Αφηρημένο

Ιστορικό

Ο καρκίνος του πνεύμονα είναι η κύρια αιτία θνησιμότητας από καρκίνο σε όλο τον κόσμο, αλλά η θεραπευτική στρατηγική για προχωρημένο μη μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα (NSCLC) είναι πεπερασμένα αποτελεσματική. Επιπλέον, επικυρωμένη αποακετυλάσης ιστόνης (HDAC) αναστολείς για τη θεραπεία των συμπαγών όγκων παραμένει να αναπτυχθεί. Εδώ, προτείνουμε ένα νέο αναστολέα HDAC, OSU-HDAC-44, ως χημειοθεραπευτικό φάρμακο για NSCLC.

Μεθοδολογία Κύρια Ευρήματα /

Η επίδραση κυτταροτοξικότητα της OSU-HDAC-44 εξετάστηκε σε τρεις ανθρώπινες κυτταρικές γραμμές NSCLC συμπεριλαμβανομένων Α549 (άγριου τύπου ρ53), Η1299 (ρ53 null), και CL1-1 (ρ53 μεταλλαγμένη). Οι antiproliferatative μηχανισμοί OSU-HDAC-44 ερευνήθηκαν από κυτταρομετρία ροής ανάλυση κυτταρικού κύκλου, προσδιορισμούς απόπτωσης και ανάλυση του γονιδιώματος σε επίπεδο χρωματίνης-ανοσοκατακρήμνιση-on-chip (τσιπ on-chip). Ποντίκια με την καθιερωμένη ξενομοσχεύματος Α549 όγκου υπέστησαν αγωγή με OSU-HDAC-44 ή όχημα ελέγχου και χρησιμοποιήθηκαν για την αξιολόγηση των επιδράσεων στην ανάπτυξη του όγκου, της αναστολής κυτταροκίνηση και απόπτωση. OSU-HDAC-44 ήταν ένας αναστολέας παν-HDAC και επιδεικνύει 3-4 φορές περισσότερο από ό, τι αποτελεσματικότητα σουβεροϋλανιλιδο υδροξαμικό οξύ (SAHA) στην καταστολή της βιωσιμότητας των κυττάρων σε διάφορες κυτταρικές σειρές NSCLC. Κατά OSU-HDAC-44 θεραπεία, κυτταροκίνηση ανεστάλη και στη συνέχεια οδήγησε σε μιτοχόνδρια-απόπτωση. Η αναστολή κυτοκίνηση προέκυψε από OSU-HDAC-44 με τη μεσολάβηση της υποβάθμισης της μίτωσης και κυτοκίνησης ρυθμιστικές Auroroa Β και survivin. Η απελευθέρωση της F ακτίνης δυναμική που προκαλείται από OSU-HDAC-44 συσχετίστηκε με μείωση της δραστηριότητας RhoA που προκύπτει από την επαγωγή srGAP1. ChIP-on-chip ανάλυση αποκάλυψε ότι OSU-HDAC-44 που προκαλείται χρωματίνης χαλάρωση και να διευκολυνθεί η μεταγραφή των γονιδίων που εμπλέκονται σε κρίσιμους μονοπάτια σηματοδότησης, όπως απόπτωση, καθοδήγηση νευραξόνων και της πρωτεΐνης ουβικιτινίωση. Τέλος, OSU-HDAC-44 αποτελεσματικά ανέστειλε την ανάπτυξη Α549 ξενομόσχευμα όγκου και προκαλούμενη ακετυλίωση των ιστονών και μη-ιστόνης πρωτείνες και απόπτωση

in vivo

.

Συμπεράσματα /Σημασία

OSU -HDAC-44 καταστέλλει σημαντικά την ανάπτυξη του όγκου μέσω επαγωγής κυτταροκίνηση ελαττώματος και εγγενή απόπτωση σε προκλινικά μοντέλα NSCLC. Τα στοιχεία μας παρέχουν πειστικές αποδείξεις ότι OSU-HDAC-44 είναι ένας ισχυρός HDAC στοχευμένη αναστολέα και μπορεί να ελεγχθεί για NSCLC χημειοθεραπεία

Παράθεση:. Tang YA, Wen WL, Chang JW, Wei TT, Tan Υ-HC, Salunke S, et al. (2010) A Novel αναστολέα απακετυλασών Εκθέματα Αντικαρκινική Δραστηριότητα μέσω απόπτωσης επαγωγής, F-ακτίνης Διατάραξη και Gene ακετυλίωση στον καρκίνο του πνεύμονα. PLoS ONE 5 (9): e12417. doi: 10.1371 /journal.pone.0012417

Επιμέλεια: Chun-Ming Wong, Πανεπιστήμιο του Χονγκ Κονγκ, Χονγκ Κονγκ

Ελήφθη: 22 Φεβρουαρίου 2010? Αποδεκτές: 2 Αύγ 2010? Δημοσιεύθηκε: 14 Σεπτεμβρίου 2010

Copyright: © 2010 Tang et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε εν μέρει με επιχορηγήσεις NSC97-2627-M-006-005 και NSC99-2628-B-006-004-my3 από το Εθνικό Συμβούλιο Επιστήμης και χορηγούν DOH98-TD-G-111-024 από το Υπουργείο Υγείας (Η Executive Yuan, Δημοκρατία της Κίνας). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

ο καρκίνος του πνεύμονα είναι η κύρια αιτία θνησιμότητας από καρκίνο σε όλο τον κόσμο. Το 5-ετή συνολική επιβίωση των μη-μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα (NSCLC) είναι μικρότερη από 15% σε πολλές χώρες [1], [2]. Το πρότυπο θεραπευτική στρατηγική για προχωρημένο NSCLC είναι με βάση την πλατίνα χημειοθεραπεία διπλό πράκτορα η οποία, όμως, έχει φθάσει σε ένα οροπέδιο της ισχύος στην βελτίωση της επιβίωσης των ασθενών [3], [4]. Μόνο λίγα «παραγόντων στόχων» έδειξαν οφέλη όταν χρησιμοποιείται σε συνδυασμό με βάση την πλατίνα διπλού παράγοντα για NSCLC χημειοθεραπεία, όπως bevacizumab, erlotinib και gefitinib, σε μια υποομάδα ασθενών [5], [6]. Ως εκ τούτου, η ανάπτυξη νέων μοριακών στοχευμένων φαρμάκων με πιο γενική αποτελεσματικότητα για ασθενείς με καρκίνο του πνεύμονα είναι επιτακτική καθήκον.

Οι επιγενετικές μεταβολές, καθώς και γενετικές αλλοιώσεις συσχετίζονται με ογκογένεση [7]. Μια πρόσφατη έκθεση επισημαίνει ότι οι επιγενετικές αλλαγές που περιλαμβάνουν τροποποιήσεις των ιστονών Η2Α και Η3 σε ασθενείς με ΜΜΚΠ επηρεάζουν τη συνολική επιβίωση και την επιβίωση ελεύθερη νόσου, παρέχοντας την προγνωστική αξία των τροποποιήσεων ιστονών [8]. Αποκαλύπτει επίσης το σκεπτικό για τη χρήση των φαρμάκων κατά της ιστόνης τροποποίηση ως θεραπευτική στρατηγική για NSCLC.

