροσωπευτικά τριών ανεξάρτητων πειραμάτων. (C) COUP-TF II μειώνει το ρυθμό σύνθεσης του DNA σε κύτταρα καρκίνου του προστάτη. LNCaP κύτταρα μολύνθηκαν με AdGFP ή AdCOUP-ΤΡ II σε μέσο που περιείχε ξυλάνθρακα-απογυμνωμένο ορό και συμπληρωμένο με ή χωρίς 1 ηΜ DHT. ρυθμός της σύνθεσης του DNA τους αναλύθηκε έπειτα από [

3Η] δοκιμασία -θυμιδίνης. Τουλάχιστον τρία ανεξάρτητα πειράματα συνενώθηκαν και τιμές αντιπροσωπεύουν τη μέση τιμή ± SEM. *, P & lt? 0,05? ** P & lt? 0,01? *** P & lt?. 0.001

Η

Επειδή COUP-TF II εκφράστηκε σε πολύ χαμηλά επίπεδα σε κυτταρικές σειρές καρκίνου του προστάτη, είμαστε αξιωματική ότι COUP-TF II μπορεί να αναστέλλει τον πολλαπλασιασμό των καρκινικών κυττάρων του προστάτη. Για να ελεγχθεί αυτή η υπόθεση, έχουμε μολυνθεί εξαρτώμενων από ανδρογόνα LNCaP κυττάρων με AdGFP ή AdCOUP-TF II, και ελέγχθηκαν ρυθμό πολλαπλασιασμού των κυττάρων από προσδιορισμού σχηματισμού αποικίας μαλακού agar. Η υπερέκφραση του COUP-TF II μείωσε σημαντικά τον αριθμό αποικιών, καθώς και το μέγεθος των αποικιών των κυττάρων LNCaP σε πλήρες μέσο ανάπτυξης (Σχήμα 1Β, αριστερό πάνελ). Στη συνέχεια ερευνήθηκε κατά πόσον COUP-TF II επηρεάζει την εξαρτώμενη από ανδρογόνο πολλαπλασιασμό των κυττάρων LNCaP. Η υπερέκφραση του COUP-TF II παρεμπόδισε πλήρως DHT εξαρτώμενη σχηματισμού αποικίας των κυττάρων LNCaP σε μέσο που περιέχει απογυμνωμένο με ενεργό άνθρακα ορό (Σχήμα 1Β, δεξιό πλαίσιο). Αναστολή των ανδρογόνων που εξαρτώνται από την ανάπτυξη του COUP-TF II επιβεβαιώθηκε περαιτέρω σε [

3Η] δοκιμασία -θυμιδίνης. έκφραση COUP-TF II μπλοκαριστεί εντελώς τη σύνθεση του DNA των ανδρογόνων που προκαλείται σε κύτταρα LNCaP (Σχήμα 1 C). Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι COUP-TF II αναστέλλει την εξαρτώμενη από ανδρογόνο ανάπτυξη των καρκινικών κυττάρων του προστάτη.

COUP-TF II καταστέλλει AR Μετενεργοποίησης

Από το πραξικόπημα-TF II υπερέκφραση αναστέλλει την εξαρτώμενη από ανδρογόνα ανάπτυξη του καρκίνου του προστάτη LNCaP κύτταρα, ερευνήσαμε μια πιθανή cross-talk μεταξύ COUP-TF II και AR, το οποίο είναι σημαντικό για την ανάπτυξη των καρκίνων του προστάτη. Για να ελέγξετε για ένα cross-talk, θα συνεκφράζονται COUP-TF II με AR στην κυτταρική σειρά ΔΕΗ-1, ένα PC-3 παραγώγου και AR-αρνητικά [44], και η πρόσβαση του επίδραση στην πιθανότητα μετενεργοποίησης AR. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 2Α, COUP-TF II ανέστειλε εξαρτώμενων από ανδρογόνα AR μετενεργοποίηση με δοσο-εξαρτώμενο τρόπο. COUP-TF Ι επίσης έντονα ανέστειλε AR μετενεργοποίησης, αλλά εκφράστηκε ούτε στον προστάτη ποντικού (τα δεδομένα δεν φαίνονται), ούτε σε προστάτη καρκινικές κυτταρικές γραμμές [20], [21].

