Αφηρημένο

Ιστορικό

Διαγράφεται καρκίνο του ήπατος 1 (DLC1) χρησιμεύει ως ένα σημαντικό πρωτεΐνης ενεργοποίησης RhoGTPase (RhoGAP) πρωτεΐνη που τερματίζει ενεργός RhoA σηματοδότησης σε ανθρώπινους καρκίνους. Αυξανόμενες ενδείξεις απέδειξε ότι η κατασταλτική δράση του όγκου των DLC1 δεν εξαρτάται μόνο από την δραστηριότητα RhoGAP, αλλά στηρίζεται και σε κατάλληλη εστιακή εντόπιση πρόσφυση μέσω της αλληλεπίδρασής της με tensin οικογένεια πρωτεϊνών. Πρόσφατα, υπάρχουν αναφορές που δείχνουν ότι DLC1 μπορεί επίσης να βρεθεί στον πυρήνα? Ωστόσο, η ύπαρξη και η σχετική δραστηριότητα κατασταλτική του όγκου των πυρηνικών DLC1 δεν έχουν σαφώς απευθύνεται.

Μεθοδολογία και ΚΥΡΙΟΤΕΡΑ ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ

Είμαστε εδώ παρέχουν νέες αποδείξεις ότι η πρωτεΐνη DLC1, η οποία κατά κύριο λόγο σχετίζεται με εστιακό συμφύσεις και εντοπίζεται στο κυτταρόπλασμα, δυναμικά μπαλάκι μεταξύ κυτταροπλάσματος και πυρήνα. Η θεραπεία των κυττάρων με την εξαγωγή blocker πυρηνικά, Leptomycin Β (ΕΜΒ), διατήρησε DLC1 στον πυρήνα. Για να κατανοήσουμε την πυρηνική είσοδο του DLC1, προσδιορίσαμε τα αμινοξέα 600-700 του DLC1 ως νέου περιοχή η οποία είναι σημαντική για τον πυρηνικό εντοπισμό της. Η κατασταλτική δράση του όγκου των πυρηνικών DLC1 αξιολογήθηκε άμεσα με τη χρήση μιας παραλλαγής σήμα πυρηνικού εντοπισμού (NLS) σύντηξη των DLC1 (NLS-DLC1) με προνομιακή πυρηνικού εντοπισμού. Σε SMMC-7721 κύτταρα HCC, έκφραση της NLS-DLC1 απέτυχε να καταστείλει τον σχηματισμό ινών σχηματισμού αποικιών και το άγχος της ακτίνης

in vitro

. Η κατήργησε δραστικότητα κατασταλτική του όγκου των πυρηνικών DLC1 καταδείχθηκε για πρώτη φορά

in vivo από

υποδόρια ενέσιμη ρ53

– /- RasV12 hepatoblasts με σταθερό NLS-DLC1 έκφραση σε γυμνά ποντίκια. Τα ένεση hepatoblasts με NLS-DLC1 έκφρασης που σχηματίζονται αποτελεσματικά όγκους σε σύγκριση με τον μη-πυρηνικό στοχευμένες DLC1.

Συμπεράσματα /Σημασία

Η μελέτη μας εντοπιστεί μια νέα περιοχή υπεύθυνη για την πυρηνική είσοδο του DLC1 και κατέδειξε την λειτουργική διαφορά των DLC1 σε διαφορετικά κυτταρικά διαμερίσματα δύο

in vitro

και

in vivo

η

Παράθεση:. Chan LK, Ko FCF, Sze KM-F, Ng IO -Ε, Yam JWP (2011) Πυρηνική-Στοχευμένες Διαγράφεται Καρκίνος του ήπατος 1 (DLC1) είναι λιγότερο αποτελεσματική στην άσκηση των όγκων του Κατασταλτικός Δραστηριότητα Τόσο

In Vitro

και

In Vivo

. PLoS ONE 6 (9): e25547. doi: 10.1371 /journal.pone.0025547

Συντάκτης: Τσαντ Creighton, Baylor College of Medicine, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 7 Ιούν 2011? Αποδεκτές: 6 του Σεπτεμβρίου 2011? Δημοσιεύθηκε: 26 Σεπτεμβρίου του 2011

Copyright: © 2011 Chan et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από το Συμβούλιο του Χονγκ Κονγκ Κονδυλίων Έρευνας (HKU7798 /07M), το Χονγκ Κονγκ Κονδυλίων Έρευνας του Συμβουλίου Συνεργατική Ταμείου Έρευνας (HKU 1 /06C και HKU 7 /CRG /09) και την εξαιρετική Βραβείο Νέου Ερευνητή (σε JWP Yam). I.O.L. Ng είναι Loke Yew Καθηγητής Παθολογίας. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

διαγράφεται Καρκίνος του ήπατος 1 (DLC1) κλωνοποιήθηκε για πρώτη φορά από την αφαιρετική υβριδοποίηση σαν ένα θραύσμα γονιδίου που συχνά διαγραφεί στο ανθρώπινο ηπατοκυτταρικό καρκίνωμα (HCC) [1]. Συσσωρευμένα στοιχεία της τελευταίας δεκαετίας έχει υποστηρίξει ότι DLC1 υποεκφράζεται σε διάφορα είδη καρκίνων του ανθρώπου, εκτός από HCC [2], [3], [4], [5], [6], [7]. Αποκατάσταση DLC1 με έκτοπη έκφραση σε κύτταρα με χαμηλή ή καθόλου ενδογενή έκφραση του DLC1 επιβραδύνει τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων, επάγει την απόπτωση, επιβραδύνει την κίνηση των κυττάρων και αποσαθρώνεται δομή του κυτταροσκελετού ακτίνης

in vitro

[8], [9], [10 ]. Αντιστρόφως, DLC1 knockdown προάγει την ογκογένεση του Myc οδηγείται

in vivo

μοντέλο ηπατοκαρκινογένεσης ποντίκι με φόντο ρ53 null [11]. Η φύση των συχνών παθολογικών υποέκφραση DLC1 και την ισχυρή πειραματική δραστηριότητα κατασταλτική του όγκου τόσο υποστηρίζουν σθεναρά τις λειτουργίες DLC1 ως

καλόπιστους

ογκοκατασταλτικό.