αποακετυλάσες ιστόνης (HDACs) είναι τα ένζυμα που καταλύουν την αποακετυλίωση των ιστονών και επιγενετικώς ρυθμίζουν την αρχιτεκτονική της χρωματίνης και της γονιδιακής έκφρασης. Έχει αποδειχθεί ότι η αναστολή των HDAC αντιστρέφει έκτροπου επιγενετική κατάσταση και παρουσιάζει ισχυρή αντικαρκινική δραστηριότητες επάγοντας διακοπή του κυτταρικού κύκλου, διαφοροποίηση και /ή απόπτωση σε καρκινικά κύτταρα ποικίλες [9], [10]. HDAC αναστολείς ταξινομούνται σε έξι ομάδες ανάλογα με τη χημική τους δομή και τουλάχιστον 12 από αυτά έχουν προοδεύσει σε κλινικές δοκιμές [9], [11]. Μέχρι σήμερα, η αμερικανική Υπηρεσία Τροφίμων και Φαρμάκων εγκρίνει δύο αναστολείς HDAC, vorinostat (SAHA, σουμπεροϋλανιλίδιο υδροξαμικό οξύ, Zolinza®) και romidepsin (ΡΚ228, δεψιπεπτίδιο, Istodax®), για τη θεραπεία των δερματικών εκδηλώσεων των δερματικών Τ-κυτταρικό λέμφωμα (CTCL ) [12]. Ωστόσο, ορισμένα ανεπιθύμητα συμβάντα συμβαίνουν σε ασθενείς που έλαβαν θεραπεία με vorinostat ή άλλους αναστολείς HDAC, η οποία μπορεί να προκύψει από τις υψηλές συγκεντρώσεις της δόσης που χρησιμοποιήθηκε κατά τη διάρκεια της θεραπείας για συμπαγείς όγκους σε κλινικές δοκιμές [11], [13].

η παρούσα μελέτη, προτείνουμε μια νέα κατηγορία ισχυρών αναστολέων HDAC που βασίζονται φαινυλοβουτυρικό, OSU-HDAC-44 [4- (2,2-διμεθυλο-4-φαινυλ-βουτυρυλαμινο) –

N

– υδροξυ-βενζαμίδιο ], ένα παράγωγο του γνωστού αναστολέα HDAC,

N

(4-φαινυλβουτυρυλ-αμινο) βενζαμίδιο-4- Υδροξυ (HTPB) [14]. Τα κατά του όγκου δραστηριότητες και οι μηχανισμοί OSU-HDAC-44 μελετήθηκε σε NSCLC κύτταρο και ποντικούς ξενομοσχεύματος μοντέλα. Βρήκαμε ότι OSU-HDAC-44 ήταν ένας αναστολέας παν-HDAC και εκτίθενται 3-4 φορές μεγαλύτερη αποτελεσματικότητα στην καταστολή του πολλαπλασιασμού των κυττάρων

in vitro

και ανάπτυξη του όγκου

in vivo

σε σύγκριση με SAHA ή τριχοστατίνης Α (TSA). Επιπλέον, OSU-HDAC-44 που προκαλείται από την μίτωση και κυτοκίνηση ελάττωμα που ακολουθείται από μιτοχόνδρια με τη μεσολάβηση απόπτωση σε αμφότερες τις κυτταρικές και ζωικά μοντέλα. Χρωματίνη-ανοσοκατακρήμνιση-on-chip ανάλυση αποκάλυψε τα γονίδια-στόχους γονιδιώματος σε επίπεδο που προκαλείται από OSU-HDAC-44-μεσολάβηση υπερακετυλίωση της χρωματίνης. Τα στοιχεία μας δείχνουν ότι OSU-HDAC-44 ήταν ένας αναστολέας HDAC και θα μπορούσε να εφαρμοστεί ως στοχευμένη αντικαρκινικό φάρμακο για NSCLC χημειοθεραπεία.

Αποτελέσματα

OSU-HDAC-44 αναστέλλει τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων και εμφανίζει συνεργιστικά αποτελέσματα με σισπλατίνη ανεξάρτητα από ρ53 κατάσταση

Η δομή του OSU-HDAC-44 και SAHA φαίνονται στο Σχ. 1Α. ανάλυση σύνδεσης έδειξαν ότι OSU-HDAC-44 αλληλεπιδρά με τον καταλυτικό τομέα της HDAC 8, γεγονός που υποδηλώνει την άμεση λειτουργία του OSU-HDAC-44 ως προς τη στόχευση HDACs (Εικ. 1Β).

(Α) Χημική δομή του OSU -HDAC-44 και SAHA. (Β) Μοριακή ανάλυση σύνδεσης των OSU-HDAC-44 και SAHA. Οι δομές της OSU-HDAC-44 και SAHA υπολογίστηκαν και ο τρόπος σύνδεσης στο καταλυτική περιοχή της HDAC8 είχε προβλεφθεί χρησιμοποιώντας το ΧΡΥΣΟ προγράμματος σύνδεσης 4.0.1. (C) Δόση εξαρτώμενη επιδράσεις της OSU-HDAC-44 (

αριστερά

) και SAHA (

δεξιά

) επί της βιωσιμότητας των κυττάρων σε IMR90, Η1299, Α549 και κύτταρα CL1-1. Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 0,5-10 μΜ OSU-HDAC-44 ή SAHA για 48 ώρες, και η βιωσιμότητα των κυττάρων εκτιμήθηκε με δοκιμασία εξαίρεσης κυανούν τρυπανίου. (D) OSU-HDAC-44 synergized με σισπλατίνη να καταστέλλουν τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων. Τα κύτταρα εκτέθηκαν σε σισπλατίνη (Cis) μόνο για 4 ώρες, OSU-HDAC-44 (HDAC-44) μόνο για 48 ώρες, ή σε προεπεξεργασία με OSU-HDAC-44 για 48 ώρες πριν από τη θεραπεία cisplatin για 4 ώρες, και στη συνέχεια του φαρμάκου ήταν αποσύρθηκε και τα κύτταρα επωάστηκαν με φαρμακο-ελεύθερα μέσα ενημέρωσης για επιπλέον 48 ώρες. Η βιωσιμότητα των κυττάρων εκτιμήθηκε με δοκιμασία εξαίρεσης κυανούν τρυπανίου. CL1-1 κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 4,4 μΜ cisplatin ή 0,3 μΜ OSU-HDAC-44. Κύτταρα Α549 υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 1,6 μΜ cisplatin ή 0,2 μΜ OSU-HDAC-44. Τα δεδομένα αντιπροσωπεύουν μέση τιμή ± SEM από τρία ανεξάρτητα πειράματα. *

