Αφηρημένο

Ιστορικό

Η ανοσοκατασταλτική παράγοντες, όπως ρυθμιστικά Τ κύτταρα (Tregs) όριο η αποτελεσματικότητα της ανοσοθεραπείες. Οι ιστόνης αποακετυλάσης (HDAC) αναστολείς έχουν αναφερθεί ότι έχουν δραστικότητα κατά του όγκου σε διαφορετικές κακοήθειες και ανοσοτροποποιητικές δράσεις. Εδώ, αναφέρουμε τα Tregs-στόχευση και το ανοσοποιητικό αποτέλεσμα προαγωγής μιας κατηγορίας Ι ειδικό αναστολέα HDAC, entinostat, σε συνδυασμό είτε με IL-2 σε ένα μοντέλο νεφροκυτταρικό καρκίνωμα ποντικού (RENCA) ή μια θεραπεία εμβόλιο survivin-based (SurVaxM) σε ένα ανθεκτικό ευνουχισμό καρκίνο του προστάτη (CR Myc-CAP) μοντέλο.

Μέθοδοι και Αποτελέσματα

RENCA ή CR όγκους Myc-Cap εμφυτεύθηκαν ορθοτοπικά ή υποδορίως, αντίστοιχα. Τα εμβολιασμένα ποντίκια τυχαιοποιήθηκαν σε τέσσερις ομάδες θεραπείας: όχημα, entinostat, κυτοκίνη ή εμβόλιο, και συνδυασμό. Tregs στο αίμα αξιολογήθηκαν με ανάλυση FACS. Πραγματικού χρόνου ποσοτική PCR και ανάλυση κηλίδας Western των απομονωμένων υποπληθυσμών των Τ κυττάρων από σπλήνα διεξήχθησαν για να προσδιοριστεί Foxp3 γονίδιο και η έκφραση πρωτεΐνης. Η λειτουργία κατασταλτική των Tregs ελέγχθηκε με δοκιμασία πολλαπλασιασμού Τ κυττάρων. Χαμηλή δόση (5 mg /kg) entinostat μειωμένα επίπεδα Foxp3 σε Tregs και αυτό συνδέθηκε με αυξημένη αναστολή της ανάπτυξης του όγκου σε συνδυασμό είτε με IL-2 ή ένα εμβόλιο SurVaxM. Entinostat κάτω-ρυθμιζόμενη έκφραση Foxp3 μεταγραφικά και μπλοκάρει Tregs κατασταλτική λειτουργία χωρίς να επηρεάζει τα κύτταρα Τ-τελεστές (Teffs).

In vitro

χαμηλή entinostat δόση (0,5 μΜ) προκάλεσε STAT3 ακετυλίωση και ένας ειδικός αναστολέας της STAT3 μερικώς διασωθεί entinostat επαγόμενη μειορύθμιση Foxp3, υποδηλώνοντας ότι η σηματοδότηση STAT3 εμπλέκεται σε Foxp3 ρύθμιση προς τα κάτω με entinostat.

Συμπεράσματα

Τα αποτελέσματα αυτά καταδεικνύουν ένα μυθιστόρημα επίδραση ανοσοτροποποιητικές της ταξικής αναστολής Ι HDAC και να παρέχει μια λογική για την κλινική δοκιμή της entinostat να ενισχύσει την ανοσοθεραπεία του καρκίνου

Παράθεση:. Shen L, Ciesielski M, Ramakrishnan S, Miles KM, Ellis L, Sotomayor P, et al. (2012) Κατηγορία Ι αναστολέα απακετυλασών Entinostat Καταστέλλει Ρυθμιστική Τ κύτταρα και ενισχύει ανοσοθεραπείες στο νεφρών και Μοντέλα του καρκίνου του προστάτη. PLoS ONE 7 (1): e30815. doi: 10.1371 /journal.pone.0030815

Συντάκτης: Μινγκ Tat Λινγκ, Queensland University of Technology, Αυστραλία

Ελήφθη: 10 Αυγούστου του 2011? Αποδεκτές: 21η, Δεκεμβρίου του 2011? Δημοσιεύθηκε: 27 Γενάρη 2012

Copyright: © 2012 Shen et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτή η μελέτη υποστηρίχθηκε εν μέρει από μια επιχορήγηση της έρευνας από το National Cancer Institute-23 R21CA137649. Καμία πρόσθετη εξωτερική χρηματοδότηση που έλαβε για την παρούσα μελέτη. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

η ανάπτυξη του όγκου αντιπροσωπεύει ένα αποτέλεσμα των καρκινικών κυττάρων διαφυγή υποδοχής ανοσοποιητικό επιτήρησης. Παρά τις κάποιες επιτυχίες, ανοσοθεραπευτικές παρεμβάσεις έχουν δείξει περιορισμένο όφελος. Ένα σημαντικό εμπόδιο αντιπροσωπεύεται από την παρουσία των ανοσοκατασταλτικών παραγόντων που φαίνεται να είναι κυρίαρχη σε ασθενείς με καρκίνο. Αυτά τα ανοσοκατασταλτικά συστατικά περιλαμβάνουν Tregs [1], [2], που προέρχεται μυελοειδή κατασταλτικά κύτταρα (MDSCs), ανοσολογικές σημεία ελέγχου που διαμεσολαβείται από μόρια κυτταρικής επιφάνειας, όπως CTLA-4 [3] και [4] PD-1, και κυκλοφορεί κυτοκίνες όπως TGF -β και IL-10 [5]. Μελέτες έχουν δείξει ότι αυτοί οι μηχανισμοί ανοχή μπορεί να προκληθεί από τον όγκο και τα περιβάλλοντα στρωματικά κύτταρα. Tregs κανονικά διατηρηθεί η ανοχή για την αυτο-αντιγόνα και πρόληψη αυτοάνοσων αποκρίσεων [6], [7]. Από την άλλη πλευρά, Tregs έχουν χαρακτηριστεί ως ένας από τους σημαντικότερους παίκτες στον όγκο ανοσολογικής ανοχής. Τα δικαιολογητικά που αποδεικνύουν περιλαμβάνει προώθηση Tregs στους ασθενείς με καρκίνο και επέκταση Tregs παρακάτω ανοσοθεραπεία [2], [8] – [11]. Περαιτέρω κλινικές αναφορές δείχνουν ότι η εξάντληση των Tregs μπορεί να ενισχύσει την αντικαρκινική ανοσολογική απόκριση σε ασθενείς με καρκίνο.

