Αφηρημένο

παγκρέατος αδενοκαρκίνωμα (PAC) είναι ένα από τα πιο δύσκολα όγκων για τη θεραπεία. Ένα μεγάλο μέρος αυτού οφείλεται στην καθυστερημένη διάγνωση. Για τον προσδιορισμό των βιολογικών δεικτών για την έγκαιρη ανίχνευση, εξετάσαμε τις διαφορές μεθυλίωσης του DNA στο DNA των λευκοκυττάρων μεταξύ των περιπτώσεων PAC και τους ελέγχους σε μια μελέτη δύο φάσεων. Στη φάση Ι, μετρήσαμε τα επίπεδα μεθυλίωσης σε 1.505 περιοχές CpG σε πρωτοθεραπευόμενους λευκοκυττάρων DNA από 132 ποτέ καπνιστής ασθενείς Pac και 60 ποτέ καπνιστής υγιείς μάρτυρες. Βρήκαμε σημαντικές διαφορές σε 110 περιοχές CpG (ποσοστό εσφαλμένης ανακάλυψη & lt? 0,05). Στη φάση ΙΙ, θα δοκιμαστεί και πιστοποιηθεί 88 96 φάσης Ι επιλεγμένες θέσεις CpG σε 240 περιπτώσεις Pac και 240 μάρτυρες (p ≤ 0,05). Χρησιμοποιώντας τιμωρούνται λογιστικής παλινδρόμησης, φτιάξαμε ένα μοντέλο πρόβλεψης που αποτελείται από πέντε περιοχές CpG (IL10_P348, LCN2_P86, ZAP70_P220, AIM2_P624, TAL1_P817) που υφίστανται οι ασθενείς PAC από τους μάρτυρες (C-στατιστική = 0.85 φάσης Ι? 0,76 στη φάση ΙΙ). Είναι ενδιαφέρον, μια περιοχή CpG (LCN2_P86) και μόνο θα μπορούσε διακρίσεις χειρουργήσιμη ασθενείς από τους μάρτυρες (C-στατιστική = 0.78 φάσης Ι? 0,74 στη φάση ΙΙ). Πραγματοποιήσαμε επίσης ανάλυση μεθυλίωσης ποσοτικά χαρακτηριστικό loci (methQTL) και εντοπίστηκαν τρεις περιοχές CpG (AGXT_P180_F, ALOX12_E85_R, JAK3_P1075_R) όπου τα επίπεδα μεθυλίωσης σχετίζονταν σημαντικά με πολυμορφισμούς μονών νουκλεοτιδίων (SNPs) (ποσοστό εσφαλμένης ανακάλυψη & lt? 0,05). Τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι επιγενετικές διακύμανση μπορεί να ληφθεί εύκολα DNA λευκοκυττάρων, που εκδηλώνεται με αναπαραγώγιμες διαφορές μεθυλίωση, μπορεί να χρησιμοποιηθεί για την ανίχνευση ασθενών PAC. Οι διαφορές μεθυλίωσης σε ορισμένες θέσεις CpG οφείλονται εν μέρει στη γενετική παραλλαγή. Αυτή η μελέτη υποστηρίζει σθεναρά μελλοντική μελέτη σύνδεσης επιγονιδιώματος κλίμακα χρησιμοποιώντας λευκοκυττάρων DNA για ανακάλυψη βιοδεικτών σε ανθρώπινες ασθένειες

Παράθεση:. Pedersen KS, Bamlet WR, Oberg AL, de Andrade Μ, Ματσουμότο ME, Tang H, et al. (2011) λευκοκυττάρων μεθυλίωσης του DNA Υπογραφή Διαφοροποιεί Παγκρέατος Καρκινοπαθών από υγιείς μάρτυρες. PLoS ONE 6 (3): e18223. doi: 10.1371 /journal.pone.0018223

Επιμέλεια: Hana Algul, Τεχνικό Πανεπιστήμιο του Μονάχου, Γερμανία

Ελήφθη: 17 Νοεμβρίου του 2010? Αποδεκτές: 24, Φεβρουαρίου, 2011? Δημοσιεύθηκε: 24 Μαρτίου του 2011

Copyright: © 2011 Pedersen et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτή η μελέτη υποστηρίχθηκε από Mayo Clinic SPORE σε καρκίνο του παγκρέατος (Ρ50 CA102701) και το Τμήμα Εργαστηριακής Ιατρικής και Παθολογίας, Mayo Clinic. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

ο καρκίνος του παγκρέατος (PAC) είναι το 10

ου πιο κοινός τύπος του όγκου για τους άνδρες και τις γυναίκες σε ετήσια επίπτωση στις Ηνωμένες Πολιτείες και η τέταρτη κύρια αιτία θνησιμότητας από καρκίνο [1]. PAC συνδέεται με μια πολύ κακή πρόγνωση, καθώς παραμένει μια από τις πιο δύσκολες όγκων για τη θεραπεία. Ένα μεγάλο μέρος αυτού μπορεί να αποδοθεί στην καθυστέρηση στάδιο κατά το οποίο συνήθως ανιχνεύεται καρκίνος. Μεταξύ του 1999 και του 2006, μόνο το 8% των ασθενών που διαγνώστηκαν, συχνά τυχαίο εύρημα σε ακτινολογικές απεικόνισης, σε μία εντοπισμένη στάδιο όπου η άμεση χειρουργική εκτομή και την επακόλουθη θεραπεία θα μπορούσε να θεωρηθεί [2]. Επί του παρόντος, δεν υπάρχουν συνιστώμενα μέτρα ελέγχου [3]. Με λίγα σε καμία χαρακτηριστικά συμπτώματα και αναίσθητη μέθοδοι για την έγκαιρη ανίχνευση, θεραπευτική παρέμβαση είναι σπάνια.

Επιγενετική παίζει σημαντικό ρόλο στην ανάπτυξη της νόσου, διότι ενώνει πυρηνικό επαναπρογραμματισμό κατά την ανάπτυξη, το περιβάλλον που προκαλείται από τις αλλαγές στο σώμα, καθώς και την ικανότητα των κυττάρων να ανταποκρίνονται κατάλληλα σε εξωτερικά ερεθίσματα [4]. Επιγενετικές παραλλαγές είναι κληρονομικές αλλαγές στην έκφραση γονιδίων που εμφανίζονται στην απουσία μιας αλλαγής στην ίδια την ακολουθία του DNA. μεθυλίωση του DNA, τροποποίηση της ιστόνης και ρύθμιση microRNA μπορεί να αλλάξει προφίλ έκφρασης των γονιδίων ». Αυτές οι αλλαγές έκφρασης συχνά οδηγούν στα παρεκκλίνουσα πρότυπα ανάπτυξης των νεοπλασματικών κυττάρων [4].

