Αφηρημένο

Η αντίσταση στη θεραπεία ΤΚΙ είναι ένα σημαντικό εμπόδιο στην αποτελεσματική θεραπεία του NSCLC. Εκτός από την κατάσταση μετάλλαξης του EGFR, οι μηχανισμοί που εμπλέκονται είναι σε μεγάλο βαθμό άγνωστη. Ορισμένα στοιχεία υποστηρίζει ένα ρόλο για microRNA 21 στη διαμόρφωση της ευαισθησίας του φαρμάκου της χημειοθεραπείας, αλλά ο ρόλος του στην αντίσταση NSCLC ΤΚΙ παραμένει ανεξερεύνητο. Αυτή η μελέτη είχε σκοπό να διερευνήσει κατά πόσον NSCLC miR-21 μεσολάβηση αντίσταση στην TKIs προκύπτει επίσης από τη στόχευση PTEN. Εδώ, δείχνουμε miR-21 προάγει τον καρκίνο ρυθμίζοντας αρνητικά την έκφραση ΡΤΕΝ σε ανθρώπινους ιστούς NSCLC: υψηλά επίπεδα έκφρασης του miR-21 συσχετίστηκαν με μικρότερη DFS σε 47 ασθενείς με ΜΜΚΠ? υψηλή χαμηλή PTEN επίπεδα έκφρασης του miR-21 /υποδεικνύεται μια φτωχή ΤΚΙ κλινική ανταπόκριση και την μικρότερη συνολική επιβίωση σε ένα άλλο 46 ασθενείς με NSCLC που υποβάλλονται σε θεραπεία ΤΚΙ.

In vitro

δοκιμασίες έδειξαν ότι miR-21 ήταν ρυθμισμένη ταυτόχρονα προς τα κάτω ρύθμιση της ΡΤΕΝ σε PC-9 /GR κύτταρα σε σύγκριση με το PC-9 κύτταρα. Επιπλέον, η υπερέκφραση του miR-21 μειώθηκε σημαντικά η ευαισθησία gefitinib από τα κάτω ρύθμιση έκφρασης ΡΤΕΝ και ενεργοποίηση Akt και ERK μονοπάτια σε PC-9 κύτταρα, ενώ miR-21 knockdown δραματικά αποκατέστησε την ευαισθησία gefitinib PC-9 /GR κύτταρα με ανάντη ρύθμιση της έκφρασης ΡΤΕΝ και απενεργοποίηση της ΑΚΤ και μονοπάτια ERK,

in vivo

και

in vitro

. Προτείνουμε αλλαγή της έκφρασης /ΡΤΕΝ miR-21 ως νέο μηχανισμό για την αντίσταση ΤΚΙ στον καρκίνο NSCLC. Τα ευρήματά μας παρέχουν μια νέα βάση για τη χρήση του miR 21 /ΡΤΕΝ που βασίζονται σε θεραπευτικές στρατηγικές για να αντιστρέψει την αντίσταση gefitinib στο NSCLC

Παράθεση:. Shen Η, Zhu F, Liu J, Xu Τ, Pei D, Wang R, et al. (2014) Τροποποίηση στο Mir-21 Έκφραση /PTEN Διαμορφώνει Gefitinib Αντίσταση σε μη μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα. PLoS ONE 9 (7): e103305. doi: 10.1371 /journal.pone.0103305

Επιμέλεια: Jung Weon Lee, Εθνικό Πανεπιστήμιο της Σεούλ, Δημοκρατία της Κορέας

Ελήφθη: 4 Μαρτίου 2014? Αποδεκτές: 27, Ιουνίου 2014? Δημοσιεύθηκε: 24 Ιουλίου 2014

Copyright: © 2014 Shen et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Δεδομένα Διαθεσιμότητα:. Η συγγραφείς επιβεβαιώνουν ότι όλα τα δεδομένα που διέπουν τα ευρήματα είναι πλήρως διαθέσιμα χωρίς περιορισμούς. Τα δεδομένα που περιλαμβάνονται στο έγγραφο

Χρηματοδότηση:. Το ερευνητικό έργο χρηματοδοτήθηκε από το Εθνικό Ίδρυμα Φυσικών Επιστημών της Κίνας (81101705 και 81272532), η επαρχία Jiangsu κλινικά προγράμματα επιστήμης και τεχνολογίας (κλινική έρευνα κέντρο, BL2012008) και η Ίδρυμα Φυσικών Επιστημών της επαρχίας Jiangsu (BK2011852). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

μη μικροκυτταρικός καρκίνος του πνεύμονα (NSCLC) είναι η κύρια αιτία θανάτου που σχετίζονται με τον καρκίνο σε όλο τον κόσμο. [1] Δυστυχώς, παρά τις προόδους στην έγκαιρη διάγνωση του καρκίνου, η πλειοψηφία των ασθενών με NSCLC διαγιγνώσκονται με προχωρημένου σταδίου της νόσου, με αποτέλεσμα την κακή πρόγνωση με διάμεση επιβίωση μόνο 10-12 μήνες. [2], [3] Η ανάπτυξη φαρμάκων που στοχεύουν τον υποδοχέα του επιδερμικού αυξητικού παράγοντα (EGFR), όπως EGFR-ΤΚΙδ (gefitinib και erlotinib) έχει βελτιώσει την αποτελεσματικότητα της θεραπείας NSCLC. Πράγματι, η παρουσία του ενεργοποιούμενες μεταλλάξεις του EGFR εξόνιο διαδραματίζει βασικό ρόλο στην πρόβλεψη της θεραπευτικής αποτελεσματικότητας του EGFR-TKIs. [2] Αυτές οι ενεργοποιώντας μεταλλάξεις του EGFR συχνά συσχετίζονται σημαντικά με αδενοκαρκίνωμα που σχετίζονται με την ιστολογία, το κάπνισμα κατάσταση, το φύλο και την εθνότητα. [3] Έτσι, EGFR-TKIs έχουν προταθεί ως θεραπεία πρώτης γραμμής για ασθενείς με ΜΜΚΠ με μεταλλάξεις του EGFR. Δυστυχώς, η κλινική αποτελεσματικότητα τους είναι περιορισμένη από την ανάπτυξη της επίκτητης αντοχής: οι περισσότεροι ασθενείς που αρχικά ανταποκρίνονται θα βιώσουν συνέχεια την εξέλιξη της νόσου με τη συνεχή χρήση του ΤΚΙ για περίπου 9-11 μήνες? [4] περίπου το 50% των ασθενών που αντιδρούν αρχικά σε EGFR-ΤΚΙ αντοχή σε EGFR-ΤΚΙ αποκτήσουν, ενώ EGFR Τ790Μ μετάλλαξη σε λογαριασμούς exon20 για το 50% αυτής της επίκτητης αντοχής? [4] ένα άλλο 20% των ΤΚΙ αποκτήσει αποτελέσματα αντίσταση από ΚΟΑ ενίσχυση. [2] Δεν είναι ακόμη σαφές πώς το υπόλοιπο 30% των ασθενών αναπτύσσουν επίκτητης αντοχής.

microRNA (miRNA), που είναι γνωστό ότι καταστέλλει εγγενώς mRNA από την αντιστοίχιση με το 3′-αμετάφραστη περιοχή (UTR) του mRNA ήταν φαίνεται να ρυθμίζουν αρνητικά την έκφραση των στοχευμένων γονιδίων. [5], [6] Ως ρυθμιστές γονιδίων, miRNA ρυθμίζουν περίπου το ένα τρίτο των γονιδίων και παίζουν σημαντικό ρόλο στη κυτταρικές λειτουργίες όπως πολλαπλασιασμό, την ανάπτυξη, τη διαφοροποίηση και την απόπτωση. [7], [8] Τα τελευταία χρόνια, ο κρίσιμος ρόλος της miRNAs στην καρκινογένεση έχουν καταδειχθεί. [9] Επιπλέον, ορισμένα miRNAs λειτουργούν ως καταστολείς όγκων

in vitro.

