Αφηρημένο

Το ραβδομυοσάρκωμα είναι η πιο συχνή σάρκωμα μαλακών ιστών σε παιδιά και εφήβους, με υψηλό ποσοστό υποτροπής που επηρεάζει δραματικά την κλινική έκβαση. Πολυπρακτορικά χημειοθεραπεία, σε συνδυασμό με χειρουργική επέμβαση και /ή θεραπεία με ακτινοβολία, είναι η θεραπεία επιλογής. Ωστόσο, το ποσοστό υποτροπής είναι απογοητευτικά υψηλό και ταυτοποίηση νέων θεραπευτικών εργαλείων χρειάζεται επειγόντως. Σύμφωνα με την άποψη αυτή, η επιλεκτική μπλοκ των βασικών χαρακτηριστικών των καρκινικών βλαστικών κυττάρων (CSC) φαίνεται ιδιαίτερα ελπιδοφόρα. Σε αυτή τη μελέτη, απομονώσαμε ραβδομυοσάρκωμα CSC με χαρακτηριστικά στέλεχος-όπως (υψηλή έκφραση του Nanog και OCT3 /4, ικανότητα αυτο-ανανέωσης, πολυδυναμικότητα). Ραβδομυοσάρκωμα CSC έδειξαν υψηλότερη ικανότητα επεμβατική και μειωμένη κυτταροτοξικότητα σε δοξορουβικίνη σε σύγκριση με την φυσική κύτταρα, μέσω ενός μηχανισμού που δεν σχετίζονται με τη διαδικασία της κλασικής αντίσταση σε πολλά φάρμακα. Αυτό ήταν εξαρτώμενη σε ένα υψηλό επίπεδο του λυσοσώματος οξύτητας που προκαλείται από μια υψηλή έκφραση του vacuolar ΑΤΡάσης (V-ΑΤΡάση). Δεδομένου ότι δεν συσχετίστηκε με άλλους παιδιατρικούς καρκίνους, όπως σάρκωμα και νευροβλάστωμα του Ewing, V-ΑΤΡάση υψηλότερη έκφραση σε CSC ήταν ραβδομυοσάρκωμα συγκεκριμένο. Αναστολή της λυσοσωματικής αύξηση της οξύτητας με τον V-ΑΤΡάσης ομεπραζόλη, ή από ειδικές σίγηση siRNA, ενισχύεται σημαντικά η δοξορουβικίνη κυτταροτοξικότητας. Απροσδόκητα, η στόχευση λυσοσωμική μπλοκάρει επίσης την ανάπτυξη των κυττάρων και μείωσε την επιθετική πιθανότητα του ραβδομυοσαρκώματος CSC, ακόμη και σε πολύ χαμηλές δόσεις ομεπραζόλης (10 και 50 μΜ, αντίστοιχα). Με βάση αυτές τις παρατηρήσεις, προτείνουμε λυσόσωμα οξύτητα ως ένα πολύτιμο στόχο την ενίσχυση χημειοευαισθησία του ραβδομυοσαρκώματος CSC, και προτείνουν τη χρήση παραγόντων αντι-V-ΑΤΡάση σε συνδυασμό με πρότυπα σχήματα ως μια πολλά υποσχόμενη εργαλείο για την εξάλειψη της ελάχιστης υπολειμματικής νόσου ή την πρόληψη της μεταστατικής νόσου

Παράθεση:. Salerno M, Avnet S, Bonuccelli G, Hosogi S, D Granchi, Baldini Ν (2014) Απομείωση Αξίας Λυσοσωμική δραστηριότητα ως Θεραπευτική Μονάδα για στόχευση καρκινικά βλαστικά κύτταρα από εμβρυϊκό ραβδομυοσάρκωμα Κυτταρικής γραμμής RD . PLoS ONE 9 (10): e110340. doi: 10.1371 /journal.pone.0110340

Επιμέλεια: Adriano Angelucci, Πανεπιστήμιο της Λ ‘Άκουιλα, Ιταλία

Ελήφθη: 2 του Μαΐου του 2014? Αποδεκτές: 21 Σεπτεμβρίου του 2014? Δημοσιεύθηκε: 20 Οκτώβρη του 2014

Copyright: © 2014 Salerno et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Δεδομένα Διαθεσιμότητα:. Η συγγραφείς επιβεβαιώνουν ότι όλα τα δεδομένα που διέπουν τα ευρήματα είναι πλήρως διαθέσιμα χωρίς περιορισμούς. Όλα τα σχετικά δεδομένα είναι εντός του χαρτιού

Χρηματοδότηση:. Η εργασία αυτή υποστηρίζεται από ένα FIRB επιχορήγησης (RBAP10447J να Ν.Β.) από το Υπουργείο Παιδείας, Πανεπιστημίων και Έρευνας ιταλικά? από την Ένωση ιταλική Έρευνας για τον Καρκίνο (AIRC 11426 έως Ν.Β.)? και από το Υπουργείο Υγείας, η χρηματοδοτική στήριξη για την Επιστημονική Έρευνα «5 τοις χιλίοις το 2010» Ιταλική. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

ραβδομυοσάρκωμα (RMS) είναι η πιο συχνή συμπαγής όγκος της παιδικής ηλικίας, ιστολογικά χαρακτηρίζει διαφορετικά πρότυπα γραμμωτών μυών διαφοροποίηση και χαρακτηρίζεται από μια πολύ επιθετική κλινική συμπεριφορά [1]. Αν και η έκβαση των ασθενών RMS έχει βελτιωθεί σημαντικά κατά τις τελευταίες δύο δεκαετίες που βασίζονται στη χρήση της χειρουργικής επέμβασης και /ή ακτινοθεραπεία σε συνδυασμό με χημειοθεραπεία, υποτροπές εξακολουθούν να εμφανίζονται σε 30-40% των μη μεταστατικό ασθενών. Επιπλέον, περίπου το 15% των παιδιών με RMS παρουσιάζουν ενδείξεις συστημικής νόσου κατά τη στιγμή της διάγνωσης. Αυτά τα θέματα «υψηλού κινδύνου» έχουν περιορισμένες θεραπευτικές επιλογές και κακή πρόγνωση [2], εξ ου και η επιτακτική ανάγκη για την ταυτοποίηση νέων θεραπειών που βασίζονται σε ενδελεχή γνώση της RMS βιολογίας.