Πολυάριθμες μελέτες δείχνουν ευρήματα που ένα προφίλ μεθυλίωση ΟΝΑ μεταβάλει ριζικά σε ανθρώπινους καρκίνους, όπου παγκόσμια απώλεια της μεθυλίωσης του DNA και υπερμεθυλίωση προαγωγού είναι τόσο αναφερθεί [5], [6]. Για PAC, προηγούμενες μελέτες έχουν εντοπίσει μια ομάδα γονιδίων που είναι έκτροπα μεθυλιωμένα και σιγήσει σε καρκινικούς ιστούς, συμπεριλαμβανομένου του

ppENK

,

SPARC

,

TFPI2

,

FOXE1

,

NPX2

,

TSLC1

,

p16

,

p14

,

p57

, και

CCND2

[7] – [12]. Αυτά τα γονίδια είναι σε μεγάλο βαθμό μεθυλιωμένα σε παγκρεατικά καρκινικούς ιστούς και σπάνια μεθυλιωμένα σε μη νεοπλαστικές ιστούς πάγκρεας [13]. Μια πρόσφατη μελέτη ανέφερε ότι η έκφραση των γονιδίων 58 ρυθμιζόταν με διαφορική μεθυλίωση. Επιπλέον, 10 δείκτες μεθυλίωση συσχετίστηκαν με αλλοιωμένη έκφραση γονιδίων κρίσιμων για

gemcitabine

ανταπόκρισης [14]. Ωστόσο, αυτές οι μελέτες έχουν διεξαχθεί χρησιμοποιώντας είτε

in vitro

συστήματα, όπως κυτταρικές γραμμές, ή

in vivo

με δείγματα παγκρεατικό χυμό και πρωτογενείς ιστούς όγκου, τα οποία είναι δύσκολο να αποκτηθούν για προσυμπτωματικό έλεγχο του καρκίνου λόγω της επεμβατικής φύσης των εν λόγω διαδικασίες δειγματοληψίας [13]. Λόγω των κινδύνων, του κόστους, και δυσκολία στην απόκτηση του παγκρέατος εκκρίσεις και ιστών για την έγκαιρη διάγνωση, μια ελάχιστα επεμβατική τεχνική, όπως το αίμα δειγματοληψίας είναι μια πιο εφικτή προσέγγιση για τον προσυμπτωματικό έλεγχο.

Διαφορικό μεθυλίωσης μεταξύ καρκινοπαθών και υγιών μαρτύρων έχει έχουν αναφερθεί σε DNAs περιφερικό αίμα, αν και λίγα είναι γνωστά για τον PAC [15] – [18]. Moore

et al.

[16] ανέφεραν μια ένωση DNA υπομεθυλίωσης λευκοκυττάρων με καρκίνο της ουροδόχου κύστης, ανεξάρτητα από το κάπνισμα και τις άλλες αξιολογήθηκαν παράγοντες κινδύνου. Widschwendter

et al.

[18] εξέτασε ειδικής θέσεως μεθυλίωση και βρήκαν ότι συγκεκριμένα μοτίβα μεθυλίωσης του DNA στο περιφερικό αίμα μπορούν να χρησιμεύσουν ως υποκατάστατοι δείκτες για καρκίνο του μαστού. Σε μια πρόσφατη μελέτη μικροκυτταρικού καρκίνου του πνεύμονα, μεθυλίωση προφίλ ανάλυση λευκοκυττάρων DNA προσδιορίζονται δύο θέσεις CpG που διακρίσεις από κοινού καρκινοπαθείς από ελέγχους μη καρκινικά [17]. Αυτά τα αποτελέσματα έδειξαν ότι η κατάσταση μεθυλίωσης σε δείγματα DNA των λευκοκυττάρων μπορεί να παρέχει ένα χρήσιμο βιοδείκτη για τους δυνητικούς έγκαιρη ανίχνευση και διαφορική διάγνωση. Για τον προσδιορισμό των δεικτών μεθυλίωσης για κλινικές εφαρμογές, εξετάσαμε τα προφίλ μεθυλίωσης σε μια μελέτη ασθενών-μαρτύρων δύο φάσεων, η οποία περιελάμβανε την ανακάλυψη υποψήφιος δείκτη και επικύρωσης, καθώς και η οικοδόμηση των μοντέλων πρόβλεψης.

Υλικά και Μέθοδοι

Ηθική Δήλωση

Όλα τα θέματα που προβλέπονται γραπτή συγκατάθεση? και η μελέτη εγκρίθηκε από το IRB Mayo Clinic.

πληθυσμός Μελέτη

περιπτώσεις δείκτη PAC ήταν ενήλικες ασθενείς με ιστολογικά επιβεβαιωμένο πρωτογενές αδενοκαρκίνωμα του παγκρέατος δει στη Mayo Clinic μεταξύ 1ης Οκτωβρίου, 2000 και 1 Ιουνίου 2006. Επιλέξιμες Mayo περιπτώσεις αδενοκαρκινώματος του παγκρέατος εντοπίστηκαν μέσω ενός υπερ-ταχύ σύστημα ταυτοποίησης του ασθενούς και να προσληφθούν σε μια προοπτική έρευνα του μητρώου. συντονιστές μελέτη προσδιόρισε δυνητικούς ασθενείς από το ηλεκτρονικό σύστημα προγραμματισμού των ασθενών και τις καθημερινές εκθέσεις παθολογίας. Όλα τα επιλέξιμα ασθενείς ζητήθηκε είτε στην κλινική κατά το χρόνο του διορισμού τους ή αργότερα μέσω ταχυδρομείου ή τηλεφώνου αν η επαφή κλινική δεν ήταν δυνατή. Αν έρθει σε επαφή με την κλινική, ο συντονιστής της μελέτης που λαμβάνονται εν επιγνώσει συναίνεση, κανόνισε μια φλεβοκέντησης για 40 mL αίματος πριν από την έναρξη της θεραπείας (όποτε είναι δυνατόν), και ζήτησε από τους συμμετέχοντες να συμπληρώσουν το ερωτηματολόγιο της μελέτης. Αν ήταν υποχρεωμένη επαφή αλληλογραφίας (περίπου το 28% των περιπτώσεων πλησίασε με e-mail), ο συντονιστής της μελέτης αποσταλεί μια επιστολή πρόσκλησης στη διεύθυνση κατοικίας του ασθενούς. Μια συνέχεια τηλεφώνημα έγινε εάν το δείγμα ή τα έντυπα δεν ελήφθησαν μετά από 1 μήνα. Περίπου το 74% του συνόλου των επιλέξιμων ασθενείς είχαν εγγραφεί στο μητρώο. Από το μητρώο, επιλέξαμε 132 ασθενείς ποτέ καπνιστής στη φάση Ι και 240 ασθενείς στη φάση ΙΙ με ίση εκπροσώπηση των φύλων, το κάπνισμα (καπνιστής /καπνίστρια) και το στάδιο της PAC (χειρουργήσιμη, τοπικά προχωρημένο και μεταστατικό).

