Αφηρημένο

Η μεθυλίωση του DNA παίζει σημαντικό ρόλο στην καρκινογένεση και η αναστρεψιμότητα της επιγενετικής τροποποίησης είναι ένας πιθανός θεραπευτικός στόχος κάνει. Μέχρι σήμερα, οι αναστολείς μεθυλτρανσφεράσης DNA (DNMTi) δεν έχουν επιδείξει κλινική αποτελεσματικότητα σε καρκίνο του προστάτη, με ένα από τα σημαντικότερα εμπόδια είναι η αδυναμία να παρακολουθούν τη δραστηριότητα του φαρμάκου κατά τη διάρκεια της δοκιμής. Δεδομένης της υψηλής συχνότητας και εξειδίκευση του

GSTP1

μεθυλίωσης του DNA στον καρκίνο του προστάτη, ερευνήσαμε εάν

GSTP1

είναι ένας χρήσιμος δείκτης της αποτελεσματικότητας της θεραπείας DNMTi. LNCaP καρκίνου του προστάτη κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 5-αζα-2′-δεοξυκυτιδίνη (5-αζα-CDR) είτε με μία μόνο υψηλή δόση (5-20 μΜ), κάθε αναπληρωτή ημέρα (0,1-10 μΜ) ή την ημέρα (0,005 έως 2,5 μΜ). Μια καθημερινή θεραπευτική αγωγή με 5-αζα-CdR ήταν η βέλτιστη, με σημαντική καταστολή του πολλαπλασιασμού των κυττάρων επιτεύχθηκε με δόσεις των 0,05 μΜ ή μεγαλύτερη (ρ & lt? 0.0001) και επαγωγή του κυτταρικού θανάτου από 0,5 μΜ (ρ & lt? 0,0001). Σε αντίθεση, η αγωγή με μία μόνο υψηλή δόση 20 μΜ 5-αζα-CdR ανέστειλε τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων, αλλά δεν ήταν σε θέση να επάγει τον κυτταρικό θάνατο. Η απομεθυλίωση του

GSTP1

παρατηρήθηκε με δόσεις των 5-αζα-CdR που επάγεται σημαντική καταστολή του πολλαπλασιασμού των κυττάρων (≥0.05 μΜ). Re-έκφραση της πρωτεΐνης GSTP1 παρατηρήθηκε μόνο σε δόσεις των 5-αζα-CDR (≥0.5 μΜ) που σχετίζεται με την επαγωγή του κυτταρικού θανάτου. Η επεξεργασία των κυττάρων LNCaP με μια πιο σταθερή DNMTi, Zebularine απαιτούνται τουλάχιστον 100 φορές υψηλότερη δόση (≥50 μΜ) για την αναστολή του πολλαπλασιασμού και ήταν λιγότερο ισχυρή στην επαγωγή κυτταρικού θανάτου, το οποίο αντιστοιχούσε σε έλλειψη GSTP1 πρωτεΐνης επανέκφραση. Δείξαμε ότι

GSTP1

κατάσταση μεθυλίωσης του DNA και η έκφραση πρωτεΐνης συσχετίζεται με ανταπόκριση στη θεραπεία DNMTi σε κύτταρα καρκίνου του προστάτη. Δεδομένου ότι

GSTP1

μεθυλιώνεται σε σχεδόν όλους τους καρκίνους του προστάτη, τα αποτελέσματά μας δικαιολογούν τη δοκιμή της ως δείκτης της απόκρισης επιγενετικών θεραπεία σε μελλοντικές κλινικές δοκιμές. Καταλήγουμε στο συμπέρασμα ότι η κατάσταση μεθυλίωσης του DNA και την έκφραση της πρωτεΐνης του

GSTP1

είναι καλοί δείκτες της αποτελεσματικότητας DNMTi

Παράθεση:. Chiam K, Centenera MM, Butler LM, Tilley WD, Bianco-Miotto T ( 2011) GSTP1 μεθυλίωσης του DNA και έκφραση Κατάσταση είναι ενδεικτική της 5-αζα-2′-δεοξυκυτιδίνη αποτελεσματικότητα σε ανθρώπινα κύτταρα καρκίνου του προστάτη. PLoS ONE 6 (9): e25634. doi: 10.1371 /journal.pone.0025634

Επιμέλεια: Irina Agoulnik, Διεθνές Πανεπιστήμιο της Φλόριντα, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 7 Μάρτη 2011? Αποδεκτές: 8 Σεπτέμβρη του 2011? Δημοσιεύθηκε: 28 Σεπ του 2011

Copyright: © 2011 Chiam et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από επιχορηγήσεις από το Εθνικό Σύστημα Υγείας και του Συμβουλίου Ιατρικής Έρευνας (627.185? WDT, LMB, TBM), το Υπουργείο άμυνας των ΗΠΑ (W81XWH-04-1-0017? WDT, LMB), Καρκίνος Αυστραλία /προστάτη Ίδρυμα Καρκίνου της Αυστραλίας ( 627.229? LMB, WDT), του προστάτη Ίδρυμα Καρκίνου της Αυστραλίας Εξοπλισμός Grant (EG0809? WDT, LMB, TBM), W. Bruce Hall του καρκίνου του Συμβουλίου της Α.Ε. Research Fellowship (ΤΒΜ), και ένα Αντικαρκινικό Συμβούλιο Α.Ε. Senior Research Fellowship (LMB). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Ο καρκίνος του προστάτη είναι ένας από τους πιο συχνά διαγιγνώσκεται αρσενικό καρκίνους στις δυτικές χώρες. Οι τρέχουσες θεραπείες για κλινικά εντοπισμένο νόσου περιλαμβάνουν χειρουργική αφαίρεση του αδένα του προστάτη (προστατεκτομή) και /ή ακτινοθεραπεία με ή χωρίς θεραπεία στέρησης ανδρογόνων (ADT). Από την ανακάλυψη, στη δεκαετία του 1940, ότι ο καρκίνος του προστάτη εξαρτάται από τις ανδρικές ορμόνες του φύλου [1], αρχικώς ευνουχισμός και στη συνέχεια διάφορες μορφές ADT, είτε μόνη της είτε σε συνδυασμό με τον υποδοχέα ανδρογόνων (AR) ανταγωνιστές, ήταν η κύρια θεραπεία για μεταστατικό ασθένεια. Μετά από μια αρχική μεταβλητή διάρκεια της υποχώρησης του όγκου, οι περισσότεροι μεταστατικοί καρκίνοι του προστάτη να εξελιχθεί σε μια «ευνουχισμού ανθεκτικό» στάδιο το οποίο δεν ανταποκρίνεται στην ADT. Επί του παρόντος, υπάρχουν περιορισμένες θεραπευτικές επιλογές διαθέσιμες για ευνουχισμό ανθεκτικό καρκίνο του προστάτη και ως εκ τούτου υπάρχει μια σοβαρή ανάγκη για την ανάπτυξη νέων θεραπειών.