Ένας αυξανόμενος όγκος στοιχείων υποδεικνύει ότι η ανεπάρκεια της τρέχουσας αντικαρκινικών θεραπειών για την εκρίζωση ελάχιστης υπολειμματικής νόσου και την πρόληψη της υποτροπής εξαρτάται εν μέρει από την ανικανότητά τους να στοχεύουν το υποσύνολο ηρεμίας ή χαμηλού πολλαπλασιαζόμενα κύτταρα όγκου, που είναι γνωστή ως καρκίνος βλαστικά κύτταρα (CSC) [3]. CSC εντοπίστηκαν για πρώτη φορά σε λευχαιμίες [4] και στη συνέχεια περιγράφεται σε αρκετές στερεούς όγκους [5], [6], [7], συμπεριλαμβανομένων των σαρκωμάτων [8], [9], [10], [11], [12]. Είναι γενικά αποδεκτό ότι η CSC ξεκινήσει αποτελεσματικά όγκους, οθόνη χαρακτηριστικά στέλεχος-όπως, και είναι υπεύθυνοι για την τοπική και συστηματική υποτροπή λόγω της μη ανταπόκριση σε αντικαρκινικά φάρμακα [3]. Μια σχέση μεταξύ CSC και ελάχιστης υπολειμματικής νόσου έχει αναφερθεί [13], γεγονός που υποδηλώνει έντονα ότι η στόχευση αυτών των κυττάρων θα κατέχει ένα σημαντικό δυναμικό για τη βελτίωση της έκβασης των ασθενών που έλαβαν θεραπεία με τα συμβατικά αντικαρκινικά φάρμακα. Πράγματι, CSC-όπως χημειοθεραπεία στοιχεία έχουν ήδη εντοπιστεί και στην RMS [14], [15].

μικροπεριβάλλον συνθήκες είναι σε θέση να ρυθμίζουν σημαντικά το φαινότυπο βλαστική ικανότητα υπό φυσιολογικές συνθήκες καθώς και στον καρκίνο. Ειδικά στην κόγχη CSC, τα καρκινικά κύτταρα ανταποκρίνονται σε υποξία με την μετατροπή από την αερόβια αναπνοή σε γλυκόλυση, η οποία με τη σειρά του παράγει γαλακτικό οξύ και προκαλεί τοπική οξέωση. Η παρουσία τέτοιων ιδιαιτερότητες μικροπεριβάλλοντος έχει συσχετισθεί με την επαγωγή και διατήρηση της πολυδυναμικότητα και βλαστική ικανότητα [16]. Εξωκυττάριο οξέωση εκ τούτου, είναι ένας σημαντικός παράγοντας στο σχηματισμό και τη συντήρηση των CSC, επειδή, αυτή καθαυτή, είναι σε θέση να προωθήσει ένα φαινότυπο στελέχους-όπως. Είναι ήδη γνωστό ότι οι κακοήθεις όγκους, συμπεριλαμβανομένων των σαρκωμάτων, που χαρακτηρίζεται από ένα όξινο εξωκυτταρικό περιβάλλον και ότι τα καρκινικά κύτταρα συνήθως περιέχουν μια σημαντική ποσότητα των όξινων λυσοσώματα. Αυτά τα χαρακτηριστικά είναι σύμφωνα με τα διάφορα χαρακτηριστικά κακοήθειας, συμπεριλαμβανομένης της ικανότητας εισβολής και αντίσταση στην αντικαρκινικών θεραπειών [17]. Στην πραγματικότητα, η συσσώρευση των βασικών φαρμάκων σε όξινα κυστίδια, ή εξουδετέρωση τους μέσω της οξίνισης του εξωκυτταρικό περιβάλλον είναι ένας αποτελεσματικός μηχανισμός χημειοαντίσταση και μπορεί να διευκολύνει την προσβολή όγκου [18], [19]. . Για το λόγο αυτό, η συμπεριφορά CSC επηρεάζεται από βιοχημικές και βιοφυσικές μεταβλητών της εξωκυτταρικό διαμέρισμα

Σε αυτή τη μελέτη, διερευνήσαμε το ρόλο του λυσοσώματος οξίνισης, που υπέστη το κενοτοπική (H +) – ΑΤΡάσης (V-ΑΤΡάση ) της αντλίας πρωτονίων ως περίεργη μηχανισμό που παρέχουν επιλεκτικό πλεονέκτημα στην RMS CSC. Δείξαμε ότι η V-ΑΤΡάση εμπλέκεται στην ικανότητα εισβολής, καθώς και σε χημειοευαισθησία αυτών των κυττάρων, και τα εν λόγω στοιχεία της κακοήθειας μπορεί να αναστραφεί πλήρως από απόφραξη της διαδικασίας οξίνισης με θεραπευτικές δόσεις των αναστολέων της αντλίας πρωτονίων (ΡΡΙ), υποδηλώνοντας το δυνητικό πλεονέκτημα αυτής της κατηγορίας φαρμάκων, σε συνδυασμό με τα συμβατικά αντικαρκινικά φάρμακα για να στοχεύσετε αποτελεσματικά RMS CSC.

Υλικά και Μέθοδοι

Οι κυτταρικές σειρές

RD (RMS), MG-63 (οστεοσάρκωμα ), SK-ES-1, Α-673 (σάρκωμα Ewing, ES), SH-SY5Y, ΝΒ-100 και CHP-212 (νευροβλάστωμα, ΝΒ) κυτταρικές γραμμές αγοράστηκαν από την American Type Culture Collection (ATCC) και καλλιεργήθηκαν σε ΙΜϋΜ (Life Technologies), συν 20 U /mL πενικιλλίνη, 100 mg /mL στρεπτομυκίνη, και 10% ορό απενεργοποιημένο με θέρμανση εμβρυϊκό ορό (FBS) (πλήρες μέσο). πολυανθεκτικής κύτταρα MG-63 απομονώθηκαν με σταδιακή έκθεση σε αυξανόμενες δόσεις δοξορουβικίνη (DXR). Το προκύπτον MG-63 κυτταρική γραμμή που αυξήθηκε εκθετικά με την παρουσία 100 ng /mL του DXR ορίστηκε ως πολυφαρμακευτική ανθεκτική παραλλαγή MG-63-DXR100. MG-63-DXR100 συνεχώς εκτεθειμένοι σε 100 ng /mL του DXR να διατηρηθεί η ανθεκτική σε πολλαπλά φάρμακα φαινότυπο [20].

Σφαίρα καλλιέργειες

κύτταρα σχηματισμού σφαίρας ελήφθησαν όπως περιγράφηκε προηγουμένως [12 ]. Εν συντομία, όλα τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε ανεξάρτητη από προσκόλληση συνθήκες σε DMEM: F12 μέσο με προγεστερόνη (20 ηΜ), putresceine (10 mg /ml), σεληνικό νάτριο (30 ηΜ), απο-τρανσφερρίνης (100 μg /mL), και η ινσουλίνη (25 μg /mL) (Sigma-Aldrich) σε φιάλες χαμηλής προσκόλλησης (Nunc). Φρέσκα επιδερμικού αυξητικού παράγοντα ανθρώπου (20 ng /mL) και βασικού αυξητικού παράγοντα ινοβλαστών (10 ng /mL) (PeproTech) προστέθηκαν δύο φορές την εβδομάδα έως ότου τα κύτταρα άρχισαν να αυξάνονται σχηματισμό επιπλεουσών συσσωματώσεων, που ονομάζεται rhabdospheres. Οι καλλιέργειες επεκτάθηκαν με μηχανική διάσπαση των σφαιρών, που ακολουθείται από επανα-plating των κυττάρων και των υπολειμματικών συσσωματώματα κυττάρων σε πλήρες μέσο. θεωρήθηκαν μόνο πολιτισμών σε θέση να ανάπτυξης υπό spherogenic αποικίες και τα χαρακτηριστικά εμφάνιση βλαστικών κυττάρων που σχετίζονται με. Οι σφαίρες αναλύθηκαν υπό στερήθηκαν ορού μέσο σε χαμηλή υποστρώματα προσκόλλησης (μη προσκολλημένα κατάσταση) ή προσκολλημένα κατάσταση με την παρουσία του ορού, ανάλογα με την δοκιμασία. Όλα τα απομονωμένα σφαίρες χαρακτηρίστηκαν για την έκφραση των δεικτών των βλαστικών κυττάρων που σχετίζονται με (Nanog και OCT3 /4) και, μόνο για RMS CSC, η σφαίρα της αποδοτικότητας και πολυδυναμικότητα σχηματισμού.