P

& lt? 0,05? **

P

& lt? 0,01? ***

P

& lt?. 0.001

Η

Οι δραστηριότητες ανάπτυξης των κυττάρων αναστολή της OSU-HDAC-44 αξιολογήθηκαν σε τρεις ανθρώπινες κυτταρικές σειρές NSCLC συμπεριλαμβανομένων Α549 (ρ53 άγριου τύπου) , Η1299 (p53 null), και CL1-1 (p53 μεταλλαγμένα). SAHA συμπεριλήφθηκε ως θετικός αναστολέας HDAC ελέγχου. OSU-HDAC-44 ανέστειλε σημαντικά τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων σε όλες τις κυτταρικές σειρές καρκίνου παρά τις διαφορές τους στο παρασκήνιο ρ53, και δεν προκάλεσε εμφανή κυτταροτοξικότητα σε IMR90 κύτταρα, ένα φυσιολογικό πνεύμονα κυτταρική γραμμή (Σχ. 1 C). OSU-HDAC-44 κατέστειλε κυτταρικής βιωσιμότητας των Α549 και CL1-1 κύτταρα με υπομικρομοριακή IC

50 τιμές (0,65 ± 0,08 και 0,67 ± 0,01 μΜ, αντίστοιχα) και το IC

50 αξία των Η1299 εξήχθησαν είναι 1.14 ± 0.14 μΜ. Αξίζει να σημειωθεί ότι, OSU-HDAC-44 εμφάνισε 3-4 φορές περισσότερο από ό, τι ισχύ SAHA σε αντικαρκινική ικανότητα (IC

50: Α549, 1,90 ± 0,16? CL1-1, 2,85 ± 0,27? Η1299, 4,87 ± 0,98 μΜ). Επιπλέον, το Σχ. 1D έδειξε ότι OSU-HDAC-44 ενήργησαν σε συνέργεια με σισπλατίνη για να ενισχύσει τον κυτταρικό θάνατο σε CL1-1 και τα κύτταρα Α549, τα οποία ήταν και οι δύο σισπλατίνη-ανθεκτικά κύτταρα.

OSU-HDAC-44 επάγει αναστολή κυτταροκίνηση και την απόπτωση

για να διερευνήσουν τον υποκείμενο μηχανισμό της καταστολής της ανάπτυξης των κυττάρων από OSU-HDAC-44, τα αποτελέσματα της OSU-HDAC-44 στην εξέλιξη του κυτταρικού κύκλου αξιολογήθηκαν με κυτταρομετρία ροής. Η θεραπεία με 2.5 μΜ OSU-HDAC-44 για 24 ώρες προκάλεσε Α549 και Η1299 κύτταρα να συσσωρεύονται σε φάση G2 /M (4Ν κύτταρα), και στη συνέχεια οδήγησε σε απόπτωση (κύτταρα υπο-G1) σε 48 ώρες επεξεργασίας, ενώ η έκθεση σε υψηλότερη συγκέντρωση (5 μΜ) του SAHA για 48 ώρες είχαν παρόμοια επίδραση (Εικ. 2Α), υποδεικνύοντας ότι OSU-HDAC-44 ασκείται μια πιο ισχυρή κυτταρικού κύκλου απορρύθμισης επίδραση από ό, τι SAHA. Να εξετάσει τις κυτταρικές συνέπειες της OSU-HDAC-44-μεσολάβηση συσσώρευση των κυττάρων 4Ν, πραγματοποιήθηκαν μικροσκοπικές αναλύσεις time-lapse. Όπως φαίνεται στο Σχ. S1A, OSU-HDAC-44 προκάλεσε την εμφάνιση του ελαττωματικού δομή αυλάκι διάσπασης και τα δύο θυγατρικά κύτταρα συντήκονται πίσω μαζί, ενώ μη κατεργασμένα κύτταρα πέρασαν κανονικά μέσω της κυτταρικής διαίρεσης. Να συμπίπτει, περίπου το 20% των κυττάρων σε επεξεργασία με OSU-HDAC-44 συσσωρεύτηκαν ως bi-εμπύρηνων κυττάρων, σε σύγκριση με λιγότερο από 5% των κυττάρων ελέγχου (Σχ. 2Β και Σχ. S1B). OSU-HDAC-44 επίσης προκάλεσε το σχηματισμό μικροπυρήνων και διαταράσσεται η φυσιολογική δομή του F-ακτίνης των Α549 και Η1299 κύτταρα (Εικ. 2Β). Ως εκ τούτου, αυτά τα αποτελέσματα έδειξαν ότι OSU-HDAC-44 μπορεί να προκαλέσει παρεκκλίνουσα κυτταροκίνηση και εν συνεχεία οδήγησαν σε απόπτωση σε καρκινικά κύτταρα του πνεύμονα.

(Α) Τα αποτελέσματα του OSU-HDAC-44 για τη διανομή του κυτταρικού κύκλου σε Α549 και Η1299 κύτταρα. Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε θεραπεία με 2,5 μΜ OSU-HDAC-44 ή 5 μΜ SAHA για υποδεικνυόμενους χρόνους και αξιολογήθηκαν με κυτταρομετρία ροής.

Αριστερά

, τα αποτελέσματα από ένα αντιπροσωπευτικό πείραμα παρουσιάζονται.

Δεξί

, το μέσο ποσοστό των G2 /M και κλάσμα υπο-G1 πληθυσμός χαράσσεται στο ιστόγραμμα. (Β) Οι bi-πυρήνες κυττάρων και απορρύθμισης των F-ακτίνης που προκαλείται από OSU-HSAC-44. Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε θεραπεία με 2,5 μΜ OSU-HDAC-44 για 48 ώρες και στη συνέχεια σταθεροποιήθηκαν και χρωματίσθηκαν με ϋΑΡΙ (DNA) και φαλλοειδίνη (F-ακτίνη). Asterisk επεσήμανε την bi-πυρήνα. Ράβδοι κλίμακας: 30 μm. (C) OSU-HDAC-44 που προκαλείται από την υποβάθμιση της Aurora Β και survivin μέσω 26S μονοπατιού πρωτεασώματος.

Άνω

, εξαρτώμενη από τον χρόνο μειώσεις στις Aurora Β και τα επίπεδα της πρωτεΐνης survivin μετά από 2,5 μΜ OSU-HDAC-44 της θεραπείας.

Μέση

, κύτταρα Α549 υποβλήθηκαν σε αγωγή με 2,5 μΜ OSU-HDAC-44 με την παρουσία ή απουσία MG132 για 24 ώρες.