Είναι καθιερωμένη ότι επιγενετικές αλλοιώσεις είναι κοινές εκδηλώσεις στην καρκινογένεση, συμπεριλαμβανομένου του καρκίνου του προστάτη, η οποία μπορεί να οδηγήσει σε παρεκκλίνουσα έκφραση των κρίσιμων γονιδίων όπως καταστολείς όγκων και ογκογονίδια. Σε αντίθεση με τις μεταλλάξεις του DNA, επιγενετικές μεταβολές είναι χημικά αναστρέψιμη με παράγοντες που είναι γνωστό ως επιγενετική αναστολείς και ως εκ τούτου πιθανούς θεραπευτικούς στόχους. Παραδείγματα των επιγενετικών αναστολέων που έχουν δείξει την επιτυχία ως θεραπευτικοί παράγοντες περιλαμβάνουν τους αναστολείς μεθυλτρανσφεράσης DNA (DNMTi), 5-αζα-κυτιδίνης (5-αζα-CR ή Vidaza) και περισσότερο ισχυρές αναλόγου 5-αζα-2′-δεοξυκυτιδίνη του (5- αζα-CdR ή Decitabine). 5-αζα-CR και 5-αζα-CdR είναι νουκλεοσιδίου DNMTi αναπτύχθηκε αρχικά ως χημειοθεραπευτικούς παράγοντες καρκίνου που χρησιμοποιούνται σήμερα για τη θεραπεία της μυελοδυσπλαστικών συνδρόμων (MDS) [2]. Οι δράσεις απομεθυλίωσης του 5-αζα-CR και 5-αζα-CdR βασιστεί στην ικανότητά τους να ενσωματωθούν στο αναδιπλασιαζόμενο DNA και ομοιοπολικά συνδέονται προς το ένζυμο DNMT1 με μη αναστρέψιμο τρόπο, η οποία οδηγεί σε υποβάθμιση της πρωτεΐνης DNMT1 [2], [3]. Όπως DNMT1 απαιτείται για τη διατήρηση του DNA μεθυλίωση κατά την διάρκεια αντιγραφής, η αποικοδόμηση του DNMT1 ακολούθως οδηγεί σε μία απώλεια της μεθυλίωσης του DNA.

Η ανώμαλη έκφραση των επιγενετικών τροποποίησης ενζύμων που εμπλέκονται στη ρύθμιση της μεθυλίωσης του DNA έχει παρατηρηθεί σε όλα τα στάδια εξέλιξης του καρκίνου του προστάτη [4], [5], [6]. Παγκόσμια επιπέδων 5-μεθυλκυτοσίνη και επιγενετικές τροποποιητικά ένζυμα που εμπλέκονται στην μεθυλίωση του DNA (δηλ DNMTs) να προβλέψει την πιθανότητα της εξέλιξης της νόσου στον καρκίνο του προστάτη. Το εύρημα αυτό υποδηλώνει ότι η μεθυλίωση του DNA μπορεί να είναι σημαντική στην πρόοδο του καρκίνου του προστάτη και επομένως DNMTi θα πρέπει να θεωρηθεί ως μια πιθανή θεραπευτική επιλογή [7], [8], [9]. Ενώ

in vitro

πειράματα και ζωικά μοντέλα έχουν δείξει ότι η 5-αζα-CdR έχει δραστηριότητες κατά των όγκων σε αρκετούς καρκίνους συμπεριλαμβανομένου του καρκίνου του προστάτη [10], [11], [12], [13], [14 ], κλινικές δοκιμές 5-αζα-CdR για την θεραπεία των συμπαγών όγκων δεν υπήρξαν επιτυχείς λόγω της σχετίζεται με τα ναρκωτικά ανεπιθύμητες ενέργειες όπως μυελοκαταστολή, ναυτία και έμετο [15], [16], [17]. Εκτός από τα θέματα τοξικότητας, την αποτελεσματικότητα της παράδοσης και η πρόσληψη του 5-αζα-CdR στους ιστούς όγκων, υπάρχει αβεβαιότητα σχετικά με τη βέλτιστη δόση χρονοδιάγραμμα για συγκεκριμένους τύπους όγκων [18]. Μέχρι σήμερα, μόνο μια μικρή μελέτη φάσης ΙΙ με 5-αζα-CdR στον καρκίνο του προστάτη έχει δημοσιευθεί, πριν από περίπου μια δεκαετία [16]. Ενώ υπάρχουν σε εξέλιξη κλινικές δοκιμές για την 5-αζα-CdR σε διάφορους συμπαγείς όγκους, καμία από αυτές τις δοκιμές είναι ειδική για τον καρκίνο ούτε περιλαμβάνουν τον καρκίνο του προστάτη (National Institutes of Health, ΗΠΑ, clinicaltrials.gov).

In vitro

μελέτες που διερευνούν τις επιδράσεις της 5-αζα-CdR σε καρκίνο προστάτη κυτταρικές γραμμές (βλέπε Πίνακα S1) έχουν χρησιμοποιήσει διάφορα καθεστώτα θεραπείας και διαφορετικούς ορισμούς για χαμηλή και υψηλή δόσεις 5-αζα-CdR, καθιστώντας δύσκολη να συγκρίνουν μεταξύ των μελετών και καθορίζουν την βέλτιστη αγωγή θεραπείας, συμπεριλαμβανομένων χρονοδιάγραμμα δόσεων, για τον καρκίνο του προστάτη. Παραδόξως, πολύ λίγα από τα

in vitro μελέτες

(Πίνακας S1A) έχουν ερευνήσει τις επιδράσεις της 5-αζα-CdR επί του πολλαπλασιασμού και την επιβίωση των κυττάρων καρκίνου του προστάτη, αλλά μάλλον έχουν διερευνήσει την επίδραση της 5-αζα- CdR στη γονιδιακή έκφραση, προκειμένου να προσδιοριστούν οι υποψήφιες επιγενετικώς ρυθμιζόμενων γονιδίων (Πίνακας S1B).

Ο σκοπός της παρούσας μελέτης ήταν να διερευνήσει τις δοσο-εξαρτώμενη επιδράσεις της 5-αζα-CdR σε καρκινικά κύτταρα του προστάτη με σκοπό να παρέχοντας τη βάση για την ανάπτυξη ενός βέλτιστου καθεστώς επεξεργασίας 5-αζα-CdR για τον καρκίνο του προστάτη. Διερευνήσαμε επίσης την σχετική τοξικότητα της 5-αζα-CdR και Zebularine σε LNCaP κύτταρα καρκίνου του προστάτη. Zebularine είναι ένα ανάλογο κυτιδίνης που έχει παρόμοιες λειτουργίες σε 5-αζα-CdR ως παράγοντα απομεθυλίωσης, αλλά είναι λιγότερο τοξικό και έχει μια πιο σταθερή ημιζωή (~508 ώρες στους 37 ° C, ρΗ 7) από 5-αζα-CDR ( 12 ώρες στους 37 ° C, ρΗ 7) [19], [20]. Ταυτοποίηση ενός καλού δείκτη της αποτελεσματικότητας DNMTi για κλινικές δοκιμές, σαν την μέτρηση των επιπέδων του PSA στον ορό για την παρακολούθηση της αποτελεσματικότητας των ADT [21], θα έχουν τη δυνατότητα να βοηθήσει την κλινική διαχείριση των ασθενών με καρκίνο του προστάτη που έλαβαν θεραπεία με επιγενετικές θεραπείες. Για τη διερεύνηση της αποτελεσματικότητας της 5-αζα-CdR και Zebularine σε καρκινικά κύτταρα προστάτη, εξετάσαμε μεθυλίωσης του DNA και την κατάσταση έκφρασης του γλουταθειόνη-δ-τρανσφεράσης P1 (

GSTP1

) γονίδιο.