Υψηλή δόση της IL-2 είναι ένα FDA-εγκριθεί θεραπεία για επιλεγμένους ασθενείς με μεταστατικό σαφές καρκινικό κύτταρο νεφρικών κυττάρων [12], [ ,,,0],13]. θεραπεία με IL-2 επάγει αντικειμενικές αποκρίσεις σε περίπου 20% των ασθενών, με το ανθεκτικό πλήρεις αποκρίσεις σε ένα μικρό κλάσμα. Δεδομένου του περιορισμένου αποτελεσματικότητα της υψηλής δόσης IL-2 θεραπεία, έχουν επιπλέον προσπάθειες έχουν κατευθυνθεί για την αύξηση της αποτελεσματικότητας αυτής της ανοσοθεραπευτική προσέγγιση.

Εμβόλιο θεραπείες παραμένουν περιορισμένο όφελος σε συμπαγείς όγκους, αν και η θεραπεία εμβόλιο Sipuleucel-Τ ήταν πρόσφατα εγκριθεί για τη θεραπεία του ανθεκτικού ευνουχισμό καρκίνο του προστάτη. Τα Tregs επικρατεί σε διάφορους καρκίνους, συμπεριλαμβανομένων προχωρημένο καρκίνο του προστάτη [2]. Μελέτες έχουν δείξει ότι η παρουσία ανοσοκατασταλτικών παραγόντων, όπως Tregs παίζουν σημαντικό ρόλο στην ανοσολογική ανοχή και χαμηλή αποτελεσματικότητα στη θεραπεία του εμβολίου [14], [15]. Κατά συνέπεια, ο συνδυασμός των εμβολίων με προσέγγιση (εις) να καταστρέφουν ή να καταστέλλουν Tregs αντιπροσωπεύει μια ορθολογική στρατηγική στη θεραπεία του καρκίνου του προστάτη.

έχουν HDACs έχουν δειχθεί ότι εμπλέκονται σε ογκογόνο μετασχηματισμό με την διαμεσολάβηση της μεταγραφική ρύθμιση των γονιδίων που εμπλέκονται σε εξέλιξη του κυτταρικού κύκλου, του πολλαπλασιασμού, και την απόπτωση [16], [17]. HDAC αναστολείς αναπτύσσονται σήμερα για τη θεραπεία του καρκίνου και έχουν αποδείξει αντικαρκινική δράση σε διαφορετικούς όγκους. HDACs έχουν χαρακτηριστεί σε τέσσερις διαφορετικές κλάσεις με διαφορετικούς στόχους και υποκυτταρικά τοποθεσίες. Εκτός από τις ιστόνες, αρκετές πρωτεΐνες μη-ιστόνης επίσης αντιστρεπτά ακετυλιωμένα στα υπολείμματα λυσίνης και αυτές οι μετα-μεταφραστικές τροποποιήσεις μπορεί επίσης να διαδραματίσει σημαντικό ρόλο στις αντικαρκινική επίδραση των αναστολέων HDAC [18] – [20]. Το συνθετικό βενζαμίδιο, entinostat, είναι ένας εκλεκτικός αναστολέας των HDAC κατηγορίας Ι. Entinostat έχει αντικαρκινική δράση τόσο

in vitro

και

in vivo

σε αρκετά μοντέλα όγκου [21] – [24]. Επιπλέον, η ομάδα μας έχει αναφερθεί στο παρελθόν την συνεργιστική αντικαρκινική δράση του entinostat σε συνδυασμό με υψηλή δόση IL-2 στο μοντέλο RENCA [25].

Πρόσφατες πειραματικές μελέτες έχουν αποδείξει ότι οι αναστολείς HDAC έχουν δυνατότητες ανοσοτροποποιητική δράση τόσο i

n vitro

και

in vivo

μοντέλα φλεγμονής, αυτοανοσία και μεταμόσχευση. HDAC αναστολείς μπορεί να επηρεάσει ανοσολογικές αντιδράσεις με τη ρύθμιση της παραγωγής κυτοκινών. Σε ένα μοντέλο ποντικού της αλλογενούς μεταμόσχευσης μυελού των οστών, τον αναστολέα HDAC, vorinostat (SAHA), μειωμένη οξεία μοσχεύματος έναντι ξενιστή με καταστολή των κυτοκινών προ-φλεγμονής όπως TNF-α, IL-1, και INF-γ [26 ]. Ο αναστολέας HDAC, LAQ824, έχει δειχθεί ότι μεταβάλλει την ενεργοποίηση και τη λειτουργία των μακροφάγων και των δενδριτικών κυττάρων. LAQ824 έχει επίσης βρεθεί να ρυθμίζουν τη λειτουργία των δενδρικών κυττάρων για την αναστολή της Th1, αλλά όχι Th2 λειτουργία τελεστή [27]. Επιπλέον, οι αναστολείς HDAC μπορεί να ρυθμίσει τη μεταγραφή του μείζονος ιστοσυμβατότητας τάξης Ι και II [28], ή την ενεργοποίηση του συν-διεγερτικών μορίων [28], [29]. Πιο πρόσφατα, έχει αναφερθεί ότι ένα τηγάνι αναστολέα HDAC, tricostatin Α (TSA) μπορεί να αυξήσουν τη λειτουργία του και να ενισχύσει Tregs ανοσοκατασταλτική τους δράση

in vivo

[30]. Επιπλέον, τα θετικά αποτελέσματα από κλινικές δοκιμές σε δερματικά λεμφώματα Τ κυττάρων (CTCL) υποδηλώνουν ότι οι αναστολείς HDAC μπορεί να επηρεάσει την ανοσοαπόκριση, δεδομένου ότι ορισμένες από τις παθολογικές μηχανισμών CTCL διαμεσολαβούνται μέσω φλεγμονής και μια ανισορροπία του ανοσοποιητικού συστήματος. Στο σύνολό τους, αυτές οι παρατηρήσεις υποδεικνύουν ότι η αντικαρκινική δράση των αναστολέων HDAC μπορεί εν μέρει να οφείλεται στην ανοσορυθμιστική τους ιδιότητες.

Σε αυτή τη μελέτη, έχουμε διαφορετικά αποτελέσματα στο σύστημά μας και αναφέρουν ότι η θεραπεία με entinostat μειώνει έκφραση Foxp3 σε Tregs και αναστέλλει την κατασταλτική λειτουργία των Tregs. Επιπλέον, STAT3 σηματοδότηση δείχθηκε να συνδέεται με Foxp3 ρύθμιση προς τα κάτω με entinostat. Αυτή η ιδιότητα του entinostat μπορεί να ενισχύσει την αντικαρκινική ανοσολογική απόκριση σε IL-2 και τη θεραπεία του εμβολίου και παρέχει ένα σκεπτικό για τη χρήση entinostat στις στρατηγικές συνδυασμό με ανοσοθεραπείες.