Κάτω

, κύτταρα Α549 υποβλήθηκαν σε αγωγή με 2,5 μΜ OSU-HDAC-44 για 24 ώρες και κυτταρικό λύμα υποβλήθηκε σε δοκιμασία IP χρησιμοποιώντας αντι-Aurora Β ή αντι-survivin ειδικά αντισώματα και γίνεται αποτύπωμα με αντίσωμα αντι-ουβικουϊτινίωση ( Anti-Ub). δοκιμασία (D) δραστηριότητα κασπάσης (

αριστερά)

και αναλύσεις Western blot (

δεξιά)

επιβεβαίωσε ότι OSU-HDAC-44 που προκαλείται από ενδογενή οδό της απόπτωσης. Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε θεραπεία με 2,5 μΜ OSU-HDAC-44 για υποδεικνυόμενους χρόνους και η υποβλήθηκαν σε δοκιμασία δραστικότητας κασπάσης και αναλύσεις κηλίδος Western. Τα δεδομένα αντιπροσωπεύουν μέση τιμή ± SEM από τρία ανεξάρτητα πειράματα. *

P

& lt? 0,05? **

P

& lt?. 0.01

Η

Για τον προσδιορισμό του μοριακού μηχανισμού που εμπλέκονται στην OSU-HDAC-44 που προκαλείται από την αναστολή κυτταροκίνηση, εξετάστηκαν οι κυτταρικό κύκλο ρυθμιστικών πρωτεϊνών. Η ταλάντωση του μιτωτικό αναστολέα Weel και μιτωτική δείκτες φωσφορυλιωμένη ιστόνη Η3 και έκφραση της κυκλίνης Β έδειξε ότι OSU-HDAC-44-επεξεργασμένα κύτταρα ήταν σε φάση Μ μετά από θεραπεία 12 ώρες και στη συνέχεια βγήκε φάση Μ (Σχ. S1c), η οποία συνοδεύεται με κυτοκίνηση ελάττωμα. Επιπλέον, OSU-HDAC-44 προκάλεσε μειώσεις στα επίπεδα πρωτεΐνης του Aurora Β και survivin (Σχήμα 2C?. Άνω), τα οποία είναι απαραίτητα για την εξέλιξη της μίτωσης και κυτταροκίνηση [15], [16]. Αξίζει να σημειωθεί ότι, OSU-HDAC-44 που προκαλείται από ουβικουϊτινίωση της Aurora Β και survivin, και της ταυτόχρονης θεραπείας με αναστολέα πρωτεοσώματος MG132 εμπόδισε την OSU-HDAC-44 που προκαλείται από την υποβάθμιση της Aurora Β και survivin (Σχήμα 2C?. Μέση και κάτω). Στη συνέχεια, χρησιμοποιήσαμε νοκοδαζόλη να συγχρονίσετε τα κύτταρα σε προ-μετάφαση και για την περαιτέρω επιβεβαίωση ότι OSU-HDAC-44 πράγματι προκάλεσε ανώμαλη υποβάθμιση της Aurora Β και survivin σε μιτωτική φάση. Όπως φαίνεται στο Σχ. S1D και Ε, η θεραπεία με νοκοδαζόλη για 24 ώρες προκάλεσε συσσώρευση σε Aurora Β και πρωτεΐνες survivin, ενώ συνδυασμός της OSU-HDAC-44 και νοκοδαζόλη οδήγησε σε μειώσεις Aurora Β και τα επίπεδα της πρωτεΐνης survivin μετά 24 ώρες μετά τη θεραπεία. Αυτά τα αποτελέσματα έδειξαν ότι η OSU-HDAC-44-μεσολάβηση αποτυχία της κυτοκίνησης μπορεί εν μέρει να προκύψουν από την αρνητική ρύθμιση της Aurora Β και πρωτεΐνες survivin μέσω 26S μονοπατιού πρωτεασώματος.

OSU-HDAC-44 ενεργοποιεί την εγγενή αποπτωτικό μονοπάτι

για να διευκρινιστεί περαιτέρω η OSU-HDAC-44-επαγόμενη απόπτωση, εκτελέσαμε φωσφατιδυλοσερίνη (PS) χρώση αναλύσεις για την ανίχνευση της πρόωρης διαδικασία της απόπτωσης. Όπως φαίνεται στο Σχ. S2, OSU-HDAC-44 θεραπεία για 24 ώρες αύξησε την ένταση της χρώσης PS σε αντίθεση με χαμηλή ένταση χρώσης κατά την κατεργασία DMSO σε Α549 και κύτταρα Η1299. Επιπλέον, OSU-HDAC-44 θεραπεία διεγείρεται σημαντικά τις δραστηριότητές της κασπάσης-3 και κασπάσης-9 (ένας δείκτης της εγγενούς μιτοχονδριακό μονοπάτι) μετά από 24 ώρες θεραπείας ενώ η δραστικότητα της κασπάσης-8 (ένας δείκτης της οδού του υποδοχέα εξωγενές μεμβράνη) παρέμεινε ανεπηρέαστη σε Α549 και κύτταρα Η1299 (Σχ. 2D, αριστερά). Επιπλέον, η θεραπεία με 2,5 μΜ OSU-HDAC-44 για 12 ώρες προκάλεσε μείωση στην αντι-αποπτωτική πρωτεΐνη Bcl-x

L, ενώ αυξήθηκε η προ-αποπτωτική πρωτεΐνη, Bad, εντός 6-12 ωρών θεραπεία σε Α549 και κύτταρα Η1299 (Σχ. 2D, δεξιά). Η απελευθέρωση του κυτοχρώματος c στο κυτοσόλιο συνοδεύεται από την διάσπαση του προ-κασπάσης-9 παρατηρήθηκε επίσης μετά OSU-HDAC-44 θεραπεία για 24-48 ώρες. Αυτά τα αποτελέσματα επιβεβαίωσαν επίσης ότι OSU-HDAC-44 θα μπορούσε να προκαλέσει την εγγενή αποπτωτικό μονοπάτι σε καρκινικά κύτταρα του πνεύμονα.

OSU-HDAC-44 επάγει την ακετυλίωση πρωτεΐνης με την ικανότητά του να στοχεύσετε πολλές HDACs

Οι βιοδείκτες της αναστολής HDAC είναι ακετυλίωση της ιστόνης και μη-ιστόνης πρωτείνες και η επαγωγή ρ21

έκφραση Cip1 σε ρ53-ανεξάρτητο τρόπο [17], [18]. Η έκθεση σε OSU-HDAC-44 προκαλούμενη ακετυλίωση της ιστόνης Η3, Η4 ιστόνης και ρ53 σε ένα δοσο-εξαρτώμενο τρόπο (εικ. 3Α) και χρονο-εξαρτώμενο τρόπο (Εικ. 3Β), ενώ δεν επηρέασε τα επίπεδα πρωτεΐνης HDAC1 και HDAC6 (Σχ. 3Β και Σχ. S3). Αξίζει να σημειωθεί ότι, τα αποτελέσματα αυτά ήταν μεγαλύτερη σε σχέση με εκείνη του SAHA. Παρά την κατάσταση ρ53, OSU-HDAC-44 επήγαγε την έκφραση του p21

Cip1 mRNA και πρωτεΐνης σε Α549 και Η1299 κύτταρα (Σχ. S4). Για να εξετασθεί η ειδικότητα στόχου της OSU-HDAC-44 με την κλάση Ι, II, και IV HDACs,

in vitro

δοκιμασίας αναστολής HDAC διεξήχθη. Όπως φαίνεται στο Σχ. 3C, οι δραστηριότητες δεακετυλάσης διαφορετικών ισοτόπων HDAC συμπεριλαμβανομένων τάξης Ι (HDAC1 και HDAC8), κατηγορίας II (HDAC4 και HDAC6), και της κατηγορίας IV (HDAC11) ήταν σημαντικά αναστέλλεται από OSU-HDAC-44. Τέτοια αποτελέσματα ήταν μεγαλύτερα σε σύγκριση με εκείνη του SAHA, ενός γνωστού αναστολέα της παν-HDAC. Αυτά τα αποτελέσματα πρότειναν ότι OSU-HDAC-44 προκαλούμενη ακετυλίωση πρωτεΐνης ασκώντας ευρεία ανασταλτική δράση κατά πολλές HDACs.