[10], [11] Ως εκ τούτου, η υπερ-έκφραση αυτών των miRNAs μπορεί να καταστείλει τις πρωτεΐνες-στόχους οι οποίοι λειτουργούν ως καρκινογόνες παράγοντες. [7], [12] Σε αντίθεση με σύντομης παρεμβολής RNA, miRNAs πιστεύεται ότι ρυθμίζουν την ίδια οδό σε πολλαπλά επίπεδα. [10] MiR-21 είναι ένα σημαντικό ογκογόνος miRNA, σχετίζεται στενά με την ανάπτυξη του όγκου και τη μετάσταση. [13], [14] Πράγματι, η έκφραση του miR-21 δείχθηκε να συνδέεται με κακή πρόγνωση και χημειο-ευαισθησία σε αδενοκαρκίνωμα του παχέος εντέρου. [15], [16] Επιπλέον, αντι-miR-21 κατέστειλε την ανάπτυξη των κυττάρων του καρκίνου του μαστού μέσω της κάτω ρύθμιση αντιαποπτωτικού παράγοντα, Β-κυτταρικό λέμφωμα 2 (Bcl-2). [17], [18] Αυτά τα δεδομένα λαμβανόμενα μαζί, υποστηρίζουν ένα σημαντικό ρόλο του αλλοιωμένη έκφραση miR-21 κατά τη διάρκεια της ανάπτυξης του όγκου. Έτσι, ερευνήσαμε αν miR-21 ρυθμίζει την ευαισθησία ΤΚΙ σε ασθενείς με NSCLC, καθώς και.

Βρήκαμε ότι πάνω ρύθμιση του miR-21 και κάτω ρύθμιση της PTEN σε 47 ιστούς όγκων NSCLC σε σύγκριση με τα γειτονικά φυσιολογικούς ιστούς τους, και ότι τα επίπεδα έκφρασης τους συσχετίζεται αρνητικά. miR-21 έκφρασης συσχετίζεται με μικρότερη DFS στους 47 ασθενείς με NSCLC. Επιπλέον, τα δεδομένα μας έδειξαν καλή συσχέτιση μεταξύ των υψηλών /χαμηλών PTEN επίπεδα έκφρασης του miR-21 και η κακή ευαισθησία ΤΚΙ με μικρή συνολική επιβίωση σε 46 ασθενείς με NSCLC που υποβάλλονται σε θεραπεία ΤΚΙ. Ως εκ τούτου, υποθέσαμε ότι η μεταβολή της έκφρασης miR-21-ΡΤΕΝ ρυθμίζει την ευαισθησία ΤΚΙ σε καρκινικά κύτταρα του πνεύμονα. Βρήκαμε ότι το miR-21 ήταν ρυθμισμένη concomittantly με ρύθμιση προς τα κάτω της PTEN σε PC-9 /GR κυττάρων σε σύγκριση με το PC-9 κύτταρα,

in vitro

. Περαιτέρω, η υπερ-έκφραση του miR-21 μειώθηκε σημαντικά η ευαισθησία gefitinib μέσω ρύθμισης προς τα κάτω της έκφρασης ΡΤΕΝ και ενεργοποίηση των οδών Akt και ERK, ενώ knockdown του miR-21 δραματικά αποκατέστησε την ευαισθησία gefitinib PC-9 /GR κύτταρα με up-ρύθμιση ΡΤΕΝ έκφρασης και την αδρανοποίηση ΑΚΤ και ERK μονοπατιών σηματοδότησης, τόσο

in vivo

και

in vitro

.

Υλικά και Μέθοδοι

Υλικά |

gefitinib ήταν ένα είδος δώρο της AstraZeneca (Tocris, Ηνωμένο Βασίλειο). Αντισώματα έναντι ΡΤΕΝ, φωσφο-ERK1 /2, φωσφο-ΑΚΤ (Ser-473), και η συνολική ΑΚΤ αγοράσθηκαν από τη Cell Signaling Technology (Beverly, ΜΑ). Αντισώματα έναντι ERK2 αγοράστηκαν από την Santa Cruz Biotechnology (CA, USA). Αντισώματα έναντι GAPDH ελήφθησαν από Kangcheng Company (Σαγκάη, Κίνα). Lipofectamine και ΤΚΙζοΙ αντιδραστήρια αγοράστηκαν από την Life Technologies (Grand Island, ΝΥ, USA). MiR-21 μιμείται και miR-21 αναστολέα δόθηκαν από GenePharma (Σαγκάη, Κίνα). Το υψηλής χωρητικότητας RNA-σε cDNA Kit και Power SYBR Green ΡΟΚ Master Mix αγοράστηκαν από την Applied Biosystems (Carlsbad, CA). Οι κυτταρικές σειρές PC-9 αγοράστηκαν από το Type Culture Collection από την Κινεζική Ακαδημία Επιστημών, Σαγκάη της Κίνας. Το gefitinib ανθεκτική κυτταρική γραμμή PC-9 (PC-9 /GR), η οποία επάγεται από έκθεση των κυττάρων PC-9 σε αυξανόμενες συγκεντρώσεις του gefitinib όπως αναφέρθηκε προηγουμένως [19], [20], χορηγήθηκε ευγενώς από το Τμήμα Ογκολογίας, Σαγκάη Πνευμονική Νοσοκομείο, Πανεπιστήμιο Tongji, Σαγκάη.

Κλινικά δείγματα

Αξιόπιστες δείγματα ανθρώπινου NSCLC (n = 47) και να συνδυαστούν φυσιολογικά δείγματα παρακείμενο ιστό συλλέχθηκαν από ασθενείς που υποβάλλονται σε τυπικές χειρουργικές επεμβάσεις στην Πρώτη Ενταγμένο νοσοκομείο Ιατρικό Πανεπιστήμιο Nanjing, Jiangsu (Κίνα), με τη γραπτή συγκατάθεση των ασθενών. Ένα μέρος του κάθε δείγματος ιστού αμέσως καταψύχθηκαν ταχέως σε υγρό άζωτο, ενώ το άλλο μέρος σταθεροποιήθηκε σε φορμαλίνη για ιστολογική εξέταση.