Αποτελέσματα

Entinostat ενίσχυση υψηλής δόσης IL-2 θεραπεία σχετίζεται με διαμόρφωση των Tregs σε ποντίκια που φέρουν όγκους

η ομάδα μας έχει ήδη αναφερθεί ότι ο αναστολέας HDAC κατηγορίας Ι, entinostat, έχει αντικαρκινική δράση στο μοντέλο RENCA [25], [31]. Entinostat φαίνεται να έχει μια επίδραση ανοσοτροποποιητικές που οδηγεί σε μια συνεργική αντικαρκινική δράση σε συνδυασμό με IL-2. θεραπεία με IL-2 προάγει τον πολλαπλασιασμό και την ενεργοποίηση των κυττάρων τελεστών Τ (Teffs), αλλά επίσης επάγει ανοσοκατασταλτική Tregs με σταθερή έκφραση του IL-2 υποδοχέα CD25. Ως εκ τούτου, στην παρούσα μελέτη, που επικεντρώθηκε στην επίδραση της entinostat για Tregs. Ελέγξαμε την επίδραση του entinostat ως μονοθεραπεία και σε συνδυασμό με IL-2 επί Tregs στο μοντέλο RENCA. RENCA κύτταρα εμβολιάστηκαν ορθοτοπικά σε ποντικούς BALB /c. Τρεις ημέρες μετά τον εμβολιασμό, τα ζώα έλαβαν θεραπεία με είτε όχημα, IL-2, entinostat (5 mg /kg), ή συνδυασμό. Μετά από 5 ημέρες θεραπείας, το περιφερικό αίμα συλλέχθηκε από κάθε ποντικό, χρωματίστηκαν για δείκτες κυτταρικής επιφάνειας και ενδοκυτταρική πρωτεΐνη Foxp3, και υποβλήθηκε σε φθορισμό διαλογή κυττάρων που συνδέονται ανάλυση (FACS). Δεν παρατηρήθηκαν σημαντικές διαφορές στον αριθμό των CD4

+ Foxp3

+ Tregs (Εικ. 1 Α και Β). Ωστόσο, τα επίπεδα πρωτεΐνης Foxp3 σε CD4

+ Foxp3

+ κύτταρα, όπως παριστάνεται ως μέση ένταση φθορισμού (MFI), μειωμένη με entinostat θεραπεία (Εικ. 1Α και Β). Μια αύξηση στα επίπεδα Foxp3 παρατηρήθηκε με τη θεραπεία με IL-2 μόνο, επιβεβαιώνοντας την ιδέα ότι η IL-2 προάγει Tregs ενώ υποστηρίζει τον πολλαπλασιασμό των Τ κυττάρων. Στη θεραπεία συνδυασμού, entinostat εξακολουθούν να διασωθούν τα επίπεδα Foxp3 στα επίπεδα του ελέγχου (Εικ. 1 Α και Β). Οι αναλύσεις στυπώματος Western έδειξαν ότι το

in vivo

entinostat θεραπεία αύξησε το επίπεδο ακετυλίωσης ιστόνης Η3 σε σπληνοκύτταρα (Εικ. 1 F). Αντικαρκινική επιδράσεις των θεραπειών αξιολογήθηκαν με αξιολόγηση βάρη όγκου μετά από δύο εβδομάδες. Δεν παρατηρήθηκαν σημαντικές μεταβολές του σωματικού βάρους παρατηρήθηκαν με θεραπείες. θεραπεία με IL-2 προκάλεσε μια μέτρια μείωση του βάρους του όγκου (& lt? 10%). Entinostat χορήγηση απλής παράγοντα σε 5 mg /kg οδήγησε σε σημαντική μείωση του βάρους του όγκου σε σύγκριση με την ομάδα ελέγχου (μείωση -40%, Σχ. 1C). Ο συνδυασμός της entinostat με IL-2 είχε πολύ μεγαλύτερη ανασταλτική επίδραση στην ανάπτυξη του όγκου (μείωση περίπου 80%, Σχ. 1C). Για να προσδιοριστεί αν η μείωση της έκφρασης Foxp3 και την αναστολή της ανάπτυξης του όγκου που προκαλείται από entinostat συσχετίστηκε με αυξημένη ανοσολογική απόκριση, εξετάσαμε IFN-γ επαγωγή. IFN-γ ήταν ελαφρώς επάγεται σε κύτταρα CD8 σε ζώα IL-2 θεραπεία, ενώ τα κύτταρα CD8 σε ζώα συνδυασμό ασθενείς είχαν πολύ υψηλότερη επαγωγή ΙΡΝ-γ (Σχ. 1D). Στο σύνολό τους, αυτές οι παρατηρήσεις υποδεικνύουν ότι entinostat ενισχύει CD8 κυττάρων ανοσολογική απόκριση που επάγεται από την IL-2, ενώ μείωση του επιπέδου Foxp3 σε Tregs.

Ποντίκια με ορθοτοπική εμβολιασμό των κυττάρων RENCA υποβλήθηκαν σε θεραπεία για 5 ημέρες. Ελήφθη αίμα από τα ποντίκια την πέμπτη ημέρα και χρωματίστηκαν για αντισώματα ειδικά για CD4, CD25, και Foxp3. Τα βάρη των όγκων μετρήθηκαν στο τέλος των δύο εβδομάδων της θεραπείας. Α και Β, Επίδραση της entinostat επί Tregs σε ποντίκια που φέρουν όγκο. Α, Effects οχήματος, IL-2, entinostat, ή θεραπεία συνδυασμού επί της έκφρασης Tregs Foxp3. Τα κύτταρα χρωματίστηκαν και υποβλήθηκαν σε ανάλυση κυτταρομετρίας ροής. Τα οικόπεδα dot ήταν περιφραγμένη για CD4

+ κύτταρα. Η ορθογώνια περιοχή περικλείει τα CD4

+ Foxp3

+ κύτταρα, οι αριθμοί στην κορυφή αντιπροσωπεύουν το ποσοστό των Foxp3

+ κύτταρα. Οι αριθμοί στο κάτω μέρος της περιοχής αντιπροσωπεύουν την μέση ένταση φθορισμού (MFI) της χρώσης Foxp3 ΡΕ του CD4

+ Foxp3

+ κύτταρα. Β, Ποσοτικοποίηση των Tregs ποσοστό του πληθυσμού CD4 (αριστερό πάνελ) και τα επίπεδα Foxp3 (MFI) σε Tregs (δεξί πάνελ) με ανάλυση FACS. Οι τιμές είναι μέσοι και οι ράβδοι σφάλματος αντιπροσωπεύουν S.D. για 5-7 δείγματα ανά ομάδα. Στο δεξιό τμήμα του παραθύρου,

σ

= 0,0011 για την IL-2 εναντίον οχήματος?