δοσοεξαρτώμενες επιδράσεις (Α) και χρονο-εξαρτώμενη επιδράσεις (Β) του OSU-HDAC-44 για την πρωτεΐνες ιστόνης και μη ιστόνης. Ac-Η3, ακετυλιωμένη Η3 ιστόνης? Ac-Η4, ακετυλιωμένη Η4 ιστόνης? Ac-p53, p53 ακετυλιωμένο? p53, p53 συνολική. (C) OSU-HDAC-44 κατέστειλε τις δραστηριότητες της τάξης Ι (HDAC1 και HDAC8), κατηγορίας II κατηγορίας IV (HDAC11) HDACs (HDAC4 και HDAC6), και. Διαφορετικές ισότυποι HDAC ανοσοκαταβυθίστηκαν από πυρηνικό εκχύλισμα Η1299 από ειδικά αντισώματα, και στη συνέχεια υποβάλλεται σε

in vitro

δοκιμασία αναστολής HDAC όπως περιγράφεται στα Υλικά και Μέθοδοι τμήμα. Τα δεδομένα αντιπροσωπεύουν μέση τιμή ± SEM από τρία ανεξάρτητα πειράματα. **

P

& lt? 0,01? ***

P

& lt?. 0.001

Η

OSU-HDAC-44 αυξάνει την έκφραση των γονιδίων με τη χαλάρωση της δομής της χρωματίνης

Για τον προσδιορισμό των άμεσων επιπτώσεων της OSU- HDAC-44 επί της χρωματίνης δομή και την έκφραση του γονιδίου, η χρωματίνη-ανοσοκαταβύθιση (μάρκας) -ον-chip διεξήχθη ανάλυση χρησιμοποιώντας το αντίσωμα κατά του χαλαρά σήμα χρωματίνης, ακετυλιωμένα λυσίνες 9 και 14 της ιστόνης Η3 (H3K9K14Ac), μετά από 2,5 μΜ OSU- θεραπεία HDAC-44 για 2 ώρες σε Α549 και Η1299 κύτταρα. Επαγωγή της ιστόνης ακετυλίωση σε 33 κοινά γονιδίου τόπους των Α549 και Η1299 εντοπίστηκαν μετά OSU-HDAC-44 θεραπεία (Πίνακας S1). Αρκετά από αυτά τα 33 γονίδια είχαν αποδειχθεί ότι παίζουν σημαντικό ρόλο σε ορισμένες οδούς σηματοδότησης, όπως απόπτωση, οξειδωτική αντίδραση στο στρες, την καθοδήγηση νευράξονας και οδοί πρωτεΐνη ουβικιτινίωση (Πίνακας 1). Για να επιβεβαιώσετε τα δεδομένα μικροσυστοιχιών, θα επικυρωθεί η δομή της χρωματίνης του μερικά από τα γονιδίου τόπους συμπεριλαμβανομένων των

srGAP1

,

NR4A1

και

FOXO4 από

ChIP-PCR χρησιμοποιώντας το αντίσωμα έναντι H3K9K14Ac. Όπως φαίνεται στο Σχ. 4Α, η θεραπεία με 2,5 μΜ OSU-HDAC-44 για 2 ώρες αύξησε το ποσό των

srGAP1

,

NR4A1

και

FOXO4

DNA προαγωγού με χαλαρή δομή της χρωματίνης σε σύγκριση με τα μη επεξεργασμένα κύτταρα. Να συμπίπτει με τα επίπεδα του mRNA της

srGAP1

,

NR4A1

και

FOXO4

αυξήθηκαν μετά OSU-HDAC-44 θεραπεία για 24 ώρες (Εικ. 4Β).

(Α) χρωματίνη ανοσοκαταβύθιση-PCR αναλύσεις επιβεβαιώθηκε ότι η αγωγή με 2,5 μΜ OSU-HDAC-44 για 2 ώρες επαγόμενη ακετυλίωση της ιστόνης Η3 (H3K9K14Ac) στην περιοχή προαγωγού του

srGAP1

,

NR4A1

και

FOXO4

γονίδια. (Β) OSU-HDAC-44 αύξησε τα επίπεδα του mRNA της

srGAP1

,

NR4A1

και

FOXO4

γονιδίων χρησιμοποιώντας σε πραγματικό χρόνο ανάλυση RT-PCR. Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε θεραπεία με 2,5 μΜ OSU-HDAC-44 για 24 ώρες και το ολικό RNA εκχυλίστηκε για τον πραγματικό χρόνο αναλύσεις RT-PCR. Τα δεδομένα αντιπροσωπεύουν μέση τιμή ± SEM από τρία ανεξάρτητα πειράματα. *

P

& lt? 0,05. δοκιμασία (C) Ανοσοκαταβύθιση έδειξε ότι η αυξημένη αλληλεπίδραση μεταξύ srGAP1 και RhoA προκλήθηκε από OSU-HDAC-44. Α549 κύτταρα επεξεργασμένα ή μη επεξεργασμένα με 2.5 μΜ OSU-HDAC-44 για 24 ώρες και υποβλήθηκαν σε ΙΡ-αναλύσεις Western. (D) SI-srGAP1 καταργηθεί το OSU-HDAC-44-επαγόμενη μείωση της δραστηριότητας RhoA (

πάνω

) και έσωσε την κανονική δομή της F-ακτίνης μετά OSU-HDAC-44 της θεραπείας (

κάτω

). Κύτταρα Α549 επιμολυσμένα με srGAP1 siRNA υποβλήθηκαν σε θεραπεία με 2,5 μΜ OSU-HDAC-44 για 24 ώρες και υποβάλλεται σε δοκιμασία ενεργοποίησης RhoA και αναλύσεις ανοσοφθορισμού. Ράβδοι κλίμακας:. 30 μm