παραφίνη ενσωματωμένα δείγματα ασθενών με NSCLC (n = 46), οι οποίοι λάμβαναν EGFR- θεραπεία ΤΚΙ, συλλέχθηκαν από το τμήμα παθολογίας του πρώτου Ενταγμένο Νοσοκομείο Ιατρικό Πανεπιστήμιο Nanjing, Jiangsu (Κίνα), με τη γραπτή συγκατάθεση των ασθενών. Όλα τα δείγματα ιστολογικά ταξινομούνται και ταξινομούνται ανάλογα με το στάδιο TNM από τυφλό κλινική παθολογοανατόμος. Όλα τα πειραματικά πρωτόκολλα εγκρίθηκαν από την Επιτροπή Θεσμικών αναθεώρηση της πρώτης συνδεδεμένες νοσοκομείο της Nanjing Ιατρικό Πανεπιστήμιο, Nanjing (Κίνα).

Κυτταρική καλλιέργεια

Ανθρώπινο PC-9 και PC-9 /GR κυττάρων γραμμές, και τα κύτταρα ΗΕΚ293Τ καλλιεργήθηκαν σε RPMI και DMEM, αντίστοιχα, συμπληρωμένο με 10% βόειο εμβρυϊκό ορό, 100 μονάδες /ml πενικιλίνη, και 100 μg /ml στρεπτομυκίνη σε 37 ° C σε υγροποιημένο περιβάλλον που περιέχει 5% CO

2 .

διαμόλυνσης κυττάρων

HSA-miR-21 ή HSA-miR-NC μιμείται διαμολύνθηκαν σε PC-9 κύτταρα χρησιμοποιώντας το αντιδραστήριο Lipofectamine (Life Technologies), σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Οι τελικές συγκεντρώσεις του HSA-miR-21 ή HSA-miR-NC μιμείται για την επιμόλυνση ήσαν 40 ηΜ. Μια παρόμοια διαδικασία χρησιμοποιήθηκε για την επιμόλυνση αναστολέα miR-21 (40 ηΜ) ή NC σε PC-9 /GR κύτταρα.

Κυτταρική βιωσιμότητα δοκιμασία

PC-9 και Pc 9-/GR κύτταρα σπάρθηκαν σε πλάκες 96-φρεατίων σε πυκνότητα 4 Χ 10

3 κύτταρα /φρεάτιο και αφέθηκαν να προσκολληθούν όλη τη νύκτα. Παράλληλα, PC-9 κύτταρα σπάρθηκαν σε πλάκες 96 φρεατίων και επιμολύνθηκαν με miR-21 μιμούνται και NC για 24 ώρες, ενώ PC-9 /GR κύτταρα επιμολύνθηκαν με αναστολέα miR-21. Μετά την κυτταρική προσκόλληση, gefitinib προστέθηκε σε μία τελική συγκέντρωση 2,5-40 μmol /L. Μετά από 72 ώρες επώασης, η βιωσιμότητα των κυττάρων αξιολογήθηκε με τη χρήση των κυττάρων Μετρώντας Kit-8 (CCK-8) (Dojindo Laboratories), σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Κάθε δείγμα τοποθετήθηκε σε τριπλούν και τρία ανεξάρτητα πειράματα.

λεντοϊών συσκευασίας και σταθερή εγκατάσταση κυτταρική γραμμή

Για να knockdown σταθερώς miR-21 έκφραση σε PC-9 /GR κύτταρα, η συσκευασία φακοϊική χρησιμοποιήθηκε kit (Thermo Fisher Scientific). Lentivirus μεταφέρουν miR-21 αναστολέα ή αρνητικό μάρτυρα (MIR-NC) συσκευάσθηκε σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Πράσινη φθορίζουσα πρωτεΐνη γονιδίου (GFP) εισήχθη εντός του συστήματος συσκευασίας και συν-εκφράζεται με miRNAs. Lentivirus συσκευάστηκε σε κύτταρα ΗΕΚ293Τ και εκκρίνεται στο μέσο. Pc-9 /GR κύτταρα μολύνθηκαν με φακοϊό μεταφέρουν miR-21 αναστολέα ή miR-NC σε παρουσία πολυβρενίου (Sigma-Aldrich), και επιλέγονται από πουρομυκίνη (Sigma-Aldrich) για 2 εβδομάδες για την επίτευξη PC-9 GR /miR -21 αναστολέα και PC-9 GR /σταθερές κυτταρικές σειρές miR-NC.

η απόπτωση δοκιμασία

η απόπτωση μετρήθηκε όπως περιγράφηκε προηγουμένως [21]. Εν συντομία, τα κύτταρα θρυψινοποιήθηκαν και επισημάνθηκαν με Alexa Fluor 647 αννεξίνης V (Biolegend) και 7-AAD (Βϋ Pharmingen), και αναλύθηκαν με κυτταρομετρία ροής. Τα κύτταρα θεωρήθηκαν αποπτωτικά όταν ήταν αννεξίνη V-θετικά και 7-AAD-αρνητικό.

απομόνωση RNA και ποσοτική PCR πραγματικού χρόνου (qRT-PCR) ανάλυση

Ολικά RNAs που εξάγονται από καλλιεργημένα κύτταρα ή δείγματα ανθρώπινου ιστού χρησιμοποιώντας αντιδραστήριο ΤΚΙζοΙ σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Για τη μέτρηση των επιπέδων miR-21 έκφραση, RNAs μεταγράφηκαν με stem-loop RT εκκινητή χρησιμοποιώντας κιτ αντιδραστηρίου RT PrimeScript (Takara) όπως περιγράφηκε προηγουμένως [21], [22]. Οι αλληλουχίες των εκκινητών RT ήταν ως εξής: miR-21-RT, 5′-CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAG TCAACATC -3 ‘? U6-RT, 5’-TGGTGTCGTGGAGTCG-3 ‘. qRT-PCR εκτελέστηκε χρησιμοποιώντας SYBR Πρόμιγμα DimerEraser (Takara) σε ένα σύστημα 7900HT (Applied Biosystems). miR-21 qPCR εκκινητών ήταν: αίσθηση, 5’-ACACTCCAGCTGGG TAGCTTATCAGACTGA -3 ‘? αντι-νόημα, 5’-TGGTGTCGTGGAGTCG -3 ‘. U6 snRNA qPCR εκκινητές ήταν: sense, 5’-CTCGCTTCGGCAGCACA-3 ‘? αντι-νόημα, 5’-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3 ‘. Η έκφραση του miR-21 ομαλοποιήθηκε στα επίπεδα του U6 και τη μέθοδο συγκριτικής κατώφλι κύκλου (2

-ΔΔCT) χρησιμοποιήθηκε με U6 ως μάρτυρες.