GSTP1

είναι υπερμεθυλίωση σε όλους σχεδόν τους ανθρώπινους καρκίνους του προστάτη και του επιπέδου υποστηρικτής μεθυλίωσης του DNA του είναι σε θέση να διαφοροποιήσει μεταξύ της καλοήθους υπερπλασίας του προστάτη και διαφορετικές ποιότητες του αδενοκαρκινώματος του προστάτη [6], [22], [23], [24] , [25]. Ενώ οι τρέχουσες μελέτες έχουν επικεντρωθεί στη χρήση

GSTP1

ως πιθανό δείκτη για την έγκαιρη διάγνωση του καρκίνου του προστάτη, προτείνουμε ότι η εκτίμηση της μεθυλίωσης του DNA των

GSTP1

περιοχή του υποκινητή, καθώς και την έκφραση των GSTP1 , έχει τη δυνατότητα να είναι ένα χρήσιμο εργαλείο για τον προσδιορισμό της αποτελεσματικότητας DNMTi στον καρκίνο του προστάτη.

Υλικά και Μέθοδοι

η μέτρηση της κυτταρικής βιωσιμότητας

στα ανθρώπινα καρκινικά κύτταρα του προστάτη LNCaP και PC3 ( American Type Culture Collection, ATCC) διατηρήθηκαν σε RPMI 1640 συμπληρωμένο με 5% ή 10% εμβρυϊκό βόειο ορό (FBS). 5-αζα-CDR και Zebularine (Sigma, A3656 και Z4775) διαλύθηκαν σε διμεθυλοσουλφοξείδιο (DMSO) και ρυθμισμένο διάλυμα άλατος του Hank, αντίστοιχα. Για την ενιαία και κάθε εναλλακτική θεραπεία ημέρες με 5-αζα-CdR, τα κύτταρα σπάρθηκαν σε τριπλούν σε πλάκες 24 φρεατίων σε πυκνότητα 2,5 χ 10

4 κύτταρα ανά φρεάτιο σε 1 κ.εκ. RPMI μέσου. Για την καθημερινή θεραπεία 5-αζα-CDR και θεραπεία Zebularine, τα κύτταρα σπάρθηκαν εις τριπλούν σε πλάκες 12 φρεατίων σε πυκνότητα 1 × 10

4 κύτταρα ανά φρεάτιο σε 1 κ.εκ. RPMI μέσου. Τα κύτταρα αφέθηκαν να προσκολληθούν για 241h ή 48 ώρες, μία φορά επιτεύχθηκε κυτταρική συρροή και κατόπιν επωάστηκαν με μέσο που περιέχει 5-αζα-CdR σε συγκεντρώσεις 0-20 μΜ ή Zebularine σε συγκεντρώσεις 50-1000 μΜ. Για τις επόμενες ή πρόσθετες επεξεργασίες, φρέσκο ​​5-αζα-CDR ή Zebularine αραιωμένο σε μέσο προστέθηκαν στα κύτταρα. Τα μέσα που περιέχουν τα αντίστοιχα μέσα παρασκευάστηκαν φρέσκα από 10 mM 5-αζα-CdR και 70 mM Zebularine αποθέματα πριν από κάθε θεραπεία. Τα κύτταρα τρυψινοποιήθηκαν και μετρήθηκαν χρησιμοποιώντας ένα αιμοκυτταρόμετρο στις καθορισμένες χρονικές στιγμές μετά την έναρξη της θεραπείας και η βιωσιμότητα των κυττάρων αξιολογείται με Trypan μπλε χρωστική αποκλεισμού όπως περιγράφηκε προηγουμένως [26]. Τα δεδομένα εκφράζονται ως μέσος όρος +/- SE φρεατίων εις τριπλούν και είναι αντιπροσωπευτικά τουλάχιστον δύο ανεξάρτητα πειράματα.

ανοσοαποτύπωσης

LNCaP κύτταρα σπάρθηκαν σε πλάκες 6-φρεατίων σε πυκνότητα 2 × 10

4 κύτταρα ανά φρεάτιο σε 2 κ.εκ. RPMI μέσο που περιέχει 10% FBS. Τα κύτταρα αφέθηκαν να προσκολληθούν για 24 ώρες πριν από το μέσο αντικαταστάθηκε με μέσο που περιείχε θεραπείες. Τα κύτταρα λύθηκαν με την προσθήκη ρυθμιστικού λύσης ραδιοανοσοκατακρήμνισης δοκιμασίας (10 mM Tris-HCL, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1% Triton Χ-100) που περιέχει μίνι πλήρης σφαιριδίων αναστολέα πρωτεάσης (Roche). Προϊόντα λύσης (15-30 μg) ηλεκτροφορήθηκαν μέσω πηκτωμάτων πολυακρυλαμιδίου 5% ή 12%, μεταφέρθηκαν σε μεμβράνη νιτροκυτταρίνης (Amersham Biosciences), και αποκλείστηκε σε 5% άπαχο γάλα σε σκόνη σε TBS που περιέχει 0,05% Tween20 όλη τη νύκτα. Ανοσοανίχνευση πραγματοποιήθηκε με το ειδικό πρωτογενές αντίσωμα αραιωμένο σε 1% άπαχο γάλα σε σκόνη σε TBS που περιέχει 0,05% Tween20. GSTP1 αντίσωμα (Chemicon, AB8902) χρησιμοποιήθηκε σε αραίωση 1:5000 και ολονύκτια επώαση στους 4 ° C. Hsp90 αντίσωμα (Santa Cruz Biotechnology) χρησιμοποιήθηκε σε αραίωση 1:1000 και 30 λεπτά επώασης σε θερμοκρασία δωματίου. Υπεροξειδάση χράνου-συζευγμένο αντι-κουνελιού δευτερογενές αντίσωμα (ϋΑΚΟ, E0432) χρησιμοποιήθηκε σε αραίωση 1:2000 και 30 λεπτά επώασης σε θερμοκρασία δωματίου. Τα αποτελέσματα απεικονίστηκαν σε Hyperfilm (GE Healthcare) χρησιμοποιώντας βελτιωμένη ανίχνευση χημειοφωταύγειας (GE Healthcare).

