Αφηρημένο

πρωτεΐνη κουτί Fork-κεφάλι Α1 (FOXA1) είναι ένας «παράγοντας πρωτοπόρος», που είναι γνωστό ότι συνδέονται με τον υποδοχέα ανδρογόνων (AR) και ρυθμίζουν την μεταγραφή του AR-ειδικών γονιδίων. Ωστόσο, ο ακριβής ρόλος των FOXA1 στον καρκίνο του προστάτη (PC) παραμένει άγνωστη. Σε αυτή τη μελέτη, αναφέρουμε ότι FOXA1 διαδραματίζει έναν κρίσιμο ρόλο στον πολλαπλασιασμό των κυττάρων PC. Η έκφραση του FOXA1 ήταν υψηλότερη σε PC σε σχέση με φυσιολογικούς ιστούς προστάτη (Ρ = 0.0002), και, χρησιμοποιώντας ανοσοϊστοχημική ανάλυση, βρήκαμε ότι FOXA1 εντοπίστηκε στον πυρήνα. επίπεδα έκφρασης FOXA1 συσχετίζονταν σημαντικά τόσο με PSA και Gleason σκορ (Ρ = 0,016 και Ρ = 0.031, αντίστοιχα). Επιπλέον, FOXA1 πάνω ρύθμιση ήταν ένας σημαντικός παράγοντας στην αποτυχία PSA (P = 0,011). Η εξάντληση των FOXA1 σε καρκίνο του προστάτη κυτταρική γραμμή (LNCaP) χρησιμοποιώντας μικρά RNA παρεμβολής (siRNA) αναστέλλει σημαντικά δραστικότητα AR, οδήγησε σε καταστολή της ανάπτυξης κυττάρου, και επάγεται σύλληψης G0 /G1. Το αντι-πολλαπλασιαστική επίδραση του FOXA1 siRNA είχε προκαλείται μέσω πρωτεΐνη δέσμευσης όμοιου με ινσουλίνη αυξητικού παράγοντα 3 (IGFBP-3). Μια αύξηση στην IGFBP-3, που προκαλείται από την εξάντληση των FOXA1, ανέστειλε φωσφορυλίωση των ΜΑΡΚ και Akt, και αυξημένη έκφραση του ρυθμιστών κυτταρικού κύκλου ρ21 και ρ27. Βρήκαμε επίσης ότι η αντι-πολλαπλασιαστική δράση της εξάντλησης FOXA1 σημαντικά αντιστράφηκε με ταυτόχρονη εξάντληση siRNA της IGFBP-3. Τα ευρήματα αυτά παρέχουν άμεση φυσιολογική και μοριακή απόδειξη για ένα ρόλο των FOXA1 στον έλεγχο του πολλαπλασιασμού των κυττάρων μέσω της ρύθμισης της IGFBP-3 έκφραση στο PC

Παράθεση:. Imamura Υ, Sakamoto S, Endo Τ, Ουτσούμι T, Fuse M , Suyama Τ, et al. (2012) FOXA1 Προωθεί Tumor Progression στον καρκίνο του προστάτη μέσω του Insulin-Like Growth Factor Binding Protein 3 Pathway. PLoS ONE 7 (8): e42456. doi: 10.1371 /journal.pone.0042456

Επιμέλεια: Irina Agoulnik, Διεθνές Πανεπιστήμιο της Φλόριντα, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 27 Μαρτίου 2012? Αποδεκτές: 9, Ιουλίου, 2012? Δημοσιεύθηκε: 3, Αυγούστου, 2012

Copyright: © Imamura et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από μια επιχορήγηση-in-ενίσχυση από το Υπουργείο Παιδείας, Επιστήμης, Αθλητισμού και Πολιτισμού της Ιαπωνίας (αρ. 20390420, αρ. 22791469). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

ο καρκίνος του προστάτη (PC), η πιο κοινή μορφή καρκίνου στους άνδρες, είναι μια δεύτερη κύρια αιτία θανάτου από καρκίνο σχετίζονται στις περισσότερες δυτικές χώρες και γίνεται όλο και πιο συχνή στις χώρες της Ασίας, καθώς και [1]. Το ανδρογόνο ορμόνη και τον υποδοχέα ανδρογόνων (AR) είναι απαραίτητα για την φυσιολογική ανάπτυξη, διαφοροποίηση και διατήρηση του αδένα του προστάτη, και επίσης παίζουν κρίσιμο ρόλο στην ανάπτυξη του PC [2]. Έτσι, η θεραπεία του προχωρημένου PC περιλαμβάνει αναστέλλοντας την παραγωγή των ανδρογόνων ή ανταγωνισμού AR και γονιδίων-στόχων της [1]. Ωστόσο, PC υποτροπές μετά την εξαγορά της αντίστασης ευνουχισμού. Μια πρόσφατη μελέτη έδειξε ότι ένα χαμηλό επίπεδο ενδονεοπλαστική ανδρογόνων κατά τη διάρκεια της θεραπεία απόσπασης ανδρογόνων συνεχίζει να ενεργοποιήσει το AR, η οποία οδηγεί σε περαιτέρω πρόοδο της PC σε μετάσταση [3]. Ως εκ τούτου, ακόμη και σε προχωρημένο στάδιο της PC, η ρύθμιση της δραστικότητας AR είναι σημαντική για τη θεραπεία του PC.

βασίζεται σε προηγούμενη ανάλυση μικροσυστοιχιών στην οποία συγκρίναμε την έκφραση γονιδίων της καλοήθους υπερπλασίας του προστάτη (ΒΡΗ) και PC, ταυτοποιήσαμε το πλαίσιο πρωτεΐνη Fork-κεφαλή Α1 (FOXA1) ως ένα γονίδιο του οποίου η έκφραση είναι σημαντικά πάνω ρυθμισμένα σε PC [4]. FOXA1 είναι ένας παράγοντας μεταγραφής που ανήκει στην οικογένεια ανθρώπινου γονιδίου κουτί forkhead, και FOXA1 εμπλέκεται στην οργανογένεση ενδοδερμικής, του μεταβολισμού και της ομοιόστασης [5]. FOXA1 συνδέεται άμεσα με την AR και ρυθμίζει τη μεταγραφή του προστάτη-ειδικών γονιδίων [6]. FOXA1 χρησιμεύει επίσης ως «παράγοντας πρωτοπόρος» για AR σε περιοχές της μεταγραφικής ρύθμισης [7], [8]. Έτσι, η σύνδεση του FOXA1 να τροποποιημένων ιστόνης συνδέονται με ενεργό χρωματίνη διευκολύνει την μεταγενέστερη πρόσληψη των πυρηνικών υποδοχέων και μεταγραφικής ενεργοποίησης [7], [8]. Αρκετές γραμμές των αποδεικτικών στοιχείων που συνδέονται FOXA1 με την ανάπτυξη του προστάτη. έκφραση Επιθηλιακά FOXA1 έχει παρατηρηθεί σε όλα τα στάδια της ανάπτυξης και της διαφοροποίησης του προστάτη ποντικού [6], [9]. Το ποντίκι FOXA1-defecient κατέδειξε απώλεια της μορφογένεσης του προστάτη και διαφοροποίηση [9], [10]. FOXA1 συμβάλλει επίσης στην οιστρογόνα σηματοδότηση στον καρκίνο του μαστού, και έχει συσχετιστεί με αυλού υποτύπου και καλή πρόγνωση [11], [12]. Αυξημένη έκφραση FOXA1 έχει επίσης παρατηρηθεί στο παχύ έντερο, τον πνεύμονα, του θυρεοειδούς, καρκίνο του οισοφάγου και του καρκίνου του προστάτη [13] – [15].