Χαρακτηρισμός των ιδιοτήτων των βλαστικών κυττάρων του rhabdospheres

Η αποτελεσματικότητα σχηματισμού σφαίρας κατά τη διάρκεια σειριακά περάσματα ερευνήθηκε με επίστρωση ενιαίου κυττάρων από rhabdospheres σε πυκνότητα 2000 κυττάρων /mL σε ένα δίσκο των 48 φρεατίων για τη λήψη νέων σφαιρών. Ο συνολικός αριθμός των σφαιρών όγκου μετρήθηκε, και οι σφαίρες διαχωρίστηκαν για τη λήψη της δεύτερης και τρίτης γενιάς των σφαιρών. Για την αξιολόγηση πολυδυναμικότητα, rhabdospheres διατηρήθηκαν ως προσκολλημένες καλλιέργειες για 3 ημέρες και στη συνέχεια σπείρονται σε διαφορετικές συνθήκες. Εν συντομία, για οστεογονική διαφοροποίηση, 100.000 κύτταρα σπάρθηκαν σε πλάκες 6-φρεατίων και αναπτύχθηκαν σε α-ΜΕΜ συμπληρωμένο με 10% FBS, 10 mM β-γλυκεροφωσφορικό, 10

-8 Μ δεξαμεθαζόνη, και 50 mg /mL L-ασκορβικό οξύ 2-φωσφορικό άλας (Sigma). Μετά από 14 ημέρες, τα κύτταρα μονιμοποιήθηκαν με 3,7% παραφορμαλδεΰδη, και ανοργανοποίηση αξιολογήθηκε με χρώση με 1% Ερυθρό της αλιζαρίνης S (ρΗ 4,2? Sigma-Aldrich). Για αδιπογονική διαφοροποίησης, 100.000 κύτταρα σπάρθηκαν σε 6-πηγαδιών και αναπτύχθηκαν σε ϋΜΕΜ υψηλής γλυκόζης (Lonza) συμπληρωμένο με 10% FBS, 0.5 μΜ δεξαμεθαζόνη, 0,5 mM 3-ισοβουτυλο-1-μεθυλξανθίνη, και 50 μΜ ινδομεθακίνη (Sigma- Aldrich). Μετά από 17 ημέρες, τα κύτταρα σταθεροποιήθηκαν και λιπίδια χρωματίζονται με 0,3% Oil-Red-O. Για χονδρογονική διαφοροποίηση, 500.000 κύτταρα φυγοκεντρήθηκαν σε 15 mL κωνικό σωλήνα πολυπροπυλενίου και επωάστηκαν σε ϋΜΕΜ υψηλής γλυκόζης συμπληρωμένο με 10% FBS, 10 mg /mL TGFβ1 (PeproTech), 100 μΜ L-ασκορβικό οξύ 2-φωσφορικό άλας, 6.25 μg /mL ινσουλίνη, 40 μg /mL L-προλίνη (Sigma-Aldrich). Μετά από 3 εβδομάδες, τα τμήματα που προέρχονται από χονδρογονική σφαιρίδια κηλιδώθηκαν με Alcian Blue (ρΗ 2.5).

Η γονιδιακή έκφραση

Η γονιδιακή έκφραση αξιολογήθηκε για τον προσδιορισμό χαρακτηριστικών των βλαστικών κυττάρων που σχετίζονται και περαιτέρω χαρακτηρισμό των καλλιεργειών σφαίρα . Ολικό RNA απομονώθηκε από RMS, ES, και ΝΒ κυμαινόμενο σφαίρες ή φυσικά κύτταρα με την NucleoSpin RNA II (Macherey-Nagel), και αντίστροφη μεταγραφή. Η έκφραση του mRNA για OCT3 /4 (NM_002701.4), Nanog (NM_024865.2), MDR1 (AF016535.1), ΑΤΡ V

0C (NM_001101.2), μεταλλοπρωτεϊνάσης μήτρας (ΜΜΡ) 9 (NM_004994.2 ) και CXC χημειοκίνη υποδοχέα-4 (CXCR4) (NM_001008540.1) αξιολογήθηκε χρησιμοποιώντας ένα όργανο Light Cycler (Roche Diagnostics), ενισχύοντας 1 μg cDNA, και την καθολική Probe Library (Roche Applied Science). επιλεγμένα ανιχνευτές και εκκινητές χρησιμοποιώντας web-based λογισμικό σχεδιασμού δοκιμασία (ProbeFinder https://www.roche-applied-science.com): OCT3 /4-f 5′-CTTCGCAAGCCCTCATTTC-3′-? OCT3 /4-r 5′-GAGAAGGCGAAATCCGAAG-3 ‘? Nanog-f 5’-ATGCCTCACACGGAGACTGT-3 ‘? Nanog-r 5’-AGGGCTGTCCTGAATAAGCA-3 ‘? MDR1-f 5’-GCCATCAGTCCTGTTCTTGG-3 ‘? MDR1-r 5’-GCTTTTGCATACGCTAAGAGTTC-3 ‘? ΑΤΡ V

0C-f 5′-TTCGTTTTTCGCCGTCAT-3 ‘? ATPaseV

0C-r 5′-CCACTGGGATGATGGACTTC-3 ‘? ΜΜΡ9-f 5’-GAACCAATCTCACCGACAGG-3 ‘? ΜΜΡ9-r 5’-GCCACCCGAGTGTAACCATA-3 ‘. Τα αποτελέσματα εκφράστηκαν ως αναλογία μεταξύ γονιδίου ενδιαφέροντος και πρωτεΐνη συνδέσεως Tata (ΤΒΡ, NM_003194.4? ΤΒΡ-f 5’-TTGGGTTTTCCAGCTAAGTTCT-3 ‘? ΤΒΡ-r 5′-CCAGGAAATAACTCTGGCTCA-3’) ως γονίδιο αναφοράς σύμφωνα με το 2

-ΔΔCT μέθοδο [21].