σ

= 0.000009 για entinostat εναντίον του οχήματος. Τα αποτελέσματα είναι αντιπροσωπευτικά τριών ξεχωριστών πειραμάτων. C, μετρήσεις βάρους όγκου. Στήλες, μέση γραμμάρια όγκου? Μπαρ, Τ.Α. n = 5-7.

σ

= 0.0209 για entinostat εναντίον του οχήματος?

σ

= 0,0077 για το συνδυασμό έναντι του οχήματος?

σ

= 0.0272 για συνδυασμό εναντίον entinostat. Τα αποτελέσματα είναι αντιπροσωπευτικά τριών ξεχωριστών πειραμάτων. D, Entinostat ενισχυμένη IFN-γ τύπου ανοσολογική αντίδραση που επάγεται από τη θεραπεία IL-2. Σπληνοκύτταρα (1 × 10

6 κύτταρα) συλλέχθηκαν και διεγέρθηκαν με ΡΜΑ (20 ng /ml) και ιονομυκίνη (1 μg /ml) για 5 ώρες παρουσία του Brefeldin Α Τα κύτταρα στη συνέχεια χρωματίστηκαν για δείκτες επιφάνειας και ενδοκυτταρικά IFN-γ. Ιστογράμματα δείχνουν το ποσοστό της ΙΡΝ-γ κύτταρα που εκφράζουν σε πληθυσμό CD8.

σ

= 0,01 για το συνδυασμό έναντι της IL-2. Ε, Entinostat μειωμένη διήθηση του όγκου των Tregs. Τομές όγκων χρωματίστηκαν με αντι-Foxp3 αντίσωμα για να δείξει διείσδυση των Tregs. Ιστόγραμμα δείχνει μέσο όρο του αριθμού των βάφονται Tregs σε τυχαία 20 × ψήφισμα φωτεινά πεδία (αριθμό Tregs σε κάθε πεδίο ελήφθη με τύφλωσε καταμέτρηση). επεξεργασία F, Entinostat που προκαλείται Η3 ακετυλίωση των ιστονών σε κύτταρα σπλήνας. BALB /c ποντίκια υποβλήθηκαν σε αγωγή με φορέα (0,5% methocel) ή 5 mg /kg /ημέρα entinostat με καθετηριασμό για 5 ημέρες. Τα κύτταρα συλλέχθηκαν από σπλήνες και υποβλήθηκαν σε ανάλυση κηλίδος Western για ακετυλιωμένης ιστόνης Η3.

Η

Εξετάσαμε εάν η θεραπεία entinostat θίγονται τα Tregs που διηθούν τους όγκους. χρώση ανοσοϊστοχημείας των τμημάτων του όγκου έδειξαν ότι η θεραπεία entinostat μειωμένη Tregs διήθησης (Σχ. 1Ε και Εικ. S1).

Δοκιμάσαμε επίσης το αντι-ποντικού CD25 αντισώματος, PC61, να καταστρέφουν Tregs [32] στο μοντέλο RENCA. θεραπεία PC61 στα 500 μg /ποντικό /εβδομάδα ήταν αρκετή για να καταστρέφουν CD25

+ κύτταρα (Εικ. 2Α), μείωσε δραματικά CD4

+ Foxp3

+ αριθμός κυττάρων Tregs (Εικ. 2Α), και είχε μια παρόμοια αντικαρκινική δράση, όπως παρατηρείται με entinostat (Εικ. 2Β). Επιπλέον, η προσθήκη της θεραπείας PC61 δεν έχουν μια πρόσθετη αντικαρκινική δράση πάνω entinostat θεραπεία (Εικ. 2Β), γεγονός που υποδηλώνει ότι entinostat και PC61 μπορεί να έχει μια περιττή μηχανισμό της δραστηριότητας.

Ένα, Οικόπεδα δείχνουν επίδραση των οχημάτων, PC61, entinostat ή συνδυασμός θεραπείας στα επίπεδα CD25 και Foxp3. Ποσοτικοποίηση των Tregs ποσοστό, Foxp3 έκφραση με ανάλυση FACS παρουσιάζεται ως ιστογράμματα. Οι τιμές είναι μέσοι και οι ράβδοι σφάλματος αντιπροσωπεύουν S.D. για 6-7 δείγματα ανά ομάδα. Β, μετρήσεις βάρους όγκου από το πείραμα εξάντληση PC61. Στήλες, μέση γραμμάρια όγκου? Μπαρ, Τ.Α .. n = 6-7. * Αντιπροσωπεύει

σ

& lt? 0,05 για αισθητή σημείο εναντίον του οχήματος? ** Αντιπροσωπεύει

σ

& lt?. 0.01 για αισθητή σημείο εναντίον οχήματος

Η

Entinostat συνεργεί με τη θεραπεία με το εμβόλιο πεπτιδίου σε ένα ανθεκτικό μοντέλο καρκίνου του προστάτη ευνουχισμό

Επιπλέον σε μία θεραπεία κυτοκίνης, ελέγξαμε επίσης entinostat σε συνδυασμό με ένα άλλο ανοσοθεραπευτική προσέγγιση, μια θεραπεία εμβόλιο πεπτιδίου, σε ένα ανθεκτικό ευνουχισμό καρκίνο του προστάτη (CR Myc-CAP) μοντέλο. Χρησιμοποιήσαμε ένα νέα τροποποιημένα survivin πεπτιδίου του εμβολίου SVN53-67 /M57-KLH (SurVaxM) [33]. Survivin είναι ένα ενδοκυτταρικό που σχετίζεται με όγκο αντιγόνο που εκφράζεται σε συμπαγείς όγκους, συμπεριλαμβανομένου του καρκίνου του προστάτη. Το επίπεδο της έκφρασης της survivin συνδέεται με την εξέλιξη του όγκου και επιθετικότητα [34], και αντιπροσωπεύει ένα κατάλληλο στόχο για θεραπεία εμβολίου. Μια μεταφυτεύσιμων ευνουχισμό καρκίνο του προστάτη ανθεκτικού (CR Myc-CAP) μοντέλο έχει αναπτυχθεί στο εργαστήριο μας [35]. κύτταρα Myc-Cap, που προέρχονται από το μοντέλο ποντικού καρκίνου του Hi-Μγο διαγονιδιακά προστάτη [36], εγχύθηκαν (1 × 10