μεθυλίωσης του DNA ανάλυση

Μετά την αξιολόγηση βιωσιμότητας των κυττάρων, τα υπόλοιπα κύτταρα LNCaP συλλέχθηκαν για γενωμική εξαγωγή του DNA με τη χρήση TES (10 mM Tris-HCL εις ρΗ 8, 0,1 Μ NaCl, 1 mM EDTA) ρυθμιστικό διάλυμα, πρωτεϊνάση Κ και 20% SDS, όπως περιγράφηκε προηγουμένως [27]. DNA (1-2 μg ανά δείγμα) ήταν όξινο θειώδες τροποποιημένο με την MethylEasy ™ DNA όξινου θειώδους Τροποποίηση Kit (Human Genetic υπογραφές Pty Ltd) σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. Ένα συνολικό όγκο 25 μΙ ή 50 μΙ μείγμα αντίδρασης PCR έγινε με 3-5 μΙ του όξινου θειώδους τροποποιημένου DNA και 2,5 μονάδες HotStarTaq DNA πολυμεράση (Qiagen).

GSTP1

αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης ειδική της μεθυλίωσης (MSP) [28] και σε συνδυασμό Bisulfite Περιορισμός Ανάλυση (COBRA) [29] εκκινητές αγοράστηκαν από GeneWorks (Νότια Αυστραλία, Αυστραλία).

GSTP1

αλληλουχίες εκκινητών MSP ήταν όπως περιγράφεται προηγουμένως [24] και όλες οι αλληλουχίες εκκινητών που χρησιμοποιούνται σε αυτή τη μελέτη παρέχονται στο Σχήμα S1. Οι θερμοκρασίες ανόπτησης για τις αντίστοιχες εκκινητών ήταν: 40 κύκλοι στους 64,3 ° C για μεθυλιωμένο

GSTP1

εκκινητών MSP? 45 κύκλους στους 61,6 ° C για μη μεθυλιωμένα

GSTP1

MSP εκκινητών? 45 κύκλους στους 56,8 ° C για

GSTP1

COBRA εκκινητές. Τα προϊόντα PCR από το

GSTP1

αναλύσεις COBRA υπέστησαν πέψη με ένζυμα περιορισμού BstUI και HhaI (New England BioLabs). PCR προϊόντα έγιναν ορατά με ηλεκτροφόρηση πηκτής αγαρόζης με το σύστημα τεκμηρίωσης γέλης AlphaImager 2200 (San Leandro).

Στατιστική ανάλυση

Η μονόδρομη ανάλυση διακύμανσης (ANOVA) με μια post-hoc Dunnet πολλαπλές του συγκριτική δοκιμή χρησιμοποιήθηκε για τη σύγκριση της βιωσιμότητας των κυττάρων μεταξύ των θεραπειών και τον έλεγχο του οχήματος όταν αξιολογήθηκε ένα ενιαίο χρονικό σημείο. Αμφίδρομη ANOVA με post-hoc τεστ Bonferroni για να συγκριθούν η κυτταρική βιωσιμότητα μεταξύ των θεραπειών και τον έλεγχο του οχήματος όταν αξιολογήθηκαν πολλαπλά χρονικά σημεία. Οι αναλύσεις πραγματοποιήθηκαν με το λογισμικό GraphPad Prism 5 (GraphPad Software, Inc., Καλιφόρνια ΗΠΑ) και η στατιστική σημαντικότητα ορίστηκε στο p & lt?. 0.05 (δύο όψεων)

Αποτελέσματα

Καθημερινή 5- θεραπεία αζα-CdR απαιτείται για να προκληθεί η βέλτιστη αναστολή του πολλαπλασιασμού και την επαγωγή του κυτταρικού θανάτου σε καρκινικά κύτταρα LNCaP του προστάτη

για να διερευνηθεί η αποτελεσματικότητα των διαφορετικών προγραμμάτων 5-αζα-CdR θεραπεία, πραγματοποιήσαμε προσδιορισμούς κυτταρικού πολλαπλασιασμού και βιωσιμότητας σχετικά LNCaP κυττάρων καρκίνου του προστάτη και σε σύγκριση τα παρακάτω: μία μόνη αγωγή, εναλλακτική θεραπείες ημέρας και καθημερινά θεραπείες. Σε σύγκριση με το μάρτυρα (όχημα), ένα και μόνο θεραπεία της 5-αζα-CdR αποτελεσματικά κατέστειλε τον πολλαπλασιασμό των καρκινικών κυττάρων LNCaP του προστάτη σε όλες τις συγκεντρώσεις που χρησιμοποιήθηκαν (5-20 μΜ) (Εικόνα 1Α, Ημέρα 4: p & lt? 0,001 για 5 μΜ και ρ & lt ? 0,0001 για 10, 20 μΜ, Ημέρα 6: ρ & lt? 0,0001 για όλες τις δόσεις), αλλά δεν προκάλεσε σημαντική κυτταρικό θάνατο 6 ημέρες μετά την κατεργασία (Σχήμα 1Β). Όταν 5-αζα-CdR προστέθηκε κάθε δεύτερη μέρα (αναπληρωματικό θεραπεία ημέρα), χαμηλότερες δόσεις από 5-αζα-CDR (0,1, 0,5 και 2,5 μΜ) σε σύγκριση με δόσεις που χρησιμοποιούνται στο πρόγραμμα μόνο θεραπεία οδήγησε σε σημαντική δοσο-εξαρτώμενη αναστολή του κυτταρικού πολλαπλασιασμού όταν συγκρίνονται με LNCaP κύτταρα κατεργασμένα όχημα (Σχήμα 1 C, Ημέρα 4 και 6: ρ & lt? 0,0001 για όλες τις δόσεις). Μόνο δόσεις 5-αζα-CdR 2.5 μΜ ή μεγαλύτερη επάγεται σημαντική κυτταρικό θάνατο, σε σύγκριση με εκείνη των κυττάρων που έλαβαν φορέα (Σχήμα 1D, Ημέρα 6: ρ & lt? 0,001 για 2,5 μΜ και ρ & lt? 0,0001 για 10 μΜ). Σε αντίθεση, η καθημερινή αγωγή της 5-αζα-CdR επιτευχθεί σημαντική αναστολή του πολλαπλασιασμού σε χαμηλότερες συγκεντρώσεις (0,05 μΜ) (Σχήμα 2Α, Ημέρα 6: ρ & lt? 0.05 για 0.05 μΜ, ρ & lt? 0,001 για όλες τις δόσεις 0,5 μΜ ή μεγαλύτερο, Ημέρα 8 : p & lt? 0.05 για 0.01 μΜ και ρ & lt? 0,001 για όλες τις δόσεις 0,05 μΜ ή μεγαλύτερο) και την αύξηση του κυτταρικού θανάτου σε κύτταρα LNCaP (Σχήμα 2Β, Ημέρα 8: ρ & lt? 0,001 για δόσεις 0,5 μΜ ή μεγαλύτερο) σε σύγκριση με παρόμοια δόσεις που χορηγούνται κάθε δεύτερη ημέρα. Η δοσοεξαρτώμενη αναστολή του πολλαπλασιασμού επιτεύχθηκε με 5-αζα-CdR ημερήσιες δόσεις των 0,05 μΜ ή μεγαλύτερη με αποτέλεσμα τη μείωση 62% του αριθμού των κυττάρων σε σύγκριση με τα κύτταρα που κατεργάστηκαν όχημα και πλήρη αναστολή του πολλαπλασιασμού σε δόσεις από 0,5 μΜ ή μεγαλύτερη (Εικόνα 2Α και 2Ε, σ & lt? 0,0001). Στις δόσεις που προκάλεσαν πλήρη αναστολή του πολλαπλασιασμού, υπήρχε επίσης σημαντική αύξηση σε κυτταρικό θάνατο, από περίπου 3-φορές, σε σύγκριση με τον έλεγχο οχήματος (Σχήμα 2Β και 2F, ρ & lt? 0,0001).