Δυτική blotting

κηλίδωση Western διεξήχθη για την ανίχνευση των δεικτών των βλαστικών κυττάρων που σχετίζονται με OCT3 /4 και Nanog, καθώς και MDR1, ΑΤΡ V

0a1 υπομονάδα, και ΤΒΡ. Πλωτή σφαίρα ή εγγενή κύτταρα υποβλήθηκαν σε λύση με θερμό ρυθμιστικό διάλυμα λύσης (1% SDS, Tris ρΗ 7,4 20 mM, 5% β-μερκαπτοαιθανόλη) για την ανάλυση των OCT3 /4 και Nanog, ή με ρυθμιστικό διάλυμα RIPA (Τρις ρΗ 7,6 50 mM, NaCl 150 mM, Triton Χ-100 5%, δεοξυχολικό νάτριο 0,25%, EGTA ρΗ 8 1 mM, NaF 1 mM, Sigma) συμπληρωμένο με αναστολείς πρωτεάσης (Roche), για τις άλλες πρωτεΐνες. Ίσες ποσότητες πρωτεΐνης λύματα υποβλήθηκαν σε αναγωγική SDS-PAGE σε ένα πήκτωμα πολυακρυλαμιδίου, ακολουθούμενη από έως ανάλυση ανοσοκηλίδωσης. Οι κηλίδες ανιχνεύθηκαν με ένα πρόβατο αντι-OCT3 /4 (Abcam), ένα ποντικού αντι-Nanog (Abcam), ένα ποντικού αντι-MDR1 (D-11, Santa Cruz), ένα κουνελιού αντι-ΑΤΡάσης V

0a1 (Abcam ), ή ένα κουνελιού αντι-ΤΒΡ (Santa Cruz) ως αναφορά. Η επώαση με δευτερογενή αντισώματα συζευγμένα με υπεροξειδάση αρμορακίας ακολούθησε. Η αντίδραση αποκαλύφθηκε με υπόστρωμα χημειοφωταύγειας (Pierce ECL Plus Western Blotting Substrate, Thermo Scientific). ανιχνεύσεις ανοσοκηλιδώσεως επαναλήφθηκαν τρεις φορές. Το σήμα από κάθε μπάντα ποσοτικά με ειδικό λογισμικό για πυκνομετρικής αξιολόγηση (VisionWorksLS Λογισμικό Ανάλυσης, Biospectrum, UVP).

ανοσοφθορισμού

Για την χρώση του V-ΑΤΡ, rhabdospheres αφέθηκαν να προσκολληθούν για 24 ώρες σε πλήρες μέσο και σταθερό, στη συνέχεια επωάστηκαν με αντι-V-ΑΤΡάση V

0a1 πολυκλωνικό αντίσωμα (Sigma-Aldrich), που ακολουθείται από ένα δευτερογενές αντίσωμα αντι-κουνελιού Alexa πράσινο 488 nm (Life Technologies). Για να παρατηρήσουμε φυσαλιδώδους εντοπισμός του V-ΑΤΡάση, ακτίνη κυτταροσκελετό συν-χρώση χρησιμοποιώντας 0,5 μg ισοθειοκυανικού /mL φαλλοειδίνη-τετραμεθυλοροδαμίνη Β (TRITC) φθορίζουσα χρωστική (Sigma). Οι πυρήνες βάφτηκαν αντίθετα με Hoechst 33258 (Sigma), και τα κύτταρα παρατηρήθηκαν με συνεστιακή μικροσκοπία (Nikon TI-Ε).

δοκιμασία Μετανάστευση

Η ικανότητα μετανάστευσης των rhabdospheres αξιολογήθηκε με την τεχνική του θαλάμου Boyden σε σύγκριση με το RD. Εν συντομία, και μόνο τα κύτταρα που προέρχονται από RD ή rhabdospheres μετά θρυψινοποίηση αιωρήθηκαν σε μέσο χωρίς ορό που περιέχει 0,1% αλβουμίνη βόειου ορού (BSA) και σπάρθηκαν στο άνω διαμέρισμα του θαλάμου Boyden (πόρου 8-μm, EuroClone). Τα χαμηλότερα θάλαμοι περιείχαν 10% FBS εντός μέσου ΙΜϋΜ ως χημειο-προσελκυστικό. Τα κύτταρα επωάστηκαν στους 37 ° C και αφέθηκαν να μεταναστεύσουν για 8 ώρες. Τα κύτταρα που συνδέονται με την άνω επιφάνεια του φίλτρου απομακρύνθηκαν με μηχανικά τρίψιμο με μπατονέτες. Chambers βάφτηκαν σε 0.5% crystal violet αραιωμένο σε 100% μεθανόλη για 30 λεπτά, ξεπλύθηκαν σε νερό και εξετάζονται κάτω από μικροσκόπιο φωτεινού πεδίου. Οι τιμές για τη μετανάστευση ελήφθησαν μετρώντας 5 πεδία ανά μεμβράνη (στόχος X20) και αντιπροσωπεύουν το μέσο όρο των τεσσάρων ανεξάρτητων πειραμάτων.

δοκιμασία εισβολή

ΜΜΡ δραστηριότητα ποσοτικά όπως περιγράφηκε προηγουμένως [22]. Εν συντομία, κύτταρα από rhabdospheres και RD σπάρθηκαν σε πλάκες 6-φρεατίων (300.000 κύτταρα /φρεάτιο) και αφέθηκαν να προσκολληθούν. Μετά από 48 ώρες, τα κύτταρα πλύθηκαν και επωάστηκαν στους 37 ° C με 400 μλ αλατόνερου ρυθμισμένου με φωσφορικό (PBS) επί 3 ώρες. PBS ακολούθως συλλέγεται, φυγοκεντρείται και το υπερκείμενο χρησιμοποιήθηκε για τον προσδιορισμό. Ίσες ποσότητες του υπερκείμενου προστέθηκαν σε 100 μL σβέσης ζελατίνης (DQ Ζελατίνη, Life Technologies) σε μια πλάκα 96 φρεατίων. Τα προσκολλημένα κύτταρα αποκολλήθηκαν και μετρήθηκαν. Μετά από 24 ώρες στους 37 ° C, η εκπομπή φθορισμού μετρήθηκε με αναγνώστη μικροπλάκας (Tecan). Τα αποτελέσματα αναφέρθηκαν ως το ποσοστό εκπομπής φθορισμού σε σχέση με ακυτταρικό υπερκείμενο υγρό και κανονικοποιημένο με το συνολικό αριθμό των κυττάρων. Το πείραμα επαναλήφθηκε τρεις φορές.