(Α) δοσοεξαρτώμενη αναστολή του AR διενεργοποίησης από COUP-TFs. κύτταρα PPC-1 διαμολύνθηκαν ταυτόχρονα με 350 ng του pPBARE × 7-tk-Luc ανταποκριτή και 50 ng του πλασμιδίου έκφρασης AR μαζί με την αύξηση της συγκέντρωσης (100, 250, και 500 ng) του COUP-TF Ι ή COUP-TF II. Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με ή χωρίς 3 ηΜ DHT για 24 ώρες. (Β) COUP-TF II μεσολάβηση καταστολή των AR τρανσενεργοποίησης σε φυσικά υποστηρικτές AR-στόχο. κύτταρα PPC-1 επιμολύνθηκαν όπως στο «Α», με PSA-Luc ή MMTV-Luc ανταποκριτή. (C) COUP-TF II μεσολάβηση καταστολή της ενδογενούς μετενεργοποίησης AR. LNCaP κύτταρα επιμολύνθηκαν όπως στο «Α», χωρίς το πλασμίδιο έκφρασης AR. (D) Καταστολή της έκφρασης mRNA PSA ανδρογόνο που επάγεται από COUP-TF II. LNCaP κύτταρα μολύνθηκαν με AdGFP ή AdCOUP-TF II. Μετά από 24 ώρες ανάκτησης, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 10 ηΜ DHT, και καλλιεργήθηκαν για άλλες 24 ώρες πριν από τη συγκομιδή. Ποσοτική ανάλυση RT-PCR διεξήχθη χρησιμοποιώντας ειδικούς εκκινητές για το PSA και β-ακτίνης. Η έκφραση σχετική mRNA PSA ομαλοποιήθηκε με έκφραση β-ακτίνης. Τουλάχιστον τρία ανεξάρτητα πειράματα ενώθηκαν και οι τιμές αντιπροσωπεύουν τη μέση τιμή ± SEM (Α-Δ). ** P & lt? 0,01? *** P & lt? 0.001. (Ε) Καταστολή της έκφρασης πρωτεΐνης PSA ανδρογόνο που επάγεται από COUP-TF II. LNCaP κύτταρα μολύνθηκαν και επεξεργασία όπως στο «D», και καλλιεργήθηκαν για άλλες 48 ώρες πριν από τη συγκομιδή. Η ανάλυση στυπώματος Western των ολικών πρωτεϊνών διεξήχθη χρησιμοποιώντας αντι-PSA, αντι-AR (sc-815), αντι-ΗΑ και αντι-α-τουμπουλίνης. Τα δεδομένα είναι αντιπροσωπευτικά τριών ανεξάρτητων πειραμάτων (αριστερά). Η σχετική έκφραση της πρωτεΐνης PSA ποσοτικά με την ομαλοποίηση με την έκφραση τουμπουλίνης (rignt).

Η

Για να αποδείξει τη σημασία της COUP-TF II μεσολάβηση καταστολή AR, εξετάσαμε COUP-TF II επίδραση στο φυσικό υποστηρικτές AR-στόχους, όπως MMTV και PSA. Σε κύτταρα PPC-1, συνέκφραση COUP-TF II με AR καταστέλλεται AR διενεργοποίηση τόσο ΜΜΤν προαγωγούς και PSA (Εικόνα 2Β). Επιπλέον, COUP-TF II καταστέλλει επίσης την ενδογενή διενεργοποίηση AR σε ελάχιστο AREx7 ARE προαγωγό και προαγωγό PSA σε κύτταρα LNCaP που εκφράζουν το μεταλλαγμένο, αλλά λειτουργική, AR (Σχήμα 2C).