LNCaP του προστάτη καρκινικά κύτταρα (2.5 × 10

4 κύτταρα ανά φρεάτιο σε πλάκες 24 φρεατίων) υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με αυξανόμενες δόσεις 5-αζα-CDR (5-20 μΜ) χορηγήθηκε (Α-Β) μία φορά την ημέρα 0 ή (C- Δ) με αυξανόμενες δόσεις 5-αζα-CDR (0.1-10 μΜ) αναπληρώνονται σε εναλλασσόμενες ημέρες για έως 6 ημέρες. (Α) και τα κύτταρα (C) μετρήθηκαν σε τακτά χρονικά διαστήματα χρησιμοποιώντας αιμοκυτόμετρο και ο αριθμός των βιώσιμων κυττάρων αξιολογήθηκε με Trypan blue χρωστικής αποκλεισμό. (Β) και (Δ) ο αριθμός των νεκρών κυττάρων εκφράζεται ως ποσοστό του συνολικού αριθμού των κυττάρων που μετρήθηκαν. Τα δεδομένα σε κάθε χρονικό σημείο αντιπροσωπεύει το μέσο όρο +/- SE φρεατίων εις τριπλούν. * Αμφίδρομη ANOVA: ρ & lt? 0,0001 για το (Α), (Γ) και (Δ) (10 μΜ)? ρ & lt?. 0.001 για το (D) (2.5 μΜ) σε σύγκριση με τον έλεγχο οχήματος (veh) την τελευταία ημέρα της θεραπείας

Η καρκινικά κύτταρα

(Α-Β) LNCaP και (C-D) PC3 προστάτη (1 × 10

4 κύτταρα ανά φρεάτιο σε πλάκες 12 φρεατίων) υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με αυξανόμενες δόσεις 5-αζα-CDR (0,005 έως 2,5 μΜ) ανανεώνονται καθημερινά για έως και 8 ημέρες. (Α) και τα κύτταρα (C) μετρήθηκαν σε τακτά χρονικά διαστήματα χρησιμοποιώντας αιμοκυτόμετρο και ο αριθμός των βιώσιμων κυττάρων αξιολογήθηκε με Trypan blue χρωστικής αποκλεισμό. (Β) και (Δ) ο αριθμός των νεκρών κυττάρων εκφράζεται ως ποσοστό του συνολικού αριθμού των κυττάρων που μετρήθηκαν. (Ε) και (F) σε σχέση κυτταρικής βιωσιμότητας ακόλουθες 6 ή 8 ημέρες θεραπείας με 5-αζα-CdR παρουσιάστηκε ως το ποσοστό των βιώσιμων κυττάρων σε σύγκριση με το έκδοχο ελέγχου (veh) και η σχετική κυτταρικό θάνατο ως πολλαπλάσια του τοις εκατό των νεκρών κυττάρων σε σύγκριση με τον έλεγχο VEH. Τα δεδομένα σε κάθε χρονικό σημείο αντιπροσωπεύει το μέσο όρο +/- SE φρεατίων εις τριπλούν από δύο τουλάχιστον πειραμάτων. * Αμφίδρομη ANOVA: ρ & lt? 0,05 για το (Α) (0.01 μΜ)? ρ & lt? 0,001 για (Α) (0,05-2,5 μΜ), (Β) και (Δ) (0,5 μΜ)? ρ & lt? 0,0001 για το (C) και (D) (1, 2,5 μΜ) σε σύγκριση με τον έλεγχο οχήματος (veh) την τελευταία ημέρα της θεραπείας

Η

Επιδράσεις της 5-αζα-CDR σε καρκίνο του προστάτη. η βιωσιμότητα των κυττάρων είναι ανεξάρτητο από το AR

για να προσδιοριστεί εάν τα αποτελέσματα της 5-αζα-CdR σε κύτταρα LNCaP ήταν εξαρτάται από ένα λειτουργικό AR, ένα καθημερινό πρόγραμμα θεραπείας, εκτελέστηκε επίσης σε κύτταρα PC3, τα οποία στερούνται μία λειτουργική AR. Όταν υποβλήθηκε σε επεξεργασία με 5-αζα-CdR σε δόσεις των 0,005 έως 2,5 μΜ, υπήρχε μια παρόμοια εξαρτώμενη από την δόση αναστολή του πολλαπλασιασμού και την επαγωγή του κυτταρικού θανάτου σε κύτταρα PC3 όπως υπήρχε στα κύτταρα LNCaP (Σχήμα 2Α-D). Ότι μια κατά προσέγγιση 3-πλάσια επαγωγή του κυτταρικού θανάτου παρατηρήθηκε με 0,5 μΜ 5-αζα-CdR στις δύο κυτταρικές σειρές (Σχήμα 2F), στα κύτταρα PC3, χαμηλότερες δόσεις από 5-αζα-CDR (0.005 μΜ και 0.01 μΜ) οδήγησε σε μια σημαντική μείωση του αριθμού των κυττάρων (ρ & lt? 0,0001, Σχήμα 2Ε), και αυτό συνέβη σε προγενέστερο χρονικό σημείο (4 ημέρες) σε σύγκριση με τα κύτταρα LNCaP (6 ημέρες) έχουν το ίδιο καθεστώς (Σχήμα 2Α και 2C). Από τις 5-αζα-CdR βασίζεται σε διαιρούμενα κύτταρα για ενσωμάτωση για την πρόκληση αποτελεσμάτων του, η χρονική διαφορά μεταξύ των κυτταρικών γραμμών 2 διπλασιασμού περίπου 24 ώρες, σε κύτταρα PC3 σε σύγκριση με 48 ώρες στα κύτταρα LNCaP, μπορεί να εξηγήσει την αυξημένη ισχύ των 5 αζα-CdR στη βιωσιμότητα PC3 κυττάρων. Το ανδρογόνο ανεξάρτητη αναστολή του πολλαπλασιασμού και την επαγωγή του κυτταρικού θανάτου από την 5-αζα-CdR σε καρκινικά κύτταρα του προστάτη επιβεβαιώθηκε περαιτέρω με προσδιορισμούς κυτταρικής βιωσιμότητας εκτελούνται σε LNCaP κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε στεροειδή εξαντλημένο μέσο (Εικόνα S2).