Αν και FOXA1 συνδέονται με την ανάπτυξη του προστάτη και ρύθμιση ανδρογόνου, ο ακριβής μηχανισμός πώς FOXA1 συμβάλλουν για εξέλιξη PC, ειδικά ρύθμιση των FOXA1 που εξαρτώνται από γονίδια στόχους στο PC παραμένουν σχετικά άγνωστα.

Η παρούσα μελέτη διερευνήθηκε ο ρόλος των FOXA1 σε εξέλιξη PC. Ταυτοποιήσαμε ινσουλίνη αυξητικού παράγοντα πρωτεΐνη 3 (IGFBP-3) σύνδεση ως νέου στόχου FOXA1 για τη ρύθμιση του κυτταρικού πολλαπλασιασμού σε κύτταρα PC.

Αποτελέσματα

Η Εκδήλωση FOXA1 στον προστάτη καρκινικούς ιστούς και συσχέτιση με κλινικούς παράγοντες

Ερευνήσαμε την πρωτεΐνη έκφραση FOXA1 στο PC με ανοσοϊστοχημική ανάλυση (IHC) των δειγμάτων PC. Αντιπροσωπευτικά αποτελέσματα IHC έκφρασης πρωτεΐνης σε κανονικούς FOXA1 πλησίον όγκου (ΝΑΤ) και σε ιστούς PC που φαίνεται στο Σχήμα 1Α και Β Θετική FOXA1 ανοσοαντιδραστικότητα ανιχνεύθηκε στον πυρήνα και εν μέρει του κυτταροπλάσματος. Μια ισχυρή ανοσοαντίδραση FOXA1 ανιχνεύθηκε στους πυρήνες των κυττάρων στην αλλοίωση του καρκίνου, ενώ τα κύτταρα στην ΝΑΤ έδειξαν ασθενή ανοσοχρώση κυρίως στο κυτταρόπλασμα. Τα IHC βαθμολογίες χρώσης FOXA1 του ΝΑΤ και των βλαβών PC κυμαίνονταν από 30,2 να 123,0 (διάμεσος, 73.3) και από τις 20,4 να 260.1 (διάμεσος, 125,1), αντίστοιχα. Τα IHC βαθμολογίες χρώσης FOXA1 βλαβών PC ήταν σημαντικά υψηλότερες από αυτές του ΝΑΤ (Σχήμα 1 C, Ρ = 0,0002). Με βαθμολογία IHC, το 62% των δειγμάτων PC ήταν θετικά για FOXA1, ενώ το υπόλοιπο 38% των δειγμάτων ήταν αρνητικά. Οι συσχετισμοί μεταξύ των κλινικοπαθολογοανατομικών χαρακτηριστικά των ασθενών με PC και την κατάσταση της πρωτεϊνικής έκφρασης FOXA1 χρησιμοποιώντας το σύστημα βαθμολόγησης IHC φαίνονται στον Πίνακα 1. Αυτά τα δεδομένα έδειξαν ότι FOXA1 θετικά PCs συσχετίσθηκαν με την τιμή PSA (Ρ = 0,016), το Gleason σκορ των υπολογιστών (Ρ = 0,031) και η έκφραση του AR (Ρ = 0,002) (Πίνακας 1). Υπολογιστές που ήταν θετικά τόσο για FOXA1 και AR είχαν σημαντικά υψηλότερες βαθμολογίες Gleason από υπολογιστές που ήταν τόσο FOXA1- και AR-αρνητικό (P = 0,027) (Πίνακας 2).

Η πρωτεΐνη έκφραση FOXA1 σε αντιπροσωπευτικές φυσιολογικό παρακείμενο να όγκου (ΝΑΤ) ιστού (Α) και PC ιστού (Β), όπως αναλύθηκε χρησιμοποιώντας IHC, δείχνεται. NAT εμφανίζεται χαμηλή έκφραση της πρωτεΐνης FOXA1. χρώση FOXA1-θετικά παρατηρήθηκε σε περιπτώσεις PC. Θετική ανοσοχρώση FOXA1 ανιχνεύθηκε στον πυρήνα. Αρχική μεγέθυνση, × 400. (Γ) Ποσοτικοποίηση χρώσης FOXA1 του ΝΑΤ και ιστών PC. Οι βαθμολογίες FOXA1 IHC υπολογίστηκαν ως εξής: σκορ IHC = 1 × (αριθμός των ασθενώς χρωσμένων κυττάρων στο πεδίο) + 2 × (αριθμός των μετρίως χρώση κυττάρων στο πεδίο) + 3 × (αριθμός έντονα χρωματισμένο κυττάρων στο πεδίο) . Οι FOXA1 IHC βαθμολογίες για τους φυσιολογικούς ιστούς του προστάτη και για προσωπικούς υπολογιστές κυμαίνονταν από 30,2 να 123,0 (διάμεσος, 73.3) και από τις 20,4 να 260,1 (διάμεσος, 125,1), αντίστοιχα. Up-ρυθμιζόμενη έκφραση FOXA1 (D) συσχετίστηκε σημαντικά με την αποτυχία PSA (P = 0,011), αλλά πάνω-ρυθμισμένη έκφραση AR (Ε) δεν ήταν (P = 0.4457). στατιστικά στοιχεία log-rank χρησιμοποιήθηκαν για να δοκιμαστεί η διαφορά στους χρόνους επιβίωσης μεταξύ των ομάδων. FOXA1 (+), επάνω ρυθμισμένη FOXA1? FOXA1 (-), κάτω-ρυθμίζονται FOXA1. AR (+), επάνω ρυθμισμένη AR? AR (-), κάτω-ρυθμίζονται AR. ** Δείχνει μια στατιστικά σημαντική διαφορά της P & lt?. 0.01

Η

Η

Η ανάλυση επιβίωσης χρησιμοποιώντας τη μέθοδο Kaplan-Meier έδειξε ότι FOXA1 πάνω ρύθμιση ήταν ένας σημαντικός παράγοντας στην αποτυχία PSA (Εικόνα 1D ? δοκιμασία log-rank, P = 0,011) σε σύγκριση με το AR πάνω ρύθμιση (Σχήμα 1 Ε? δοκιμασία log-rank, P = 0.4457). Τα ποσοστά επιβίωσης αποτυχία PSA περιπτώσεων με τα επάνω ρυθμισμένη και ρυθμισμένα προς τα κάτω FOXA1 ήταν 50,7 και 87,7%, αντίστοιχα. Τα ποσοστά επιβίωσης αποτυχία PSA σε περιπτώσεις με τα επάνω ρυθμισμένη και ρυθμισμένα προς τα κάτω AR ήταν 58,5 και 73,8%, αντίστοιχα.