PSA είναι η καλύτερα χαρακτηρισμένη ανδρογόνα αποκρίνεται γονίδιο καθώς επίσης και ένα δείκτη όγκου προστάτη-ειδική. Έτσι, αξιολόγησε την επίδραση της COUP-TF II επί της έκφρασης του ενδογενούς PSA σε κύτταρα LNCaP AR-θετικά, τα οποία μολύνθηκαν με COUP-TF II εκφράζουν αδενοϊό (AdCOUP-TF II). Υπερεκφράζεται COUP-TF II μειωτικά σημαντικά την ανδρογόνων που προκαλείται από την έκφραση του mRNA ενδογενούς PSA (Εικόνα 2D) και της πρωτεΐνης (Σχήμα 2Ε), ενώ δεν είχε καμία επίδραση στην έκφραση πρωτεΐνης AR. Μαζί, αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι COUP-TF II καταστέλλει τη λειτουργία AR σε κύτταρα καρκίνου του προστάτη, αναστέλλοντας την έκφραση του ενδογενούς γονιδίου AR-στόχο PSA.

COUP-TF II φυσικά αλληλεπιδρά με το AR

in vitro

και

in vivo

η

GST δοκιμασία pull-down πραγματοποιήθηκε προκειμένου να εξετάσει κατά πόσον AR καταστολή από COUP-TF II διαμεσολαβείται μέσω άμεση αλληλεπίδραση πρωτεΐνης-πρωτεΐνης. Αλληλεπιδράσεις του AR με COUP-TF II, καθώς επίσης πεδία AR υπεύθυνη για την αλληλεπίδραση, διερευνήθηκαν χρησιμοποιώντας διαφορετικές μεταλλάξεις απαλοιφής AR συγχωνεύθηκε με την πρωτείνη GST (Σχήμα 3Α, αριστερός πίνακας). Η

in vitro

μεταφραστεί COUP-TF II αλληλεπιδρά με GST-AR AF1DBDh, GST-AR DBDH, και GST-AR LBD, αλλά όχι με GST-AR TAU, γεγονός που υποδηλώνει τη συμμετοχή των τομέων DBDH και LBD του AR στην αλληλεπίδρασή της με COUP-TF II. COUP-TF II περιοχές υπεύθυνες για την αλληλεπίδρασή του με το AR στη συνέχεια διερευνήθηκε χρησιμοποιώντας πρωτεΐνη σύντηξης GST του COUP-TF II μεταλλάξεις διαγραφής (Σχήμα 3Α, δεξί πάνελ). Η

in vitro

μεταφραστεί AR αλληλεπιδράσει με το πλήρους μήκους COUP-TF II και τις μεταλλάξεις διαγραφής (COUP-TF II AF1, COUP-TF II DBDH και COUP-TF II ΔAF1), γεγονός που υποδηλώνει την αλληλεπίδραση AR με πολλαπλές τομείς της COUP-TF II.

(α) την άμεση αλληλεπίδραση μεταξύ των COUP-TF II και AR. Αριστερά άνω πίνακα, Σχηματική αναπαράσταση του AR πλήρους μήκους και διαφορετικές μεταλλάξεις διαγραφής τομέα του χρησιμοποιούνται σε GST δοκιμασία pull-down. Αριστερό κάτω πίνακα, COUP-TF II αλληλεπιδρά άμεσα με AR μέσω του DBDH, και την περιοχή LBD του AR. [

35S] μεθειονίνη-σημασμένου COUP-TF II αφέθηκε να συνδεθεί μόνο του ή με διαφορετικά μεταλλάγματα διαγραφής τομέα του AR (GST-AR AF1DBDh, GST-AR TAU, GST-AR DBDH, GST-AR LBD με βακτηριακώς εκφρασμένη GST ). Οι αντιδράσεις διεξήχθησαν με την ισοδύναμη ποσότητα της κάθε πρωτεΐνης όπως προσδιορίζεται με χρώση με κυανό Coomassie (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Πέντε τοις εκατό του επισημασμένου πρωτεϊνών που χρησιμοποιούνται στην αντίδραση σύνδεσης φορτώθηκε ως είσοδο. Δεξιά επάνω πάνελ, Σχηματική αναπαράσταση του πλήρους μήκους COUP-TF II και μεταλλάξεις διαγραφής του. Δεξιά κάτω πίνακα, AR αλληλεπιδρά άμεσα με COUP-TF II. [