Η κατασταλτική δράση του όγκου των DLC1 είναι στενά συνδεδεμένη με ενδογενή δραστηριότητα RhoGAP του, η οποία ρυθμίζει προς τα κάτω την Rho-διαμεσολαβούμενη βιολογική απόκριση. DLC1 έχει βρεθεί να είναι RhoA-, Β-, C- και CDC42-ειδικών [12], [13]. Εστιακή εντόπιση προσκόλληση μέσω αλληλεπίδρασης με tensin οικογένεια πρωτεϊνών είναι ένα από τα χαρακτηριστικά του DLC1 και συνδέεται λειτουργικά με κατασταλτική του όγκου δραστικότητα της. Αυτό υποστηρίζεται από την απόδειξη ότι DLC1 μετάλλαξη με άθικτη περιοχή RhoGAP αλλά απέτυχε να απευθύνονται στις εστιακές συμφύσεις παρουσίασαν μειωμένη δραστικότητα καταστολής ανάπτυξης

in vitro

[10], [14]. Από την εστιακή προσκόλληση στοχεύουν ιστοσελίδες στο DLC1 επικάλυψη με την tensin θέση πρόσδεσης της πρωτεΐνης, έχει γίνει δεκτό ότι τα ζευγάρια DLC1 με tensin και λειτουργεί ως συγκρότημα κατασταλτική του όγκου σε τερματισμό της εστιακής προσκόλλησης που σχετίζεται με δραστηριότητα Rho [10], [14], [15 ].

Μια πρόσφατη μελέτη έδειξε την παρουσία βασικά κατάλοιπα πλούσιο μοτίβο σε DLC1 που μοιάζει με το NLS [16]. Επίσης, έχει προταθεί ότι η σερίνη /θρεονίνη κινάση συγκεκριμένη πρωτεΐνη D φωσφορυλιώνει DLC1 να δημιουργήσει μια θέση 14-3-3 σύνδεσης. Σχηματισμός συμπλόκου με 14-3-3 διαχωρίζει DLC1 στο κυτταρόπλασμα και σταματά την πυρηνική είσοδο της [17]. Ωστόσο, η ύπαρξη και τη ρύθμιση του πυρηνικού DLC1 δεν έχουν διερευνηθεί σχολαστικά. Το πιο σημαντικό, η σχετική δραστηριότητα κατασταλτική του όγκου των πυρηνικών DLC1 ποτέ δεν έχει αντιμετωπιστεί άμεσα. Σε αυτή τη μελέτη, έχουμε παράσχει πλήρη απόδειξη DLC1 πρωτεΐνη λεωφορεία συνεχώς μεταξύ του κυτταροπλάσματος και του πυρήνα. Έχουμε πραγματοποίησε την πρώτη λειτουργικό χαρακτηρισμό της πυρηνικής στοχευμένες DLC1 να εξετάσει τα βασικά και όγκου κατασταλτική δράση της τόσο

in vitro

και

in vivo

. Με τη μελέτη του υποκυτταρικού εντοπισμού των διαφόρων μεταλλάξεων DLC1, έχουμε εντοπίσει μια νέα περιοχή εντός του τομέα RhoGAP η οποία είναι σημαντική και επαρκεί για αυτή πυρηνικής εισαγωγής.

Αποτελέσματα

DLC1 μπαλάκι μεταξύ κυτταροπλάσματος και πυρήνα

Η έκφραση του Myc-tagged DLC1 (Myc-DLC1) σε SMMC-7721 κυττάρων αποκάλυψε την ύπαρξή του σε εστιακό συμφύσεις, κυτταρόπλασμα και τον πυρήνα (Εικ. 1Α). Ποσοτική εξέταση της έκφρασης DLC1 στα κύτταρα έδειξαν κυρίαρχη κυτταροπλασματική εντόπιση της με στικτή εστιακό πρότυπο πρόσφυση σε περιφέρεια του κυττάρου. Για να εξερευνήσετε την κίνηση του DLC1 μεταξύ του κυτταροπλάσματος και του πυρήνα, Myc-DLC1 εντοπισμό των κυττάρων μελετήθηκε σε κύτταρα που έλαβαν θεραπεία με exportin blocker, LMB. Η θεραπεία με LMB είχε ως αποτέλεσμα την πυρηνική κατακράτηση της Myc-DLC1 σε SMMC-7721 και τα κύτταρα BEL7402 (Σχ. 1Β,

αριστερό πλαίσιο

). Αξίζει να σημειωθεί ότι, εστιακή πρόσφυση εντοπισμένη DLC1 παρατηρήθηκε ακόμη, ενοχοποιώντας μόνο το μη-εστιακό πρόσφυση εντοπισμένη DLC1 ήταν αδιάκοπης και διατηρούνται στον πυρήνα. Κυτταρική κλασματοποίηση ενισχύεται περαιτέρω η παρουσία του DLC1 στο πυρηνικό κλάσμα του κυτταρολύματος (Σχ. 1Β,

δεξί πάνελ

). Παρόμοια παρατήρηση ελήφθη με GFP-tagged DLC1 (GFP-DLC1) (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Η δυναμική κίνηση των DLC1 παρατηρήθηκε υπό την απόσυρση της LMB σε διαφορετικά χρονικά σημεία (Εικ. 1 C). είχε συμβεί Re-σχηματομόρφωσης των κυτταροπλασματικών και εστιακή πρόσφυση εντός 24 ωρών. Έχουμε εκτεταμένη έρευνα μας εξετάζοντας τον εντοπισμό των ενδογενών DLC1 σε διάφορες κυτταρικές σειρές. Υποκυτταρική κλασματοποίηση των Hep3B, HLE και κύτταρα SK-ΗΕΡ1 ακολουθούμενη από ανοσοστύπωμα χρησιμοποιώντας DLC1-ειδικού αντισώματος υποστηρίζει την παρουσία του DLC1 στον πυρήνα (Σχ. 1D). Ανοσοφθορισμού για ενδογενή DLC1 σε κύτταρα SK-ΗΕΡ1 έδειξε παρόμοια υποκυτταρικό εντοπισμό στο κυτταρόπλασμα και τον πυρήνα (Εικ. 1 Ε). Σταθερά, ενδογενής DLC1 σε Hep3B διατηρήθηκε στον πυρήνα μετά από θεραπεία LMB (Εικ. 1 F). Για να υποστηρίζουν την ιδέα ότι σαΐτες DLC1 μεταξύ κυτταρόπλασμα και τον πυρήνα κάτω από φυσιολογικές συνθήκες, εκτελέσαμε ανοσοϊστοχημεία κατά DLC1 σε ένα ανθρώπινο μη νεοπλαστικό ήπατος (Εικ. 1 G). Θετική χρώση DLC1 ανιχνεύθηκε τόσο κυτταρόπλασμα και τον πυρήνα, υποστηρίζοντας περαιτέρω ότι DLC1 είναι παρόν στον πυρήνα.