Αξιολόγηση των FOXA1 Protein Expression σε Κυτταρικές Γραμμές PC-προερχόμενο

Στη συνέχεια ερευνήσαμε FOXA1 mRNA και έκφρασης πρωτεΐνης σε PC με ποσοτική αντίστροφη αλυσιδωτή αντίδραση μεταγραφής-πολυμεράσης (qRT-PCR) ανάλυση και κηλίδωση Western, αντιστοίχως, από τέσσερις κυτταρικές σειρές PC-προερχόμενο, συμπεριλαμβανομένων των ανδρογόνων ανεξάρτητη κυτταρική γραμμή (PC-3 και DU145), ανδρογόνο ευαίσθητο κύτταρο γραμμή (LNCaP), ανδρογόνο ευαίσθητος κυτταρική γραμμή (C4-2) καθιερώθηκαν από ευνουχισμένα υποδοχής των LNCaP και μη ογκογόνων κυτταρική σειρά προστάτη (RWPE-1) [16] – [19] (Εικόνα 2Α). Το μοριακό βάρος του FOXA1 με κηλίδωση Western ήταν 49 kDa. Τόσο FOXA1 mRNA και έκφρασης πρωτεΐνης ήταν σημαντικά υψηλότερα στα κύτταρα LNCaP ανδρογόνο ευαίσθητα και τα κύτταρα C4-2 σχέση με τις άλλες κυτταρικές σειρές.

(Α) Η έκφραση του mRNA και η πρωτεΐνη έκφραση του FOXA1 σε τέσσερα PC- προέρχονται κυτταρικές γραμμές (PC-3, DU-145, LNCaP, C4-2) και σε μη-ογκογόνα κυτταρική σειρά προστάτη (RWPE-1) αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας qRT-PCR και κηλίδωση Western, αντιστοίχως. (Β) LNCaP κύτταρα επιμολύνθηκαν με ένα αρνητικό μάρτυρα siRNA (αρνητικός) ή με ένα από τα τρία διαφορετικά siRNAs FOXA1 (siFOXA1 # 1-3). Μετά από 48 ώρες διαμόλυνσης, RNA εκχυλίστηκε και FOXA1 mRNA αναλύθηκε χρησιμοποιώντας ανάλυση qRT-PCR. έκφραση FOXA1 mRNA εκφράζεται σε σχέση με την έκφραση GAPDH mRNA στο ίδιο κύτταρο. Τα αποτελέσματα που δείχνονται είναι οι μέσες ± S.E.M. τριών ανεξάρτητων πειραμάτων. Οι πρωτεΐνες εκχυλίστηκαν από 72 ώρες μετά την επιμόλυνση και έκφραση FOXA1 και πρωτεΐνη GAPDH εξετάστηκε με αναλύσεις στυπώματος Western. (C, D) κύτταρα LNCaP μορφομετατράπηκαν με το pGL3-PSAP 5,8 λουσιφεράσης ανταποκριτή πλασμίδιο και με ένα από τα τρία διαφορετικά siRNAs FOXA1. (# 1-3) και στη συνέχεια αναπτύχθηκαν σε ελεύθερο κόκκινης φαινόλης RPMI-1640 που περιέχει 5% CS-FBS. (Γ) Μετά από 72 ώρες διαμόλυνσης, λουσιφεράση δραστηριότητες μετρήθηκαν χρησιμοποιώντας το σύστημα Dual-λουσιφεράσης δοκιμασίας ανταποκριτή. Οι λουσιφεράσης δραστηριότητες εκφράζονται σε σχέση με τον έλεγχο, η οποία ανατέθηκε μια τιμή 1. Οι πρωτεΐνες εκχυλίστηκαν 72 ώρες μετά την επιμόλυνση και την έκφραση του AR και GAPDH εξετάστηκε με ανάλυση κηλίδος western. (D) Τα επιμολυσμένα κύτταρα επωάστηκαν με τις υποδεικνυόμενες συγκεντρώσεις διϋδροτεστοστερόνης για 72 ώρες, και οι δραστηριότητες της λουσιφεράσης μετρήθηκαν όπως στο (C). (Ε, F) κύτταρα μη επιμολυσμένα LNCaP υπέστησαν κατεργασία με τις υποδεικνυόμενες συγκεντρώσεις διυδροτεστοστερόνη (Ε) ή βικαλουταμίδη (F) για 48 ώρες και η έκφραση mRNA FOXA1 κατόπιν αναλύθηκε χρησιμοποιώντας qRT-PCR. έκφραση FOXA1 mRNA εκφράζεται σε σχέση με την έκφραση GAPDH mRNA στο ίδιο κύτταρο. Οι τιμές που παρουσιάζονται είναι οι μέσες ± SD από τουλάχιστον 3 ανεξάρτητα πειράματα, κάθε πραγματοποιήθηκαν εις τριπλούν. * Και ** δείχνουν στατιστικά σημαντική διαφορά της P & lt? 0.05 και η P & lt?. 0.01, αντίστοιχα

Η

Για να αποκτήσετε κύτταρα στα οποία η έκφραση FOXA1 ήταν παροδικά γκρέμισε, εμείς επιμολυσμένα κύτταρα LNCaP με ένα από τα τρία διαφορετικά siRNAs FOXA1 (siFOXA1 # 1-3) πλασμίδια ή με αρνητικό έλεγχο siRNA (Νέγκα) πλασμίδιο. Στη συνέχεια αναλύονται mRNA FOXA1 και έκφραση πρωτεΐνης σε αυτά τα κύτταρα siFOXA1-μορφομετατρέπονται χρησιμοποιώντας qRT-PCR και την τεχνική Western blot, αντίστοιχα. SiFOXA1-επιμολυσμένα κύτταρα εμφανίζει μείωση του επιπέδου mRNA FOXA1 κατά σχεδόν 90% σε σύγκριση με εκείνη σε κύτταρα αρνη-επιμολυσμένα (Νέγκα). τα επίπεδα της πρωτεΐνης FOXA1 σε siFOXA1-επιμολυσμένα κύτταρα ήταν επίσης έντονα μειώθηκε σε σύγκριση με τα κύτταρα Νέγκα-επιμολυσμένα (Εικόνα 2Β).