εκχύλιση πρωτεϊνών και western αποτύπωση

τα κύτταρα ή οι ιστοί συλλέχθηκαν και λύθηκαν επί πάγου για 30 λεπτά σε ρυθμιστικό διάλυμα RIPA (Beyotime) συμπληρωμένο με 1 mM φθοριούχο φαινυλμεθυλσουλφονύλιο (PMSF). Τα προϊόντα λύσης υποβλήθηκαν σε δοκιμασία Western blotting όπως περιγράφηκε προηγουμένως [23] και ανιχνεύθηκαν με αντισώματα έναντι ΡΤΕΝ, φωσφο-ΑΚΤ (Ser-473), ολική Akt, φωσφο-ΕΚΚ, ολική ΕΚΚ, GAPDH.

ανοσοϊστοχημεία (IHC )

φορμαλίνη σταθερό, εγκλεισμένους σε παραφίνη ιστούς που συλλέγονται από ασθενείς με NSCLC (n = 46), οι τομές των 5 μm, και επωάστηκαν με αντισώματα έναντι ΡΤΕΝ (Cell Signaling Technology). Η αξιολόγηση των σημάτων IHC διεξήχθη με δύο πεπειραμένους παθολόγους με τυφλό τρόπο. Πέντε πεδία υψηλής ισχύος (200 Χ) επιλέχθηκαν τυχαία σε κάθε δείγμα. Τα ποσοστά των κυττάρων του όγκου κατηγοριοποιήθηκαν σε πέντε ημι-ποσοτική τάξεις: 0 (≤5% θετικά κύτταρα), 1 (6% -25% θετικά κύτταρα), 2 (26% -50% θετικά κύτταρα), 3 (51% -75 % θετικά κύτταρα), και 4 (& gt? 76% θετικά κύτταρα). Ένταση της χρώσης ήταν επίσης ημι-ποσοτικά προσδιορίζεται με κλίμακα από το 0-3 ως εξής: 0 (αρνητικός), 1 (ασθενώς θετικό), 2 (μέτρια θετικά), και 3 (ισχυρώς θετικά). Τα προϊόντα της ποσοστό βαθμολογιών από την ένταση της χρώσης απέδωσε τελική IHC βαθμολογίες: 0 (αρνητική), + (1-4), ++ (5-8), και +++ (9-12) όπως περιγράφηκε προηγουμένως [24]

.

σε situ υβριδισμού

ISH διεξήχθη σε παραφίνη δείγματα του NSCLC να διερευνήσει την κλινική ανταπόκριση σε ΤΚΙ και miR-21 έκφρασης. Εν συντομία, τα πλακίδια υποβλήθηκαν σε επεξεργασία και υβριδοποιήθηκε με ανιχνευτή 10 pmol (LNA-τροποποιημένο και DIG σημασμένο ολιγονουκλεοτίδιο? Exiqon) συμπληρωματικό προς miR-21, σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Μετά από επώαση με θραύσματα Fab αντι-DIG-HRP συζευγμένο με υπεροξειδάση αγριοραπανιού, οι υβριδοποιημένοι ανιχνευτές ανιχνεύθηκαν με επώαση με διάλυμα 3’3-διαμινοβενζιδίνη με πυρήνες βάφτηκαν αντίθετα με αιματοξυλίνη Carazzi του. μοτίβα χρώση αναλύθηκαν με 3 εμπειρογνώμονες και η αναλογία των θετικά χρωματισμένων κυττάρων όγκου βαθμολογήθηκε ως εξής: 0 (κανένα θετικά κύτταρα), 1 (& lt? 10% θετικά κύτταρα), 2 (10% -50% θετικά κύτταρα), 3 ( & gt? 50% θετικά κύτταρα). Τα κύτταρα σε κάθε ένταση της χρώσης καταγράφηκαν σε μια κλίμακα από το 0 (καμία χρώση), 1 (ασθενής χρώση, γαλάζιο ή κίτρινο), 2 (μέτρια χρώση, μπλε ή κίτρινο), και 3 (ισχυρή χρώση, σκούρο μπλε ή κίτρινο) . Για όγκους που έδειξε ετερογενή χρώση, το κυρίαρχο μοτίβο θεωρήθηκε για τη βαθμολόγηση. Ο δείκτης χρώση (SI) υπολογίστηκε ως ποσοστό θετικά χρωματισμένων καρκινικών κυττάρων × ένταση χρώσης. Χρησιμοποιώντας αυτή τη μέθοδο, η έκφραση του miR-21 βαθμολογήθηκε ως 0, 1, 2, 3, 4, 6 ή 9. Σε περίπτωση διαφωνίας (βαθμολογία διαφορά & gt? 1), διαφάνειες, επανεξετάστηκαν και συναίνεση επιτεύχθηκε από τους εμπειρογνώμονες .

μοντέλο όγκου ξενομοσχεύματος σε γυμνά ποντίκια

Για δοκιμασίες ανάπτυξης όγκου, 6-εβδομάδων αρσενικούς γυμνούς ποντικούς (BALB /cA-ηυ (ηυ /ηυ) αγοράστηκαν από την SLAC Κέντρο ζώων ( Σαγκάη, Κίνα), και διατηρούνται σε ειδικές άνευ παθογόνου () συνθήκες SPF. πρωτόκολλα για τα πειράματα σε ζώα εγκρίθηκαν από την Επιτροπή Μέριμνας ζώων της Nanjing Ιατρικό Πανεπιστήμιο. Δείγματα κυττάρων (4 × 10

6) ανεστάλησαν σε 150 μl μέσον FBS RPMI χωρίς ϋΜΕΜ και υποδόρια ένεση σε οπίσθιο πλευρό γυμνών ποντικών (n = 6). το μέγεθος του όγκου μετρήθηκε με τη χρήση ενός Vernier δαγκάνα κάθε επτά ημέρες έως ότου θυσιάστηκαν την ημέρα 35 μετά την εμφύτευση και του όγκου του όγκου ελήφθη ως 0.5 × Μήκος × Πλάτος

2.

η στατιστική ανάλυση

οι τιμές ελήφθησαν από τουλάχιστον τρία ανεξάρτητα πειράματα και παρουσιάζονται ως μέσοι όροι ± SE. Μαθητή αταίριαστα

t

δοκιμή πραγματοποιήθηκε και αξίες θεωρήθηκαν σημαντικά διαφορετική όταν

P

& lt?. 0.05

Αποτελέσματα

Up-ρύθμιση του miR-21 και προς τα κάτω ρύθμιση ΡΤΕΝ αρνητικά συσχετίζονται με μικρότερη DSF σε ιστούς όγκου από ανθρώπους ασθενείς με NSCLC