Η

OSU-HDAC-44 ρυθμίζει προς τα κάτω F-ακτίνης δυναμική μέσω επαγωγής srGAP1

προκαλείται από F-ακτίνη συνάθροιση OSU-HDAC-44 θεραπεία (Εικ. 2Β). Προηγούμενη μελέτη έδειξε ότι srGAP1 συνδέεται με τις δραστικές μορφές του RhoA και Cdc42 και αναστέλλει τις δραστηριότητές τους στη ρύθμιση της ακτίνης πολυμερισμού σε νευρικά κύτταρα [19]. Ωστόσο, η βιολογική λειτουργία της δέσμευσης srGAP1 να RhoA παραμένει ασαφής σε άλλα κύτταρα. Χρησιμοποιώντας ανοσοκαταβύθιση (ΙΡ) -Δυτική, δείξαμε ότι OSU-HDAC-44 αύξησε την αλληλεπίδραση μεταξύ srGAP1 και RhoA σε Α549 κύτταρα καρκίνου του πνεύμονα (Εικ. 4C). Είναι ενδιαφέρον, knockdown του srGAP1 κατάργησε όχι μόνο το OSU-HDAC-44-διαμεσολαβούμενη μείωση στο επίπεδο RhoA-GTP (Σχ. 4D, άνω), αλλά και αποκατέστησε τη δυναμική της F-ακτίνης μετά OSU-HDAC-44 θεραπεία (Εικ. 4D , χαμηλότερα). Αυτά τα αποτελέσματα έδειξαν ότι OSU-HDAC 44-ρυθμισμένα προς τα κάτω δραστικότητα RhoA εν μέρει μέσω επαγωγής srGAP1, οδηγώντας σε καταστροφή του φυσιολογικού F-ακτίνης ινών.

OSU-HDAC-44 αναστέλλει την ανάπτυξη ξενομοσχευμάτων όγκου πνεύμονα

in vivo

η

Για να αξιολογηθεί περαιτέρω η αντικαρκινική δράση της OSU-HDAC-44, Λάμπα /c null ποντίκια που φέρουν ξενομόσχευμα Α549 πνεύμονα όγκου ενδοπεριτοναϊκή ένεση με 7,5-30 mg /kg OSU-HDAC-44, 3 ημέρες /εβδομάδα για τρεις εβδομάδες. TSA του 0,5 mg /kg, η οποία έχει αποδειχθεί ότι εμφανίζουν επιδράσεις στην ανάπτυξη αντι-όγκου σε ξενομόσχευμα καρκίνου του μαστού και της ουροδόχου κύστης καρκινικά κύτταρα [20], [21], χρησιμοποιήθηκε ως ένας θετικός έλεγχος φαρμάκου. Όπως φαίνεται στο Σχ. 5Α, η θεραπεία με 7,5, 15 και 30 mg kg-OSU HDAC-44 ανέστειλε σημαντικά την ανάπτυξη /όγκου κατά 62%, 78% και 90%, αντίστοιχα, κατά την ημέρα 33 μετά τη θεραπεία σε σύγκριση με τον έλεγχο του οχήματος. Η θεραπεία με OSU-HDAC-44 δεν επηρέασε δυσμενώς το σωματικό βάρος και δεν προκάλεσε ανιχνεύσιμη τοξικότητα όπως εξετάστηκε από αιματοξυλίνη και ηωσίνη χρώση των μεγάλων οργάνων (Εικ. 6Α, Β). Αιματολογικές εξετάσεις βιοχημεία ήταν στα φυσιολογικά όρια για OSU-HDAC-44 αγωγή ζώα (Εικ. 6C).

(Α) Ποντίκια που φέρουν τους όγκους Α549 εγκατεστημένος (-50 mm

3) ενέθηκαν ενδοπεριτοναϊκώς με 7,5, 15 ή 30 mg /kg του OSU-HDAC-44 ή 1,5 mg /kg του TSA 3 ημέρες /εβδομάδα για τρεις εβδομάδες. Οκτώ ποντικοί ανά ομάδα χρησιμοποιήθηκαν στο πείραμα ξενομοσχεύματος. Μετρήθηκαν οι όγκοι των όγκων των ποντικών. Σημεία, σημαίνει? μπάρες σφάλματος, 95% διαστήματα εμπιστοσύνης.

P

τιμές ήταν για συγκρίσεις με τον έλεγχο του οχήματος (*

P

& lt? 0,05? **

P

& lt? 0,01? ***

P

& lt? .001). (Β-D) ποντικών που φέρουν καθοριστεί (περίπου 100~200 mm

3) όγκους Α549 ενέθηκαν ενδοπεριτοναϊκώς με μία μόνη δόση του OSU-HDAC-44 στα 60 mg /kg. Μετά τη θεραπεία για τον υποδεικνυόμενο χρόνο, οι όγκοι συλλέχθηκαν και υποβλήθηκαν σε Western blot ή ανοσοϊστοχημεία αναλύσεις. (Β) Οι όγκοι από δύο αντιπροσωπευτικά ποντίκια από κάθε χρονικό σημείο (Α-Ρ) συλλέχθηκαν και υποβλήθηκαν σε αναλύσεις κηλίδος Western, χρησιμοποιώντας τα υποδεικνυόμενα αντισώματα. (Γ) αναλύσεις Ανοσοϊστοχημεία πραγματοποιήθηκαν με τη χρήση αντισώματος έναντι διασπάστηκε-μορφή της κασπάσης 3 (καφετί χρώμα). Αρχική μεγέθυνση × 200. αναλύσεις (D) φθορισμού ανοσοϊστοχημεία διεξήχθησαν χρησιμοποιώντας αντίσωμα έναντι Aurora Β και ϋΑΡΙ (DNA). Οι εικόνες (d-f και j-l, κλίμακα μπαρ: 10 μm) μεγεθύνεται από πλαισιωμένο όνες (a-c και g-I, κλίμακα μπαρ: 30 μm).

Η

(Α) OSU-HDAC-44 θεραπείες δεν προκάλεσε σημαντική απώλεια σωματικού βάρους των εξεταζόμενων ζώων. (Β) Η &? Ε χρώση των εγκλεισμένων σε παραφίνη, 5 μm πάχους τομές της καρδιάς, του ήπατος, των πνευμόνων και των νεφρών από OSU-HDAC-44-επεξεργασμένων και μη επεξεργασμένων ποντίκια με ξενομοσχεύματα Α549. Δεν υπήρχαν εμφανείς ιστοπαθολογικές διαφορές μεταξύ αυτών των τμημάτων ιστών (αρχική μεγέθυνση χ 200). (Γ) Αιματολογικές βιοχημικές εξετάσεις συμπεριλαμβανομένων των GOT, GPT, αλβουμίνη, BUN, κρεατινίνη, και WBC εξετάστηκαν και τα αποτελέσματα δεν έδειξαν σημαντικές διαφορές μεταξύ DMSO και OSU-HDAC-44 της θεραπείας.