(Α) SMMC-7721 κύτταρα επιμολύνθηκαν παροδικά με Myc-tagged DLC1. DLC1 οπτικοποιήθηκε με αντίσωμα αντι-Μγο ακολουθούμενο από FITC συζευγμένο δευτερογενές αντίσωμα. Πυρήνα ήταν αντίθετα με DAPI. Υποκυτταρική μοτίβο εντοπισμού των DLC1 των 241 DLC1 επιμολυσμένων κυττάρων μετρήθηκε και κατηγοριοποιούνται σε ομάδα Α έως Ε, όπως αναφέρεται. (Β) SMMC-7721 και BEL7402 κύτταρα επιμολύνθηκαν παροδικά με Myc-tagged DLC1 και υποβλήθηκε σε κατεργασία LMB ακολουθούμενη από χρώση ανοσοφθορισμού με αντι-Μγο αντίσωμα (

αριστερό πλαίσιο

). Τα επιμολυσμένα κύτταρα κλασματώθηκαν σε κυτταροπλασματικά και πυρηνικά τμήματα που ακολουθείται από ανοσοκηλίδωση κατά Myc για εξωγενή DLC1, τουμπουλίνης (κυτταροπλασματική δείκτη), LaminB και c-jun (πυρηνικό δείκτης) (

δεξί πάνελ

). (C) SMMC-7721 κύτταρα επιμολύνθηκαν παροδικά με Myc-tagged DLC1, ακολουθούμενη από επεξεργασία LMB για 6 ώρες. Μετά τη θεραπεία LMB (η οποία ορίζεται ως t = 0), τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν με φρέσκο ​​μέσο και σταθεροποιήθηκαν στην υποδεικνυόμενη χρονική στιγμή. Εξωγενείς DLC1 οπτικοποιήθηκε με αντι-Μγο αντίσωμα. (D) Hep3B, κύτταρα HLE και κύτταρα SK-ΗΕΡ1 κλασματώθηκαν σε κυτταροπλασματικά και πυρηνικά τμήματα που ακολουθείται από ανοσοκηλίδωση με τη χρήση αντισωμάτων έναντι ενδογενών DLC1, τουμπουλίνης, LaminB και c-jun. (Ε) Ενδογενής DLC1 σε κύτταρα SK-ΗΕΡ1 οπτικοποιήθηκε με πολυκλωνικό αντι-DLC1 αντίσωμα, που ακολουθείται από FITC-συζευγμένο δευτερογενές αντίσωμα. Για να χρησιμεύσει ως αρνητικός έλεγχος, SMMC-7721 κύτταρα χωρίς έκφραση DLC1 χρωματίστηκε με την polycloncal αντι-DLC1 αντίσωμα. Το αντίσωμα DLC1 θα μπορούσε να ανιχνεύσει μόνο σήμα σε SMMC-7721 κύτταρα με εξωγενή DLC1 υπερέκφραση αλλά όχι τα μη επιμολυσμένα κύτταρα. κύτταρα (F) Hep3B υποβλήθηκαν σε αγωγή με ΕΜΒ για 6 ώρες. Η ενδογενής DLC1 ακολούθως ορατή με πολυκλωνικό αντι-DLC1 αντίσωμα, που ακολουθείται από FITC-συζευγμένο δευτερογενές αντίσωμα. (G) Ένα τμήμα της ανθρώπινης μη νεοπλασματικών ήπατος ανοσοβαφή για DLC1 (Brown). Οι πυρήνες βάφτηκαν αντίθετα με αιματοξυλίνη (μπλε). Κύτταρα τα οποία εμφανίζουν θετική χρώση των πυρηνικών DLC1 υποδείχθηκαν από τα στερεά-με επικεφαλής βέλη. Πυρήνα του κυττάρου που δείχνει αρνητική χρώση DLC1 υποδείχθηκε από τους ανεγκέφαλοι βέλη. μπαρ κλίμακα:. 10 μm

Η

DLC1 600-700 υπολείμματα συνεργάστηκε με NLS στη ρύθμιση της DLC1 πυρηνικής εισόδου

Οι πρωτεΐνες μεγάλου μοριακού μεγέθους διαθέτουν σήματα πυρηνικής μεταφοράς για την ενεργό μεταφορά σε όλη την πυρηνικού φακέλου με τη βοήθεια πολύπλοκων πυρηνικής μεταφοράς. Έχει προταθεί ότι ένα monopartite NLS (423 έως 431) [17] και διμερούς NLS (415-431) [16] είναι παρόντες σε DLC1 οι οποίες διευκολύνουν την πυρηνική είσοδο του DLC1. Να αντιμετωπίσει συγκεκριμένα τον εντοπισμό των DLC1 χωρίς προτεινόμενων NLS κατά την αγωγή LMB, κατασκευάσαμε DLC1Δ415-431 μεταλλαγμένων ειδικά λείπει το προτεινόμενο NLS (Εικ. S1 Α και S1B). Έκφραση των DLC1Δ415-431 σε SMMC-7721 κύτταρα έδειξαν την ίδια υποκυτταρική εντόπιση ως άγριου τύπου DLC1. Παραδόξως, DLC1Δ415-431 ήταν ακόμη ευαίσθητη σε θεραπεία LMB και διατηρήθηκε στον πυρήνα όσο αποτελεσματικά αγρίου τύπου DLC1 (Εικ. S1c). Έχει επίσης αναφερθεί ότι η φωσφορυλίωση σε σερίνη-431 (S431) του DLC1 από την κινάση πρωτεΐνης D (PKD) [17] διευκολύνει τη σύνδεση μεταξύ DLC1 και πρωτεΐνες 14-3-3, εμποδίζοντας έτσι την πυρηνική είσοδο του DLC1. Ωστόσο, βρήκαμε ότι DLC1 S431 φωσφο-ελαττωματικός μεταλλάκτης, S431A έδειξαν παρόμοια βαθμός της πυρηνικής συγκράτησης μετά τη θεραπεία LMB (Εικ. S1D). Στο σύνολό τους, δεν θα μπορούσαμε να παράσχει επαρκή αποδεικτικά στοιχεία για την υποστήριξη της λειτουργικότητας του προτεινόμενου NLS, καθώς και το ρόλο της φωσφορυλίωσης S431 στη ρύθμιση της πυρηνικής μεταφοράς DLC1.