6 κύτταρα /ποντικό) υποδορίως σε αρσενικούς FVB ποντικούς. Του όγκου που φέρουν τα ζώα χειρουργικά ευνουχισμένα δημιουργία μετα όγκου και κατά συνέπεια οι όγκοι διήλθαν μέσω 5 επιπλέον γύρους χειρουργικά ευνουχισμένα ποντίκια FVB. Survivin έκφρασης επιβεβαιώθηκε σε όγκους Myc-Cap με ανοσοϊστοχημεία. CR Myc-Cap ποντικών που φέρουν όγκο τυχαιοποιήθηκαν σε τέσσερις ομάδες και έλαβαν θεραπεία με όχημα, entinostat (5 ημέρες /εβδομάδα, 5 mg /kg), SurVaxM (1 δόση /εβδομάδα) ή συνδυασμό. Μετά από τρεις εβδομάδες θεραπείας, entinostat ή SurVaxM απλή θεραπεία εμφανίζεται μέτρια επίδραση κατά των όγκων (10-25% της μείωσης) (Σχ. 3Α και Β). Ωστόσο, ο συνδυασμός του entinostat και SurVaxM μείωσε δραματικά το βάρος του όγκου (μείωση περίπου 80%,

σ

= 0,002) σε σύγκριση με είτε όχημα ή ομάδες απλής θεραπείας (Εικ. 3Α και Β). χρώση κυττάρων περιφερικού αίματος έδειξαν ότι η θεραπεία με μόνο και σε συνδυασμό με SurVaxM entinostat μειωμένο επίπεδο Foxp3 σε Tregs από ποντικούς που φέρουν όγκο (Σχ. 3C), αλλά δεν είχε καμία επίδραση στον αριθμό Tregs (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται).

Α και Β, Entinostat ενισχύει την αντικαρκινική δράση του εμβολίου survivin, SurVaxM. FVB ποντίκια ευνουχίστηκαν και υποδόρια εμβολιάζονται με μικρά ευνουχισμό κομμάτια ανθεκτικά όγκου. Περίπου 7 ημέρες μετά τον εμβολιασμό, όταν οι όγκοι έφθασαν ένα μέσο μέγεθος 50 mm

2, τα ποντίκια υποβλήθηκαν σε αγωγή τρεις εβδομάδες με όχημα, entinostat (5 mg /kg, 1 δόση /ημέρα, 5 ημέρες /εβδομάδα), survivin εμβόλιο SurVaxM (100 μg /δόση, 1 δόση /εβδομάδα), ή συνδυασμό. Α, Single γραμμές διάγραμμα της ανάπτυξης όγκου δημιουργήθηκαν με διαδοχικές μετρήσεις καλίμπρας. Β, οι όγκοι συλλέχθηκαν στο τέλος της θεραπείας και ζυγίστηκαν (συνδυασμός vs. εμβόλιο survivin,

σ

= 0,003). C, η θεραπεία Entinostat μειωμένα επίπεδα Foxp3 στο Tregs από ποντίκια που φέρουν όγκο CR Myc-Cap. Μετά από 5 ημέρες θεραπείας, τα κύτταρα περιφερικού αίματος συλλέχθηκαν από ποντικούς, βάφονται για CD4 και Foxp3, και υποβλήθηκαν σε ανάλυση FACS. Ο ποσοτικός προσδιορισμός των Foxp3 μέση ένταση φθορισμού (MFI Foxp3) (όχημα εναντίον entinostat,

p = 0,0002

? Συνδυασμού έναντι survivin,

σ

= 0,0004).

Η

survivin θεραπεία εμβόλιο επάγει αντιγονο-ειδικά CD8 κύτταρα και entinostat συνεργεί με εμβόλιο για να επάγει ΙΡΝ-γ ανοσοαπόκριση

προκειμένου να εκτιμηθεί η παρουσία του survivin αντιγονο-ειδικών Τ κυττάρων τα οποία μπορούν να παραχθούν σε απόκριση σε εμβολιασμό, κάναμε μια survivin εμβόλιο-ειδικό πεπτίδιο-ΜΗΟ τάξης Ι τετραμερές δοκιμασία δέσμευσης. Το τετραμερές είναι ειδικά για ένα πεπτίδιο survivin επίτοπο [33]. Σπληνοκύτταρα απομονώθηκαν από τα ποντίκια που έλαβαν διαφορετικές θεραπείες όπως έγινε στο πείραμα θεραπεία και υποβλήθηκε σε survivin ειδικών τετραμερούς και χρώση δείκτη επιφάνειας. Μόνο τα σπληνοκύτταρα από ποντικούς που υπέστησαν αγωγή με το εμβόλιο survivin (εμβόλιο ενιαία και θεραπείας συνδυασμού) έδειξαν επαγωγή κυττάρων CD8 αντιγόνου-ειδικών (Σχ. 4Α). Είναι ενδιαφέρον ότι, η κηλίδωση ενδοκυτταρική κυτοκίνη υποδηλώνει σημαντική επαγωγή CD8

+ ΙΡΝ-γ

+ κυττάρων πάνω επίπεδο του οχήματος στην ομάδα συνδυασμού, η οποία ταιριάζει ενισχυμένη αντικαρκινική του δράση (Εικ. 4Β).

Α . ανάλυση τετραμερές σπληνοκύτταρα που λαμβάνονται από ποντικούς ανοσοποιημένους με SurVaxM. Σπληνοκύτταρα υπέστησαν χρώση με αντι αντισώματα CD8 και survivin ειδικών τετραμερή για ανάλυση κυτταρομετρίας ροής. Τα αποτελέσματα βασίζονται σε περίφραξη των CD8 + Τ κυττάρων και να αναφέρει το ποσοστό των διπλών επισημασμένων κυττάρων (CD8 + /τετραμερών +) σε σχέση με συγκεκριμένες τετραμερές. Β, συνδυασμένη θεραπεία οδήγησε σε CD8

+ IFN γ-

επαγωγή + κύτταρα. Τα ποντίκια υποβλήθηκαν σε αγωγή όπως υποδεικνύεται. Σπληνοκύτταρα διεγέρθηκαν και χρώση ενδοκυτταρικής IFN-γ πραγματοποιήθηκε όπως περιγράφεται στην Εικόνα 1D.

σ

& lt?. 0.01 για συνδυασμό εναντίον οχημάτων

Η

Entinostat καταστέλλει την έκφραση των γονιδίων Foxp3 στα κύτταρα Treg και αναστέλλει Tregs λειτουργία

Για να διερευνηθεί περαιτέρω η προώθηση ανοσοποιητικό αποτέλεσμα του entinostat, υποβάλλαμε σε αγωγή αφελείς BALB /c ποντικών με είτε όχημα ή entinostat (5 mg /kg ή 20 mg /kg) για 5 ημέρες. Σπληνοκύτταρα και κύτταρα λεμφαδένων συλλέχθηκαν. Ο αριθμός των έκφραση Tregs και Foxp3 προσεγγίστηκαν με ανάλυση FACS.