Για να προσδιοριστούν τα επίπεδα έκφρασης του miR-21 και ΡΤΕΝ πρωτεΐνης σε ιστούς όγκων από ασθενείς ανθρώπινο NSCLC, αξιολογήσαμε 47 ζεύγη καρκίνου δειγμάτων όγκου και των παρακείμενων φυσιολογικών ιστών (Πίνακας S1) με qRT-PCR και βρήκαν μία σημαντικά υψηλότερη έκφραση του miR-21 σε 37/47 (78,7%) σε ιστούς όγκων σε σύγκριση με τους φυσιολογικούς ιστούς παρακείμενα (Εικ. 1Α). Δεδομένου ΡΤΕΝ είναι ένας από τους σημαντικούς στόχους της miR-21, [25], [26] μελετήθηκε η σχέση μεταξύ της έκφρασης του miR-21 και ΡΤΕΝ σε ανθρώπινο NSCLC δείγματα τόσο με ανοσοστύπωμα και ανοσοϊστοχημεία (IHC). Βρήκαμε ότι τα επίπεδα πρωτεΐνης ΡΤΕΝ ήταν σημαντικά μειωμένη σε 34/47 ιστούς (72,3%) του όγκου σε σύγκριση με το παρακείμενο φυσιολογικό αυτά (Σχ. 1Β). Επιπλέον, τα σχετικά επίπεδα έκφρασης του ΡΤΕΝ αξιολογήθηκαν από δύο έμπειρους παθολόγους με τυφλό τρόπο, και σημειώνονται με τελική IHC βαθμολογίες από 0 (αρνητική), + (αδύνατη), ++ (μέτρια) και +++ (ισχυρές) (Σχ. 1C ). Επίπεδα miR-21 μειώθηκαν σε υψηλή ένταση ΡΤΕΝ (Σχ. 1D). Επιπλέον, η ανάλυση διάγραμμα διασποράς έδειξαν μία αντίστροφη συσχέτιση μεταξύ miR-21 επίπεδα έκφρασης και IHC δεκάδες σήματα ΡΤΕΝ (Εικ. 1 Ε). Αυτά τα αποτελέσματα κατέδειξαν ότι τα επίπεδα έκφρασης miR-21 συσχετίζονταν αντίστροφα με τα επίπεδα ΡΤΕΝ σε ιστούς NSCLC. Για να αξιολογηθεί περαιτέρω η συσχέτιση μεταξύ 21 miR-/PTEN επίπεδα έκφρασης και την πρόγνωση σε ασθενείς με ΜΜΚΠ, χρησιμοποιήσαμε την ανάλυση επιβίωσης Kaplan-Meier και δοκιμασία log-rank για την εκτίμηση των κανονικοποιημένων επίπεδα έκφρασης του miR-21 (όγκος /κανονική) και ελεύθερη νόσου επιβίωση ( DFS). Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι οι ασθενείς με υψηλά επίπεδα έκφρασης miR-21 είχε μικρότερη νόσο επιβίωση χωρίς (DFS) σε σύγκριση με τους ασθενείς με χαμηλά miR-21 έκφραση (Εικ. 1 F).

(Α) Τα επίπεδα έκφρασης του ΜΙΚ 21 ήταν ρυθμισμένα προς τα πάνω σε 37/47 ζεύγη ιστών NSCLC σχετικώς προς παρακείμενο φυσιολογικό δείγματα. MiR-21 αναλύθηκαν με stem-loop qRT-PCR, και ομαλοποιήθηκε ως προς τα επίπεδα του U6. Fold αλλαγές ελήφθησαν από το λόγο του miR-21 αφθονία σε καρκινικούς ιστούς με εκείνη στο παρακείμενο φυσιολογικούς ιστούς. *

σ

& lt? 0.05 δείχνει σημαντική διαφορά συγκρίνοντας miR-21 έκφρασης σε ιστούς όγκων με παρακείμενες φυσιολογικούς ιστούς. (Β) Τα επίπεδα πρωτεΐνης Αντιπροσωπευτικά ΡΤΕΝ σε ιστούς NSCLC (Τ) και γειτονικό φυσιολογικό δείγματα (Ν) αξιολογούνται με ανοσοκηλίδα, GAPDH χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης. (C) PTEN ανοσοϊστοχημεία (IHC) τα αποτελέσματα των τμημάτων NSCLC, 0 (αρνητική), + (ασθενώς θετικό), ++ (μέτρια θετική), και +++ (έντονα θετικά). (Δ) Ανάλυση συσχέτισης μεταξύ των επιπέδων της πρωτεΐνης PTEN και τα επίπεδα έκφρασης του miR-21 σε ιστούς NSCLC. IHC βαθμολογίες χρησιμοποιούνται για να περιγράψουν τα επίπεδα πρωτεΐνης ΡΤΕΝ σε ιστούς όγκων, αξιολογήθηκε από έμπειρους παθολόγους με τυφλό τρόπο. καμπύλες παλινδρόμησης (Ε) Γραμμική της έκφρασης miR-21 και τα επίπεδα της πρωτεΐνης PTEN. καμπύλες (F) Kaplan-Meier που απεικονίζει την ελεύθερη νόσου επιβίωση, σύμφωνα με την έκφραση του miR-21. Η τιμή αποκοπής των υποομάδων (υψηλή και χαμηλή) του επιπέδου έκφρασης miR-21 ήταν η 50η αξία εκατοστημόριο.

Η

Up-ρύθμιση του miR-21 και κάτω ρύθμιση της PTEN πρωτεΐνης που σχετίζεται με την κακή ΤΚΙ ευαισθησία και βραχύτερη γενική επιβίωση σε ιστούς όγκων των ασθενών ανθρώπινης NSCLC που υποβάλλονται σε θεραπεία ΤΚΙ

Προηγούμενες μελέτες έχουν αποδείξει ότι miR-21 επάγει αντίσταση σισπλατίνη σε NSCLC [27]. Επιπλέον, Wang et al. διαπίστωσε ότι το miR-214 ρυθμίζει την επίκτητη αντοχή στο gefitinib μέσω του PTEN /AKT οδό σε EGFR-μεταλλαγμένες κυτταρικές γραμμές [28]. Λαμβάνοντας υπόψη την πιθανή επίδραση των miRNA στη ρύθμιση της ευαισθησίας των ναρκωτικών, ερευνήσαμε αν αλλοίωση της έκφρασης /ΡΤΕΝ miR-21 συσχετίζεται με την ευαισθησία ΤΚΙ. Μετά την παρακολούθηση της κλινικής θεραπείας των ασθενών 47 NSCLC, βρήκαμε μόνο 5 ασθενείς που χρησιμοποίησαν θεραπεία ΤΚΙ. Ένας ασθενής που δείχνει μια μερική ανταπόκριση (PR) έδειξαν επίπεδο έκφρασης του miR-21 (όγκος /κανονική) μόνο 0,16? τρεις ασθενείς με σταθερή νόσο (SD) εμφανίζονται μέσα επίπεδα έκφρασης του miR-21 2,57? ένας ασθενής με μια προοδευτική ασθένεια (Ρϋ) έδειξε υψηλή έκφραση miR-21 στο 33,15 (Εικ. 2Α). IHC δοκιμασίες σε ιστούς που λαμβάνονται από αυτές τις πέντε ασθενείς έδειξε ότι τα επίπεδα έκφρασης ΡΤΕΝ συσχετίζεται αρνητικά με την κλινική απόκριση του ΤΚΙ: ένας ιστός PD ασθενής έδειξε ΡΤΕΝ έκφραση του (-)? ΡΤΕΝ έκφραση στα υπόλοιπα τέσσερα ασθενείς με PR και SD κυμαίνονταν από (++) έως (+++) (Σχ. 2Β). Για να επιβεβαιωθεί περαιτέρω τα ευρήματά μας, αξιολογήσαμε miR-21 επίπεδα έκφρασης χρησιμοποιώντας δοκιμασίες ISH (Εικ. 2D) και τα επίπεδα έκφρασης ΡΤΕΝ από την IHC στις τομές παραφίνης δείγματα από 46 ασθενείς με NSCLC που έλαβαν θεραπεία με ΤΚΙ (gefitinib ή erlotinib) ως θεραπεία και παρακολούθηση των κλινικών τους ανταπόκριση και την κατάσταση επιβίωσης (Πίνακας S2). Όπως αναμενόταν, τα επίπεδα miR-21 έκφραση σε ασθενείς με PD ήταν σημαντικά υψηλότερες από εκείνες στο PR και SD ομάδες (Σχ. 2C). Τα υψηλότερα επίπεδα έκφρασης του miR-21 ανέφερε, επίσης, μικρότερη συνολική επιβίωση σε ΤΚΙ θεραπεία ασθενών (Σχ. 2Ε). Επιπλέον, τα επίπεδα έκφρασης ΡΤΕΝ σε ασθενείς με PD ήταν σημαντικά χαμηλότερη από ό, τι στο PR και ομάδες ασθενών SD (Σχ. 2F), και τα υψηλότερα ΡΤΕΝ έκφραση συσχετίζεται με μεγαλύτερη συνολική επιβίωση σε ασθενείς που έλαβαν ΤΚΙ (Σχ. 2G). Τα ευρήματα αυτά είναι όλα σε συμφωνία και να προτείνουν τη συμμετοχή των υψηλών miR-21 /χαμηλή PTEN έκφραση στη ρύθμιση της ευαισθησίας ΤΚΙ σε NSCLC.