Η Επίδραση της FOXA1 στην ανδρογόνων υποδοχέων δραστηριότητας και την επίδραση των AR ενεργοποίησης για έκφραση FOXA1

για να προσδιοριστεί η επίδραση της FOXA1 knockdown στη δραστηριότητα AR, επιμολύναμε τις siFOXA1-επιμολυσμένα κύτταρα LNCaP με ένα πλασμίδιο έκφρασης λουσιφεράσης καθοδηγείται από το αντιγόνο (PSA) υποκινητή ειδικού προστατικού, pGL3PSAp-5.8. Αν και δεν υπήρξε καμία διαφορά στην πρωτεΐνη έκφραση του AR σε siFOXA1-επιμολυσμένα κύτταρα ή σε κύτταρα Νέγκα επιμολυσμένα, siFOXA1-επιμολυσμένα κύτταρα έδειξαν μείωση σχεδόν 80% της δραστηριότητας προαγωγού PSA σε σύγκριση με εκείνη των κυττάρων αρνη-επιμολυσμένα (Σχήμα 2C). Όταν LNCaP κύτταρα ελέγχου που επιμολύνθηκαν μόνο με pGL3PSAp-5,8 υποβλήθηκαν σε αγωγή με τον συνδέτη διυδροτεστοστερόνη AR (DHT), η δραστικότητα προαγωγέα PSA αυξήθηκε με έναν δοσο-εξαρτώμενο τρόπο. Ωστόσο, συν-διαμόλυνση των κυττάρων αυτών με siFOXA1 μείωσε σημαντικά δραστηριότητα υποκινητή PSA μετά από θεραπεία με διάφορες συγκεντρώσεις της DHT (Σχήμα 2D). Για να εξετάσουμε την επίδραση της FOXA1depletion στην ενδογενή έκφραση του PSA, όπως FOXA1 πράξεις να αναδιαμορφώσει χρωματίνης, αναλύσαμε την έκφραση του PSA mRNA σε siFOXA1-επιμολυσμένα κύτταρα χρησιμοποιώντας qRT-PCR. Το σχήμα δείχνει ότι S1A εξάντληση FOXA1 μεσολαβεί σημαντική μείωση του επιπέδου PSA mRNA σε σύγκριση με εκείνη σε κύτταρα αρνη-επιμολυσμένα.

Για να καθοριστεί εάν η έκφραση του mRNA FOXA1 διαμεσολαβείται από δραστικότητα AR, ελέγξαμε την επίδραση της θεραπείας των κυττάρων LNCaP με DHT και ή με την βικαλουταμίδης ανταγωνιστή AR στην έκφραση FOXA1 mRNA. QRT-PCR ανάλυση έδειξε ότι δεν υπήρχε διαφορά στην έκφραση του mRNA της FOXA1 σε κύτταρα LNCaP ανδρογόνο ευαίσθητα μετά την ανάπτυξη σε μέσο που περιέχει DHT ή σε μέσο που περιέχει βικαλουταμίδη (Σχήμα 2Ε και F). Αυτά τα αποτελέσματα έδειξαν ότι FOXA1 μεσολαβεί η ενεργοποίηση του AR, όμως, η έκφραση της ίδιας της FOXA1 δεν ρυθμίζεται από ανδρογόνα.

FOXA1 ρυθμίζει τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων στο PC κύτταρα

Για να διερευνηθεί η επίδραση της FOXA1 νοκ ντάουν στο κελί πολλαπλασιασμός, η κυτταρική ανάπτυξη του siFOXA1 επιμολυσμένα κύτταρα LNCaP παρακολουθήθηκε επί 4 ημέρες. Οι siFOXA1-επιμολυσμένα κύτταρα έδειξαν μια σημαντική μείωση στην κυτταρική ανάπτυξη σε σύγκριση με κύτταρα επιμολυσμένα αρνη-(Σχήμα 3Α). Από την άλλη πλευρά, FOXA1 υπερεκφράζουν κυττάρων αυξήθηκε σημαντικά την κυτταρική ανάπτυξη σε σύγκριση με κύτταρα επιμολυσμένα αρνη-(Σχήμα S1c). Για να διερευνηθεί επίδραση της FOXA1 σε πρόοδο του κυτταρικού κύκλου, αναλύσαμε τα στάδια του κυτταρικού κύκλου siFOXA1 επιμολυσμένα κύτταρα χρησιμοποιώντας ανάλυση κυτταρομετρίας ροής. Το ποσοστό των siFOXA1 επιμολυσμένα κύτταρα στην φάση G0 /G1 ήταν υψηλότερη από εκείνη των κυττάρων αρνη-επιμολυσμένα (Σχήμα 3Β), γεγονός που υποδηλώνει ότι τα κάτω ρύθμιση FOXA1 ανέστειλε τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό με πρόκληση G0 /G1 σύλληψης.

(Α) LNCaP κύτταρα επιμολύνθηκαν με ένα αρνητικό μάρτυρα siRNA (αρνητικός) ή με ένα από τα τρία διαφορετικά siRNAs FOXA1 (# 1- # 3), και στη συνέχεια επανασπάρθηκαν σε πλάκα καλλιέργειας 24-φρεατίων. Ο πολλαπλασιασμός των κυττάρων προσδιορίστηκε στη συνέχεια πάνω από 4 ημέρες με μέτρηση του αριθμού των κυττάρων για κάθε κατάσταση επιμόλυνση, όπως υποδεικνύεται. (Β) το στάδιο του κυτταρικού κύκλου των κυττάρων αναλύθηκε χρησιμοποιώντας βαφή ιωδιούχου προπιδίου και FACS ανάλυση 24 ώρες μετά την επιμόλυνση siRNA και το ποσοστό των κυττάρων σε κάθε πληθυσμό που επιμολυσμένα ήταν σε κάθε φάση του κύκλου υπολογίστηκε. (Γ) LNCaP κύτταρα επιμολύνθηκαν με ένα αρνητικό μάρτυρα siRNA (αρνητικός) ή με ένα από τα τρία διαφορετικά siRNAs FOXA1 (siFOXA1 # 1-3). Μετά από 48 ώρες από την επιμόλυνση έκφρασης IGFBP-3 mRNA αναλύθηκε με qRT-PCR. IGFBP-3 mRNA έκφραση εκφράζεται σε σχέση με την έκφραση GAPDH mRNA στο ίδιο κύτταρο. (D) Κύτταρα LNCaP μορφομετατράπηκαν με αρνητικό έλεγχο siRNA (αρνητικός) ή με ένα από τα τρία διαφορετικά siRNAs FOXA1 (siFOXA1 # 1-3). Μετά από 72 h επιμόλυνσης, IGFBP-3 συγκέντρωσης των μέσων αναλύθηκε με ELISAs. (Ε) Οι πρωτεΐνες εκχυλίστηκαν 72 ώρες μετά την επιμόλυνση και την έκφραση του IGFBP3, της ινσουλίνης υποδοχέα σηματοδότησης σχετικών πρωτεϊνών (συνολική ποσότητα του ΜΑΡΚ, φωσφο-ΜΑΡΚ, το συνολικό ποσό των Akt και φωσφο-Akt), του G0 /G1 arrest- ρυθμιστικές πρωτεΐνες σχετικές κυτταρικού κύκλου (p21Cip1, p27kip1) και της GAPDH εξετάστηκε με ανάλυση κηλίδος western. Τα Protein μοριακά βάρη υποδεικνύονται στα δεξιά πλευρές του ανοίγματος. Τα αποτελέσματα αυτά είναι τα μέσα ± S.E.M. τριών ανεξάρτητων πειραμάτων. ** Δείχνει μια στατιστικά σημαντική διαφορά της P & lt?. 0.01