Οι υγιείς Καυκάσου έλεγχοι επιλέχθηκαν από μια έρευνα μητρώο των ασθενών της ομάδας ελέγχου πρωτοβάθμιας περίθαλψης έχει επισκέψεις ρουτίνας check-up (γενική ιατρική εξέταση) μεταξύ 1 Μαΐου 2004 και της 31ης Αυγούστου Mayo Clinic-based, 2006. Οι έλεγχοι συχνότητας ταιριάζουν με τις περιπτώσεις με την ηλικία (± 5 έτη), το φύλο, και την κατάσταση /περιοχή διανομής διαμονής των περιπτώσεων. Έλεγχοι δεν είχαν προηγούμενη διάγνωση του καρκίνου (καρκίνος του δέρματος εκτός μη μελάνωμα) κατά το χρόνο της εγγραφής. Πριν από το διορισμό τους, οι πιθανοί έλεγχοι αποσταλεί ένα ενημερωτικό φυλλάδιο που περιγράφει τη μελέτη και μια επιστολή της πρόσκλησης. Την ημέρα του ραντεβού, βοηθός μελέτη προσέγγισε το θέμα, επιβεβαιώνονται τα κριτήρια επιλεξιμότητας, και έλαβε ενημερωμένη συγκατάθεση. Κάθε συμμετέχων ερωτηματολόγια μελέτη ολοκληρωθεί (η οποία περιελάμβανε ένα αυτο-έκθεση του ύψος, το βάρος, και την κατάσταση του διαβήτη) και υπό την προϋπόθεση 30 mL δείγματος έρευνα αίματος. Περίπου το 70% όλων των προσέγγισε ελέγχων συμμετείχαν σε αυτή τη μελέτη. Από αυτό το μητρώο θα επιλεγεί 60 ποτέ έλεγχοι καπνιστής για τη φάση Ι και 240 έλεγχοι (τα μισά δεν είναι ποτέ καπνιστές) για τη φάση ΙΙ.

τροποποίηση του DNA με όξινο θειώδες νάτριο

Εμείς εξάγεται DNA από 5 ml πλήρους αίμα χρησιμοποιώντας ένα AutoGen FLEXSTAR (AutoGen, Inc., ΜΑ) και τροποποίησε τα γενωμικού DNA δειγμάτων χρησιμοποιώντας το κιτ ΕΖ μεθυλίωσης του DNA από Zymo Research Corporation (Orange, CA) που συνδύαζε διθειώδους μετατροπή και τον καθαρισμό του DNA. Το κιτ βασίζεται στην αντίδραση τριών σταδίων που πραγματοποιείται μεταξύ κυτοσίνης και όξινο θειώδες νάτριο, όπου η κυτοσίνη μετατρέπεται σε ουρακίλη. Χρησιμοποιήσαμε 1 μα γονιδιωματικού DNA από το DNA του περιφερικού αίματος για την τροποποίηση ανά τις συστάσεις του κατασκευαστή. Τα επεξεργασμένα δείγματα DNA φυλάχθηκαν στους -20 ° C και αναλύθηκαν μέσα σε δύο εβδομάδες.

μεθυλίωσης του DNA profiling ανάλυση

Η Illumina (San Diego, CA) GoldenGate μεθυλίωση Beadchip (πάνελ του καρκίνου) και Illumina έθιμο δοκιμασία μεθυλίωσης VeraCode χρησιμοποιήθηκαν για τη φάση Ι και φάσης ΙΙ, αντίστοιχα, σύμφωνα με τη διαδικασία του κατασκευαστή. Εμείς απεικονίζεται τις συστοιχίες χρησιμοποιώντας ένα σαρωτή BeadArray Reader (Illumina, Inc.). Το ποσοστό μεθυλιωμένο (β-value) σε κάθε θέση CpG υπολογίστηκε χρησιμοποιώντας BeadStudio Λογισμικού (Illumina, Inc.) μετά την αφαίρεση της έντασης φόντο, το οποίο υπολογίζεται από τους αρνητικούς μάρτυρες, από κάθε αναλυτική σημείο δεδομένων. Η τιμή β αντιπροσωπεύεται σχετική αναλογία σημάτων φθορισμού μεταξύ του Μ (μεθυλιωμένη) αλληλόμορφο και το Μ + U (μη μεθυλιωμένα) αλληλόμορφα. Αυτή η τιμή κυμαίνεται συνεχώς από 0 (μη μεθυλιωμένα) έως 1 (πλήρως μετουσιωμένο).

Διαφορική μεθυλίωση ανάλυση

Λόγω της μη-Gaussian κατανομή των τιμών μεθυλίωσης CpG, χρησιμοποιήσαμε δοκιμές Wilcoxon Rank Sum να εξετάζει τις διαφορές της διάμεση β-τιμές μεταξύ των περιπτώσεων και ελέγχων τόσο φάσης Ι και φάσης ΙΙ. Για να διορθωθεί για πολλαπλές δοκιμές φάσης Ι, χρησιμοποιήσαμε τιμές Q για να αντιπροσωπεύουν το ποσοστό εσφαλμένης ανακάλυψη (FDR) [19]. Οι CpGs με FDR q-αξίας ≤0.05 επίπεδο θεωρήθηκαν σημαντικές. Αυτά τα CpGs ήταν τότε οι υποψήφιοι για την επικύρωση της φάσης ΙΙ, όπου ένα ≤0.05 τιμή p θεωρήθηκε σημαντική. οικόπεδα Bland-Altman και ο συντελεστής συσχέτισης Spearman χρησιμοποιήθηκαν για την αξιολόγηση συμφωνία μεταξύ των δύο δοκιμασίες μεθυλίωσης στα 40 θέματα που αναλύθηκαν τόσο φάσης Ι και φάσης ΙΙ. Τα οικόπεδα Bland-Altman επιτρέπουν την αξιολόγηση της διαφωνίας δοκιμασία ως συνάρτηση του επιπέδου της μεθυλίωσης [20].

methQTL ανάλυση

Χρησιμοποιώντας plink (https://pngu.mgh.harvard.edu/~ Purcell /plink /) για αυτή τη μελέτη, πραγματοποιήσαμε μια ποσοτική ανάλυση σύνδεσης γνώρισμα με κατεργασία κάθε β-αξία CpG ως τον φαινότυπο (ποσοτική γνώρισμα), και τους γονότυπους SNP που προέρχονται από προηγούμενη μελέτη σύνδεσης γονιδιώματος σε επίπεδο (GWAS) όπως ο προγνωστικός [21]. Το FDR ήταν υπολογίζονται με βάση τις τιμές p από τη δοκιμή ποσοτική συσχέτιση γνώρισμα Wald. CpG-SNP ζεύγη με FDR ≤0.05 θεωρήθηκαν σημαντική (δηλαδή αποδείξεις SNP – ένωση μεθυλίωσης CpG). Επειδή η ηλικία, το φύλο, το κάπνισμα και τη φάση της μελέτης μπορεί να επηρεάσει τα επίπεδα μεθυλίωσης, η ανάλυση methQTL προσαρμοσμένο για αυτές τις μεταβλητές. Τα αποτελέσματα από την ανάλυση αυτή χρησιμοποιήθηκαν για να αξιολογηθεί η γενετική επίδραση στην CpG μεθυλίωση.