In vivo

θεραπεία με entinostat δεν είχε σημαντική επίδραση στον αριθμό των Tregs (CD4

+ Foxp3

+ Τ κύτταρα) σε CD4 πληθυσμό

+ Τ κυττάρων είτε από λεμφαδένες ή σπλήνα. Ωστόσο, σε σύγκριση με τα ποντίκια που υπέστησαν αγωγή με φορέα, Tregs από ποντίκια με αγωγή είχε μια δοσοεξαρτώμενη μείωση στα επίπεδα Foxp3 (Εικ. 5Α). Η επίδραση της entinostat επί της έκφρασης Foxp3 ελέγχθηκε επίσης με μέτρηση των επιπέδων Foxp3 mRNA σε απομονωμένες πληθυσμούς κυττάρων μέσω ποσοτικής πραγματικού χρόνου RT-PCR. Tregs (CD4

+ CD25

+) και μη-Tregs (CD4

+ CD25

-) CD4 Τ κύτταρα καθαρίστηκαν από entinostat- και με φορέα ποντίκια που έλαβαν θεραπεία με τη χρήση μαγνητικών σφαιριδίων.

In vivo

entinostat θεραπεία μειώθηκε σημαντικά Foxp3 αγγελιοφόρου RNA σε Tregs, σε σύγκριση με Tregs από ποντίκια που έλαβαν φορέα (Σχ. 5Β). Η μειωμένη έκφραση της πρωτεΐνης Foxp3 σε αγωγή Tregs επιβεβαιώθηκε επίσης με ανάλυση στυπώματος Western (Σχ. 5C).

ποντίκια BALB /c υποβλήθηκαν σε αγωγή με φορέα (0,5% methocel) ή 5 mg /kg /ημέρα ή 20 mg /kg /ημέρα του entinostat με καθετηριασμό για 5 ημέρες. Τα κύτταρα συλλέχθηκαν από σπλήνες και οι λεμφαδένες. Α,

In vivo

entinostat θεραπεία μείωσε το επίπεδο έκφρασης Foxp3 στα CD4 + κυττάρων

+ Foxp3

(Treg). Τα κύτταρα χρωματίστηκαν με φθορισμό συζευγμένα με αντισώματα ειδικά για CD4, CD25, και Foxp3 και υποβλήθηκαν σε ανάλυση κυτταρομετρίας ροής. Τα οικόπεδα dot ήταν περιφραγμένη για CD4

+ κύτταρα. Η ορθογώνια περιοχή περικλείει τα CD4

+ Foxp3

+ κύτταρα, οι αριθμοί στην κορυφή αντιπροσωπεύουν το ποσοστό των Foxp3

+ κύτταρα. Οι αριθμοί στο κάτω μέρος της περιοχής αντιπροσωπεύουν την μέση ένταση φθορισμού της χρώσης Foxp3 ΡΕ του CD4

+ Foxp3

+ κύτταρα. Τα πάνελ στα δεξιά αντιπροσωπεύουν ποσοτικοποίηση των Tregs ποσοστό (άνω) και την έκφραση Foxp3 (κάτω) στην ανάλυση FACS. Γράφημα δείχνει μέσα, ράβδοι σφάλματος αντιπροσωπεύουν τις τυπικές αποκλίσεις για 6 δείγματα σε κάθε ομάδα.

σ

= 0,00078 για 5 mg /kg entinostat εναντίον του οχήματος?

σ

= 0.000004 για 20 mg /kg entinostat εναντίον του οχήματος?

σ

= 0.0038 για 20 mg /kg entinostat έναντι 5 mg /kg entinostat. α = 0,05. Τα αποτελέσματα είναι αντιπροσωπευτικά τριών ξεχωριστών πειραμάτων. Β,

In vivo

entinostat θεραπεία μείωσε τα επίπεδα Foxp3 mRNA σε απομονωμένες Tregs. Σύνολο RNAs εξήχθησαν από απομονωμένα CD4

+ CD25

+ Τ κύτταρα (Tregs) και CD4

+ CD25

– Τ κύτταρα (Teffs) και αναλύθηκαν για Foxp3 mRNA σε πραγματικό χρόνο RT-PCR. επίπεδα Foxp3 mRNA ήταν κανονικοποιούνται σε GAPDH mRNA (ή ριβοσωμικού RPL13A RNA) και οι τιμές αντιπροσωπεύουν μέσο για τρία δείγματα (τρία ποντίκια ανά δείγμα) ανά ομάδα και έχουν σχετικές μονάδες.

σ

= 0,0157 για Tregs αντιμετωπίζονται με entinostat εναντίον Tregs αγωγή με όχημα. Τα αποτελέσματα είναι αντιπροσωπευτικά τριών ξεχωριστών πειραμάτων. C,

In vivo

entinostat θεραπεία μείωσε το επίπεδο της πρωτεΐνης Foxp3 στο Tregs. Συνολικής κυτταρικής πρωτεΐνης εκχυλίστηκε από απομονωμένα Tregs και Teffs και αναλύθηκε για πρωτεΐνη Foxp3 με κηλίδα Western. D, Τα αποτελέσματα του αναστολέα HDAC, entinostat, για Tregs κατασταλτική λειτουργία και τον πολλαπλασιασμό Teffs. Tregs δοκιμασίες καταστολής: 2 × 10

5 CFSE σημασμένο Teffs διεγέρθηκαν με 0.5 μg /ml του αντισώματος αντι-CD3ε και 4 χ 10

5 ακτινοβολημένα κύτταρα που παρουσιάζουν αντιγόνο (CD4 κύτταρα-εξαντλημένο σπληνοκύτταρα) και συν-καλλιεργήθηκαν με Tregs σε διαφορετικές αναλογίες για να Teffs για 62-80 ώρες. Ποσοστά διαιρούμενο Teffs υπολογίστηκαν σε όλα τα σημεία αναλογία για κάθε επεξεργασία. Ποσοστό καταστολή της Teffs διαχωριστικών υπολογίστηκε για κάθε σημείο με τη σύγκριση των κυττάρων διαίρεση σε κάθε αναλογία προς το κύτταρο διαχωριστική απουσία Tregs (0:1). Αριστερό πλαίσιο: Επίδραση της entinostat θεραπείας στη λειτουργία Tregs. Δεξιά πίνακα: Επίδραση της entinostat θεραπεία για τον πολλαπλασιασμό των Teffs. Ιστόγραμμα δείχνει το ποσοστό των χωρίζεται Teffs χωρίς Tregs. Τα δεδομένα είναι αντιπροσωπευτικά τριών ξεχωριστών πειραμάτων. Οι τιμές είναι μέσοι από μετρήσεις εις τριπλούν. * Αντιπροσωπεύει