η παρατεταμένη αποτελέσματα 5-αζα-CdR μεταχείριση σε παρόμοιες κυτταρικό θάνατο, ανεξάρτητα από το καθεστώς θεραπείας

Για να χαρακτηριστούν περαιτέρω οι διαφορές μεταξύ του αναπληρωτή ημέρα και την καθημερινή θεραπευτική αγωγή, η υψηλότερη εναλλακτική θεραπεία ημέρας (10 μΜ) και η υψηλότερη ημερήσια θεραπεία (2,5 μΜ) συγκρίθηκαν σε μία εκτεταμένη καμπύλη ανάπτυξης (Σχήμα 3). LNCaP καρκίνου του προστάτη κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με έκδοχο ελέγχου ή 5-αζα-CdR αναπληρώνονται σε εναλλασσόμενες ημέρες ή ημερησίως, όπως παραπάνω. Η βιωσιμότητα των κυττάρων και θάνατο των κυττάρων εκτιμήθηκαν μετά από 6 ημέρες θεραπείας. Μία ομάδα κυττάρων τότε συνέχισε να λαμβάνει 5-αζα-CdR αναπληρώνονται σε εναλλασσόμενες ημέρες ή καθημερινά μέχρι την ημέρα 12 (συμβολίζεται ως 10 μΜ-12d ή 2,5 μΜ-12d? Σχήμα 3), ενώ το άλλο σετ των κυττάρων έλαβε μέσων που περιέχουν τον έλεγχο του οχήματος ( συμβολίζεται ως 10 μΜ-6d ή 2,5 μΜ-6d? Σχήμα 3). Μετά από 6 ημέρες θεραπείας, τόσο η εναλλακτική ημέρες και τα καθεστώτα καθημερινή θεραπεία επαγόμενη καταστολή της ανάπτυξης σε σύγκριση με τον έλεγχο του οχήματος, αλλά μόνο η καθημερινή αγωγή είχε ως αποτέλεσμα τον κυτταρικό θάνατο (Εικόνα 3). Καθώς τα κύτταρα ελέγχου είχαν φθάσει σε συρροή την ημέρα 6, τα κύτταρα αυτά αποκλείστηκαν για το υπόλοιπο του πειράματος. Με τη συνέχιση της θεραπείας σε κάθε καθεστώς το ποσό του κυτταρικού θανάτου συνέχισε να αυξάνεται για τις 12 ημέρες, φθάνοντας το 61,4% για την εναλλακτική θεραπεία ημέρα και 68.6% για την καθημερινή θεραπεία. Είναι ενδιαφέρον ότι, τα κύτταρα που έλαβαν αγωγή μόνο για 6 ημέρες, που έδειξαν ισοδύναμα επίπεδα κυτταρικού θανάτου σε εκείνους που έλαβαν θεραπεία για 12 ημέρες (Σχήμα 3).

(Α) και (Γ) LNCaP κύτταρα καρκίνου προστάτη (2.5 × 10

4 κύτταρα ανά φρεάτιο σε πλάκες 24 φρεατίων) κατεργάστηκαν με 10 μΜ 5-αζα-CDR ή ελέγχου του οχήματος, αναπληρώνονται σε εναλλασσόμενες ημέρες. (Β) και (Δ) του καρκίνου του προστάτη LNCaP κύτταρα (1 χ 10

4 κύτταρα ανά φρεάτιο σε πλάκες 12 φρεατίων) υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 2,5 μΜ 5-αζα-CDR ή όχημα ελέγχου, ανανεώνονται καθημερινά. Μετά 6 ημέρες θεραπείας, τα κύτταρα ελέγχου σκεπάστηκαν και τα υπόλοιπα κύτταρα είτε συνέχισε να λαμβάνει 5-αζα-CDR (10 μΜ-12d ή 2,5 μΜ-12d, αντίστοιχα) ή έλαβαν φρέσκο ​​μέσο που περιέχει φορέα (10 μΜ-6d ή 2.5 μΜ -6d). (Α) και τα κύτταρα (C) μετρήθηκαν κατά την ημέρα 6, 8 και 12 χρησιμοποιώντας ένα αιμοκυτταρόμετρο και ο αριθμός των βιώσιμων κυττάρων αξιολογήθηκε με Trypan blue χρωστικής αποκλεισμό. (Β) και (Δ) ο αριθμός των νεκρών κυττάρων εκφράζεται ως ποσοστό του συνολικού αριθμού των κυττάρων που μετρήθηκαν.

Η

GSTP1

κατάσταση προαγωγέα DNA μεθυλίωσης και πρωτεΐνη επανέκφραση ως δείκτες της 5-αζα-CdR αποτελεσματικότητα

για να διερευνήσουν πώς οι αντι-πολλαπλασιαστικές επιδράσεις της 5-αζα-CdR αφορούν απομεθυλιωτικής δραστηριότητά του, MSP διεξήχθη για να εκτιμήσει την κατάσταση μεθυλίωσης του DNA των

GSTP1

προαγωγό (Σχήμα 4Α). Υπερμεθυλίωση

GSTP1

υποστηρικτής του DNA ήταν παρών στα κύτταρα LNCaP αντιμετωπίζονται με τον έλεγχο του οχήματος. Σε αντίθεση, μη μεθυλιωμένες

GSTP1

προαγωγέα DNA ανιχνεύθηκε σε κύτταρα LNCaP αγωγή ημερησίως με 0.05 μΜ ή μεγαλύτερη 5-αζα-CdR, αλλά εντελώς απομεθυλιώνεται

GSTP1

υποκινητή ΟΝΑ δεν παρατηρήθηκε με ακόμα υψηλότερο συγκέντρωση της 5-αζα-CDR. Η απομεθυλίωση του

GSTP1

προαγωγό από την 5-αζα-CdR σε δόσεις μεγάλη από ή ίσο με 0,05 μΜ συνέπεσε με την ικανότητα του 5-αζα-CDR να αναστέλλουν ουσιαστικά τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων σε αυτές τις συγκεντρώσεις (Σχήμα 2Α-Β) .