Εμείς αμφισβήτησε το κατά πόσον, εκτός από την πυρηνική μοτίβο στόχευσης προτεινόμενες από τους άλλους, επιπλέον περιοχή σε DLC1 εμπλέκεται στην πυρηνικό εντοπισμό του DLC1. Για να αντιμετωπιστεί αυτό, έχουμε κλωνοποιήθηκε και εκφράστηκε GFP-DLC1 μεταλλάξεις απαλοιφής και εξετάστηκαν εντοπισμός τους μετά LMB θεραπεία σε κύτταρα HeLa (Σχ. 2Α). Βρήκαμε ότι DLC1 Δ292-646 εσωτερική μετάλλαξη διαγραφής έδειξαν σημαντική μείωση του πυρηνικού εντοπισμού κατά την κατεργασία LMB (Σχ. 2Β και 2C). Από την άλλη πλευρά, η πυρηνική κατακράτηση DLC1 1-807 C-τερματική διαγραφή μεταλλάγματος δεν επηρεάστηκε σε σύγκριση με άγριου τύπου DLC1 κατά την κατεργασία LMB. Είναι ενδιαφέρον, 1-807 μετάλλαγμα το οποίο περιείχε την προτεινόμενη εστιακής προσκόλλησης στόχευσης περιοχή (περιοχή 200-500) [18] δεν μπορεί να στοχευθεί αποτελεσματικά εστιακές συμφύσεις και διάχυτα εκφράζονται στο κυτταρόπλασμα.

(Α) σχηματικό διάγραμμα που δείχνει η δομή του άγριου τύπου DLC1 (DLC1 WT) και μεταλλάξεις διαγραφής του (Δ292-646 και 1-807). (Β) κύτταρα HeLa επιμολύνθηκαν παροδικά με την έκφραση DLC1 GFP-κατασκευάσματα με επισύναψη όπως απαριθμούνται στο (Α), ακολουθούμενη από επεξεργασία LMB. Εστιακή συμφύσεις βάφτηκαν αντίθετα με αντι-βινκουλίνης αντίσωμα. Η υποκυτταρική εντόπιση του DLC1 καταγράφηκε μετρώντας τουλάχιστον 100 επιμολυσμένα κύτταρα ανά δείγμα. (Γ) Μπαρ γράφημα που συνοψίζει την υποκυτταρική εντόπιση της DLC1 και μεταλλακτών του στο (Β) με ή χωρίς την θεραπεία LMB. Τα αποτελέσματα αντιπροσωπεύουν ένα αντίγραφο δύο ανεξάρτητα πειράματα. Τα ποσοστά της εστιακής προσκόλλησης θετική DLC1 σε επιμέρους ομάδα τονίστηκαν επίσης.

Η

Έχει προταθεί ότι η Ν-τελική περιοχή της DLC1 ρυθμίζει αρνητικά την πυρηνική είσοδο της [16]. Ένας αριθμός των πιθανών σήμα πυρηνικής εξαγωγής (NES) έχει χαρτογραφηθεί σε 62-71, 764 έως 773 και 792 έως 801 κατάλοιπα DLC1 από

in silico

αναζήτησης (Εικ. S2A). Η σημασία αυτών των αλληλουχιών σήματος στη ρύθμιση την κυτταροπλασματική εντόπιση στη συνέχεια αξιολογήθηκε με ανοσοφθορισμό. Η λειτουργικότητα του NES σε 764-773 και 792 έως 801 υπολείμματα αποκλείστηκαν από την κυτταροπλασματική έκφραση του 1-291 και 1-400 μεταλλάξεις (Εικ. S2B). Από 609-stop και 648 – 839 μεταλλάξεις που αναγράφεται ενισχυμένη πυρηνικού εντοπισμού, ο ρόλος του NES σε 62-71 υπολείμματα αναλύθηκε περαιτέρω δημιουργώντας ένα DLC1 Δ62-71 μεταλλαγμένα. Αυτό το μεταλλαγμένο DLC1 έδειξε χαρακτηριστικές εστιακό εντοπισμό προσκόλληση παρόμοια με του άγριου τύπου, χωρίς να εμφανίζουν καμία αύξηση της πυρηνικής συγκράτησης (Εικ. S2B). Για να διευκρινιστεί η απουσία της πυρηνικής συγκράτησης δεν οφειλόταν στην ισχυρή εστιακό ένωση πρόσφυση, DLC1 1-807Δ62-71, μια μετάλλαξη δεν εντοπίζεται σε εστιακές συμφύσεις εκφράστηκε. Ωστόσο, αυτή η μεταλλαγμένη βρέθηκε επίσης να είναι εντοπισμένη κυρίως στο κυτταρόπλασμα. Στο σύνολό τους, βρήκαμε ότι απομάκρυνση των προβλεπόμενων NES στο Ν-τελικό άκρο της DLC1 δεν επηρέασε πυρηνοκυτταροπλασματικής διανομής της.

Μετά την προβολή της περιοχής της πυρηνικής στόχευσης προς το κέντρο περιοχή του DLC1, εκτελέσαμε την πρώτη λεπτομερή εντόπιση ανάλυση ενός πάνελ μεταλλακτών GFP-DLC1 (Σχ. 3Α). Είναι ενδιαφέρον, βρήκαμε ότι η έκφραση του μεταλλαγμένου 350-807 έδειξε μια κυρίαρχη πυρηνικού εντοπισμού. Παρόμοια πυρηνικού εντοπισμού εξέχοντα παρατηρήθηκε σε Myc-DLC1 291-807 (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Εξέταση των 600 – 807 μεταλλαγμένου αποκάλυψε παρόμοια πυρηνικού εντοπισμού, ενώ 700-807 μεταλλαγμένο εντοπίζεται τόσο κυτταρόπλασμα και τον πυρήνα σε κύτταρα HeLa (Σχ. 3Β και 3C). Αυξημένη πυρηνικό εντοπισμό του μεταλλαγμένου 600-807 υποστηρίχθηκε επίσης από την ισχυρότερη έκφραση DLC1 στον πυρηνικό κλάσμα που λαμβάνεται στην δοκιμασία βιοχημική κλασματοποίηση σε σύγκριση με τα άλλα μεταλλάγματα DLC1 (Σχ. 3D). Στο σύνολό τους, διαπιστώσαμε ότι DLC1 περιοχή 600-700 στον τομέα RhoGAP συμμετείχε επίσης στην πυρηνική είσοδο του DLC1.