Πρόβλεψη μοντέλου οικοδόμησης

Για την ανάπτυξη μοντέλων πρόβλεψης, χρησιμοποιήσαμε πιθανότητα διασταυρούμενης επικυρωμένα τιμωρούνται μοντέλα λογιστικής παλινδρόμησης που υλοποιείται είτε L1 ποινής (Λάσο) [22] ή ποινής L2 (Ridge) χρησιμοποιώντας το πακέτο R ‘τιμωρούνται’ [23]. Ένα Lasso μοντέλο (ή ποινή L1) χρησιμοποιήθηκε στη φάση Ι δοκιμή της μελέτης λόγω επιθυμητό χαρακτηριστικό για επιλογή μοντέλου, το οποίο έχει ελάχιστη επίδραση επί των αντίστοιχων συντελεστών CpG ενώ καθορισμό των συντελεστών των unassociated CpGs »στο μηδέν. Ένα μοντέλο παλινδρόμησης Ridge (ή ποινή L2) που συρρικνώνεται όλοι οι συντελεστές σε μικρές τιμές, αλλά όχι μηδενικά θεωρήθηκε επίσης για το μοντέλο του κτιρίου. Η διαδικασία επιλογής μεταβλητών διέπεται από μια παράμετρο που αναγκάζει όλοι οι συντελεστές που πρέπει να συρρικνωθεί κοντά στο μηδέν αρχικά, στη συνέχεια, απελευθερώνεται σταδιακά να μειώσει το ποσό της συρρίκνωσης. Η βέλτιστη τιμή της παραμέτρου αυτής καθορίζεται με σταυρό επικύρωσης. Τα αποτελέσματα του μοντέλου Ridge επίσης σε σύγκριση με τα αποτελέσματα από το Lasso μοντέλο για να ακονίσετε το τελικό μοντέλο.

Το τελικό μοντέλο που εντοπίζονται μέσω των τιμωρηθεί προσεγγίσεις ήταν τότε ταιριάζει σαν ένα γενικευμένο γραμμικό μοντέλο (λογιστικής παλινδρόμησης) χρησιμοποιώντας το πακέτο R ‘ GLM », προκειμένου να εκτιμηθεί το εμβαδόν κάτω από (AUC) της χαρακτηριστικής (ROC) καμπύλη για κάθε μοντέλο. Τα μοντέλα είναι εξοπλισμένα τόσο στο σύνολο δοκιμών (φάση Ι) και το σύνολο επικύρωσης (φάση II) ξεχωριστά με AUC που αναφέρθηκαν για κάθε μοντέλο. Βασισμένο σε κάθε εντοιχισμένη μοντέλο, η πιθανότητα κάθε επιμέρους περίπτωση να είναι ένα (έλεγχος) υπολογίστηκε. Αν η πιθανότητα να είναι μια περίπτωση ήταν μεγαλύτερη από 0,50 το άτομο θα έχουν ταξινομηθεί ως περίπτωση. Η ευαισθησία ορίζεται ως το ποσοστό των περιπτώσεων ορθά ως περιπτώσεις χρησιμοποιώντας το μοντέλο. Η ιδιαιτερότητα είναι το ποσοστό των ελέγχων σωστά χαρακτηριστεί ως μάρτυρες χρησιμοποιώντας το μοντέλο.

Εκτός από τη μη διορθωμένη μοντέλο (μόνο τα CpGs), δύο ακόμα μοντέλα είναι εξοπλισμένα, αυτό που θεωρείται η ηλικία, το φύλο και την πρώτη οικογένεια βαθμού ιστορία ως συμπαράγοντες και ένα άλλο που θεωρείται, επίσης, τύπου αίματος ΑΒΟ ( «Ο» vs «μη-O») ως πρόσθετη συμμεταβλητή. ΑΒΟ τύπους αίματος προήλθαν για ένα υποσύνολο των ασθενών που είχαν GWAS πληροφορίες γονότυπο [21] διαθέσιμες. Τα μοντέλα της φάσης ΙΙ είχαν χωρέσει δύο τρόπους. Κατ ‘αρχάς, οι συντελεστές από τη φάση Ι διεξήχθησαν σταθερή και αξιολογούνται διακρίσεις. Δεύτερον, δεδομένου ότι η πλατφόρμα δοκιμασίας άλλαξε από τη φάση Ι της φάσης ΙΙ, τα μοντέλα ταιριάζουν επιτρέπουν οι συντελεστές που πρέπει να επανεκτιμάται.

Αποτελέσματα

Αναγνώριση των διαφορικά μεθυλιωμένων CpG θέσεων στη φάση I

Για φάσης Ι που εξετάστηκαν 132 ασθενείς ποτέ καπνιστής με PAC και 60 ποτέ καπνιστής υγιείς μάρτυρες. Λόγω χημειοθεραπεία ή ακτινοθεραπεία πριν από την αιμοληψία, 13 ασθενείς αποκλείστηκαν από την ανάλυση αυτή. Αξιολογήσαμε την κατάσταση μεθυλίωσης (τιμές β) του 1505 CpG τοποθεσίες από DNAs λευκοκυττάρων στις υπόλοιπες 119 περιπτώσεις και 60 ελέγχους (Πίνακας 1). Επειδή υπάρχουν σημαντικές διαφορές μεθυλίωσης στο χρωμόσωμα Χ μεταξύ ανδρών και γυναικών, αναλύσαμε CpG θέσεις για autosomes και το χρωμόσωμα φύλου ξεχωριστά. Οι αναλύσεις αυτές εντοπίστηκαν σημαντικές διαφορές μεταξύ των ασθενών PAC και τους ελέγχους σε 110 περιοχές CpG σε 92 ανεξάρτητα γονίδια (FDR ≤0.05). 109 από τα 110 σημαντικές περιοχές CpG βρίσκονταν σε αυτοσωμικά. Ο Πίνακας 2 παραθέτει τις 10 πιο σημαντικές περιοχές CpG στην μελέτη φάσης Ι.