Η κυτταρομετρία ροής

κύτταρα Rhabdosphere και RD διαχωρίστηκαν με θρυψίνη, μετρήθηκαν και χρωματίστηκαν ως εξής. Για την ποσοτικοποίηση της έκφρασης CD133, εναιωρήματα κυττάρων επωάστηκαν με μονοκλωνικά CD133 /1 αντίσωμα (AC133, Miltenyi Biotec) για 10 λεπτά, ακολουθούμενη από 20 λεπτά επώαση με αντι-κατσίκας αντίσωμα Alexa πράσινο 488 nm (ϋίβ Technologies) στους 4 ° C. Για την αξιολόγηση του περιεχομένου CXCR4, εναιωρήματα κυττάρων βάφτηκαν με μονοκλωνικά CD184 (CXCR4) ΡΕ (Miltenyi Biotec) για 10 λεπτά στους 4 ° C. Μετά τη χρώση, τα κύτταρα κατόπιν επαναιωρήθηκαν σε PBS και αναλύθηκαν με ένα Coulter EPICS XL Κυτταρόμετρο Ροής (Coulter Corporation, Beckman Coulter). Τα πειράματα επαναλήφθηκαν τρεις φορές.

ευαισθησία φαρμάκου

δοκιμασίας

κύτταρα Rhabdosphere και RD απλώθηκαν σε πλάκες 6-φρεατίων (200,000 /φρεάτιο) και αφέθηκαν να προσκολληθούν. Μετά από 24 ώρες, τα κύτταρα επωάστηκαν με DXR (10, 50, και 100 ng /mL? Sigma) ή σισπλατίνη (5, 10, και 100 μΜ? Sigma), και μετά από επιπλέον 72 ώρες, ο αριθμός των βιώσιμων κυττάρων αξιολογήθηκε με Trypan μπλε δοκιμασία αποκλεισμού χρωστικής. Το ποσοστό αναστολής της ανάπτυξης υπολογίστηκε σε σχέση με τα μη επεξεργασμένα κύτταρα. Το φάρμακο το ήμισυ της μέγιστης αποτελεσματικής συγκέντρωσης (ΕΚ

50) για κάθε κυτταρική σειρά υπολογίστηκε με τη μέθοδο γραμμικής παλινδρόμησης. Το πείραμα επαναλήφθηκε δύο φορές.

DXR πρόσληψη

κύτταρα Rhabdosphere και RD σπάρθηκαν σε ποτήρι chamberslides 8 φρεατίων και αφέθηκαν να προσκολληθούν. Τα κύτταρα στη συνέχεια εκτίθενται σε DXR (10 μg /mL) για 15 λεπτά, πλύθηκαν, και παρατηρήθηκαν άμεσα με συνεστιακή μικροσκοπία. Το επίπεδο της πυρηνικής DXR ήταν ποσοτικά σε τουλάχιστον 100 κύτταρα σε διαφορετικά πεδία χρησιμοποιώντας το ΝΑΚ-Στοιχεία λογισμικού Μικροσκόπιο Imaging (Nikon).

λυσοσώματα οξύτητα

αξιολόγηση

Το φάσμα εκπομπής του pH-ευαίσθητα πορτοκαλί ακριδίνης (AO) χρησιμοποιήθηκε για τη μέτρηση μεταβολών του ρΗ σε όξινα οργανίδια [23], [24]. κύτταρα Rhabdosphere και RD σπάρθηκαν σε πλάκες 6-φρεατίων και αφέθηκαν να προσκολληθούν για 24 ώρες σε πλήρες μέσο. Τα κύτταρα στη συνέχεια εκτίθενται σε ΑΟ (1 μg /mL) για 10 λεπτά, πλύθηκαν, και παρατηρήθηκαν άμεσα από φασματική συνεστιακή μικροσκοπία. Για να χαρακτηριστεί το προφίλ των φασμάτων εκπομπής AO, η συνεισφορά κόκκινη ταινία (R%) σε όλο το φάσμα εκπομπής υπολογίστηκε ως εξής: R% = 100

I

655 /(

I

655 /

I

530) όπου

I

655 και

I

530 είναι το πράσινο (520-540 nm ) και το κόκκινο (645 – 665 nm) ολοκληρωμένα εντάσεων εκπομπής, αντίστοιχα. Ο μέσος όρος R% υπολογίστηκε για όλες τις όξινες οργανίδια σε 10 κύτταρα. Το πείραμα επαναλήφθηκε δύο φορές.

κυτοσολίου μέτρηση του ρΗ

κυτοσολίου ρΗ (PHC) κυττάρων rhabdosphere και RD μετρήθηκε με τη χρήση καρβοξυ-seminaphthorhodafluor-1 (καρβοξυ-SNARF-1) (Molecular Probes ). Τα κύτταρα σπάρθηκαν σε πλάκες θαλάμου και αφέθηκαν να προσκολληθούν για 24 ώρες, και στη συνέχεια 10 μΜ του καρβοξυ-SNARF-1 προστέθηκαν στο μέσο καλλιέργειας για 30 λεπτά. Τα πλακίδια θαλάμου τοποθετήθηκαν επί το στάδιο της συνεστιακού μικροσκοπίου και αφέθηκαν να προσαρμοστούν για τουλάχιστον 20 λεπτά πριν από την έναρξη των μετρήσεων PHC. Η ακτίνα λέιζερ διέγερσης 514 nm (Arlaser) κατευθύνθηκε στο δείγμα μέσω S Σχέδιο Fluor φακό ΕΛ WD 40Χ (Nikon). Το προκύπτον εκπομπή φθορισμού συλλέχθηκε στους 644 nm και 594 nm. Αρκετές περιοχές ενδιαφέροντος (ROI) με διάμετρο 1 μm μετά επιλέχθηκαν τυχαία με εξαίρεση την πυρηνική περιοχές. Η αναλογία εκπομπής βαθμονομήθηκε χρησιμοποιώντας διαλύματα (110 mM KCl, 25 mM KHCO

3, 11 mM γλυκόζη, 1 mM MgCl

2, 1 mM ΟαΟ

2, 10 mM HEPES), με διαφορετικά επίπεδα ρΗ και που περιέχουν 10 μΜ νιγερισίνη (K + /H + ιονοφόρου). Η αναλογία εκπομπής φθορισμού (644 nm /594 nm) υπολογίστηκε και χρησιμοποιήθηκε για την εκτίμηση PHC από την καμπύλη βαθμονόμησης. Το πείραμα επαναλήφθηκε τρεις φορές.