(Α) Η κλινική ανταπόκριση του ΤΚΙ και miR-21 επίπεδα έκφρασης σε ασθενείς 5 NSCLC αξιολογούνται Q-RT PCR. (Β) Η κλινική ανταπόκριση των επιπέδων ΤΚΙ και η έκφραση ΡΤΕΝ σε 5 ασθενείς με NSCLC δοκιμαστεί με ανοσοϊστοχημεία. PR (μερική ανταπόκριση) και SD (σταθερή νόσος) ασθενείς είχαν σχετικά χαμηλότερα επίπεδα έκφρασης του miR-21 και υψηλότερο PTEN επίπεδα έκφρασης σε σύγκριση με το PD (προοδευτική νόσο) ασθενείς. (*

σ

& lt? 0,05). ανάλυση (C) Συσχέτιση εκτελούνται μεταξύ miR-21 επίπεδα έκφρασης και η κλινική ανταπόκριση στη TKIs. miR-21 επίπεδα και βαθμολογίες (D) Αντιπρόσωπος στον NSCLC ιστούς που υποβάλλονται σε θεραπεία ΤΚΙ αξιολογήθηκαν με in situ υβριδισμού. καμπύλες (Ε) Kaplan-Meier που απεικονίζει τη συνολική επιβίωση, σύμφωνα με την έκφραση του miR-21 σε 46 ασθενείς με NSCLC που υποβάλλονται σε θεραπεία TKIs. ανάλυση (F) Συσχέτιση πραγματοποιείται μεταξύ PTEN επίπεδα έκφρασης και η κλινική ανταπόκριση στη TKIs. (Ε) Kaplan-Meier καμπύλες που απεικονίζουν τη συνολική επιβίωση, σύμφωνα με την έκφραση του ΡΤΕΝ σε 46 ασθενείς που υποβάλλονται σε θεραπεία NSCLC TKIs.

Η

PC9 /κυττάρων GR παρουσιάζουν σημαντική αντίσταση στο gefitinib, αυξητική ρύθμιση του miR-21, κάτω ρύθμιση των PTEN και ενεργοποίηση της ΑΚΤ, ERK σε σύγκριση με τα κύτταρα PC9

για να ελέγξετε εάν το αποτέλεσμα της υψηλής miR-21 /χαμηλή PTEN έκφραση για τη διαφοροποίηση της ευαισθησίας ΤΚΙ, επιλέξαμε PC-9, ένα ευαίσθητη κυτταρική γραμμή ΤΚΙ, και το gefitinib ανθεκτική κυτταρική σειρά PC-9 /GR (ευγενική παραχώρηση του Τμήματος Ογκολογίας, Σαγκάη Πνευμονική Νοσοκομείο, Πανεπιστήμιο Tongji, Σαγκάη) προκλήθηκαν από την έκθεση του PC-9 κυττάρων με αυξανόμενες συγκεντρώσεις του gefitinib όπως αναφέρθηκε προηγουμένως . [19], [20] Χρησιμοποιήσαμε τη δοκιμασία CCK-8 για την ανίχνευση της ευαισθησίας gefitinib στο pc-9 και GR κύτταρα 9 pc-και διαπίστωσε ότι το pc 9-GR κύτταρα ήταν ανθεκτικά στο gefitinib σε σύγκριση με το PC-9 κύτταρα (Εικ. 3Α , Σχ. 3Β). Η IC50 για gefitinib στο PC9 /κύτταρα GR ήταν περίπου 2,54 mmol /L, 200times υψηλότερη από ό, τι στα κύτταρα PC9 (0.0127 mmol /L, P & lt? 0.001) (Εικ. 3C). Μετά από 72 ώρες θεραπείας gefitinib /L 1 μmοl, χρησιμοποιήσαμε ροής για την εκτίμηση επάγεται gefitinib ποσοστά απόπτωσης. Τα δεδομένα μας έδειξαν τα ποσοστά απόπτωσης σημαντικά υψηλότερη σε κύτταρα PC9 σύγκριση με PC9 /GR (15,04% έναντι 3,08%) (Σχ. 3D). δεδομένα qRT-PCR έδειξε ότι miR-21 ήταν 3,70-φορές αυξορρυθμίζεται PC9 κύτταρα /GR σε σύγκριση με κύτταρα PC9 (Σχ. 3Ε). Χρησιμοποιώντας δοκιμασίες δυτικού στυπώματος, δείξαμε ΡΤΕΝ απώλεια και ενεργοποίηση ΑΚΤ και ERK σε PC-9 GR κυττάρων σε σύγκριση με το PC-9 κύτταρα, αλλά δεν έδειξε συνολική ΑΚΤ και συνολική διαφορά έκφραση ERK μεταξύ των δύο κυτταρικών σειρών (Σχ. 3F, 3G).