Η

Για την αξιολόγηση για πιθανές διαφορές μεταξύ των φύλων, συγκρίναμε τις CpG τοποθεσίες 1421 αυτοσωματικό μεταξύ ανδρών και γυναικών. Παρατηρήσαμε σημαντικές διαφορές σε 71 περιοχές CpG όταν συνδυάζοντας τις περιπτώσεις και τους ελέγχους. Όταν αναλύθηκαν αυτά τα sites CpG σε περιπτώσεις και τους ελέγχους ξεχωριστά, παρατηρήσαμε διαφορές σε 44 CpG θέσεις για τους ασθενείς PAC και 6 CpG θέσεις για τους ελέγχους (Πίνακας S1). Να αξιολογήσει τις πιθανές αλλαγές μεθυλίωσης κατά τη διάρκεια της εξέλιξης του όγκου, εξετάσαμε τις διαφορές μεθυλίωσης μεταξύ των τριών σταδίων της PAC σε αυτό τον πληθυσμό ασθενών, συμπεριλαμβανομένων 31 χειρουργήσιμη, 45 τοπικά προχωρημένο και μεταστατικό 43 περιπτώσεις. Παρά το γεγονός ότι εννέα περιοχές CpG έδειξε μια τάση σε σχέση με το κλινικό στάδιο (p & lt? 0,01) (Πίνακας 3), η ανάλυση των δεδομένων δεν έδειξε σημαντική διαφορά μεταξύ των τριών σταδίων (όλες οι θέσεις CpG με FDR & gt? 0,05).

επικύρωση των επιλεγμένων χώρων CpG στη φάση ΙΙ

Για να επικυρώσετε τα διαφορικά μεθυλιωμένο CpG θέσεις εντοπίστηκαν στη φάση Ι μέσα σε ένα μεγαλύτερο αριθμό ασθενών και ένα ευρύτερο φάσμα των δημογραφικών χαρακτηριστικών, σχεδιάσαμε μια προσαρμοσμένη δοκιμασία μεθυλίωσης VeraCode (Illumina, Inc.) και εξετάστηκαν 96 από τις 110 σημαντικές περιοχές CpG σε 240 περιπτώσεις Pac και 240 μάρτυρες. Οι 96 θέσεις CpG επιλέχθηκαν σύμφωνα με διάμεση τιμή των διαφορών μεταξύ των περιπτώσεων β και των ελέγχων. Για CpG θέσεις με παρόμοια μέση διαφορές β, επιλέχθηκαν οι θέσεις CpG με μικρότερες FDR. Μεταξύ των 480 ατόμων, 40 φάσης θέματα I (20 περιπτώσεις και 20 έλεγχοι) περιλήφθηκαν προκειμένου να συγκριθεί ο βαθμός συμφωνίας μεταξύ των δύο δοκιμασίες μεθυλίωσης. Bland Altman οικόπεδα [20] παρουσίασαν μικρή μέση μετατόπιση και η συνεχής διακύμανση των διαφορών σε όλο το εύρος των τιμών (Σχήμα 1), αποδεικνύοντας λογική συμφωνία μεταξύ των δύο δοκιμασιών. Οι δύο δοκιμασίες σχετίζονταν σημαντικά όπως αναμενόταν μεταξύ όλων των 96 CpG θέσεις. Το μεσαίο Spearman συντελεστής συσχέτισης r ήταν 0,94 (εύρος 0,84 – 0,96).

Εκπρόσωπος Bland-Altman γράφημα σε ένα θέμα δείχνει καλή συμφωνία μεταξύ των δεδομένων φάσης Ι και φάσης ΙΙ, στις περισσότερες των 96 CpG θέσεις. Κάθε τελεία αντιπροσωπεύει μία ιστοσελίδα CpG. Η μέση στάθμη μεθυλίωσης για κάθε τοποθεσία CpG (από 0 έως 100%) παρουσιάζεται στον άξονα χ. Μεθυλίωση διαφορά επιπέδου για κάθε τοποθεσία CpG μεταξύ φάσης Ι και φάσης ΙΙ παρουσιάζεται στον άξονα y. Οι διακεκομμένες γραμμές δείχνουν το 95% διάστημα εμπιστοσύνης για τη διαφορά μεταξύ των δύο δοκιμασιών και η συνεχής γραμμή δείχνει τις μέσες διαφορές μεταξύ των δύο δοκιμασιών.

Η

Ανάμεσα στους 220 ασθενείς PAC που ήταν μοναδική για τη φάση ΙΙ, 47 ασθενείς που είχαν υποβληθεί σε θεραπεία πριν από την αιμοληψία. Συγκρίναμε τα επίπεδα μεθυλίωσης μεταξύ αυτών των περιπτώσεων αντιμετωπίζονται 47 και 173 περιπτώσεις ποτέ αγωγή για να αξιολογηθεί η επίδραση της θεραπείας για την κατάσταση μεθυλίωσης αυτών επιλεγμένες θέσεις CpG. Δύο CpG θέσεις (TAL1_P817_F και CSF3_E242_R) έδειξε ονομαστική διαφορές (ρ = 0,001 και 0,025, αντίστοιχα), αν και αυτά τα αποτελέσματα θα μπορούσε να οφείλεται στην τύχη, δεδομένου του μεγάλου αριθμού των συγκρίσεων. Σε γενικές γραμμές, δεν παρατηρήσαμε σημαντική επίδραση της θεραπείας στην μεθυλίωση αυτών των επιλεγμένων χώρων CpG. Ομοίως, καμία επίδραση οφειλόταν σε ιστορικό καπνίσματος (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Από τις υπόλοιπες 220 μάρτυρες, πέντε επιπλέον ελέγχους αποκλείστηκαν λόγω ανεπαρκούς ποιότητας, αφήνοντας 215 ελέγχους οι οποίοι ήταν μοναδική για φάση II (Πίνακας 1). Συνολικά 173 περιπτώσεις δεν έλαβαν και 215 μάρτυρες αναλύθηκαν στη φάση ΙΙ. Η Wilcoxon Rank Sum Test εντοπίσει μια σημαντική διαφορά (p ≤ 0,05) σε 88 από τα 96 επιλεγμένα CpGs. Σημαντικά, όλα 88 από αυτές τις επικυρωμένες CpG θέσεων στη φάση ΙΙ έδειξε επίσης την ίδια κατεύθυνση της αλλαγής μεθυλίωσης ως φάση Ι (Σχήμα 2). Από αυτούς, 23 και 65 CpG θέσεις αποδειχθεί υπερμεθυλίωση και υπομεθυλίωση σε ασθενείς PAC, αντίστοιχα. Ο Πίνακας 2 παραθέτει τις 10 πιο σημαντικές περιοχές CpG στη μελέτη φάσης ΙΙ (Πίνακας S2 περιέχει στατιστικά στοιχεία των 96 sites CpG και στις δύο φάσεις Ι και ΙΙ).