35S] μεθειονίνη-επισημασμένο AR αφέθηκε να συνδεθεί με την GST μόνη της, σε όλο το μήκος (GST-COUP-TF II F) ή διαφορετικές μεταλλάξεις διαγραφής του COUP-TF II (GST-COUP-TF II AF1, GST- COUP-TF II DBDH, και GST-COUP-TF II ΔAF1). Τα δεδομένα είναι αντιπροσωπευτικά τριών ανεξάρτητων πειραμάτων. F: Πλήρης μήκος του COUP-TF II? AF1DBDh: AF1 + DBD + μεντεσέ? TAU: μονάδα διενεργοποίηση? DBDH: DBD + περιοχή άρθρωσης. (Β) COUP-TF ΙΙ συγκατακρημνίστηκαν με AR. κύτταρα PPC-1 επιμολύνθηκαν με AR και GFP-συγχωνευμένων πλασμίδια έκφρασης COUP-TF II και στη συνέχεια υποβλήθηκε σε επεξεργασία με ή χωρίς 10 ηΜ DHT για 24 ώρες μετά την επιμόλυνση. Coimmunoprecipitations διεξήχθησαν με αντι-AR (sc-815) ή αντι-ΟΡΡ αντίσωμα. αναλύσεις Western blot ανοσοκαταβυθισμένης υλικών πραγματοποιήθηκαν με τη χρήση αντι-AR (sc-815) ή αντισωμάτων αντι-GFP. Οι κηλίδες εισόδου δείχνονται για το επίπεδο έκφρασης της κάθε πρωτεΐνης. Τα δεδομένα είναι αντιπροσωπευτικά τριών ανεξάρτητων πειραμάτων.

Η

Για να εξεταστεί

in vivo

αλληλεπίδραση μεταξύ των COUP-TF II και AR, πραγματοποιήσαμε ανάλυση Συνανοσοκατακρήμνιση με ΔΕΗ-1 κύτταρα που συνεπιμολύνθηκαν με AR και COUP-TF II πλασμίδια έκφρασης GFP-λιωμένο. Η ανοσοκατακρήμνιση χρησιμοποιώντας αντι-AR ή αντι-ΟΡΡ αντίσωμα, που ακολουθείται από ανάλυση κηλίδος Western των ανοσοκατακρημνισμένων συμπλεγμάτων για AR και COUP-TF II, αποκάλυψε ότι AR και COUP-TF II ήταν αποτελεσματικά συγκαθίζησης (Σχήμα 3Β).