(Α, Β) pc-9 και pc-9 /GR κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με gefitinib για 72 ώρες σε 0.1% ορό που περιέχει RPMI. Η κυτταρική ανάπτυξη μετρήθηκε με CCK-8 δοκιμασία εις τριπλούν. Η ανάπτυξη των κυττάρων σε 72 ώρες σχεδιάζεται ως προς gefitinib συγκέντρωσης. (C) gefitinib IC 50 στην PC-9 και PC-9 /GR κυττάρων με προσδιορισμούς εις τριπλούν που εκτελούνται. ** Υποδεικνύει ρ & lt? 0,01. (D), τα ποσοστά απόπτωσης του PC-9 /GR και PC-9 κυττάρων που επάγεται από gefitinib αξιολογήθηκαν με κυτταρομετρία ροής. PC-9 /GR και PC-9 κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 1 mmol /L gefitinib για 72 ώρες πριν από την αξιολόγηση της απόπτωσης. (Ε) Σχετικά επίπεδα έκφρασης του miR-21 σε PC-9 και pc-9 /GR κύτταρα αξιολογήθηκε με stem-loop qRT-PCR, και ομαλοποιήθηκε ως προς τα επίπεδα U6. Εις τριπλούν προσδιορισμοί πραγματοποιήθηκαν για κάθε δείγμα RNA. Σημαντικές διαφορές υποδεικνύονται με * (Ρ & lt? 0,05). (F) ΡΤΕΝ, ρ-ΑΚΤ, ΑΚΤ, ρ-ΕΚΚ, ERK πρωτεΐνες σε PC-9 και pc-9 /GR κύτταρα αναλύονται με κηλίδα Western. (G) Ποσοτικοποίηση της ανάλυσης κηλίδος Western έδειξε ότι η έκφραση ΡΤΕΝ πρωτεΐνης ήταν μειωμένη σε PC-9 GR κύτταρο /σύγκριση με τα κύτταρα PC-9 ** Ρ & lt? 0,01? ρ-ΑΚΤ και την έκφραση των πρωτεϊνών ρ-ERK ήταν πάνω ρυθμισμένα σε PC-9 GR κυττάρων σε σύγκριση με το PC-9 κύτταρα ** Ρ & lt? 0,01? δεν υπήρχαν σημαντικές διαφορές του συνόλου των ΑΚΤ και το σύνολο των ERK πρωτεΐνες μεταξύ του PC-9 και PC-9 /GR κύτταρα.

Η

Η αυξημένη έκφραση του miR-21 μειωμένη ευαισθησία gefitinib, ενισχυμένη επεμβατική ικανότητα και μειωμένη gefitinib που προκαλείται απόπτωση σε PC-9 κυττάρων με τα κάτω ρύθμιση ΡΤΕΝ και ενεργοποιώντας οδούς ΑΚΤ και ERK

Τα αποτελέσματά μας που περιγράφονται ανωτέρω έδειξαν ότι miR-21 ρυθμίζεται πάνω και ΡΤΕΝ ήταν ρυθμισμένα προς τα κάτω σε PC-9 GR κυττάρων σε σύγκριση με PC-9 κύτταρα. Ως εκ τούτου, υποθέσαμε ότι miR-21 /ΡΤΕΝ μεταβολή έκφραση παίζει έναν σημαντικό ρόλο στη ρύθμιση της ευαισθησίας gefitinib σε PC-9 κύτταρα και PC-9 /GR κύτταρα. Εμείς επιμολυσμένα PC-9 κυττάρων με miR-21 μιμείται και στη συνέχεια συν-επιμολυσμένα με αυτά τα κύτταρα ΡΤΕΝ πλασμίδιο για να παρατηρήσει αν ΡΤΕΝ θα μπορούσε να διασώσει miR-21 που προκαλείται από βιολογικές μεταβολές σε PC-9 κύτταρα. στοιχεία qPCR επιβεβαίωσε ότι miR-21 έκφραση αυξήθηκε σημαντικά υπό miR 21-μιμητικό επιμολυσμένα κύτταρα σε σύγκριση με τα επιμολυσμένα κύτταρα NC, ** ρ & lt? 0,01 (Εικ. 4Α). Στη συνέχεια χρησιμοποιήσαμε το κιτ δοκιμασίας CCK-8 για την ανίχνευση της ευαισθησίας gefitinib 24 ώρες μετά την επιμόλυνση. Όπως ήταν αναμενόμενο, miR-21 έκαναν να μειώσει την ευαισθησία gefitinib στο PC-9 κύτταρα και υπερ-έκφραση ΡΤΕΝ θα μπορούσε να σώσει αυτή την αλλαγή ευαισθησία gefitinib. ** Ρ & lt? 0,01 (Εικ. 4Β, 4C). Για να παρατηρήσουμε άλλες αλλαγές των παραμέτρων μετά miR-21 επιμόλυνση, πραγματοποιήσαμε μια δοκιμασία φρεατίων για να προσδιοριστεί η επίδραση του miR-21 για τα χωροκατακτητικά ικανότητα. Βρήκαμε ότι το miR-21 επιμολυσμένα PC-9 κύτταρα ήταν πιο επεμβατική από την ομάδα NC και υπερ-έκφραση ΡΤΕΝ θα μπορούσε να σώσει αυτό το επεμβατική ικανότητα ** p & lt? 0,01 (Εικ. 4D, 4Ε). Με σκοπό την ανίχνευση των επιπτώσεων των miR-21 στην επαγόμενη απόπτωση gefitinib, τα κύτταρα που περιγράφονται παραπάνω υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 1 mmol /L gefitinib για 72 ώρες. Χρησιμοποιώντας κυτταρομετρία ροής, διαπιστώσαμε ότι σε PC-9 κύτταρα, μία αξιοσημείωτη μείωση στην απόπτωση παρατηρήθηκε σε miR 21-μιμητικό επιμολυσμένα κύτταρα σε σύγκριση με NC επιμολυσμένα κύτταρα και miR-21 μιμούνται και ΡΤΕΝ πλασμίδιο συν-επιμολυσμένα κύτταρα μετά από θεραπεία gefitinib (Σχ. 4F). Για την καλύτερη κατανόηση των μοριακών μηχανισμών που εμπλέκονται στην επαγόμενη miR-21 αντίσταση gefitinib σε PC-9 κύτταρα, προσδιορισμούς δυτικού στυπώματος χρησιμοποιήθηκαν για να αξιολογηθεί η έκφραση των σχετικών πρωτεϊνών. Σε PC-9 κύτταρα, αυξημένη έκφραση του miR-21 είχε σαν αποτέλεσμα καταστολή της έκφρασης ΡΤΕΝ και ενεργοποίηση του π-ΑΚΤ και π-ERK σε σύγκριση με την ομάδα NC, αλλά δεν άλλαξε ολικής πρωτεΐνης έκφραση των ΑΚΤ και EKR. Υπερ-έκφραση της έκφρασης ΡΤΕΝ θα μπορούσε να διασώσει τα πάνω ρύθμιση του miR-21 επαγόμενη ενεργοποίηση του π-ΑΚΤ και π-ERK. (Σχ. 4G, 4Η).