(Α) Σχηματικό διάγραμμα που δείχνει τη δομή ενός πίνακα των θραυσμάτων DLC1 τερματίζεται στο αμινοξύ 807 και μια σειρά από μεταλλάξεις DLC1 εσωτερική διαγραφή για χαρτογράφηση του κλειδιού τοποθεσία πυρηνική στόχευση. Οι δομές του άγριου τύπου DLC1 και Δ292-646 επίσης παρατίθενται για λόγους σύγκρισης. (Β) κύτταρα HeLa επιμολύνθηκαν παροδικά με τις κατασκευές έκφρασης DLC1 GFP-tagged υποδεικνύεται. Εστιακή συμφύσεις βάφτηκαν αντίθετα με αντι-βινκουλίνης αντίσωμα. Η υποκυτταρική εντόπιση του DLC1 καταγράφηκε μετρώντας τουλάχιστον 100 επιμολυσμένα κύτταρα ανά δείγμα. γράφημα (Γ) Μπαρ συνοψίζει το ποσοστό των κυττάρων με κυτταροπλασματικό και πυρηνικό εντοπισμό του DLC1 και μεταλλακτών του στο (Β). Τα αποτελέσματα αντιπροσωπεύουν ένα αντίγραφο δύο ανεξάρτητα πειράματα. (D) κύτταρα HeLa διαμολύνθηκαν παροδικά με τα υποδεικνυόμενα κατασκευές έκφρασης DLC1 GFP-tagged ακολουθούμενη από υποκυτταρική κλασμάτωση. Τα κλασματωμένα κυτταροπλασματικά και πυρηνικά προϊόντα λύσης υποβλήθηκαν σε ανοσοκηλίδωση με αντισώματα έναντι GFP, τουμπουλίνης (κυτταροπλασματική δείκτης) και c-jun (πυρηνικό δείκτη). κύτταρα (Ε) HeLa διαμολύνθηκαν παροδικά με τα υποδεικνυόμενα κατασκευές έκφρασης DLC1 GFP-tagged, ακολουθούμενη από επεξεργασία LMB. (Ε) Μπαρ γράφημα συνοψίζει το ποσοστό των κυττάρων με κυτταροπλασματικό και πυρηνικό εντοπισμό του DLC1 και μεταλλακτών του σε (D). Τα αποτελέσματα αντιπροσωπεύουν ένα αντίγραφο δύο ανεξάρτητα πειράματα. μπαρ κλίμακα:. 10 μm

Η

Για να επιβεβαιωθεί περαιτέρω τη σημασία αυτής της νέας περιοχής, θα διαγραφεί περιοχή 601-689 στο DLC1 και αξιολογούνται εντοπισμό του. Είναι ενδιαφέρον, βρήκαμε μία αξιοσημείωτη μείωση στην πυρηνική εντόπιση του μεταλλαγμένου DLC1Δ601-689 μετά τη θεραπεία LMB (Σχ. 3Ε και 3F). Όπως αποδεικνύεται από την Δ415-431Δ601-689 μετάλλαξη στην οποία προηγουμένως αναφερθεί NLS και χαρτογραφήθηκαν το site μας διαγράφηκαν, διαγραφή των 415-431 δεν μείωσε περαιτέρω την πυρηνική συγκράτηση πολύ μετά τη θεραπεία LMB. Τα αποτελέσματα μας πρότεινε ότι η νέα θέση χαρτογραφήθηκε διαδραματίζει σημαντικό ρόλο στη στόχευση DLC1 στον πυρήνα.

Πυρηνική DLC1 χάσει την ανασταλτική της δράση στην καταστολή σχηματισμού αποικίας και σχηματισμού ινών έντασης ακτίνης

in vitro

Μέχρι σήμερα, δεν υπάρχει καμία μελέτη για την αξιολόγηση την άμεση λειτουργική σχέση μεταξύ πυρηνικό εντοπισμό και τη βιολογική λειτουργία του DLC1. Για τη μέτρηση της λειτουργικής ικανότητας της πυρηνικής DLC1

in vitro

, δημιουργήσαμε και επιβεβαίωσε την έκφραση μιας πυρηνικής στοχευμένη DLC1 (NLS-DLC1) (Εικ. 4Α και 4Β). Με ανοσοφθορισμό, επιβεβαιώσαμε ότι NLS-DLC1 ήταν κυρίως εντοπισμένη στον πυρήνα σε SMMC-7721 κύτταρα. Μια NLS γνώμονα DLC1 RhoGAP μεταλλαγμένο, NLS-K714E θα μπορούσαν επίσης να απευθύνονται στον πυρήνα τόσο αποτελεσματικά όσο το άγριου τύπου DLC1 (Εικ. 4C). Στη συνέχεια εξετάστηκε η ακεραιότητα της ακτίνης ινών στρες σε SMMC-7721 κύτταρα παροδικά επιμολυσμένα με αυτά τα μεταλλάγματα. Σε αντίθεση με την αποσυναρμολόγηση των ινών στρες ακτίνης στα DLC1 επιμολυσμένα κύτταρα, NLS-DLC1 μπορούσε εν μέρει μόνο καταστέλλουν την ακτίνη σχηματισμό ινών στρες (Εικ. 4D). Ως αρνητικός έλεγχος, κύτταρα μετεμβολιασμένα με DLC1 K714E εμφανίζεται ανέπαφο ίνες στρες ακτίνης. Παρόμοιο μοτίβο παρατηρήθηκε σε κύτταρα που εκφράζουν NLS-K714E υποστηρίζοντας επιπλέον ότι η πυρηνική σύστημα στόχευσης μας δεν ασκούσε μη ειδική επίδραση στο σχηματισμό ακτίνης ινιδίων του στρες. δραστηριότητα RhoGAP του DLC1 έχει αποδειχθεί ότι συνδέεται στενά με κατασταλτική της ανάπτυξης δράση του. Στη συνέχεια εκτελείται δοκιμασία σχηματισμού αποικίας για την αξιολόγηση του

in vitro

κατασταλτική δράση αύξησης των NLS-DLC1 τόσο SMMC-7721 και τα κύτταρα HeLa (δεν παρουσιάζονται τα δεδομένα). Σύμφωνα με την επίδραση στο σχηματισμό ινών στρες, NLS-DLC1 έδειξε μεγάλο βαθμό μειωμένη δραστηριότητα καταστολής της ανάπτυξης σε σύγκριση με DLC1 (Εικ. 4Ε) Λαμβάνοντας μαζί, βρήκαμε ότι η πυρηνική DLC1 χάσει την ικανότητα να καταστέλλουν την ανάπτυξη των κυττάρων.