δοκιμασίες Ανάπτυξης μετά λυσοσώματα στόχευση

Για να διαταράξει τη λειτουργία λυσόσωμα, rhabdosphere κύτταρα και RD υποβλήθηκαν σε θεραπεία με τη χρήση δύο διαφορετικές στρατηγικές. Για το πρώτο, τα κύτταρα σπάρθηκαν σε πλάκες 6-φρεατίων (200,000 /φρεάτιο), αφέθηκαν να προσκολληθούν για 24 ώρες σε πλήρες μέσο, ​​και στη συνέχεια υποβλήθηκε σε επεξεργασία με ΑΟ (0.1, 0.5, και 1 μg /mL? Sigma) που συσσωρεύεται επιλεκτικά σε όξινο λυσοσώματα και να επηρεάσει την ανάπτυξη των κυττάρων του καρκίνου [25]. Μετά από 72 ώρες, ο αριθμός των βιώσιμων κυττάρων αξιολογήθηκε με δοκιμασία χρωστικής αποκλεισμό. Το πείραμα επαναλήφθηκε δύο φορές. Η άλλη στρατηγική αξιολογήθηκε με τη χρήση της ομεπραζόλης ΡΡΙ (ΟΜΕ), ένα φάρμακο που είναι γνωστό ότι αναστέλλει δραστικότητα V-ΑΤΡάση [26]. Η βιωσιμότητα των κυττάρων μετά την αγωγή της ΟΜΕ προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας δύο διαφορετικές δοκιμασίες. α) Για την έμμεση δοκιμή, rhabdospheres και RD, ή κύτταρα εκπρόσωπος του ES ή ΝΒ histotype, σπάρθηκαν σε πλάκες 96 φρεατίων (8000 κύτταρα /φρεάτιο) και αφέθηκαν να προσκολληθούν. Μετά από 24 ώρες, το μέσο αλλάχθηκε με μη ρυθμισμένο RPMI με 10% FBS και υποβλήθηκε σε επεξεργασία με 10, 25, 50, και 100 μΜ του ΟΜΕ (Sigma-Aldrich). Μετά από 24, μόνο για τα κύτταρα ραβδομυοσαρκώματος, και 72 ώρες για RMS, τα κύτταρα ES και ΝΒ, η βιωσιμότητα αξιολογήθηκε με προσδιορισμό όξινης φωσφατάσης (ΑΡ). Εν συντομία, τα κύτταρα πλύθηκαν και επωάστηκαν στους 37 ° C με 100 μL ρυθμιστικού διαλύματος που περιέχει 0.1 Μ οξικό νάτριο (ρΗ 5.0), 0.1% Triton Χ-100, και 5 mM φωσφορικού ρ-νιτροφαινύλ. Μετά από 3 ώρες, η αντίδραση διακόπηκε με την προσθήκη 10 μι 1 Ν ΝαΟΗ, και η ανάπτυξη του χρώματος προσδιορίστηκε στα 405 nm χρησιμοποιώντας αναγνώστη μικροπλάκας (Tecan) [23]. β) για την άμεση ανίχνευση, rhabdospheres και RD σπάρθηκαν σε πλάκες 6-φρεατίων και αφέθηκαν να προσκολληθούν. Μετά από 24 ώρες, 50 μΜ ΟΜΕ προστέθηκε στο μέσο καλλιέργειας. Μετά από επιπλέον 24 ώρες, ο αριθμός των βιώσιμων κυττάρων προσδιορίστηκε με δοκιμασία χρωστικής αποκλεισμό. Το πείραμα επαναλήφθηκε δύο φορές.

Η απόπτωση ανάλυση

κύτταρα Rhabdosphere αφέθηκαν να προσκολληθούν μετά από 24 ώρες σε πλήρες μέσο και εκτίθεται σε 50 μΜ ΟΜΕ σε μη ρυθμισμένου RPMI με 10% FBS. Μετά από 24 και 48 ώρες, τα κύτταρα επισημάνθηκαν με Hoechst 33258 και η παρουσία αποπτωτικών σωμάτων ανιχνεύθηκε κάτω από μικροσκοπία φθορισμού.

κυτταρικού κύκλου ανάλυση

Rhabdospheres εκτέθηκαν σε 100 μΜ του ΟΜΕ σε μη προσκολλημένα συνθήκες σε ρΗ 6,8 για 24 ώρες. Το περιεχόμενο DNA και βρωμοδεοξυουριδίνης (BrdU) την ενσωμάτωση κατά τη διάρκεια της φάσης S προσδιορίστηκαν με ταυτόχρονη ανάλυση ιωδιούχου προπιδίου (ΡΙ) για το συνολικό περιεχόμενο DNA και του FITC-συζευγμένο αντι-BrdU φθορισμού. Εν συντομία, τα κύτταρα επωάστηκαν με 40 μΜ 5-BrdU (Sigma) για 60 λεπτά στους 37 ° C, πλύθηκαν και έπειτα 5 × 10

6 μονά κύτταρα μονιμοποιήθηκαν με 75% αιθανόλη για 20 λεπτά στους 4 ° C. Μερική μετουσίωση του DNA πραγματοποιήθηκε με επώαση κυττάρων σε HCl, ακολουθούμενη από εξουδετέρωση με Na τετραβορικό. Τα δείγματα στη συνέχεια επωάστηκαν με ένα μονοκλωνικό αντίσωμα ποντικού αντι-BrdU αντίσωμα FITC (BD Biosciences), πλύθηκαν, χρωματίστηκαν με 2,5 μg /mL ΡΙ (Sigma-Aldrich), και αναλύθηκαν. Μονοπαραμετρικές και biparametric αναλύσεις πραγματοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας το λογισμικό WinMDI 2.7. Το πείραμα επαναλήφθηκε δύο φορές.

Επιδράσεις της DXR στη βιωσιμότητα των κυττάρων μετά ΟΜΕ θεραπεία

κύτταρα

Rhabdosphere ας να προσκολληθούν για 24 ώρες σε πλήρες μέσο. Τα κύτταρα στη συνέχεια προ-επεξεργασία με 10, 25, 50, και 100 μΜ του ΟΜΕ σε μη ρυθμισμένου RPMI με 10% FBS. Μετά από επιπλέον 24 ώρες, τα κύτταρα εκτέθηκαν σε 50 και 25 ng /mL της DXR σε ρυθμισμένο μέσο. Μετά από επιπλέον 48 ώρες, η βιωσιμότητα των κυττάρων αξιολογήθηκε με τη δοκιμασία ΑΡ, όπως περιγράφηκε προηγουμένως. Τα δεδομένα αναφέρθηκαν ως κυτταρική επιβίωση σε σχέση με τα μη επεξεργασμένα κύτταρα (σετ = 100%). Το πείραμα διεξήχθη εις τετραπλούν.

πρόσληψη DXR μετά ΟΜΕ θεραπεία

κυττάρων

Rhabdosphere αφήσει να προσκολληθούν για 24 ώρες σε πλήρες θρεπτικό μέσο. Τα κύτταρα στη συνέχεια προ-επεξεργασία με 10 και 20 μΜ του ΟΜΕ σε μη ρυθμισμένου RPMI με 0,1% FBS για 1 ώρα, και στη συνέχεια εκτέθηκαν σε 5 μg /mL του DXR για 15 λεπτά. Το επίπεδο της πυρηνικής DXR ποσοτικοποιήθηκε σε τουλάχιστον 100 κύτταρα πάνω διάφορους τομείς, όπως περιγράφηκε προηγουμένως, και σε σύγκριση με εκείνη των μη επεξεργασμένων κυττάρων. Το πείραμα επαναλήφθηκε δύο φορές.