Σχετικά επίπεδα έκφρασης του miR-21 στο (Α) PC-9 /NC + pCMV 6 επιμολυσμένα κύτταρα, PC-9 /miR-21 μιμητικό + pCMV 6 επιμολυσμένα κύτταρα και PC-9 /miR-21 μιμητικό + ΡΤΕΝ πλασμιδίου επιμολυσμένα κύτταρα εκτιμήθηκε με stem-loop qRT-PCR, και ομαλοποιήθηκε ως προς τα επίπεδα U6. Εις τριπλούν προσδιορισμοί πραγματοποιήθηκαν για κάθε δείγμα RNA. Οι σημαντικές διαφορές υποδεικνύονται με ** (Ρ & lt? 0,01). (Β) την ευαισθησία gefitinib του PC-9 /NC + pCMV 6 επιμολυσμένα κύτταρα, PC-9 /miR-21 μιμούνται + pCMV 6 επιμολυσμένα κύτταρα και pc 9-/miR-21 μιμούνται πλασμίδιο επιμολυσμένα κύτταρα + PTEN αξιολογήθηκαν από CCK-8 χημική δοκιμή. (C) IC50 για gefitinib στο PC-9 /NC + pCMV 6 επιμολυσμένα κύτταρα, PC-9 /miR-21 μιμούνται + pCMV 6 επιμολυσμένα κύτταρα και /miR-21 μιμούνται + PTEN πλασμίδιο επιμολυσμένα κύτταρα 9 pc-. ** P & lt? 0.001, # Ρ & lt? 0,01. (D) PC-9 /NC + pCMV 6 επιμολυσμένα κύτταρα, PC-9 /miR-21 μιμούνται + pCMV 6 επιμολυσμένα κύτταρα και pc 9-/miR-21 μιμούνται πλασμίδιο επιμολυσμένα κύτταρα + ΡΤΕΝ χρησιμοποιήθηκαν για δοκιμασίες κυτταρικής εισβολής. Εισβολή κύτταρα χρωματίστηκαν με 0.1% κρυσταλλικό ιώδες μετρήθηκαν 24 ώρες μετά την επίστρωση. Άνω πάνελ: αντιπροσωπευτικές φωτογραφίες των μεταστατικών κυττάρων (× 200). (Ε) Αριθμός επεμβατική κυττάρων ανά πεδίο ελήφθη από τουλάχιστον τρία πανομοιότυπα βοθρία και αντιπροσωπεύονται από μέση τιμή ± SD (γραφική παράσταση κάτω). ** Υποδηλώνει σημαντική διαφορά μεταξύ PC-9 /NC + pCMV 6 επιμολυσμένα κύτταρα και PC-9 /miR-21 μιμούνται + pCMV 6 επιμολυσμένα κύτταρα (P & lt? 0,01). ## Υποδηλώνει σημαντική διαφορά μεταξύ PC-9 /miR-21 μιμούνται + pCMV 6 επιμολυσμένα κύτταρα και PC-9 /miR-21 μιμούνται + PTEN πλασμίδιο επιμολυσμένα κύτταρα (P & lt? 0,01). ποσοστά (F) απόπτωση των PC-9 /NC + pCMV 6 επιμολυσμένα κύτταρα, PC-9 /miR-21 μιμούνται + pCMV 6 επιμολυσμένα κύτταρα και PC-9 /miR-21 μιμούνται + PTEN πλασμίδιο επιμολυσμένα κύτταρα που προκαλείται από gefitinib αξιολογήθηκαν από κυτταρομετρία ροής. Όλα τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 1 mmol /L gefitinib για 72 ώρες πριν από την αξιολόγηση της απόπτωσης. (G) PTEN, π-ΑΚΤ, ΑΚΤ, π-ERK, και ERK πρωτεΐνες PC-9 /NC + pCMV 6 επιμολυσμένα κύτταρα, PC-9 /miR-21 μιμούνται + pCMV 6 επιμολυσμένα κύτταρα και PC-9 /ΜΙΚ 21 μιμητικό πλασμίδιο επιμολυσμένα κύτταρα + ΡΤΕΝ αναλύθηκαν με κηλίδα Western. (H) Ποσοτικοποίηση της ανάλυσης κηλίδος western έδειξε προς τα κάτω ρύθμιση ΡΤΕΝ πρωτεΐνης σε PC-9/21 μιμητικά + pCMV 6 επιμολυσμένα κύτταρα σε σύγκριση με το PC 9-/NC + pCMV 6 επιμολυσμένα κύτταρα (* Ρ & lt? 0,05) και PC-9 /miR-21 μιμούνται + PTEN πλασμίδιο επιμολυσμένα κύτταρα (# P & lt? 0,05)? ρ-ΑΚΤ και την έκφραση των πρωτεϊνών ρ-ERK ήταν πάνω ρυθμισμένα σε PC-9/21 μιμητικά + pCMV 6 επιμολυσμένα κύτταρα σε σύγκριση με το pc 9-/NC + pCMV 6 επιμολυσμένα κύτταρα (* Ρ & lt? 0,05) και PC-9 /ΜΙΚ 21 μιμητικό πλασμίδιο επιμολυσμένα κύτταρα + ΡΤΕΝ (# Ρ & lt? 0,05). Δεν υπήρχαν σημαντικές διαφορές στην ολική ΑΚΤ και συνολικών πρωτεϊνών ERK μεταξύ των τριών κυττάρων.

Η

εξόντωση miR-21 αποκατέστησε την ευαισθησία gefitinib, μείωσε την επεμβατική ικανότητα και αυξημένη επάγεται gefitinib απόπτωση σε PC-9 /GR κύτταρα με up-ρύθμιση PTEN και απενεργοποιώντας το AKK και μονοπάτια ERK

για την περαιτέρω επιβεβαίωση της λειτουργίας του miR-21 για τη ρύθμιση της ευαισθησίας gefitinib στο PC-9 /GR κυττάρων, PC-9 /GR κύτταρα επιμολυσμένα με miR -21 αναστολέα να μειώσει miR-21 έκφρασης και στη συνέχεια συν-επιμολυσμένα αυτά τα κύτταρα με ΡΤΕΝ siRNA. Δοκιμάσαμε για πρώτη φορά την επίδραση της PTEN siRNA, έχουμε επιμολυσμένα PC-9 /GR κύτταρα με δύο PTEN siRNAs και αγωνίζομαι siRNA (siSCR). Τόσο η Παγκόσμια Τράπεζα και οι δοκιμασίες qRT-PCR έδειξε ότι siPTEN # 1 θα μπορούσε να μειώσει πρωτεΐνης PTEN (Εικ. S1 Α), και το επίπεδο έκφρασης του mRNA (Εικ. S1B) πιο αποτελεσματικά από 2 siPTEN #. Έτσι επιλέξαμε siPTEN # 1 για να κάνει περαιτέρω πείραμα. Αποτελέσματα qPCR επιβεβαίωσαν ότι miR-21 έκφραση ήταν σημαντικά μειωμένη σε miR 21-αναστολέα επιμολυσμένα κύτταρα σε σύγκριση με τα κύτταρα NC, ** ρ & lt? 0,01 (Εικ. 5Α). CCK-8 δεδομένα προσδιορισμού έδειξαν ότι το miR-21 νοκ ντάουν μειώθηκε σημαντικά η ευαισθησία gefitinib του PC-9 /GR και μειωμένο επίπεδο PTEN έκφραση θα μπορούσε να αποκαταστήσει την ευαισθησία gefitinib του PC-9 /GR ** p & lt? 0,01 (Εικ. 5Β, 5Γ). Yang et al.