Η

Η εξάντληση των FOXA1 Ρυθμίζει IGFBP-3 και IGF Σηματοδοσίας

Για να αποκτήσουν μια εικόνα για τα γονίδια που είναι up-ρυθμίζονται από εξάντληση FOXA1 των κυττάρων PC, εκτελέσαμε γονίδιο ανάλυση μικροσυστοιχιών έκφραση των κυττάρων εξαντλούνται του FOXA1 (Πίνακας 3 και 4). Εμείς εντοπίστηκαν 421 γονίδια που ήταν πιο έντονα εκφράζεται σε κύτταρα FOXA1 εξαντλημένο από τις αρνητικές επιμολύνσεις ελέγχου. Ομαδοποίηση των up-ρυθμιζόμενα γονίδια σε λειτουργικές κατηγορίες έδειξε ότι το μεγαλύτερο ποσοστό του πάνω ρυθμισμένα γονίδια που σχετίζονται με τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό, που ακολουθείται από απάντηση σε τραυματισμό, τις διαδικασίες του συστήματος των μυών, οι αποκρίσεις άμυνας, φλεγμονώδεις αποκρίσεις, η αρνητική ρύθμιση του κυτταρικού πολλαπλασιασμού, απόκριση υποξία και ωρίμανση κυττάρων (Πίνακας 3). Τα ρυθμισμένα προς τα πάνω γονίδια που σχετίζονται με την αρνητική ρύθμιση του κυτταρικού πολλαπλασιασμού που απαριθμούνται στον Πίνακα 4. Από αυτές τις up-ρυθμιζόμενα γονίδια, μελετήσαμε περαιτέρω την ινσουλίνη αυξητικού παράγοντα πρωτεΐνη-3 δέσμευσης (IGFBP-3), δεδομένου ότι αυτό το γονίδιο είναι ένα καλά -Ιδρύθηκε γονίδιο όγκου-κατασταλτικό στον υπολογιστή [20] – [23]

η

Για να επιβεβαιώσετε τη ρύθμιση προς τα πάνω της IGFBP-3 σε κύτταρα LNCaP από την εξάντληση FOXA1 που υποδεικνύεται από τον μικροσυστοιχιών. δεδομένα, αναλύσαμε IGFBP-3 mRNA και έκφρασης πρωτεΐνης σε κύτταρα LNCaP επιμολυσμένα με siFOXA1 πλασμίδια ή με τον αρνητικό πλασμίδιο siRNA ελέγχου, χρησιμοποιώντας qRT-PCR και την τεχνική Western blot, αντίστοιχα. Η Εικόνα 3C δείχνει ότι IGFBP-3 mRNA έκφραση σε siFOXA1-επιμολυσμένα κύτταρα ήταν σημαντικά υψηλότερη από ότι σε κύτταρα αρνη-επιμολυσμένα. IGFBP-3 επίπεδα πρωτεΐνης σε siFOXA1-επιμολυσμένα κύτταρα επίσης έντονα αυξημένα σε σύγκριση με το επίπεδο σε κύτταρα αρνη-επιμολυσμένα (Σχήμα 3Ε). Επιπλέον, προκειμένου να αξιολογηθούν οι αλλαγές στα επίπεδα των εκκρινόμενων IGFBP-3, εκτελέσαμε ELISAs. Η Εικόνα 3D δείχνει ότι η συγκέντρωση IGFBP-3 στο μέσο των siFOXA1-επιμολυσμένων κυττάρων αυξήθηκε επίσης έντονα (πάνω από 30 φορές) σε σύγκριση με εκείνη των κυττάρων που αρνη-επιμολυσμένα. Δεδομένου ότι IGFBP-3 ρυθμίζει IGF-1 σηματοδότηση, έχουμε την επόμενη διερευνήθηκε αν ρύθμιση FOXA1 της IGFBP-3 έκφραση συσχετίστηκε με διαμόρφωση του επιπέδου έκφρασης ή ενεργοποίησης κατάστασης του IGF-1 καθοδικά σήματα σε αυτά τα κύτταρα (Σχήμα 3Ε). Η ανάλυση στυπώματος Western ενδεικνυόμενη σημειώνονται πάνω ρύθμιση της IGFBP-3, κάτω ρύθμιση της φωσφορυλίωσης της ΜΑΡΚ και Akt, και αυξητική ρύθμιση της πρωτεΐνης έκφρασης των αναστολέων εξαρτώμενης από κυκλίνη κινάσης (p21Cip1, p27kip1) σε siFOXA1-επιμολυσμένα κύτταρα σε σύγκριση με κύτταρα επιμολυσμένα αρνη-(Σχήμα 3Ε). Επιπλέον, η εξάντληση FOXA1 μπλοκάρει σημαντικά την ενεργοποίηση της ΑΚΤ σε απάντηση IGF-1 θεραπεία σε LNCaP (Σχήμα S1E). Αυτά τα αποτελέσματα έδειξαν ότι η ρύθμιση FOXA1 της IGFBP-3 συνοδεύεται από ρύθμιση του IGF-1 κατάντη σήματα.

Για να προσδιοριστεί η σημασία της IGFBP-3 για τη ρύθμιση FOXA1 πολλαπλασιασμού PC, συγκρίναμε την αύξηση των siFOXA1 επιμολυσμένα κύτταρα LNCaP και ότι από siIGFBP-3-επιμολυσμένα κύτταρα. IGFBP-3 ήταν παροδικά χτυπηθεί κάτω από την επιμόλυνση των κυττάρων LNCaP με ανάλυση της IGFBP-3 siRNA (siIGFBP-3) mRNA πλασμίδιο και IGFBP-3 και έκφραση πρωτεΐνης στα siIGFBP-3-επιμολυσμένα κύτταρα εκτιμήθηκε με χρήση qRT-PCR και κηλίδος western , αντίστοιχα. Το Σχήμα 4Α δείχνει ότι η IGFBP-3 mRNA και έκφρασης πρωτεΐνης στα siIGFBP-3-επιμολυσμένα κύτταρα ήταν σημαντικά χαμηλότερη από ότι στα αρνη-επιμολυσμένα κύτταρα. Αν και οι siFOXA1-επιμολυσμένα κύτταρα έδειξαν μια σημαντική μείωση στην κυτταρική ανάπτυξη σε σύγκριση με κύτταρα επιμολυσμένα αρνη-(Σχήμα 3Α και 4Β), το αντι-πολλαπλασιαστική επίδραση του siFOXA1 αντιστράφηκε με διπλή επιμόλυνση των siFOXA1 και siIGFBP-3 (Σχήμα 4Β). Αυτό το αποτέλεσμα έδειξε ότι FOXA1 ρυθμίζει τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων σε ένα IGFBP-3-εξαρτώμενο τρόπο.