DNA και πρωτεΐνες εκχυλίστηκαν από κύτταρα LNCaP σε επεξεργασία με αυξανόμενες δόσεις 5-αζα-CDR (0,005 έως 2,5 μΜ). Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε αγωγή καθημερινά και DNA και πρωτεϊνών που συγκομίζονται μετά από 6 ημέρες θεραπείας. (Α) MSP πραγματοποιήθηκε σε όξινο θειώδες-τροποποιημένο DNA με εκκινητές που στοχεύουν όξινο θειώδες τροποποιημένου μεθυλιωμένου

GSTP1

υποστηρικτής ή μη μεθυλιωμένα

GSTP1

υποκινητή. (Β-Ο) η σχετική κατάσταση μεθυλίωσης του υποκινητή GSTP1 ακόλουθες 5-αζα-CdR θεραπεία αξιολογήθηκε περαιτέρω με COBRA χρήση δύο ενζύμων περιορισμού, BstUI και HhaI. MDA-MB-231 κύτταρα καρκίνου του μαστού, χρησιμοποιήθηκαν ως έλεγχος για μη-μεθυλιωμένο

GSTP1

υποκινητή. (D) Ανοσοστύπωμα έγινε για να αναλυθεί έκφραση πρωτεΐνης GSTP1. Ανίχνευση της Hsp90 χρησιμοποιήθηκε ως μάρτυρας φόρτωσης.

Η

Για να εξεταστεί περαιτέρω η σχετική κατάσταση μεθυλίωσης του DNA των

GSTP1

υποκινητή στην 5-αζα-CdR αντιμετωπίζονται LNCaP κύτταρα, COBRA ήταν πραγματοποιήθηκε με τη χρήση BstUI και ένζυμα περιορισμού HhaI (Σχήμα 4Β-C). Η μη μεθυλιωμένη

GSTP1

παρούσα προαγωγό σε MDA-MB-231 κύτταρα καρκίνου του μαστού δεν ήταν σε πέψη με BstUI ή HhaI (Σχήμα 4Β). Σε συμφωνία με τα αποτελέσματα MSP, μεθυλιωμένη

GSTP1

υποκινητή ανιχνεύθηκε σε αγωγή με φορέα (έλεγχος) και 5-αζα-CdR κατεργασμένων κυττάρων LNCaP σε δόσεις 0,005-0,5 μΜ. Σημαντική

GSTP1

προαγωγέα DNA απομεθυλίωση παρατηρήθηκε μόνο σε απόκριση προς 0.5 μΜ 5-αζα-CdR, η οποία είναι η χαμηλότερη 5-αζα-CdR δόση επαρκής για να προκαλέσει πλήρη αναστολή του πολλαπλασιασμού των LNCaP κυττάρων και θάνατο των κυττάρων αποδείχθηκε σε ο προσδιορισμούς κυτταρικής βιωσιμότητας (Σχήμα 2Α-Β). Αυτά τα ευρήματα υποδηλώνουν ότι η αποτελεσματικότητα του 0,5 μΜ 5-αζα-CdR οφείλεται στην ικανότητά του να επάγει μεγαλύτερη DNA απομεθυλίωση

GSTP1

σε σύγκριση με χαμηλότερες δόσεις.

Η μεγαλύτερη απομεθυλίωσης επίδραση του 0,5 μΜ σε σύγκριση με 0,05 μΜ 5-αζα-CdR αντιστοιχεί με πρωτεΐνη GSTP1 επανέκφραση παρατηρήθηκε σε 0,5 μΜ 5-αζα-CDR ή μεγαλύτερη (Εικόνα 4D). Σε συμφωνία με αυτό, οι δόσεις 5-αζα-CdR που οδηγούν σε επανέκφραση του GSTP1 πρωτεΐνης επάγουν επίσης σημαντικές κυτταρικό θάνατο σε κύτταρα LNCaP (Σχήμα 2Β και 2F).

Zebularine αναστέλλει τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων καρκίνου του προστάτη αλλά δεν έχει περιορισμένα αποτελέσματα επί του κυτταρικού θανάτου

LNCaP κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με Zebularine (0-1000 μΜ? υψηλότερη δόση που χρησιμοποιήθηκε σε προηγούμενες μελέτες [30]), ενώ τα κύτταρα PC3 υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με δόσεις Zebularine μέχρι 400 μΜ. Zebularine δόθηκε την ημέρα 0 και αναπληρώνονται πάλι στα μισά της περιόδου θεραπείας. Zebularine προκάλεσε μια δοσο-εξαρτώμενη αναστολή του πολλαπλασιασμού σε αμφότερα LNCaP και PC3 κύτταρα καρκίνου του προστάτη (Σχήμα 5Α και 5C, ρ & lt? 0,0001), υποδεικνύοντας ότι Zebularine έχει παρόμοια AR-ανεξάρτητου μηχανισμού αναστολής της ανάπτυξης δράσης σε καρκινικά κύτταρα του προστάτη ως 5-αζα -CdR. Μια σημαντική μείωση του αριθμού των βιώσιμων κυττάρων παρατηρήθηκε με 100 έως 200 μΜ Zebularine, και πλήρη αναστολή του πολλαπλασιασμού των κυττάρων παρατηρήθηκε στα 400 μΜ ή μεγαλύτερη σε αμφότερα LNCaP και PC3 κύτταρα (Σχήμα 5Α και 5C, ρ & lt? 0,0001). Ενώ Zebularine απέτυχε να επάγει κυτταρικό θάνατο σε οποιαδήποτε δόση σε κύτταρα LNCaP (Σχήμα 5Β), σημαντική κυτταρικός θάνατος προκλήθηκε με 400 μΜ Zebularine σε κύτταρα PC3 (Εικόνα 5D, p = 0,0004).

(ΑΒ) LNCaP και (C-D) του καρκίνου του προστάτη PC3 κύτταρα (1 χ 10

4 κύτταρα ανά φρεάτιο σε πλάκες 12 φρεατίων) υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με αυξανόμενες δόσεις Zebularine (0-400 μΜ, έως 1000 μΜ για τα κύτταρα LNCaP) αναπληρώνονται μία φορά επί 4η ημέρα για μια περίοδο 6 ημερών για τα κύτταρα PC3, και 8 ημέρες για τα κύτταρα LNCaP. (Α) και τα κύτταρα (C) μετρήθηκαν σε τακτά χρονικά διαστήματα χρησιμοποιώντας αιμοκυτόμετρο και η βιωσιμότητα κυττάρου αξιολογήθηκε με Trypan blue χρωστικής αποκλεισμό. (Β) και (Δ) ο αριθμός των νεκρών κυττάρων εκφράζεται ως ποσοστό του συνολικού αριθμού των κυττάρων που μετρήθηκαν. Τα δεδομένα σε κάθε χρονικό σημείο αντιπροσωπεύει το μέσο όρο +/- SE φρεατίων εις τριπλούν. * One-way ANOVA? ρ & lt? 0,0001 για το (Α) και (C)? ρ = 0,0004 για το (D) σε σύγκριση με τον έλεγχο οχήματος (veh).