οικόπεδο διασποράς δείχνει να αναπαραχθούν διαφορές μεθυλίωσης μεταξύ φάσης Ι και φάσης ΙΙ . Wilcoxon Rank Sum z-τιμές σχεδιάζεται στον άξονα χ (φάση Ι) και το Υ-άξονας (φάση II). 88 από τις 96 περιοχές CpG επικυρώθηκαν από p αξίας (& lt? 0,05) και την κατεύθυνση (υπερ /υπο-μεθυλίωση). Παρά το γεγονός ότι 8 CpG θέσεις δεν ήταν στατιστικά σημαντικές, οι τάσεις και στις δύο φάσεις είναι όλοι το ίδιο.

Η

Η γενετική επίδραση στην μεθυλίωση του DNA

Για να εξεταστεί αν υπήρξε κάποια γενετική επίδραση στην CpG μεθυλίωση , εμείς υποχώρησε το επίπεδο μεθυλίωσης (τιμή β) για κάθε ένα από 96 φάσης ΙΙ CpG θέσεις που αντιστοιχούν στις SNP γονοτύπων μέσα σε 1 ΜΒ της θέσης στόχου CpG. Υπήρχαν 16.217 γονότυπος SNPs που περιβάλλει τις 96 CpG θέσεις με μια μικρή ≥0.1 συχνότητα αλληλόμορφο. 135 έλεγχοι και 194 ασθενείς είχαν δεδομένων γονότυπο SNP. Χρησιμοποιώντας ένα μοντέλο πρόσθετης ύλης και την προσαρμογή για την ηλικία και το φύλο, εντοπίσαμε 33 CpG-SNP ζεύγη (methQTLs) σε ελέγχους και 99 methQTLs σε περιπτώσεις PAC με FDR ≤0.05 (Σχήμα 3 και Πίνακας S3). Από αυτούς, 24 methQTLs μοιράστηκαν μεταξύ των δύο περιπτώσεων και ελέγχων. Αυτές οι κοινές methQTLs εμπλέκονται τρεις ανεξάρτητες θέσεις CpG. Οι methQTLs με τις ισχυρότερες ενώσεις για τις τρεις θέσεις CpG ήταν ALOX12_E85_R και rs434473 (FDR = 1,66 × 10

-25 σε ελέγχους και 3,01 × 10

-14 σε ασθενείς), AGXT_P180_F και rs4675872 (FDR = 1.83 × 10

-9 σε ελέγχους και 3,73 × 10

-15 σε ασθενείς), και JAK3_P1075_R και rs7245564 (FDR = 1.89 × 10

-4 σε ελέγχους και 3,48 × 10

-4 σε ασθενείς), αντίστοιχα (Πίνακας 4). Οι αποστάσεις μεταξύ των SNPs και CpGs στόχος ήταν λιγότερο από 15.5 Kb για όλες τρία ζευγάρια που αναφέρθηκαν εδώ. Πραγματοποιήσαμε επίσης την ανάλυση methQTL ρύθμισης για τις φάσεις της μελέτης ή /και το ιστορικό καπνίσματος εκτός από την ηλικία και το φύλο. Αυτά τα αποτελέσματα ήταν σύμφωνα με αυτά κατά την προσαρμογή για την ηλικία και το φύλο και μόνο (Πίνακας S3).

επίπεδα μεθυλίωσης για κάθε μια από 96 περιοχές CpG είχαν εξασθενήσει σε αριθμό αντιγράφων ήσσονος αλληλόμορφα σε κοντινή απόσταση (+/- 1 Mb) SNPs . Οι θέσεις CpG τοποθετήθηκαν επί του x-άξονα με βάση τη σειρά τους χρωμοσωμική θέση. Υ-άξονας ήταν -λογ10 της σ αξίας methQTL μετά την προσαρμογή για την ηλικία και το φύλο. Μέγεθος κάθε κουκίδας ήταν ανάλογη με τη σημασία της κάθε τιμή p. A. έλεγχο μόνο methQTLs και Β υπόθεση μόνο methQTLs.

Η

Οικοδομικά και επικύρωση του μοντέλου πρόβλεψης

Για την κατασκευή μοντέλων πρόβλεψης με βάση φάσης Ι δεδομένα, αποκλείονται πρώτα 43 από τα 96 CpG θέσεων που έδειξε λιγότερο από 5% διάμεσος διαφορές μεταξύ των περιπτώσεων β και των ελέγχων ή p-value ≥0.001 (FDR & gt? 0.007) σε φάση Ι τέθηκαν Αυτά τα κριτήρια φίλτρου για τα ακόλουθα τεχνικά ζητήματα. Πρώτον, CpG θέσεις με μικρότερες διαφορές μεθυλίωσης είναι επιρρεπείς σε εργαστήριο σφάλμα λόγω τεχνικών περιορισμών. Δεύτερον, CpG θέσεις με λιγότερο σημαντικές ρ-τιμές είναι λιγότερο πιθανό να αναπαραχθούν σε μια μελλοντική μελέτη. Βασισμένο σε 53 υπόλοιπες θέσεις CpG, χτίσαμε πρώτα μοντέλα που χρησιμοποιούν L1 και L2 κυρώσεις, όπως περιγράφεται στις μεθόδους που χρησιμοποιούν τη φάση των δεδομένων μου. Το καλύτερο μοντέλο επιλέχθηκε με βάση τα κριτήρια της ROC AUC και φειδώ. Το μοντέλο αυτό στη συνέχεια δοκιμάστηκε χρησιμοποιώντας τη φάση II δεδομένα χωρίς τα 40 θέματα που αναλύθηκαν και στις δύο φάσεις για τη μελέτη συμφωνίας. Κατά την εξέταση όλων των περιπτώσεων και όλους τους ελέγχους, εντοπίσαμε μια ομάδα πέντε θέσεις CpG (υπόδειγμα Ι: IL10_P348, LCN2_P86, ZAP70_P220, AIM2_P624, TAL1_P817), που ήταν οι πρώτοι πέντε CpGs να εισέλθουν και να παραμείνουν στην Λάσο μοντέλο και, επίσης, οι πέντε μεγαλύτερες συντελεστές από το μοντέλο Ridge. Αυτό πέντε CpG-μόνο μοντέλο έδειξε καλή διάκριση μεταξύ ασθενών και μαρτύρων (c-στατιστική = 0.85 στη φάση Ι και 0,76 στη φάση ΙΙ) με βάση το μοντέλο λογιστικής παλινδρόμησης. Όταν η ειδικότητα ορίστηκε στο 0,90, η μέγιστη ευαισθησία ήταν 0,65 στην φάση Ι και 0,51 στη φάση ΙΙ. Όταν η ειδικότητα ορίστηκε στο 0,70, η μέγιστη ευαισθησία ήταν 0,83 στην φάση Ι και 0,72 στη φάση II (βλέπε Πίνακα S4 για ολόκληρο το φάσμα της ειδικότητας και ευαισθησίας). Όταν συμπεριλαμβανομένου συμμεταβλητές στο μοντέλο λογιστικής παλινδρόμησης (ηλικία, φύλο, 1