(Α) LNCaP κύτταρα επιμολύνθηκαν με ένα αρνητικό μάρτυρα siRNA (αρνητικός) ή με ένα IGFBP-3 siRNA (siIGFBP-3) και, 48 ώρες αργότερα, IGFBP-3 mRNA και τα επίπεδα πρωτεΐνης αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας qRT-PCR και ανάλυση κηλίδας Western. IGFBP-3 mRNA έκφραση εκφράζεται σε σχέση με την έκφραση GAPDH mRNA στο ίδιο κύτταρο. (Β) LNCaP κύτταρα επιμολύνθηκαν με ένα αρνητικό μάρτυρα siRNA (αρνητικός) ή με ένα από τα τρία siRNAs FOXA1 (siFOXA1 # 1- # 3) και /ή ένα IGFBP-3 siRNA (siIGFBP-3), και επανεμβολιάζονται σε 24 -Καλά πλάκα καλλιέργειας. Ο πολλαπλασιασμός των κυττάρων μετρήθηκε πάνω από 4 ημέρες και ο αριθμός των κυττάρων για κάθε επιμολυσμένα πληθυσμό υποδεικνύεται. (C, D) κύτταρα LNCaP μορφομετατράπηκαν με αρνητικό έλεγχο siRNA (αρνητικός) ή με ένα AR siRNA (si AR) και /ή ένα FOXA1 siRNA (si FOXA1 # 1) και, 48 ώρες μετά την επιμόλυνση, AR mRNA και πρωτεΐνης ( Γ) ή τα επίπεδα IGFBP-3 mRNA (D) αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας qRT-PCR ή /και ανάλυση στυπώματος western. Τα επίπεδα mRNA εκφράζεται σε σχέση με την έκφραση GAPDH mRNA στο ίδιο κύτταρο. Τα αποτελέσματα που δείχνονται είναι οι μέσες ± S.E.M. τριών ανεξάρτητων πειραμάτων. ** Υποδηλώνουν στατιστική διαφορά της P & lt?. 0.01

Η

Από την ενεργοποίηση του AR έχει αναφερθεί σε κάτω-ρύθμιση IGFBP-3 έκφραση [24], μελετήσαμε περαιτέρω την επίδραση της AR για μεσολάβηση FOXA1 ρύθμιση της IGFBP-3 χρησιμοποιώντας Σιάρ-επιμολυσμένα κύτταρα (Σχήμα 4C και 4D). Η εξάντληση του AR έκαναν την αύξηση της έκφρασης του mRNA IGFBP-3 (2,8 φορές). Ωστόσο, η αύξηση IGFBP-3 έκφραση που παρατηρείται σε siFOXA1-επιμολυσμένα κύτταρα ήταν πολύ υψηλότερη (16,4 φορές) από ότι σε Σιάρ-επιμολυσμένα κύτταρα. Επιπλέον, η ταυτόχρονη εξάντληση του AR και FOXA1 οδήγησε σε περαιτέρω αύξηση IGFBP-3 έκφρασης (24,0 φορές) σε σύγκριση με την εξάντληση των FOXA1 μόνο, που υποδηλώνει ότι η FOXA1 και AR συνεργατικά ρυθμίζουν IGFBP-3 έκφρασης (Εικόνα 4D).

ο ρόλος της FOXA1 για Ευνουχισμός ανθεκτικό καρκίνο του προστάτη (CRPC) Μοντέλα

Είμαστε αξιολόγησε τον ρόλο των FOXA1 για τον καρκίνο του προστάτη ανεξάρτητο από ανδρογόνο χρησιμοποιώντας C4-2 κύτταρα, που ιδρύθηκε από ευνουχισμένα υποδοχής των κυττάρων LNCaP. Η εξάντληση των FOXA1 αναστέλλει σημαντικά την κυτταρική ανάπτυξη των κυττάρων C4-2 ακόμη και στο χαμηλό ανδρογόνων περιβάλλον (5% ξυλάνθρακα διηθείται FCS) συγκρίνουν με κύτταρα αρνη-επιμολυσμένα (Σχήμα 5Α). Overexpresssion των FOXA1 στα κύτταρα C4-2 προώθησε σημαντικά την ανάπτυξη των κυττάρων (Σχήμα S1D). Όταν κύτταρα ελέγχου C4-2 υποβλήθηκαν σε αγωγή με χαμηλές δόσεις του DHT (1-100 ρΜ), δραστηριότητα υποκινητή PSA ήταν ρυθμισμένη σε μια συγκέντρωση DHT 100 ρΜ. Ωστόσο, η επιμόλυνση του FOXA1 siRNA μπλοκάρει το πάνω ρύθμιση της δραστικότητας υποκινητή PSA που εμφανίστηκαν σε απόκριση στην θεραπεία DHT σε 100 ρΜ σε κύτταρα C4-2 (Σχήμα 5Β). Ομοίως, η εξάντληση των FOXA1 ανέστειλε σημαντικά την έκφραση του mRNA PSA σε qRT-PCR (Σχήμα S1B). Αναλύσαμε επίσης IGFBP-3 mRNA έκφραση σε κύτταρα επιμολυσμένα με C4-2 πλασμίδια siFOXA1 ή με τον αρνητικό μάρτυρα, χρησιμοποιώντας qRT-PCR. Το Σχήμα 5C δείχνει ότι IGFBP-3 mRNA έκφραση σε siFOXA1-επιμολυσμένα κύτταρα ήταν σημαντικά υψηλότερη από ότι σε κύτταρα αρνη-επιμολυσμένα. Το Σχήμα 5D δείχνει ότι η συγκέντρωση IGFBP-3 στο μέσο των siFOXA1-επιμολυσμένα κύτταρα αυξήθηκαν επίσης έντονα (πάνω από 40 φορές) σε σύγκριση με το επίπεδο σε κύτταρα αρνη-επιμολυσμένα. siFOXA1 ανέστειλε σημαντικά την φωσφορυλίωση της Akt μετά διέγερση με IGF-1 σε κύτταρα C4-2 παρόμοια με εκείνη των κυττάρων LNCaP, υποδεικνύοντας αρνητική ρύθμιση του IGF-1 σηματοδότηση την εξάντληση FOXA1 (Σχήμα S1F).