Η

OSU-HDAC -44 προκαλεί ακετυλίωση πρωτεΐνης, την απόπτωση και την κυτταροκίνηση αναστολή

in vivo

η

Για να επιβεβαιώσετε ότι OSU-HDAC-44 κατέστειλε την ανάπτυξη του όγκου ξένου μοσχεύματος μέσω στόχευση των HDACs και επαγωγή της απόπτωσης

in vivo

, ποντίκια που φέρουν όγκους Α549 εγκατεστημένος υποβλήθηκαν σε αγωγή με μια μονή δόση του OSU-HDAC-44. Μετά τη θεραπεία για προκαθορισμένο χρόνο, οι όγκοι αποκόπηκαν και υποβλήθηκαν σε Western blot, ανοσοϊστοχημεία ή ανάλυση ανοσοϊστοχημείας φθορισμού (Σχ. 5Β-D). Ακετυλίωση ιστόνης Η3, Η4 ιστόνης και ρ53 βαθιά αυξήθηκαν μετά τη θεραπεία 2 ώρες. Τα επίπεδα της πρωτεΐνης Bcl-x

L και survivin άρχισαν να μειώνονται μετά την θεραπεία 2 ώρες, ενώ το επίπεδο της πρωτεΐνης Bad αυξήθηκε μετά από 4 ώρες αγωγή (Σχ. 5Β). Η ενεργοποιημένη κασπάση-3 ανιχνεύθηκε επίσης τόσο στο κυτοσόλιο και πυρήνα μετά τη θεραπεία 8 ώρες και ενισχύθηκε περαιτέρω μετά από 24 ώρες θεραπείας (Εικ. 5C). Επιπλέον, OSU-HDAC-44 μειώθηκαν τα επίπεδα Aurora Β και διακοπεί η σύνδεσή της με το χρωμόσωμα μετάφαση σε σύγκριση με τα κύτταρα ελέγχου DMSO (Εικ. 5D). Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι OSU-HDAC-44 θα μπορούσε να προκαλέσει απόπτωση και κάτω-ρυθμίζουν μιτωτική και κυτταροκίνηση ρυθμιστικές αρχές, Aurora Β και survivin,

in vivo

. Επιπλέον, η αύξηση των βιοδεικτών αναστολή HDAC όπως ακετυλίωση της ιστόνης Η3, Η4 ιστόνης και p53 ήταν εμφανής σε όγκους των ποντικών που έλαβαν.

Συζήτηση

Από HDACs είναι πολλά υποσχόμενη στόχοι για τη θεραπεία του καρκίνου, μια αριθμός αναστολέων HDAC είναι σε κλινικές δοκιμές ως ενιαία θεραπεία ή /και σε συνδυασμό με άλλα αντικαρκινικά φάρμακα [9]. Ωστόσο, η αποτελεσματική HDAC αναστολείς για τη θεραπεία των συμπαγών όγκων παραμένει να αναπτυχθεί. Σε αυτή τη μελέτη, παρέχουν πειστικές αποδείξεις από μελέτες κυττάρων και ζώο που OSU-HDAC-44, μια ένωση που βασίζεται φαινυλοβουτυρικό, είναι ένας δυνητικός αναστολέας HDAC για θεραπεία NSCLC. OSU-HDAC-44 στοχευμένη πολυάριθμα μέλη εντός τριών κατηγοριών HDACs

in vitro

και αποτελεσματικά διεγείρεται ακετυλίωση πρωτεΐνης σε κυτταρικά και ζωικά μοντέλα (Εικ. 3 και 5). OSU-HDAC-44 καταστέλλεται η βιωσιμότητα των κυττάρων και την απόπτωση που επάγεται σε διάφορες κυτταρικές σειρές NSCLC με 3-4 φορές μεγαλύτερη ισχύ από SAHA (Σχ. 1C και 2Α). Επιπλέον, υπομικρομοριακή συγκέντρωση OSU-HDAC-44 παρουσίασαν ευδιάκριτα συνεργιστικές επιδράσεις σε συνδυασμό με σισπλατίνη για καταστολή του πολλαπλασιασμού των κυτταρικών σειρών NSCLC (Σχ. 1D). Τα πειράματα ξενομοσχεύματος επιβεβαίωσε περαιτέρω ότι OSU-HDAC-44 επάγεται απόπτωση των κυττάρων και έτσι να αναστέλλει την ανάπτυξη του όγκου

in vivo

(Εικ. 5) χωρίς να επηρεάζεται δυσμενώς το βάρος σώματος, τα κύρια όργανα και αιματολογικές παραμέτρους (Εικ. 6). Συλλογικά, αυτά τα αποτελέσματα έδειξαν ότι OSU-HDAC-44 είναι ένας υποσχόμενος αναστολέας HDAC υποψήφιος για θεραπεία NSCLC.

Έχει δειχθεί ότι αρκετές κινάσες και ρυθμιστικές πρωτεΐνες, όπως Aurora Β, suvivin καθώς και μικρά ΟΤΡάση RhoA απαιτούνται για τη συμπλήρωση κυτοκίνησης [22]. Η αναστολή της Aurora Β ή εξάντληση των survivin μπορεί να αποτρέψει τα αργά βήματα κυτταροκίνηση, που οδηγεί στο σχηματισμό της πολυ-εμπύρηνα κύτταρα [15], [16]. Στην παρούσα μελέτη, στοιχεία που αποδεικνύουν ότι OSU-HDAC-44 που προκαλείται από την πρωτεόλυση της Aurora Β και survivin τόσο

in vitro

και

in vivo

(Σχ. 2C και Σχ. 5Β, D) , η οποία συνδέεται με OSU-HDAC-44-διαμεσολαβούμενη αναστολή κυτοκίνηση, με αποτέλεσμα τη συσσώρευση του δι-εμπύρηνων κυττάρων (Σχ. 2Β και Σχ. S1A-Β). Επιπλέον, ο συνδυασμός ενός προ-μετάφασης νοκοδαζόλη επαγωγέα και OSU-HDAC-44 είχε σαν αποτέλεσμα μείωση των επιπέδων Aurora Β και πρωτεΐνη survivin μετά 24 ώρες μετά τη θεραπεία (Εικ. S1E). Αυτά τα δεδομένα υποδηλώνουν ότι OSU-HDAC-44-μεσολάβηση ελάττωμα κυτταροκίνηση οφειλόταν σε ανώμαλη υποβάθμιση της Aurora Β και survivin στη μιτωτική φάση. Έχει αναφερθεί ότι η υπερέκφραση της Aurora Β συσχετίζεται με την έκφραση survivin στον πυρήνα, λεμφαδένα εισβολή, και κακή πρόγνωση σε ασθενείς με NSCLC [23]. Έτσι, η κλινική αποτελεσματικότητα της OSU-HDAC-44 σε σχέση με τα κάτω-ρυθμίζονται Aurora Β και surivin στη θεραπεία των ασθενών με NSCLC είναι άξιο περαιτέρω έρευνα.