( Α) Σχηματικό διάγραμμα που δείχνει τη δομή του πυρηνικού στοχευμένη DLC1 (NLS-DLC1) που χρησιμοποιείται για το πείραμα παροδικής έκφρασης. Η αλληλουχία DNA που κωδικοποιεί το monopartite NLS το οποίο αποτελείται από πέντε βασικά αμινοξέα KKKRK εισήχθησαν μπροστά από το ανοιχτό πλαίσιο ανάγνωσης του Μγο-tagged DLC1. Μετάφραση της χειραγωγείται κατασκευάσματος έκφρασης κωδικοποιούνται με Myc NLS-DLC1. (Β) προϊόντων λύσης ΗΕΚ293Τ με υπερεκφράζεται με Myc DLC1 ή NLS-DLC1 ανοσοστυπώθηκαν με αντι-Μγο αντίσωμα. (C) SMMC-7721 κύτταρα επιμολύνθηκαν παροδικά με την υποδεικνυόμενη DLC1 άγριου τύπου ή το μετάλλαγμα RhoGAP (K714E) κατασκευάσματα. Η Myc-tagged πρωτείνης κατέστη ορατό με αντίσωμα αντι-Μγο που ακολουθείται από FITC-συζευγμένο δευτερογενές αντίσωμα. Η υποκυτταρική εντόπιση του DLC1 καταγράφηκε μετρώντας τουλάχιστον 100 επιμολυσμένα κύτταρα ανά κάθε δείγμα. γράφημα Bar υποδεικνύει το ποσοστό των κυττάρων με χρώση των πυρηνικών DLC1. Τα αποτελέσματα αντιπροσωπεύουν ένα αντίγραφο δύο ανεξάρτητα πειράματα. (D) SMMC-7721 κύτταρα επιμολύνθηκαν παροδικά με τα υποδεικνυόμενα Myc-κατασκευάσματα με επισύναψη DLC1 και οι ίνες στρες ακτίνης βάφτηκαν με TRITC-συζευγμένο φαλλοειδίνη 1 ώρα μετά την επαγωγή του ορού. Ο αστερίσκος (*) σημειώνει τις DLC1-επιμολυσμένα κύτταρα. (Ε) Μπαρ γράφημα που δείχνει την σχετική αποτελεσματικότητα σχηματισμού αποικίας των SMMC-7721 κύτταρα που επιμολύνθηκαν με τα υποδεικνυόμενα μορφώματα DLC1 και φορέα pEGFP-C1 που φέρει γονίδιο ανθεκτικό στη νεομυκίνη σε 10:01 αναλογία. Τα επιμολυσμένα κύτταρα επιλέχθηκαν με G418 για 2 εβδομάδες. Οι αποικίες που σχηματίζονται έγιναν ορατά με χρώση κρυσταλλικού ιώδους και ποσοτικά. Η μέση διαφορά μεταξύ της ένδειξης της ομάδας βρέθηκε να είναι στατιστικά σημαντική (***

P

& lt? 0,005? Ασύζευκτα

t

-τεστ). μπαρ κλίμακας: 10 μm

Η

Πυρηνική DLC1 δεν καταστέλλουν

in vivo

ογκογενετικότητας

Για να εκτιμηθεί η κατασταλτική δράση του όγκου των πυρηνικών DLC1

in vivo

, εκτελέσαμε σταθερή ρετροϊική έκφραση του πυρηνικού στοχευμένων με Myc DLC1 ποντικιού σε ένα ρ53 null hepatoblasts ποντίκι με συστατική ενεργοποίηση RasV12 [11]. DLC1 στοχεύτηκε στον πυρήνα με την εισαγωγή ενός διαδοχική επανάληψη τριών monopartite NLSs (NLS3) μπροστά από το κωδικόνιο έναρξης DLC1 ποντίκι στο ρετροϊικό κατασκεύασμα έκφρασης (Εικ. 5Α). Μετά την επιλογή με πουρομυκίνη, οι ανθεκτικοί κλώνοι επεκτάθηκαν και πάνω από το 95% ανθεκτικοί κλώνοι βρέθηκαν να είναι GFP θετικά, επιβεβαιώνοντας την υψηλή ρετροϊική αποτελεσματικότητα μεταγωγής (Εικ. 5Β). Επιβεβαιώσαμε επίσης την επιτυχή πυρηνική στόχευση των DLC1 ποντίκι με χρώση ανοσοφθορισμού για την πρωτεΐνη σύντηξης NLS3-DLC1. Βρήκαμε ότι πάνω από το 90% των NLS3-DLC1 σε μεταγωγή κύτταρα έδειξαν πυρηνική χρώση σε σύγκριση με την κυτταροπλασματική χρώση σε DLC1 μεταγόμενα κύτταρα. χρώση Ιστορικό με αντι-Μγο αντίσωμα ήταν μόλις ανιχνεύσιμη στον φορέα κύτταρα (Σχ. 5Β). Επιβεβαιώσαμε περαιτέρω η έκφραση πρωτεϊνών επίπεδο DLC1 με ανοσοαποτύπωση (Εικ. 5C). Για την περαιτέρω επιβεβαίωση ότι το ακίνητο πυρηνοκυτταροπλασματικής παλινδρόμηση διατηρήθηκε σε DLC1 μας υπερεκφράζουν hepatoblast μοντέλο, που αντιμετωπίζονται DLC1 κυττάρων που εκφράζουν με LMB, που ακολουθείται με ανοσοφθορισμό. Βρήκαμε ότι η θεραπεία με LMB θα μπορούσε να διατηρήσει σταθερά DLC1 στον πυρήνα (Σχ. 5D). Αυτή η παρατήρηση υποστηρίζεται επίσης ότι η πυρηνοκυτταροπλασματικής ακίνητο παλινδρόμηση διατηρήθηκε στα ανθρώπου και ποντικού ορθόλογα DLC1. Η

in vivo

ογκογονικότητας αυτών των σταθερών κλώνων εξετάστηκε με υποδόρια ένεση σε γυμνά ποντίκια. Σταθερά, DLC1 παρουσίασαν επίδραση καταστολής στο σχηματισμό όγκου, ενώ η πυρηνική DLC1 έδειξαν μια σημαντική μείωση στην καταστολή ογκογενετικότητας

in vivo

(Σχ. 5Ε και 5F).

(Α) Σχηματικό διάγραμμα που απεικονίζει τη ρετροϊική φορείς που χρησιμοποιούνται για να οδηγηθεί η σταθερή έκφραση του Myc-tagged DLC1 ποντίκι και το πυρηνικό στόχευση DLC1 ποντικού (NLS3-DLC1). (Β) Hepatoblasts μολύνθηκαν με τον φορέα, DLC1 ή NLS3-DLC1 ρετροϊοί σταθεροποιήθηκαν και η έκφραση του Myc-tagged πρωτείνης κατέστη ορατό με αντίσωμα αντι-Μγο ακολουθούμενη από Texas Red συζευγμένο με δευτερογενές αντίσωμα. (C) Προϊόντα λύσεως των μολυσμένων hepatoblasts με φορέα, DLC1 ή NLS3-DLC1 ρετροϊοί υποβλήθηκαν σε ανοσοκηλίδωση χρησιμοποιώντας αντισώματα έναντι Myc, DLC1 και GFP. β-ακτίνη χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης. (D) Hepatoblasts μολυσμένα με ρετροϊό DLC1 υποβλήθηκαν σε θεραπεία LMB. Τα κύτταρα στη συνέχεια σταθεροποιήθηκαν και ο εντοπισμός της Myc-tagged DLC1 οπτικοποιήθηκε με αντίσωμα αντι-Μγο ακολουθούμενη από Texas Red συζευγμένο με δευτερογενές αντίσωμα. γράφημα Bar υποδεικνύει το ποσοστό των κυττάρων με χρώση των πυρηνικών DLC1. Τα αποτελέσματα αντιπροσωπεύουν ένα αντίγραφο δύο ανεξάρτητα πειράματα. (Ε) Η ογκογονικότητα των αναφερόμενων ρετροϊικοί μετάγονται hepatoblasts αξιολογήθηκε με υποδόρια ένεση γυμνών ποντικών. 1 × 10