(Α) C4 -2 κύτταρα επιμολύνθηκαν με ένα αρνητικό μάρτυρα siRNA (αρνητικός) ή με ένα από τα τρία siRNAs FOXA1 (# 1- # 3), και στη συνέχεια επανασπάρθηκαν σε μια πλάκα καλλιέργειας 24 φρεατίων με ελεύθερο ερυθρού φαινόλης RPMI-1640 που περιέχει 5% CS-FBS. Ο πολλαπλασιασμός των κυττάρων μετρήθηκε στη συνέχεια επί 4 ημέρες και εμφανίζεται ως ο αριθμός των κυττάρων για κάθε επιμολυσμένα πληθυσμό. κύτταρα (Β) C4-2 διαμολύνθηκαν με το pGL3-PSAP ρεπόρτερ λουσιφεράσης 5,8 και με ένα FOXA1 siRNA (# 1) και αναπτύχθηκαν σε ελεύθερο κόκκινης φαινόλης RPMI-1640 που περιέχει 5% CS-FBS με τις υποδεικνυόμενες συγκεντρώσεις διϋδροτεστοστερόνης (1-100 ρΜ). Μετά από 72 ώρες διαμόλυνσης, δραστικότητα λουσιφεράσης μετρήθηκε χρησιμοποιώντας το σύστημα δοκιμασίας ανταποκριτή Dual-λουσιφεράσης. (C) κύτταρα C4-2 επιμολύνθηκαν με ένα αρνητικό μάρτυρα siRNA (αρνητικός) ή με ένα από τα τρία διαφορετικά siRNAs FOXA1 (siFOXA1 # 1-3). Μετά από 48 ώρες από την επιμόλυνση έκφρασης IGFBP-3 mRNA αναλύθηκε με qRT-PCR. IGFBP-3 mRNA έκφραση εκφράζεται σε σχέση με την έκφραση GAPDH mRNA στο ίδιο κύτταρο. (D) Κύτταρα C4-2 επιμολύνθηκαν με ένα αρνητικό μάρτυρα siRNA (αρνητικός) ή με ένα από τα τρία διαφορετικά siRNAs FOXA1 (siFOXA1 # 1-3). Μετά από 72 h επιμόλυνσης, IGFBP-3 συγκέντρωσης των μέσων αναλύθηκε με ELISAs. Τα αποτελέσματα που δείχνονται είναι οι μέσες ± S.E.M. τριών ανεξάρτητων πειραμάτων. * Και ** δείχνουν στατιστικά σημαντική διαφορά της P & lt? 0.05 και η P & lt?. 0.01, αντίστοιχα

Η

Συζήτηση

Η παρούσα μελέτη διερευνήθηκε ο ρόλος των FOXA1 σε εξέλιξη PC. Έχουμε προσδιορίσει το ογκοκατασταλτικό IGFBP-3 ως νέο στόχο FOXA1, και έδειξε ότι FOXA1 στόχευση του IGFBP-3 παίζει ουσιαστικό ρόλο στη ρύθμιση του κυτταρικού πολλαπλασιασμού PC.

IGFBP-3 έχει γίνει γνωστό να λειτουργεί ως ένα ογκοκατασταλτικό ή έναν αναστολέα του κυτταρικού κύκλου σε κύτταρα PC [21], [24]. Αυξημένη IGFBP-3 έκφραση μετά την εξάντληση FOXA1 ανέστειλε την φωσφορυλίωση της ΜΑΡΚ και της Akt και μεσολαβεί διακοπή του κυτταρικού κύκλου μέσω της αυξημένης έκφρασης του ρυθμιστών του κυτταρικού κύκλου p21 και p27 στα κύτταρα PC. FOXA1 έχει πρόσφατα αναφερθεί για τη ρύθμιση του πολλαπλασιασμού των κυττάρων του κυτταρικού κύκλου και σε κύτταρα LNCaP [15]. Τα δεδομένα μας έδειξαν ότι IGFBP-3 μπορεί να είναι ένας κύριος ρυθμιστής του κυτταρικού πολλαπλασιασμού FOXA1 εξαρτώμενη σε κύτταρα LNCaP. Με βάση τα αποτελέσματα μας, όχι μόνο το AR, αλλά και IGFBP-3 μπορεί να είναι ένας βασικός παράγοντας για τη μεσολάβηση FOXA1 σηματοδότησης στο PC.

FOXA1 είναι ένας μεταγραφικός παράγοντας που ρυθμίζει τη λειτουργία των υποδοχέων στεροειδών ορμονών. Στον προστάτη, FOXA1 αλληλεπιδρά με το AR και ελέγχει επαγόμενη ανδρογόνων ενεργοποίηση του ειδικού προστατικού γονιδίων [6]. Πρόσφατα, AR και παρακείμενες θέσεις σύνδεσης FOXA1 έχουν βρίσκονται σε πολλαπλούς προαγωγούς σε προστατικά κύτταρα [7], [25]. Παρόμοια με την λειτουργία του AR, η έκφραση FOXA1 είναι απαραίτητη για τη φυσιολογική ανάπτυξη καθώς επίσης και για ανδρογόνων ρύθμιση των PC [26]. Αυξημένη έκφραση του FOXA1 έχει παρατηρηθεί σε όλα τα στάδια της ανάπτυξης του προστάτη σε ένα μοντέλο ποντικού [27]. Βρήκαμε ότι FOXA1 υπερεκφράστηκε στους πυρήνες των κυττάρων PC, και ότι αυτή η υπερέκφραση συνδέθηκε με αυξημένο PSA, Gleason βαθμολογίες και έκφραση AR. Επιπλέον, η υπερέκφραση του FOXA1 ήταν ένας σημαντικός παράγοντας στην αποτυχία PSA. Εκείνοι αποτέλεσμα είναι συνεπές με την προηγούμενη έκθεση που δείχνει ότι η ένταση χρώσης FOXA1 ήταν σημαντικά ασθενέστερη στην παρακείμενη μη-καρκινικές από καρκινικό ιστό [28] και ότι η ισχυρή χρώση FOXA1 σχετίζεται με κακή πρόγνωση, υψηλότερα στάδια Pt και αυξημένη Gleason Βαθμού [15], [28 ]. Ένα υψηλό επίπεδο FOXA1 προηγουμένως βρεθεί σε 89% των μεταστατικών PC και η έκφραση του FOXA1 συσχετίστηκε θετικά με το μέγεθος του όγκου, εξωπροστατικών εισβολή, AR και λεμφαδένων εισβολή [29]. FOXA1 συμβάλλει στην ανδρογόνο-εξαρτώμενη ανάπτυξη των PC [30]. FOXA1 παίζει επίσης σημαντικό ρόλο στην έκφραση του ουμπικουϊτίνης-ένζυμο σύζευξης E2C (UBE2C), ένα γονίδιο που αδρανοποιεί το σημείο ελέγχου Μ-φάσης και UBE2C υπερεκφράζεται σε κυτταρικές σειρές PC ανεξάρτητου από ανδρογόνο και κλινικές περιπτώσεις [31]. μελέτες συσχέτισης γονιδιώματος σε επίπεδο έδειξε την παρουσία ενός πολυμορφισμού ενός νουκλεοτιδίου (rs119986220) στη θέση σύνδεσης FOXA1 εντός 8q24 αλληλόμορφα που σχετίζεται με τον κίνδυνο PC [25]. Η συνδυασμένη στοιχεία υποστηρίζουν τη σχέση μεταξύ FOXA1 και εξέλιξης του όγκου σε PC.