σ

& lt? 0,05 για αισθητή σημείο εναντίον του οχήματος? ** Αντιπροσωπεύει

σ

& lt?. 0.01 για αισθητή σημείο εναντίον οχήματος

Η

Για να καθοριστεί εάν μειωμένη έκφραση Foxp3 στο entinostat αντιμετωπίζονται Tregs οδηγεί σε διαταραχή της κατασταλτικής λειτουργίας των Tregs, CFSE-επισημασμένο καθαρισμένα CD4

+ CD25

– Τ κύτταρα (Teffs) καλλιεργήθηκαν με αντι-CD3e αντίσωμα και κύτταρα παρουσίασης αντιγόνου. Tregs προστέθηκαν στη συνέχεια στον πολιτισμό με διαφορετικές Treg εναντίον αναλογίες Teff (Εικ. 5D). BALB /c ποντίκια υποβλήθηκαν σε αγωγή με όχημα ή διάφορες δόσεις entinostat

in vivo

όπως υποδεικνύεται. Tregs απομονώθηκαν από σπληνοκύτταρα από ποντίκια διαφορικά αγωγή και καλλιεργούνται με απομονωμένο Teffs από ποντικούς υπό αγωγή με όχημα για να δοκιμαστεί η επίδραση της θεραπείας επί Tregs κατασταλτική δραστηριότητα (Σχ. 5D, αριστερό πάνελ). Επιπλέον, Teffs απομονώθηκε από σπληνοκύτταρα από ποντίκια με αγωγή διαφορικά διεγέρθηκαν να εξεταστούν τα αποτελέσματα των διαφορετικών αγωγών επί της ικανότητας πολλαπλασιασμού των Teffs (Σχ. 5D, δεξί πάνελ). Entinostat (5 mg /kg) έλαβαν Tregs ήταν δύο έως τρεις φορές (για παράδειγμα, στο Tregs:Teff = 1:04, 25% έναντι 63% καταστολή) λιγότερο αποτελεσματική στην καταστολή του πολλαπλασιασμού Teffs από αγωγή με όχημα Tregs (Σχ. 5D , αριστερό πάνελ). Υψηλότερη δόση entinostat (20 mg /kg) ανέστειλε περαιτέρω λειτουργία κατασταλτική Treg με έως και επτά φορές (Tregs:Teffs = 1:02) μείωση (Σχ. 5D, αριστερό πάνελ). Είναι ενδιαφέρον ότι,

in vivo

χαμηλή δόση entinostat θεραπεία (5 mg /kg) έδειξαν ελάχιστη αναστολή της ικανότητας πολλαπλασιασμού των Teffs, ενώ υψηλότερη δόση (20 mg /kg) ανέστειλε σημαντικά την ικανότητα πολλαπλασιασμού των Teffs, σε σύγκριση με όχημα κατεργασμένα Teffs (Εικ. 5D, δεξί πάνελ). Λαμβανόμενα μαζί, αυτά τα αποτελέσματα υποδεικνύουν ότι το

in vivo

θεραπεία με χαμηλή, δεν κυτταροτοξική δόση entinostat [25] αναστέλλει Tregs κατασταλτική λειτουργία με ελάχιστη επίδραση στην ικανότητα Teffs πολλαπλασιαζόμενων.

STAT3 ακετυλιώνεται με entinostat θεραπείας και σχετίζεται με Foxp3 κάτω ρύθμιση

Στη συνέχεια εξετάσαμε το δυνατόν μεσολαβητές σηματοδότησης υπεύθυνο για Foxp3 κάτω ρύθμιση που προκαλείται από entinostat. σηματοδότηση STAT3 ενεργοποιείται με ακετυλίωση και έχει ενοχοποιηθεί σε Foxp3 διαφοροποίηση [37], [38]. Για να δοκιμαστεί εάν STAT3 είναι ένας από τους στόχους της entinostat, κύτταρα HepG2, μία κυτταρική γραμμή ηπατώματος με επαγώγιμο σηματοδότηση STAT3 χρησιμοποιήθηκαν για STAT3 σηματοδότηση μελέτες [38], υποβλήθηκαν σε αγωγή για 6 ώρες. Η θεραπεία με 0.5 μΜ entinostat ήταν αρκετή για να επάγει την ακετυλίωση της STAT3 (Σχ. 6Α) χωρίς να αλλάξει σημαντικά την ολική επίπεδα πρωτεΐνης STAT3 (Σχ. 6Α). Επιπλέον, ελέγξαμε STAT3 ακετυλίωσης σπληνοκύτταρα. Και πάλι, entinostat θεραπεία αυξημένη ακετυλίωση της STAT3 σε σπληνοκυττάρων (σχ. 6Β). Για την περαιτέρω δοκιμή αν STAT3 μεσολαβεί κάτω ρύθμιση των Foxp3 από entinostat, χρησιμοποιήσαμε ένα πολύ συγκεκριμένο, κελί διαπερατό αναστολέα πεπτίδιο STAT3 [39]. θεραπεία Entinostat μειωμένα επίπεδα Foxp3 σε Tregs, ενώ η παρουσία του ειδικού αναστολέα STAT3 μερικώς, αλλά σημαντικά εξουδετερώνεται το ανασταλτικό αποτέλεσμα επί της έκφρασης entinostat Foxp3 σε Tregs (-50% εξουδετέρωση) τόσο στην απουσία και παρουσία IL-2 (Σχ. 6C και 6D, αντίστοιχα). Σε όλες τις συνθήκες, δεν υπήρχε σημαντική διαφορά στον αριθμό των Tregs. Το αποτέλεσμα αυτό υποδηλώνει ότι η STAT3 είναι εν μέρει εμπλέκονται στην entinostat κάτω ρύθμιση της έκφρασης Foxp3 στο Tregs.