siRNA διαμόλυνση

Ειδικά γονιδιακής σίγησης επίδραση λήφθηκε από την τεχνολογία που σχετίζεται με siRNA πιπέτα τύπου ηλεκτροδιάτρηση. Εν συντομία, rhabdosphere κύτταρα θρυψινοποιήθηκαν και 100 μL του εναιωρήματος των κυττάρων που περιέχουν 2.000.000 κύτταρα και 1,6 nmol συγκεκριμένων siRNA (πισίνα ON-TARGETplus Ανθρωπίνων ATP6V0C siRNA Smart, Dharmacon, Thermo Scientific) ή τον έλεγχο siRNA (siRNA CTR, ON-TARGETplus Μη στόχευσης Ελέγχου πισίνα, Dharmacon) ή νερό (όχι siRNA) μεταφέρθηκαν σε μια κυψελίδα 1-mm (νέον Επιμόλυνση System, Life Technologies). Ηλεκτροδιαπήδηση κύτταρα σπάρθηκαν σε πλάκες 6-φρεατίων (500.000 κύτταρα /φρεάτιο) για την απομόνωση του RNA και σε ένα 96-φρεατίων για τη δοκιμασία ανάπτυξης (15,000 κύτταρα /φρεάτιο). Μετά από 24 ώρες, η μείωση του επιπέδου του mRNA για το V

0c ΑΤΡάσης επαληθεύτηκε με Real Time PCR, όπως περιγράφηκε προηγουμένως. Για τη δοκιμασία της ανάπτυξης, τα κύτταρα εκτέθηκαν σε 25 ng /mL της DXR σε ρυθμισμένο μέσο και επωάστηκαν για επιπλέον 48 ώρες. Η βιωσιμότητα των κυττάρων εκτιμήθηκε με την έμμεση ανίχνευση AP, όπως περιγράφηκε προηγουμένως. Τα αποτελέσματα αναφέρθηκαν ως ποσοστό της κυτταρικής επιβίωσης

vs

κύτταρα ελέγχου (χωρίς siRNA). Το πείραμα επαναλήφθηκε δύο φορές.

Αναστολή της κυτταρικής μετανάστευσης rhabdosphere με ΟΜΕ

Rhabdospheres διαχωρίστηκαν και σπάρθηκαν σε πλάκες 6-φρεατίων ας να προσκολληθούν για 24 ώρες σε πλήρες μέσο. Για να αξιολογηθεί η ικανότητα της μετανάστευσης, τα κύτταρα στη συνέχεια προ-αγωγή με 50 μΜ του ΟΜΕ σε μη ρυθμισμένου RPMI με 10% FBS. Μετά από 24 ώρες, τα βιώσιμα κύτταρα μετρήθηκαν και στη συνέχεια ένα ίσο αριθμό των μη επεξεργασμένων ή ΟΜΕ-επεξεργασμένα κύτταρα σπάρθηκαν εντός του άνω διαμέρισμα του θαλάμου Boyden, όπως περιγράφηκε προηγουμένως. Το πείραμα επαναλήφθηκε δύο φορές.

Αναστολή της επεμβατικής δυναμικού rhabdosphere κύτταρο με ΟΜΕ

Για να αξιολογηθεί η επεμβατική δυναμικό, rhabdosphere κύτταρα αφέθηκαν να προσκολληθούν για 24 ώρες σε πλήρες μέσο και στη συνέχεια προ-αγωγή με 50 μΜ του ΟΜΕ σε μη ρυθμισμένου RPMI με 0,1% FBS για 3 ώρες. Η απελευθέρωση των MMPs στο υπερκείμενο ποσοτικοποιήθηκε με δοκιμασία ζελατίνη απόσβεση, όπως περιγράφηκε προηγουμένως, και κανονικοποιημένο με το συνολικό αριθμό των βιώσιμων κυττάρων. Για να αξιολογηθεί η επίδραση στο CXCR4 εκφράζουν πληθυσμού, rhabdospheres σπάρθηκαν σε σχηματισμού σφαίρας κατάσταση σε ρΗ 6,8 και προ-επεξεργασία με 100 μΜ ΟΜΕ. Μετά από 48 ώρες, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε βιώσιμη απαρίθμηση και το CXCR4-θετικό κλάσμα του πληθυσμού των ζώντων κυττάρων (που επιλέγονται από τις παραμέτρους προς τα εμπρός και την πλευρά σκέδαση) αξιολογήθηκε με κυτταρομετρία ροής, όπως περιγράφηκε προηγουμένως. Τα πειράματα επαναλήφθηκαν δύο φορές.

Η στατιστική ανάλυση

Λόγω του μικρού αριθμού παρατηρήσεων, τα δεδομένα θεωρήθηκαν ως μη κανονική κατανομή. Οι τιμές εκφράζονται ως μέσοι ± SE. Η στατιστική ανάλυση έγινε με το λογισμικό StatView 5.0.1 (SAS Institute Inc., Cary, NC). Η μη παραμετρική Mann-Whitney U χρησιμοποιήθηκε και p & lt?. 0.05 θεωρήθηκε σημαντική

Αποτελέσματα

σχηματισμό Rhabdosphere και τον εμπλουτισμό

Μετά από 2-3 εβδομάδες καλλιέργειας σε παράγοντα ανάπτυξης εμπλουτισμένο μέσο χωρίς ορό πεινασμένο, κύτταρα RD σχηματίζεται πολιτισμούς που συνίσταται στην πλωτή συσσωματώματα κυττάρων, τα λεγόμενα rhabdospheres, που θα μπορούσε να επεκταθεί περαιτέρω

στο

vitro

(Εικόνα 1Α). Για να εκτιμηθεί η ικανότητα των κυττάρων rhabdosphere να κινήσει αυτο-ανανέωση, προσδιορίστηκε ο αριθμός των σφαιρών που σχηματίζεται πάνω από τρεις σειριακές διελεύσεις σε κάθε πέρασμα. Ο αριθμός των σφαιρών που ελήφθη κατά την τρίτη γενιά ήταν σημαντικά υψηλότερη, υποδεικνύοντας ότι rhabdospheres μπορεί να εμπλουτιστεί σειριακά. (Εικόνα 1Β? P = 0,0495

vs

πέρασμα 1)