Μέσω της ανάλυσης γονιδιακής έκφρασης, εντοπίσαμε IGFBP-3 ως στόχο τα κάτω ρεύμα FOXA1. IGFBP-3 είναι μια ινσουλίνη αυξητικού παράγοντα πρωτεΐνη της οποίας η κύρια λειτουργία συνδέεται με την παράδοση IGF και διαθεσιμότητα [32] δεσμευτική. IGFBP-3 έχει μια μεγαλύτερη συγγένεια για τον IGF-1 από τον υποδοχέα IGF-1 και δεσμεύει την IGF-1 μεσολαβεί οδό. IGFBP-3 μπορεί ως εκ τούτου να μειώσει IGF-1 και αναστέλλουν τη βιοδιαθεσιμότητα του IGF-1 αλληλεπίδραση με τον υποδοχέα IGF-1, με τον τρόπο αυτό να λειτουργεί ως καταστολέας όγκου [21], [24]. Ένα IGF-ανεξάρτητο ρόλο της IGFBP-3 έχει επίσης πρόσφατα πιστοποιηθεί. IGFBP-3 συνδέεται με τον υποδοχέα τύπου V παράγοντα-β μετασχηματιστικής ανάπτυξης και έτσι αναστέλλει την ανάπτυξη των κυττάρων ανεξάρτητα από τα αποτελέσματά της επί του IGF [20], [33]. Επαγωγή της απόπτωσης μέσω συνεργική αλληλεπίδραση IGFBP-3 με έναν πυρηνικό υποδοχέα όπως τον υποδοχέα ρετινοειδούς Χ (RXR) -άλφα έχει επίσης παρατηρηθεί σε κύτταρα PC [24], [34]. Το αποτέλεσμά μας έδειξαν επίσης ότι η αυξημένη έκφραση του IGFBP-3 κατά την εξάντληση του FOXA1 αναστέλλει σημαντικά τον πολλαπλασιασμό PC σε κύτταρα LNCaP ευαίσθητο σε ανδρογόνο, πιθανότατα μέσω της οδού σηματοδότησης IGF-1. Αυξημένη IGFBP-3 την εξάντληση FOXA1 ανέστειλε φωσφορυλίωση των μεσολαβητών σηματοδότησης στο μονοπάτι σηματοδότησης IGF-1, περιλαμβανομένων ΜΑΡΚ και Akt, και μεσολαβεί διακοπή του κυτταρικού κύκλου μέσω της ρ21 και ρ27 σε κύτταρα PC. Τα τελευταία αποτελέσματα είναι σύμφωνα με μια προηγούμενη αναφορά ότι FOXA1 ήταν ρυθμισμένη σε μία βλάβη του καρκίνου του θυρεοειδούς και του εν λόγω εξάντλησης των επάγεται FOXA1 διακοπή του κυτταρικού κύκλου και τη μείωση του πολλαπλασιασμού των κυττάρων μέσω μιας ρ27-εξαρτώμενη μηχανισμός [14].

Απόκτηση ανδρογόνων αντίσταση σε PC, το οποίο ονομάζεται αντίσταση ευνουχισμός, είναι ένα μείζον πρόβλημα που περιορίζει την ποιότητα του ασθενούς της ζωής, καθώς και το προσδόκιμο ζωής. Αν και έχουν προταθεί αρκετοί μηχανισμοί για να εξηγήσει την ανάπτυξη του ευνουχισμού ανθεκτικών PC (CRPC), η κύρια οδός της αντοχής ακόμη φαίνεται ότι περιλαμβάνει την AR, ακόμη και κατά τη διάρκεια της αντι-ανδρογόνο θεραπεία. Ενίσχυση του AR, μετάλλαξη του AR, η υπερέκφραση του συνενεργοποιητές AR ή απορρύθμιση των αυξητικών παραγόντων /κυτοκινών μπορεί όλα να συμβεί σε CRPC και επάγουν μια αλλαγή στην απόκριση σε AR ανταγωνιστές. Ένας άλλος μηχανισμός του CRPC είναι μέσω διαφυγής από την απόπτωση λόγω της απώλειας του όγκου-κατασταλτικό γονίδιο PTEN και καταστολή της αντι-αποπτωτική γονίδιο BCL-2 [35]. Μια άλλη γνωστή αιτία CRPC είναι ότι το AR μπορεί να ενεργοποιηθεί σε ανθρώπινα κύτταρα PC απουσία ανδρογόνων από την IL-6 [36], [37]. Ύπαρξη τόσων πολλών πολύπλοκων μονοπάτια που σχετίζονται με τη ρύθμιση της ενεργοποίησης AR καθιστά δύσκολο για τον έλεγχο της ανάπτυξης των CRPC. Με βάση τα δεδομένα μας, η στόχευση των FOXA1 μπορεί να παρέχει μια πρακτική μέθοδο για την ρύθμιση προς τα κάτω της δραστηριότητας AR σε CRPC. Η εξάντληση των FOXA1 σημαντικά κάτω-ρυθμίζονται ενεργοποίηση AR εξαρτώμενη από συνδετήρα (έως και 80%) σε κύτταρα LNCaP και κυττάρων C4-2. Επιπλέον, η εξάντληση του FOXA1 πάνω ρυθμισμένα IGFBP-3 έκφραση και αναστέλλει σηματοδότηση του IGF-1, η οποία είναι μια σημαντική οδός για ανεξάρτητη από συνδέτη ενεργοποίηση των AR [38]. Ωστόσο, μια άλλη γραμμή των αποδεικτικών στοιχείων που αναφέρονται διττό ρόλο της FOXA1. Παρά το γεγονός ότι FOXA1 χρησιμεύει ως παράγοντας πρωτοπόρος προώθηση της AR και χρωματίνης αλληλεπίδραση, δημιουργεί όμως και συγκροτήματα συγκαταστολέας αναστολή AR και χρωματίνης δεσμευτική. Έτσι FOXA1 αποτελέσματα εξάντληση στην εμφάνιση ενός μεγάλου αριθμού νέων ARBs που συνδέονται με ανδρογόνων ρύθμιση των κοντινών γονιδίων [28], [39]. Από FOXA1 μεσολάβηση ρύθμιση των AR δεν έχει χαρακτηριστεί πλήρως, περαιτέρω ανάλυση θα αποκαλύψει τη θεραπευτική σημασία της FOXA1 σε CRPC.

Ως επόμενο βήμα, κατά τον προσδιορισμό της λειτουργίας FOXA1, είμαστε σήμερα μελετούν τις ακριβείς μηχανισμοί με τους οποίους FOXA1 ρυθμίζει IGFBP-3 έκφραση. 2+, μέτρια? τριών ανεξάρτητων πειραμάτων.