ου βαθμού οικογενειακό ιστορικό PAC, ΑΒΟ τον τύπο του αίματος), η διάκριση βελτιώθηκε στη φάση Ι (c-στατιστική = 0,89), αλλά μειώθηκε στη φάση ΙΙ (c-στατιστική = 0,72). Όταν εκ νέου υπολογισμό των συντελεστών αυτών των συμμεταβλητών στη φάση ΙΙ (εκ νέου τοποθέτηση), η διάκριση βελτιώθηκε, όπως αναμενόταν, αλλά όχι δραματικά (c-στατιστική = 0,77 για πέντε CpGs μόνο, 0,77 μετά την καταχώριση της συμπαράγοντες) (Πίνακας 5). Όταν συμπεριλαμβανομένων χειρουργήσιμη ασθενείς μόνο και όλους τους ελέγχους, εντοπίσαμε μια ιστοσελίδα CpG (Model II: LCN2_P86) που φάνηκε να κάνουν διακρίσεις για χειρουργήσιμη νόσο (c-στατιστική = 0.78 στη φάση Ι και 0,74 στη φάση ΙΙ)

Η

Συζήτηση

σε αυτή τη μελέτη δύο φάσεων (δοκιμή επικύρωσης), εξετάσαμε DNA περιφερικού αίματος για να προσδιοριστεί εάν οι διαφορές στη μεθυλίωση σε διάφορες θέσεις CpG μπορούσε να διακρίνει μεταξύ ατόμων με και χωρίς PAC. Εμείς περιορίζεται η μελέτη μας σε εκείνους τους ασθενείς οι οποίοι δεν είχαν ποτέ υποβληθεί σε θεραπεία για καρκίνο (τόσο φάσης Ι και ΙΙ), και στη φάση Ι εκείνους που δεν είχαν καπνίσει ποτέ. Δείξαμε πολύ σημαντική υπόταση ή υπερμεθυλίωση τόπους σε λευκοκυττάρων DNA των ασθενών με PAC. Αυτό ίσχυε και στις δύο φάσεις της μελέτης και φαίνεται να παραμένουν σημαντικές με προσαρμογή για το κάπνισμα και τη θεραπεία του καρκίνου. Είναι σημαντικό, βρήκαμε ότι οι διαφορές μεθυλίωσης δεν ήταν σημαντικές στα διάφορα στάδια της νόσου, αλλά σημαντικά μεταξύ χειρουργήσιμη ασθενών και μαρτύρων, γεγονός που υποδηλώνει ότι τα διαφορικά μετουσιωμένο υπογραφές CpG μπορεί να είναι χρήσιμη για την έγκαιρη διάγνωση.

Αξίζει να τονιστεί ότι τουλάχιστον τέσσερις (

LCN2

,

IL10

,

PECAM1

και

ΜΜΡ14

) από τα δέκα πιο σημαντικά μεθυλιώνονται γονίδια σε αυτή τη μελέτη έχουν προηγουμένως έχουν αναφερθεί ότι έχουν διαγνωστική ή /και προγνωστική αξία για PAC. Για παράδειγμα, μελέτες έχουν δείξει ότι στον ορό

Οι IL-10

επίπεδα είναι σημαντικά αυξημένα σε ασθενείς Pac [24], [25]. Οι ασθενείς οι οποίοι είχαν υψηλότερα επίπεδα της

IL-10

έδειξε σημαντικά χειρότερη επιβίωση συγκριτικά με τους ασθενείς που εμφάνισαν χαμηλότερες

IL-10

επίπεδα. Το αυξημένο επίπεδο

IL-10

στον ορό των ασθενών PAC είναι συνεπής με τις τρέχουσες μας εύρημα ότι λευκοκυττάρων DNA είχαν χαμηλότερα υποκινητή CpG μεθυλίωση του γονιδίου σε ασθενείς PAC έναντι των μαρτύρων (ρ = 2,50 × 10

-9 για τη φάση Ι και p & lt? 1 × 10

-10 για τη φάση ΙΙ). Είναι ενδιαφέρον, ένα άλλο γονίδιο,

LCN2

, προτείνεται ως πρώιμο δείκτη διάγνωσης για το Pac [26] – [28]. Μια μελέτη της έκφρασης που βασίζεται έδειξε ότι τα επίπεδα των πέντε πρωτεΐνες, συμπεριλαμβανομένων των

LCN2

, διακρίσεις μεταξύ των ασθενών PAC και μάρτυρες έως και 13 μήνες πριν από τη διάγνωση του καρκίνου [26]. Σε αυτή τη μελέτη με τη χρήση των λευκοκυττάρων του DNA, διαπιστώσαμε ότι δύο περιοχές CpG (LCN2_P86_R και LCN_P141_R) εντός του

LCN2

περιοχή του υποκινητή έδειξαν σημαντικά χαμηλότερα επίπεδα μεθυλίωσης σε ασθενείς PAC από ό, τι στην ομάδα ελέγχου (p = 2,00 × 10

– 10 και 1,16 × 10

-7 στη φάση Ι, σ & lt? 1 × 10

-10 και & lt? 1 × 10

-10 στη φάση ΙΙ, αντίστοιχα). Με βάση μια πρόσφατη μελέτη διδύμων, φαίνεται ότι η υπομεθυλίωση σχετίζεται με αυξημένο

LCN2

έκφραση σε λευκοκύτταρα [29]. Επιπλέον, το μοντέλο αλγόριθμο μας κατετάγη IL10_P348 και LCN2_P86 όπως τα δύο κορυφαία μνημεία CpG επιλεγεί στο υπόδειγμα Ι και LCN2_P86 ως το μόνο site CpG επιλεγεί Μοντέλο II. Αυτά τα αποτελέσματα, ως εκ τούτου, υποστηρίζουν σθεναρά ότι η κατάσταση μεθυλίωσης του DNA σε λευκοκύτταρα μπορεί να χρησιμεύσει ως βιοδείκτες για να βοηθήσει στην διάγνωση Pac.