5 hepatoblasts εγχύθηκαν υποδορίως την ημέρα 0 και ο όγκος του μεγέθους του όγκου παρακολουθούνταν καθημερινά από την ημέρα 4. Όλα τα ποντίκια θυσιάστηκαν την ημέρα 14. Την ημέρα 14, τα ποντίκια θυσιάστηκαν και οι όγκοι ανατμήθηκαν. (F) Οι αποκόπηκαν όγκοι ζυγίστηκαν και οι μάζες τους καταγράφηκαν. μπαρ κλίμακα:. 10 μm

Η

Έχει αναφερθεί ότι η έκτοπη έκφραση της DLC1 σε αρνητικά κύτταρα DLC1 θα μπορούσε να προκαλέσει απόπτωση [19]. Για να ελεγχθεί αν NLS3-DLC1 παρουσίασαν απόκλιση βιολογική δραστικότητα στην επαγωγή της απόπτωσης, ιδρύσαμε και αναλύθηκαν τα κύτταρα ΗΕΚ293Τ που εκφράζουν σταθερά την πυρηνική DLC1 με κυτταρομετρία ροής για τον πληθυσμό subG1 κυττάρων (Σχ. S3b). Για την αποφυγή τυχόν κλωνική αποτέλεσμα, οι δύο κλώνοι από κάθε ομάδα συλλέχθηκαν για την ανάλυση. Βρήκαμε ότι τα κύτταρα που εκφράζουν DLC1 έδειξε αυξημένο κορυφή subG1 σε σύγκριση με τον φορέα και τα κύτταρα που εκφράζουν NLS3-DLC1. DLC1 κύτταρα που εκφράζουν παρουσίασαν επίσης μειωμένη G1 αλλά αυξήθηκε S πληθυσμού (Εικ. S3b). Εύλογη εξήγηση για αυτό θα μπορούσε να είναι ότι DLC1 κύτταρα που εκφράζουν μπορούν να ξοδεύουν περισσότερο χρόνο στην S φάση από τη στιγμή που εισέρχονται στον κυτταρικό κύκλο. Αυτές οι παρατηρήσεις έδειξαν και πάλι ότι NLS3-DLC1 ήταν λιγότερο ισχυρή στην επαγωγή της απόπτωσης και ελαφρυντικών εξέλιξη του κυτταρικού κύκλου, σε σύγκριση με το DLC1 άγριου τύπου.

Συζήτηση

Στο silico

ανάλυση της αλληλουχίας έχει αποκάλυψε μια σειρά πιθανών βασικού αμινοξέος πλούσια διμερή NLSs σε DLC1 [16]. Η παρουσία αυτών των μοτίβων μας ώθησε να αναρωτηθούμε αν υπάρχει DLC1 ως μία πυρηνική πρωτεΐνη. Στην παρούσα μελέτη, δείξαμε ότι DLC1 ήταν μια πρωτεΐνη συνεχώς μπαλάκι μεταξύ κυτταρόπλασμα και τον πυρήνα σε διαφορετικές κυτταρικές σειρές. Αυτή η παρατήρηση παρέχει μια ισορροπημένη εξήγηση για την παρουσία πυρηνικών DLC1 και υποστηρίζει εγγενή κυτταροπλασματική εντόπιση της όπως αποδεικνύεται από διάφορες μελέτες [10], [18], [20], [21], [22]. Είναι αξιοσημείωτο ότι κατά τη θεραπεία με LMB, εστιακή προσκόλληση εντοπισμένη DLC1 ήταν ακόμα ανιχνεύσιμο. Αυτή η παρατήρηση προτείνει ότι μόνο μη-ειδική, κυτταροπλασματική DLC1 διατηρήθηκε στον πυρήνα μετά τη θεραπεία. Εστιακή πρόσφυση εντοπισμένη DLC1 ήταν σχετικά στατικό χαρακτήρα. Η παρατήρηση αυτή είναι συμβατή με τη μερική πυρηνική χρώση παρατηρήθηκε για το DLC1 εστιακής προσκόλλησης εντοπισμό ελαττωματικών μετάλλαξη, Y442F σε ένα μοντέλο πνεύμονα [10]. Αν και θετική πυρηνική χρώση θα μπορούσε να βρεθεί σε φυσιολογικά μη νεοπλασματικών ήπαρ σε ανοσοϊστοχημική χρώση, θα ήταν ενδιαφέρον να παρατηρήσουμε αν υπάρχει ένα ευδιάκριτο διαφορά της χρώσης πυρηνικών DLC1 μεταξύ των κανονικών ηπατικών ιστών και DLC1 θετικά HCCs (ή άλλους τύπους καρκίνου).

Αν και η παρουσία των πυρηνικών DLC1 έχει συζητηθεί προηγουμένως, κατασταλτική του όγκου δραστηριότητά της στον πυρήνα δεν έχει σαφώς απευθύνεται. Για να διερευνηθεί άμεσα την κατασταλτική δράση του όγκου του πυρηνικού DLC1, εμείς παροδικά ή σταθερά εκφράζονται NLS-DLC1 σε κυτταρικές σειρές HCC ακολουθείται από μια σειρά λειτουργικών χαρακτηρισμό. Χρησιμοποιήσαμε αυτή την προσέγγιση και όχι μελετώντας το μεταλλαγμένο DLC1 λείπει το χαρτογραφηθεί σήμα πυρηνικής στόχευσης (600-700 κατάλοιπα επικαλύπτεται με τον τομέα RhoGAP), όπως είχαμε προβλέψει ότι η άρση αυτού του σήματος θα διαταράξει την εγγενή δραστηριότητα της RhoGAP και να κάνει τη σύγκριση με την DLC1 άγριου τύπου αδύνατη . Επίσης, μακροχρόνια θεραπεία LMB για την παραγωγή πυρηνικών DLC1 είναι επίσης δυσμενής και εμποδίζει την παγκόσμια πυρηνική πρωτεΐνη των εξαγωγών και δημιουργεί στρες στα κύτταρα [23]. Ενώ η νέα λειτουργία του πυρηνικού DLC1 μένει να διερευνηθεί, επιβεβαιώσαμε ότι NLS-DLC1 ήταν λιγότερο αποτελεσματική στην καταστολή της ανάπτυξης των κυττάρων, αποσύνθεσης σχηματισμό RhoA μεσολάβηση ακτίνης ινών στρες και την πρόκληση κυτταρικού θανάτου

in vitro

. NLS-DLC1 ήταν επίσης λιγότερο αποτελεσματική στην καταστολή της ανάπτυξης του όγκου σε ένα μοντέλο ξενομοσχεύματος ποντικού. Εμείς κάνουμε εικασίες πυρηνική εσφαλμένος εντοπισμός μπορεί να είναι ένας πιθανός μηχανισμός για την κατάργηση της δραστηριότητας DLC1 σε ανθρώπινο καρκίνο με ανέπαφη την έκφραση DLC1.