Η

Zebularine έχει ασθενέστερη δράσεις απομεθυλίωσης στο

GSTP1

υποκινητή σε σύγκριση με 5-αζα-CdR

για να διερευνηθεί η δραστηριότητα του απομεθυλίωσης Zebularine, MSP εκτελέστηκε για να εξετάσει την κατάσταση μεθυλίωσης του DNA του

GSTP1

υποκινητή σε κύτταρα LNCaP (Σχήμα 6Α). Μετά από 8 ημέρες θεραπείας, μεθυλιωμένο

GSTP1

ήταν παρόν στον έλεγχο του οχήματος και όλες Zebularine επεξεργασμένα δείγματα (0-400 μΜ), ενώ η απομεθυλίωση του

GSTP1

υποκινητή έλειπε εξάρτηση από τη δόση (Σχήμα 6Α). Όταν η σχετική κατάσταση μεθυλίωσης του DNA των

GSTP1

περιοχή του υποκινητή σε αυτές τις Zebularine επεξεργασμένα LNCaP κύτταρα σε σύγκριση με COBRA χρησιμοποιώντας BstUI και την πέψη ενζύμου περιορισμού HhaI, καμία μη μεθυλιωμένα

GSTP1

ανιχνεύθηκε (Εικόνα 6Β ). Τα αδύναμα και αντιφατική ενέργειες απομεθυλίωσης της Zebularine στα κύτταρα LNCaP αντανακλάται επίσης στην έλλειψη GSTP1 πρωτεΐνης εκ νέου έκφραση μετά από 8 ημέρες θεραπείας (Σχήμα 6C).

DNA και πρωτεΐνες που προέρχονται από τα κύτταρα LNCaP μετά από 8 ημέρες της θεραπείας με αυξανόμενες δόσεις Zebularine (0-400 μΜ). (Α) DNA ήταν όξινο θειώδες τροποποιηθεί και MSP εκτελέστηκε με εκκινητές που στοχεύουν όξινο θειώδες τροποποιημένου μεθυλιωμένου

GSTP1

ή μη μεθυλιωμένα

GSTP1

. (Β) Η σχετική κατάσταση μεθυλίωσης του DNA του

GSTP1

προαγωγού μετά τη θεραπεία Zebularine εκτιμήθηκε με COBRA χρησιμοποιώντας δύο ένζυμα περιορισμού, BstUI ή HhaI. (Γ) Ανοσοστύπωμα έγινε για να αναλυθεί έκφραση πρωτεΐνης GSTP1 σε LNCaP κύτταρα μετά από 8 ημέρες θεραπείας Zebularine. Οι πρωτεΐνες εκχυλίστηκαν από κύτταρα LNCaP σε επεξεργασία με αυξανόμενες δόσεις Zebularine (0-400 μΜ). PC3 κύτταρα εκφράζουν ενδογενή πρωτεΐνη GSTP1 και χρησιμοποιήθηκαν ως θετικός έλεγχος.

Η

Συζήτηση

Ενώ η DNMTi 5-αζα-CdR είναι αποτελεσματική στη θεραπεία των συνθηκών αιματολογικών, κλινικές δοκιμές σε στερεά όγκους και στον καρκίνο του προστάτη έχουν δείξει περιορισμένη ή καθόλου αποτελεσματικότητα. Η αποτυχία των προηγούμενων κλινικών δοκιμών σε συμπαγείς όγκους, έχει αποδοθεί σε σχήματα ακατάλληλη δόση, που οδηγεί σε τοξικότητα που σχετίζονται με ανεπιθύμητες ενέργειες. Εν μέρει, αυτό οφείλεται στην κακή κατανόηση των μηχανιστικών δράσεις του 5-αζα-CdR σε συμπαγείς όγκους. Σε αυτή τη μελέτη, δείχνουμε ότι η 5-αζα-CdR, σε δόση 0,5 μΜ δίνεται καθημερινά, παρεμπόδισε πλήρως τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων και επαγόμενη από κυτταρικό θάνατο σε καρκινικά κύτταρα προστάτη, και συνδέθηκε με απομεθυλίωση του

GSTP1

υποκινητή και επανέκφραση του GSTP1 πρωτεΐνης. Τα ευρήματα αυτά υποδηλώνουν ότι η ημερήσια χαμηλή δόση θεραπευτική αγωγή 5-αζα-CDR μπορεί να είναι πιο αποτελεσματική από ό, τι ένα λιγότερο συχνό ή μονά πρόγραμμα υψηλής δόσης για τον έλεγχο της ανάπτυξης καρκίνου του προστάτη κυττάρων. Έχουμε αποδείξει επίσης ότι η ημερήσια χαμηλή δόση θεραπευτική αγωγή 5-αζα-CdR είναι πιο αποτελεσματική από μία χρησιμοποιώντας το πιο σταθερό DNMTi, Zebularine. Το πιο σημαντικό, παρέχουμε απόδειξη ότι η αυξημένη δραστικότητα της 5-αζα-CdR σύγκριση με Zebularine σε καρκινικά κύτταρα του προστάτη συνδέεται στενά με απομεθυλίωσης δραστηριότητα της και προσδιορίζονται

GSTP1

ως ένα εν δυνάμει χρήσιμο βιοδείκτη για την αξιολόγηση της αποτελεσματικότητας DNMTi σε προστάτη του καρκίνου.

Αρκετές μελέτες έχουν δείξει ότι η 5-αζα-CdR μειώνει τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων και επάγει την εκ νέου έκφραση ειδικών γονιδίων σε διάφορους καρκίνους (Πίνακας S1). Διαφορετικοί τύποι του καρκίνου ανταποκριθεί σε 5-αζα-CdR διαφορετικά, αλλά ένα ευρύ φάσμα δόσεων 5-αζα-CDR και θεραπευτικά σχήματα έχουν χρησιμοποιηθεί σε προηγούμενες μελέτες, και τα τελικά σημεία και ανάλυση ήταν διαφορετικές στις διάφορες μελέτες. Εννέα δημοσιευμένες μελέτες έχουν διερευνήσει τις επιδράσεις της 5-αζα-CdR για τη βιωσιμότητα του καρκίνου του προστάτη κυτταρικών γραμμών (Πίνακας S1A) [10], [11], [31], [32], [33], [34], [ ,,,0],35], [36], [37]. Συγκρίσεις μεταξύ των μελετών αυτών είναι δύσκολη λόγω των λόγων που αναφέρθηκαν παραπάνω. Για παράδειγμα, Walton et al [11] ανέφεραν περίπου 30% αναστολή του πολλαπλασιασμού των κυττάρων σε σύγκριση με τον έλεγχο του οχήματος στα καρκινικά LNCaP κύτταρα του προστάτη μετά από θεραπεία με 8,8 μΜ 5-αζα-CdR, ενώ Pulukuri et al [10] ανέφεραν 70% αναστολή της κυτταρικού πολλαπλασιασμού συγκριτικά με τον έλεγχο του οχήματος με την ίδια κυτταρική σειρά με μια υψηλή δόση των 10 μΜ θεραπεία 5-αζα-CDR.