Σε αυτή τη μελέτη, πραγματοποιήσαμε ένα τσιπ-on-chip ανάλυση για τη διερεύνηση των γονιδίων-στόχων γονιδιώματος σε επίπεδο που επάγεται από OSU-HDAC-44-διαμεσολαβούμενη υπερακετυλίωση της χρωματίνης μετά από έκθεση 2 ώρες, και βρέθηκε ότι η ακετυλίωση ιστόνης διεγέρθηκαν σε 33 κοινά γονίδια στις κυτταρικές γραμμές που εξετάστηκαν, συμπεριλαμβανομένων γονιδίων καταστολής οκτώ όγκου (ΕΠΙΠ ) ή ΕΠΠΕ-όπως γονίδια (Πίνακας S1). Αρκετά γονίδια παίζουν ουσιαστικό ρόλο στην απόπτωση, οξειδωτική αντίδραση στο στρες, την καθοδήγηση άξονα και τα μονοπάτια της πρωτεΐνης ουβικιτινίωση (Πίνακας 1). Η

srGAP1

γονίδιο, το οποίο κωδικοποιεί μια πρωτεΐνη ΟΤΡάσης ενεργοποίησης γνωστό ότι ρυθμίζει την καθοδήγηση νευράξονα [19], επιβεβαιώθηκε να είναι στην ανοικτή δομή χρωματίνης και αυξήθηκε το επίπεδο έκφρασης (Σχ. 4Α, Β). Είναι ενδιαφέρον, βρήκαμε ότι OSU-HDAC-44 μείωσε την δραστικότητα ενός μικρού ΟΤΡάσης RhoA μέσω επαγωγής srGAP1 και συνέβαλαν στην απορύθμιση της F-ακτίνης δυναμική (Σχ. 4C, D). Αυτά τα αποτελέσματα έδειξαν ότι OSU-HDAC-44 μπορεί να διακόψει τη μίτωση και κυτοκίνηση που προκύπτουν από τις μεταβολές του διάφορα πρόσθετα οδούς, όπως srGAP1 έλεγχος /RhoA /F-ακτίνης. Επιπλέον, δύο γονίδια που σχετίζονται με την απόπτωση,

NR4A1 /Nur77

και

FOXO4

, επικυρώθηκαν από τα δεδομένα ChIP-on-chip και τις εκφράσεις του mRNA τους ήταν όντως αυξήθηκε κατά OSU-HDAC-44 ( Σχ. 4Α, Β). NR4A1 /Nur77 και FOXO4 έχουν δειχθεί ότι ενεργοποιούν εγγενή απόπτωση μέσω επαγωγής απελευθέρωσης μιτοχονδριακού κυτοχρώματος c και ρύθμιση προς τα κάτω της Bcl-x

έκφραση L, αντίστοιχα [24] – [26]. Τέτοια NR4A1 /Nur77 απόπτωση που διαμεσολαβείται έχει αποδειχθεί ότι επάγεται από έναν αναστολέα HDAC, LBH589, σε κύτταρα CTCL [27]. Τα αποτελέσματά μας από κυτταρικά και ζωικά μοντέλα έδειξαν ότι η OSU-HDAC-44-επαγόμενο κυτταρικό θάνατο ήταν πιθανόν μέσω της ενδογενούς αποπτωτική παθολογική οδό (Σχ. 2D και 5Β). Ως εκ τούτου, η μεταγραφική up-ρύθμιση του

NR4A1 /Nur77

και

FOXO4

μπορεί να συμβάλει στην OSU-HDAC-44-μεσολάβηση εγγενή απόπτωση.

Παρόμοια με το εύρημα μας επιλεκτικής αλλαγή χρωματίνη από ένα κλάσμα του γονιδιακούς τόπους τσιπ-on-chip, πρόσφατες μελέτες χρησιμοποιώντας μικροσυστοιχίες cDNA δείχνουν ότι αρκετές HDAC αναστολείς όπως TSA, SAHA, MS-275 και δεψιπεπτιδίου μεταβάλλουν μόνο 7-20% γονιδιακή έκφραση σε διάφορες καρκινικές κυτταρικές γραμμές [ ,,,0],28] – [30]. Ειδικά πρόσληψη των συμπλοκών συνκαταστολέα περιέχουν HDACs από παράγοντες μεταγραφής ή /και ρυθμιστές μεταγραφής πιστεύεται ότι παίζει ουσιαστικό ρόλο στην μεταγραφική καταστολή [31] – [33], ωστόσο, η επιλεκτική δράση των αναστολέων HDAC επί συγκεκριμένων γονιδίων παραμένει ασαφής. Έτσι, αξίζει να διερευνήσει κατά πόσον μπορεί να υπάρξει κοινή και κριτική συγκροτήματα ρύθμισης της μεταγραφής περιέχει HDACs που καθορίζουν τα επίπεδα ακετυλίωσης της χρωματίνης των γονιδίων αυτών επικυρώνονται από τον Chip-on-chip δεδομένων.

Εν κατακλείδι, τα ευρήματά μας δείχνει ότι OSU-HDAC-44 είναι ένας νέος αναστολέας παν-HDAC που εμφανίζει ένα ευρύ φάσμα αντικαρκινικής δραστηριότητες στο κελί και μοντέλα ξενομοσχεύματος NSCLC, η οποία περιλαμβάνει όχι μόνο ακετυλίωση ιστονών που εξαρτάται από την ενεργοποίηση της μεταγραφής του γονιδίου, αλλά επίσης την ενεργοποίηση της εγγενούς αποπτωτικών οδών και μετα-μεταφραστική ρύθμιση προς τα κάτω της μιτωτικής ρυθμιστικές αρχές, Aurora Β και survivin. Επιπλέον, RhoA /F-ακτίνης έλεγχος κινητικότητα ανεστάλη από srGAP1 και αρκετές πρωτεΐνες επαγωγής απόπτωσης ενεργοποιήθηκαν με OSU-HDAC-44 (Εικ. 7). Συλλογικά, τα δεδομένα μας παρέχει πειστικές αποδείξεις ότι OSU-HDAC-44 είναι ένα HDAC στοχευμένη αναστολέα και έχει τη δυνατότητα να ελεγχθεί για τη θεραπεία NSCLC και ο συνδυασμός χημειοθεραπείας.

OSU-HDAC-44 είναι ένα μυθιστόρημα αναστολέας παν-HDAC ότι επιδεικνύει ένα ευρύ φάσμα αντικαρκινική δράση σε NSCLC κυττάρων και μοντέλα ξενομοσχεύματος, η οποία περιλαμβάνει την ακετυλίωση της ιστόνης-εξαρτώμενη ενεργοποίηση της μεταγραφής του γονιδίου στον πυρήνα. Για παράδειγμα, η εκ νέου έκφραση NR4A1 και FOXO4 μαζί με την ενεργοποίηση της κασπάσης προκαλεί εγγενή απόπτωση. Επιπλέον, RhoA /F-ακτίνης έλεγχος κινητικότητα αναστέλλεται από srGAP1 που προκύπτουν από την ενεργοποίηση από OSU-HDAC-44. *, P & lt? 0,05? ** P & lt? 0,01. *** P & lt? 0.001.