Α και Β, η θεραπεία Entinostat προκαλεί STAT3 ακετυλίωση. κύτταρα HepG2 ή σπληνοκύτταρα υποβλήθηκαν σε αγωγή για 6 ώρες, συλλέχθηκαν, λύθηκαν και για τη Δυτική ανοσοκηλίδωση ή ανοσοκαταβύθιση. Α, Entinostat προκαλούμενη ακετυλίωση STAT3 σε κύτταρα HepG2. Πάνω πίνακας: κυτταρολύματα αναλύθηκαν άμεσα και στυπώθηκαν με αντι-STAT3 και ακτίνης. Κάτω πάνελ, κυτταρολύματα ανοσοκαταβυθίστηκαν με αντι-STAT3 αντίσωμα και στη συνέχεια στυπώθηκαν με αντι-STAT3 αντίσωμα και με αντίσωμα αντι-ακετυλιωμένη λυσίνη. Β, Entinostat που προκαλείται STAT3 ακετυλίωση σε σπλήνας. IP και στύπωμα Western πραγματοποιήθηκαν όπως περιγράφεται στο Α Γ και Δ, τα κάτω ρύθμιση του Foxp3 αναστέλλεται από το κλείδωμα σηματοδότηση STAT3. Σπληνοκύτταρα συλλέχθηκαν από ποντικούς BALB /c και να θέσει σε καλλιέργεια. Οι καλλιέργειες υποβλήθηκαν σε αγωγή με όχημα ή 0.5 mM αναστολέα πεπτίδιο ειδικό STAT3 για μία ώρα, που ακολουθείται από όχημα ή 0.5 μΜ entinostat θεραπεία για 23 ώρες. Τα κύτταρα συλλέχθηκαν και αναλύθηκαν με κυτταρομετρία ροής χρησιμοποιώντας φθορισμό συζευγμένα με αντισώματα ειδικά για CD4 και Foxp3. Επιδιορθώνεται βαφή Ζωντανού /Νεκρού χρησιμοποιήθηκε για τη χρώση των κυττάρων και τα ζωντανά κύτταρα οριοθετημένα. κυτταρική καλλιέργεια σε απουσία (πάνελ C) ή σε παρουσία (πάνελ D) της IL-2. Σε κάθε κατάσταση, ιστογράμματα δείχνουν ποσοτικοποίηση των Foxp3 έκφρασης σε Tregs με ανάλυση FACS. Γράφημα δείχνει μέσα, μπάρες σφάλματος αντιπροσωπεύουν τυπικές αποκλίσεις. Στην C,

σ

= 0.0002 για entinostat εναντίον STAT3 αναστολέας + entinostat. Στο D,

σ

= 0,00015 για entinostat εναντίον STAT3 αναστολέας + entinostat. Τα αποτελέσματα είναι αντιπροσωπευτικά των τριών ξεχωριστών πειραμάτων.

Η

κατηγορία Ι, αλλά δεν Class II HDAC αναστολή καταστέλλει την έκφραση Foxp3 στο Tregs

in vitro

Η

Προηγούμενες μελέτες έχουν αναφέρει ότι αναστολή της HDACs αυξάνει τον αριθμό Tregs, και προωθεί τη λειτουργία Tregs και συνδέονται καταστολή ανοσοαπόκριση [30], [40]. Ως εκ τούτου, διερευνήσαμε κατά πόσον η αναστολή των διαφόρων κατηγοριών των HDACs μπορεί να έχει διαφορετικές επιδράσεις επί των Tregs. Δοκιμάσαμε άλλους αναστολείς HDAC συμπεριλαμβανομένης της επιλεκτικής κατηγορίας Ι αναστολέα, MGCD0103, ο αναστολέας τηγάνι, panobinostat, και δύο εκλεκτικοί αναστολείς τάξης II, MC1568 και MC1575 [41]. Σπληνοκύτταρα απομονώθηκαν από ποντικούς BALB /c καλλιεργήθηκαν με διαφορετικές θεραπείες για 24 ώρες. επιλέχθηκαν Οι δόσεις των αναστολέων με βάση προηγούμενες μελέτες [41], [42]. Τα κύτταρα συλλέχθηκαν, χρωματίστηκαν για επιφανειακούς δείκτες και Foxp3, και υποβλήθηκαν σε ανάλυση FACS. Τόσο κατηγορίας Ι HDAC αναστολείς, entinostat και MGCD0103, κάτω-ρυθμίζονται Foxp3 στο Tregs (Εικ. 7Α). Τόσο entinostat και panobinostat μειωμένα επίπεδα πρωτεΐνης Foxp3 σε πληθυσμό Tregs με δοσο-εξαρτώμενο τρόπο. Εκλεκτικοί αναστολείς HDAC κατηγορίας II δεν είχε σημαντική επίδραση στην Tregs (Εικ. 7Β). Αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι η αναστολή της κατηγορίας Ι, δεν κατηγορίας HDACs II οδηγεί σε μειορύθμιση Foxp3.

Σπληνοκύτταρα απομονώθηκαν από ποντικούς BALB /c και να θέσει σε καλλιέργεια με διαφορετικές συνθήκες επεξεργασίας όπως υποδεικνύεται για 24 ώρες. Τα κύτταρα συλλέχθηκαν, χρωματίστηκαν για δείκτες επιφάνειας και ενδοκυτταρική Foxp3, και υποβλήθηκαν σε ανάλυση FACS. Οικόπεδο περίφραξη και ένδειξη των παραμέτρων περιγράφονται στο Σχήμα 1. Τα ιστογράμματα δείχνουν ποσοτικοποίηση των επιπέδων Foxp3 στο Tregs. Ένα, δύο κατηγορίας Ι HDAC αναστολείς, entinostat και MGCD0103, αναστέλλουν την έκφραση Foxp3 στο Tregs. Κατά τη σύγκριση entinostat με MGCD0103, χρησιμοποιήθηκε ΡΕ συζευγμένο αντι-Foxp3 αντισώματος. Β, αναστολέας HDAC κατηγορίας Ι, entinostat, και ένας αναστολέας τηγάνι, panobinostat, αλλά όχι κλάσεως II HDAC αναστολείς, MC1568 και MC1575, αναστέλλουν την έκφραση Foxp3 σε Tregs. Κατά τη σύγκριση entinostat με αναστολείς HDAC κατηγορίας ΙΙ και του αναστολέα τηγάνι, panobinostat, η Alexa 700 συζευγμένο αντι-Foxp3 αντίσωμα χρησιμοποιήθηκε από άλλες φθοριόχρωμα κανάλια παρεμβολές από τον αυτοφθορισμό των αναστολέων HDAC κατηγορίας II. ** Αντιπροσωπεύει

σ

& lt?. 0.01 για έντονη θεραπεία εναντίον οχήματος

Η

Συζήτηση

Στη μελέτη μας, παρέχουμε στοιχεία που αποδεικνύουν ότι ο αναστολέας HDAC κατηγορίας Ι, entinostat, αναστέλλει Tregs και ενισχύει την αντικαρκινική δράση των δύο διαφορετικών ανοσοθεραπείες. Στην entinostat και IL-2 στρατηγική συνδυασμού, θεραπεία με IL-2 ενεργοποιημένα και προώθησε πολλαπλασιασμό των Teffs, αλλά ενεργοποιούνται επίσης Tregs (Εικ. 1).