Αν και εξαρτώνται από την αλληλουχία αλληλόμορφο-ειδική μεθυλίωση είναι ένα μοναδικό χαρακτηριστικό της αποτυπωμένα γονίδια στο ανθρώπινο γονιδίωμα, το DNA τροποποίηση έχει επίσης παρατηρηθεί σε μη έντυπη τόπους. Αρκετές πρόσφατες μελέτες έχουν δείξει ότι οι γενετικές παραλλαγές μπορεί να έχουν σημαντική επίδραση στη μεθυλίωση του DNA σε διάφορες θέσεις [30] – [33]. Χρησιμοποιώντας δοκιμασίες array-based, δύο μελέτες έχουν εντοπίσει πολλαπλές αλληλεπιδράσεις γονότυπου-epigenotype δείχνοντας σημαντική συσχέτιση μεταξύ των επιπέδων μεθυλίωσης CpG και SNP γονότυπους [30], [33]. Boks et al. αναλύονται λευκοκυττάρων μεθυλίωση του DNA σε δίδυμα και υγιείς μάρτυρες, και προσδιόρισε μια σημαντική γενετική επίδραση στην μεθυλίωσης των πολλαπλών CpG θέσεων [30]. Gibbs et al. ρωτήθηκαν 27.578 CpG θέσεις για σύνδεση με 1.630.000 SNPs σε τέσσερις τύπους ιστών του εγκεφάλου [33]. Για κάθε τύπο ιστού, 4-5% αυτών των CpGs έδειξε σημαντική συσχέτιση με τουλάχιστον έναν SNP μετά από διόρθωση για γονιδιώματος σε επίπεδο πολλαπλών δοκιμών. Συνολικά, 3.619 μοναδικές θέσεις CpG έχουν αναφερθεί να είναι methQTLs. Από αυτούς, 887 ήταν cis-methQTL. Παραδόξως, η μέγιστη εμπλουτισμού για την methQTL ήταν μόνο 45 bp στην περιοχή CpG εν λόγω [33]. Σε αυτή τη μελέτη, βρήκαμε ότι τουλάχιστον τρεις (3,13%) των 96 επιλεγμένων χώρων CpG επηρεάστηκαν σημαντικά από SNPs cis-δράσης. Βρήκαμε επίσης ότι methQTL SNPs ήταν γενικά κοντά στον τόπο CpG-στόχο (& lt? 15.5 Kb). Αυτά τα αποτελέσματα καταδεικνύουν ότι τα επίπεδα CpG μεθυλίωσης σε ορισμένες μη εκτυπώσεως τόποι επίσης εξαιρετικά ρυθμίζονται από κοντινά γενετικές παραλλαγές. Η κατάσταση μεθυλίωσης στο DNA περιφερικού αίματος μπορεί επίσης να χρησιμεύσει ως βιοδείκτες για την εκτίμηση του κινδύνου της PAC.

Αν και τα αποτελέσματα αυτής της μελέτης είναι ελπιδοφόρα, χρειάζεται περισσότερη δουλειά για να προσδιορίσει τα αίτια αυτών των διαφορών μεθυλίωσης και αν διαφορική μεθυλίωση θα μπορούσε να αξιολογηθούν περαιτέρω ως διαλογής ή διαγνωστικό εργαλείο σε ένα μη επιλεγμένο πληθυσμό. Σε αυτό το σημείο, είναι άγνωστο τι προκαλεί τις διαφορές μεθυλίωσης μεταξύ αυτών των ασθενών και ελέγχων. Εκτός από την πιθανή γενετική επίδραση, όπως περιγράφεται παραπάνω, η ανοσολογική απόκριση των λεμφοκυττάρων στα καρκινικά κύτταρα είναι μια άλλη πιθανή εξήγηση. Είναι επίσης άγνωστο αν συνοσηρότητας μπορεί να επηρεάσουν την ευαισθησία αυτής της εξέτασης και αν προκαρκινικών βλαβών ή καλοήθη νόσο, όπως παγκρεατίτιδα, θα εμφανίζουν παρόμοια πρότυπα μεθυλίωσης σε αυτές τις θέσεις CpG. Παρ ‘όλα αυτά, τα αποτελέσματα αυτά μπορεί να έχει μελλοντικά κλινική σημασία. Κατ ‘αρχάς, οι εξαιρετικά επαναλήψιμα αποτελέσματα της μελέτης δείχνουν ότι υπάρχουν διαφορές μεθυλίωσης μεταξύ των περιπτώσεων και ελέγχων PAC, οι οποίες παρέχουν υποστήριξη στο σκεπτικό του σχεδιασμού δοκιμασία μεθυλίωσης που βασίζεται για την έγκαιρη διάγνωση του καρκίνου, ακόμη και αξιολόγηση των κινδύνων. Δεύτερον, αξιοποιώντας εύκολα προσβάσιμο DNA που λευκοκυττάρων, αντί του παγκρέατος ιστού ή υπόστρωμα με βάση χυμούς, είναι επιδεκτική σε μεγάλης κλίμακας επιγενετικής εφαρμογές της επιδημιολογίας, όπως η μελέτη σύνδεσης επιγονιδιώματος κλίμακα. Τρίτον, η μελέτη εντόπισε σημαντικό ρόλο της γενετικής στην μεθυλίωσης του DNA σε ορισμένες ασθένειες που σχετίζονται με CpG θέσεις. Είναι κρίσιμης σημασίας να γίνει διάκριση μεταξύ γενετικών και μη γενετικές επιδράσεις στην μεθυλίωση ΟΝΑ. Ενώ οι αλλαγές στη μεθυλίωση, ως αποτέλεσμα μιας ασθένειας μπορεί να είναι ένας χρήσιμος δείκτης για την έγκαιρη διάγνωση, παραλλαγή μεθυλίωση λόγω γενετικές επιρροές μπορεί να είναι ένας πιθανός δείκτης για την εκτίμηση του κινδύνου μεταξύ των ατόμων σε μεγαλύτερους πληθυσμούς. Ως εκ τούτου, ο χαρακτηρισμός μιας γενετικής ρόλο στη μεθυλίωση του DNA θα διευκολύνει την ανακάλυψη βιοδεικτών και περαιτέρω διαστρωμάτωση κλινικές εφαρμογές για αυτές τις μοριακές υπογραφές.

Εν ολίγοις, έχουμε επιβεβαιώσει διαφορές επαναλήψιμη μεθυλίωσης μεταξύ των ασθενών PAC και ελέγχων και έχουν εντοπίσει μια σειρά από διαφορικά μεθυλιωμένα CpG θέσεις που φαίνεται να είναι πολύ ενδεικτική της παρουσίας της PAC. Αν περαιτέρω επικυρωθεί και βελτιώθηκε σε μελλοντικές μελέτες, τα αποτελέσματα αυτά μπορούν να εφαρμοστούν σε ένα σχήμα εφικτό διαλογής, είτε σε πληθυσμό υψηλού κινδύνου ή ακόμη και στο γενικό πληθυσμό, για την ανίχνευση του καρκίνου σε αυτό το δυνητικά θεραπευτική στάδια.

Υποστήριξη Πληροφορίες