(Α) εικόνες αντίθεσης φάσης του rhabdospheres προέρχονται από RD αναπτύχθηκαν σε ανεξάρτητη από προσκόλληση κατάσταση, σε μέσο άνευ ορού συμπληρωμένο με bFGF και EGF. Αντιπροσωπευτική εικόνα, γραμμή κλίμακας 100 μm. (Β) σχηματισμού σφαίρας αποδοτικότητα του rhabdospheres πάνω από τρεις σειριακές διελεύσεις. Το γράφημα δείχνει το ποσό της πρωτοβάθμιας, δευτεροβάθμιας (που παράγεται από διασπασμένα πρωτογενή τομέα), και τριτογενή (που παράγεται από διασπασμένα δευτεροβάθμιας σφαίρες) σφαίρες από κύτταρα 2000. * P & lt? 0,05

vs

πρωτογενή τομέα. επίπεδα (C) mRNA για τους δείκτες βλαστικών κυττάρων OCT3 /4 και Nanog σε rhabdospheres σύγκριση με τη φυσική RD με Real Time PCR. * P & lt? 0,05. (D) κηλίδωση Western για OCT3 /4 και Nanog σε rhabdospheres σε σύγκριση με RD φυσικά κύτταρα (αριστερά, εκπρόσωπος εικόνες) και πυκνομετρικής ανάλυσης (δεξιά? * Ρ & lt? 0,05). (Ε) δοκιμασίες Διαφοροποίηση του rhabdospheres μετά από επώαση με τα κατάλληλα διαφοροποίησης ερεθίσματα. Αριστερά: οστεογονική διαφοροποίηση αξιολογήθηκε με χρώση αλιζαρίνης Κόκκινο S, η κλίμακα bar 100 μm? μέση: αδιπογονική διαφοροποίηση αξιολογήθηκε με χρώση των λιπιδίων Oil-Red-O, γραμμή κλίμακας 10 μm? δεξιά: χονδρογονική διαφοροποίηση αξιολογήθηκε με βαφή Alcian Blue, μπαρ κλίμακα 50 μm. Εκπρόσωπος εικόνες. (F) Transwell χημειοταξίας δοκιμασία της rhabdospheres

vs

μητρική RD. Το γράφημα δείχνει τον αριθμό των μετανάστευσαν κυττάρων σε πέντε τομείς X20 μετά από 8 ώρες. * P & lt? 0,05. επίπεδα (G) mRNA για ΜΜΡ9 σε rhabdospheres

vs

μητρική RD με Real Time PCR. * P & lt? 0,05. (H) ΜΜΡ δραστικότητα στο υπερκείμενο του rhabdospheres

vs

RD φυσικά κύτταρα με προσδιορισμό ζελατίνης σβέσης. * P & lt? 0,05. επίπεδα (Ι) mRNA για CXCR4 σε rhabdospheres σύγκριση με τη φυσική RD με Real Time PCR. * P & lt? 0,05. (L) κυτταροφθορισμομετρικής ανάλυση των κυττάρων κλάσμα CXCR4-θετική rhabdospheres και μητρική RD. Εκπρόσωπος οικόπεδα έντασης για rhabdospheres και μητρική RD (αριστερά) και το ποσοστό των CXCR4-θετικών κυττάρων (δεξιά). ** P & lt?. 0.001

Η

βλαστική ικανότητα χαρακτηριστικά rhabdospheres

Για να εκτιμηθεί το στέλεχος χαρακτηριστικά των κυττάρων που σχετίζονται με της rhabdospheres, το επίπεδο έκφρασης των δύο βλαστική ικανότητα δεικτών, η μεταγραφή παράγοντες OCT3 /4 και Nanog, αξιολογήθηκε και συγκρίθηκε με φυσική RD κύτταρα. Η μεταγραφή των δύο γονιδίων ρυθμίζεται αυξητικά σε rhabdospheres (Σχήμα 1 C). Ειδικότερα, παρατηρήσαμε μια σημαντική αύξηση για Nanog mRNA και μια τάση αύξησης, αν και δεν είναι σημαντική, για OCT3 /4 (Εικόνα 1 C? P = 0,0283). Παρόμοια αποτελέσματα ελήφθησαν για την πρωτεΐνη Nanog με ανάλυση Western Blot, με την οποία εντοπίσαμε μια αδύναμη αλλά σημαντική αύξηση των σφαιρών (Σχήμα 1D? P = 0,0495), ενώ δεν βρήκαμε διαφορά για OCT3 /4. Αξίζει να σημειωθεί ότι, βρήκαμε επίσης ότι CD133 δεν συσχετίστηκε με το φαινότυπο στελέχους-όπως (45,9 ± 3,4% για το RMS CSC

vs

43,8 ± 1,8% για το RD, αντίστοιχα). Τέλος, δείξαμε την πλαστικότητα των βλαστικών κυττάρων του rhabdospheres από την ικανότητά τους να διαφοροποιούνται κατά μήκος τριών σειρών μεσεγχυματικά, όπως αποδεικνύεται από Ερυθρό της αλιζαρίνης S (οστεογένεση), Πετρέλαιο-Red-O (λιπογένεση), και Alcian Blue (χονδρογένεση) χρώση (Σχήμα 1 Ε) .

Ενισχυμένη μετανάστευση και την εισβολή ιδιότητες rhabdospheres

ο αριθμός των κυττάρων rhabdosphere που μετανάστευσαν μέσω της Boyden Επιμελητηρίου ήταν σημαντικά υψηλότερη από ό, τι RD (Σχήμα 1F? p = 0,0162). κύτταρα Rhabdosphere έδειξε επίσης μια σήμανση

in vitro

εξωκυτταρική μήτρα πιθανή αποικοδόμηση σε σύγκριση με την φυσική RD, όπως φαίνεται από την προς τα άνω ρύθμιση του mRNA ΜΜΡ9 (Σχήμα 1G? p = 0,0495), και από τα υψηλότερα επίπεδα δραστηριότητας αποικοδόμησης ζελατίνης εκκρίνεται ΜΜΡ9 (Σχήμα 1? p = 0,0368). Επιπλέον, rhabdospheres εξέφρασαν πολύ υψηλά επίπεδα του υποδοχέα CXCR4 κυτταρική επιφάνεια, όπως καταδεικνύεται από Real Time PCR (Σχήμα 1Θ? P = 0,0495) και κυτταρομετρία ροής (Σχήμα 1 L? P = 0,0027). Αυτός ο υποδοχέας χημειοκινών μεσολαβεί την μετανάστευση των καρκινικών κυττάρων προς τους ιστούς συνδέτη εκφράζοντας της [27].

Μειωμένη ευαισθησία στο DXR μέσω MDR1-ανεξάρτητο μηχανισμό σε rhabdospheres

Για την αξιολόγηση χημειοαντίσταση στο RMS CSC, rhabdospheres και μητρική RD εκτέθηκαν σε αυξανόμενες συγκεντρώσεις σισπλατίνης ή DXR. Από την άποψη της αναστολής βιωσιμότητας, και οι δύο πληθυσμοί κυττάρων έδειξαν το ίδιο μοτίβο σε ανταπόκριση στη σισπλατίνη (Σχήμα 2Α, ΕΚ

50 τιμές: 18,7 μΜ για σφαίρες και 14.6 μΜ για RD). Από την άλλη πλευρά, σε αντίθεση με εγγενή RD, RMS CSC έδειξε σημαντική χαμηλότερη αναστολή της ανάπτυξης σε απόκριση προς DXR (Σχήμα 2Β? Ρ = 0,018 για 10 ng /mL, ρ = 0.0209 για 50 ng /mL, και ρ = 0,0202 για 100 ng /mL). ΕΚ

50 τιμή ήταν 4,5 φορές υψηλότερη για rhabdospheres ό, τι για RD (79,5 ng /mL και 17.6 ng /mL, αντίστοιχα). * P & lt? 0,05. * P & lt? 0,05. * P & lt? 0,05. * P & lt? 0,05. * P & lt? 0,05.