COUP-TF II παρεμβαίνει με την Ν /Ο-τερματικό Αλληλεπίδραση AR

με την δέσμευση συνδέτη, AR διίσταται από πρωτεΐνες θερμικού σοκ και μετατοπίζεται εντός του πυρήνα, έτσι σύνδεση προς προαγωγούς γονιδίου στόχου της ως ομοδιμερές το οποίο σχηματίζεται από την διαμοριακή N /C τερματικό αλληλεπίδραση δύο AR μορίων. Επειδή μερικοί συγκαταστολείς AR παρεμβαίνουν με τα βήματα που εμπλέκονται στην ενεργοποίηση AR ανδρογόνο-εξαρτώμενη συνεπώς καταστολή AR μετενεργοποίηση δυναμικό [45], η ικανότητα των COUP-TF II για να αναστείλει οποιοδήποτε από τα βήματα ενεργοποίησης AR, όπως το τερματικό αλληλεπίδραση N /C και το πυρηνική μετατόπιση του AR, διερευνήθηκε. PPC-1 κύτταρα επιμολύνθηκαν με VP-AR1-660 (που περιέχει κατάλοιπα 1-660 AR), GAL-AR624-919 (που περιέχει κατάλοιπα AR 624-919), και αυξανόμενες ποσότητες COUP-TF II πλασμίδιο έκφρασης, μαζί με μια λουσιφεράση γονίδιο ανταποκριτή ρυθμίζεται από tandem Gal4-αποκριτικά στοιχεία (5XGAL4-Luc3) [39]. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 4Α, COUP-TF II αναστέλλει την αλληλεπίδραση του Gal4-AR624-919 με VP-AR1-660 σε θηλαστικά σύστημα δύο υβριδίων. Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι COUP-TF II αναστέλλει το διμερισμό του AR, μέσω της Δ /δεσμευτικό C. Προκειμένου να καθοριστεί αν COUP-TF II παρεμβαίνει φυσικά με την αλληλεπίδραση που δημιουργείται ανάμεσα στο Ν-τελικό άκρο και Ο-άκρο του AR, πραγματοποιήσαμε ανάλυση του ανταγωνισμού pull-down GST χρησιμοποιώντας GST-AR LBD,

in vitro

μεταφραστεί [ ,,,0],

35S] μεθειονίνη AR AF1DBDh, και

in vitro

μεταφραστεί πρωτεΐνες ΙΙ COUP-TF. AR AF1DBDh δείχθηκε να αλληλεπιδρά με GST-AR LBD, και η αλληλεπίδραση παρεμποδιστεί από COUP-TF II με έναν δοσο-εξαρτώμενο τρόπο (Σχήμα 4Β).

(Α) θηλαστικών δύο υβριδίων δοκιμασίας. κύτταρα ΔΕΗ-1 επιμολύνθηκαν με 5XGAL4-Luc3 μαζί με ή χωρίς VP-AR1-660, GAL-AR624-919, και COUP-TF II πλασμίδια έκφρασης. Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με ή χωρίς 10 ηΜ DHT για 24 ώρες. Τουλάχιστον τρία ανεξάρτητα πειράματα συνενώθηκαν και τιμές αντιπροσωπεύουν τη μέση τιμή ± SEM. *** P & lt? 0.001. (Β) GST δοκιμασία ανταγωνισμού pull-down. Ακινητοποιημένο πρωτεΐνες LBD GST-AR επωάστηκαν με [

35S] μεθειονίνη AR AF1DBDh πρωτεΐνες που παράγονται από

in vitro

μετάφραση. Για την ανάλυση του ανταγωνισμού, 5 και 10-πλάσια περίσσεια πρωτεϊνών

in vitro

μεταφρασμένο COUP-TF II προστέθηκε μαζί με ραδιοεπισημασμένο πρωτεΐνες AR AF1DBDh. Τα δεδομένα είναι αντιπροσωπευτικά τριών ανεξάρτητων πειραμάτων. AF1DBDh: AF1 + DBD + περιοχή άρθρωσης

Η

COUP-TF II που προκαλείται καταστολή AR δεν είχε σχέση με την πυρηνική μετατόπιση του AR και HDAC Πρόσληψη

Η επίδραση του COUP-TF II. επί AR πυρηνική μετατόπιση εκτιμήθηκε με συνεκφράζουν RFP-tagged AR και GFP-tagged COUP-TF II σε κύτταρα COS-7. Όταν τα συνεκφράστηκε RFP-AR και GFP-COUP-TF II, AR πρωτεΐνη που βρίσκονται κυρίως στο κυτταρόπλασμα απουσία συνδέτη, αλλά, AR πρωτεΐνη μετατοπίζεται εντός του πυρήνα με την παρουσία 10 ηΜ DHT (Σχήμα 5Α). Ανεξάρτητα από DHT, COUP-TF II ήταν προβλέψιμα που βρίσκεται στον πυρήνα. Ως εκ τούτου, ούτε AR ούτε COUP-TF πρωτεΐνης ΙΙ εντοπίζεται λανθασμένα από συνέκφραση τους. ** P & lt? 0,01?