Λειτουργικά, τα ευρήματά μας δεν συνάδουν με το συμπέρασμα που συνάγεται από τις προηγούμενες εκθέσεις. Yuan et al. κατέδειξε πυρηνική μετατόπιση του DLC1 μπορεί να διεγείρει απόπτωση και να διευκολύνουν τη λειτουργία κατασταλτική του όγκου του σε ένα παροδικά εκφραζόμενο αρνητικό ανθρώπινο μη μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα (NSCLC) μοντέλο κυτταρικής γραμμής DLC1 [16]. Ωστόσο, σταθερή μοντέλο έκφραση πυρηνικών DLC1 μας με hepatoblasts ποντικού και ανθρώπινα κύτταρα ΗΕΚ293Τ ούτε απέτυχε στην ενίσχυση ούτε επάγει αποπτωτικό υποπληθυσμού όπως υποδεικνύεται από ανάλυση κυτταρομετρίας ροής. Πιθανή εξήγηση περιλαμβάνει την παροδική έκφραση παράγει ένα πολύ υψηλό επίπεδο DLC1 που μπορεί να προκαλέσει τοξικότητα στα κύτταρα? ενώ το σύστημα σταθερών κυτταρικών μας μπορεί να έχουν υποστεί κάποιου είδους προσαρμογή κατά τη διάρκεια της σταθερής επιλογής κύτταρο, το οποίο επιτρέπει στα κύτταρα να διαδοθεί με την έκφραση της πυρηνικής DLC1. Επίσης, ο τύπος των κυττάρων και κυτταρική γραμμή εξαρτώμενη επιδράσεις στη συμβολή με τη διαφορά στη δραστικότητα DLC1 να επάγει απόπτωση και διακοπή της ανάπτυξης πρέπει να θεωρηθούν [11], [16], [24]. Από την άλλη πλευρά, Scholz et al έδειξε ότι DLC1 S327AS431A μεταλλαγμένο δεν είναι σε θέση να σύμπλεγμα με 14-3-3 στο κυτταρόπλασμα και είναι βιολογικά πιο ενεργό από άγριου τύπου DLC1. Δυστυχώς, οι συγγραφείς διαπίστωσαν ότι η εισαγωγή αρνητικά φορτισμένων υπολειμμάτων στις προαναφερθείσες θέσεις δεν μπορεί να μιμηθεί την ουσιαστικά δραστική 14-3-3 διαμόρφωση σύνδεσης. Η έλλειψη ενός ευνοϊκού μεταλλαγμένο δυσχεραίνει την εκτίμηση σχετικά με το πώς αυτά τα 14-3-3 δεσμευτική υπολείμματα επηρεάζουν την LMB ευαισθησία της DLC1 [17]. Με την παραδοχή ότι η DLC1 S327AS431A είναι λιγότερο πιθανό να είναι απομονωμένος στο κυτταρόπλασμα, μπορεί κανείς να προβλέψει ότι η μετάλλαξη αυτή μπορεί να αδιάκοπης στον πυρήνα πιο συχνά. Ωστόσο, επί του παρόντος είναι άγνωστο αν η υπερδραστηριότητα αυτού του μεταλλαγμένου είναι αποτέλεσμα της αυξημένης πυρηνικής εισόδου σε βραχυπρόθεσμη ή οφείλεται στην αλλαγή διαμόρφωσης που ευνοεί τη λειτουργία DLC1 RhoGAP. Είναι πιθανό ότι η αυξημένη πυρηνική είσοδο ενός βιολογικού υπερκινητικά DLC1 μπορεί να χρησιμεύσει ως αρνητικός ρυθμιστικός μηχανισμός να ρυθμίζουν προς τα κάτω την υπερκινητικά DLC1 σε μια μακροπρόθεσμη βάση.

Δύο ανεξάρτητες μελέτες έχουν επιχειρήσει να χαρτογραφήσει την NLS σε DLC1 [16] , [17]. Yuan et al πρότεινε η DLC1 415-431 είναι η υποτιθέμενη NLS, ενώ Scholz et al πρότειναν ότι DLC1 πυρηνικής μεταφοράς απαιτεί μόνο το δεύτερο μισό του στον ίδιο χώρο με τη συμμετοχή των υπολειμμάτων 428 και 429. Ωστόσο, βρήκαμε ότι μεταλλαγμένο DLC1 λείπει το σύνολο της προτεινόμενης NLS μπορούσε ακόμη να διατηρούνται αποτελεσματικά στον πυρήνα, υποδεικνύοντας επιπλέον δομική αλληλουχία σε DLC1 μπορεί να εμπλέκεται σε αυτήν την πυρηνική μεταφορά. Για να αντιμετωπιστεί αυτό, πραγματοποιήσαμε λεπτομερή υποκυτταρική εξέταση εντοπισμό της GFP-DLC1 μεταλλάξεις διαγραφής. Βρήκαμε ότι DLC1 Δ292-646 μεταλλαγμένο ήταν λιγότερο LMB ευαίσθητη. Σταθερά, βρήκαμε ότι η έκφραση των θραυσμάτων αντιπροσωπεύει μόνο την κεντρική περιοχή του DLC1 έδειξε πυρηνικό εντοπισμό. Η παρατήρηση υποδηλώνει ότι η μεταβολή στα δύο άκρα της DLC1 δυνατόν να εκθέσουν στοιχεία τα οποία οδηγούν τον πυρηνικό εντοπισμό του DLC1. Από αυτά τα δεδομένα, μπορούμε περαιτέρω να προτείνει και να επιβεβαιώσει ότι η περιοχή 600-700 στον τομέα RhoGAP είναι σημαντική στην κατεύθυνση πυρηνικό εντοπισμό της DLC1.