Αφηρημένο

Στόχοι

πολυμορφισμοί ενός νουκλεοτιδίου (SNPs) σε υποθετικές microRNA θέσεις σύνδεσης (miRSNPs) ρυθμίζουν την ευαισθησία του καρκίνου μέσω επηρεάζουν τη δέσμευση των miRNA. Εδώ, επιδιώξαμε να ερευνήσει τη σχέση μεταξύ miRSNPs και τον κίνδυνο εμφάνισης καρκίνου του τραχήλου της μήτρας.

Μέθοδοι

γονότυπος πρώτα 41 miRSNPs των 37 γονιδίων που σχετίζονται με τον καρκίνο σε 338 ασθενείς και 334 μάρτυρες (Μελέτη 1), και να αναπαραχθεί τις σημαντικές ενώσεις σε 502 ασθενείς και 600 μάρτυρες (Μελέτη 2). Δοκιμάσαμε τις επιδράσεις της miRSNPs για την αλληλεπίδραση microRNA-mRNA με δοκιμασία ανταποκριτή λουσιφεράσης.

Αποτελέσματα

Πέντε SNPs εμφανίζεται αξιοσημείωτη συσχέτιση με τον κίνδυνο εμφάνισης καρκίνου του τραχήλου της μήτρας στη Μελέτη 1. Μόνο

IL-16

rs1131445 διατήρησε μια σημαντική συσχέτιση με τον καρκίνο του τραχήλου της μήτρας (CT /CC έναντι ΤΤ, προσαρμογή OR = 1.51,

P

= 0,001) στη Μελέτη 2. Η συσχέτιση αυτή ήταν πιο εμφανής στα συνδυασμένα δεδομένα από δύο μελέτες ( προσαρμογή OR = 1.49,

P

= 0.00007). Βρήκαμε επίσης ότι το miR-135b μιμείται αλληλεπιδρά με το

IL-16

3′-UTR για τη μείωση της γονιδιακής έκφρασης και ότι το rs1131445 Τ σε υποκατάσταση C στην υποθετική θέση δέσμευσης απομείωση της αλληλεπίδρασης των miR-135b με

IL-16

3′-UTR. Μια ELISA έδειξαν ότι ο ορός IL-16 των ασθενών με καρκίνο του τραχήλου της μήτρας ήταν αυξημένα (vs. μάρτυρες,

P

= 0,001) και συσχετίστηκε με το γονότυπο rs1131445. Οι ασθενείς που έφεραν το αλληλόμορφο rs1131445 C είχαν υψηλότερα IL-16 στον ορό από τους μη-φορείς (

P

& lt? 0.001).

Συμπεράσματα

Αυτά τα αποτελέσματα υποστηρίζουν την υπόθεση μας ότι η miRSNPs αποτελούν παράγοντα ευαισθησίας για καρκίνων του τραχήλου. rs1131445 επηρεάζει

IL-16

έκφραση παρεμβαίνοντας στη λειτουργία κατασταλτική της miR135b και αυτής της παραλλαγής είναι σημαντικά συνδέεται με τον κίνδυνο εμφάνισης καρκίνου του τραχήλου της μήτρας

Παράθεση:. Mi Υ, Wang L, Zong L, Pei Μ , Lu Q, Huang P (2014) γενετικές παραλλαγές στο microRNA Target τοποθεσίες των 37 επιλεγμένων σχετίζονται με τον καρκίνο γονίδια και τον κίνδυνο του καρκίνου του τραχήλου της μήτρας. PLoS ONE 9 (1): e86061. doi: 10.1371 /journal.pone.0086061

Επιμέλεια: Qing-Yi Wei, Δούκα Ινστιτούτο Καρκίνου, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 2 του Νοεμβρίου του 2013? Αποδεκτές: 9 Δεκεμβρίου του 2013? Δημοσιεύθηκε: 22 Ιανουαρίου 2014

Copyright: © 2014 Mi et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από Xi’an Επιστήμης και Τεχνολογίας Πρόγραμμα Έρευνας (επιχορηγήσεις XASTR1125), το Ίδρυμα Επιστημονικής Έρευνας για τις επέστρεψε στο εξωτερικό κινέζικα Υποτρόφων (μέλος του Υπουργείου Παιδείας) ». Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα: Οι συγγραφείς δηλώνουν ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

ο καρκίνος του τραχήλου, ο τρίτος συχνότερος καρκίνος στις γυναίκες [1], προκαλείται κυρίως από ιό των ανθρωπίνων θηλωμάτων (HPV) [2]. Αν και HPV λοιμώξεις είναι διαδεδομένη σε σεξουαλικά ενεργές γυναίκες, μόνο μια μειοψηφία των λοιμώξεων επιμένουν και να εξελιχθεί σε τραχηλικής ενδοεπιθηλιακής νεοπλασίας βαθμού 2/3 (CIN 2/3) ή ακόμη και καρκίνο του τραχήλου της μήτρας [3]. Αρκετές συμπαράγοντες επηρεάσουν την μετάβαση από την αρχική μόλυνση HPV σε καρκίνο του τραχήλου, συμπεριλαμβανομένων ζωής, ανοσοαπόκριση ξενιστή, και γενετική ευαισθησία [4], [5]. Οι σημαντικούς ρόλους των γενετικών παραγόντων στην παθογένεια του τραχήλου της μήτρας καρκίνου του ζητηθεί από τα ευρήματα ότι ο καρκίνος του τραχήλου της μήτρας παρουσιάζει σημαντική οικογενειακή ομαδοποίηση και οι πρώτου βαθμού συγγενείς των ασθενών που έχουν διπλό κίνδυνο ανάπτυξης καρκίνου του [6]. Λίγες παραλλαγές κινδύνου διαμόρφωσης για τον καρκίνο του τραχήλου της μήτρας έχουν προσδιοριστεί από μια μελέτη συσχέτισης υποψήφιων γονιδίων. Τα γονίδια που σχετίζονται με την ευαισθησία του καρκίνου του τραχήλου που εμπλέκονται στην επιδιόρθωση του DNA, κυτταρική κύκλου και απόπτωση, κυτταρικό πολλαπλασιασμό και διαφοροποίηση, το σύστημα ανθρώπινου αντιγόνου λευκοκυττάρων και ανοσολογικών αποκρίσεων [7], [8].

Πρόσφατα πειστικές αποδείξεις υποδεικνύει ότι πολυμορφισμοί στο microRNA (miRNA) θέσεις δέσμευσης των γονιδίων σχετιζόμενων με τον καρκίνο είναι μια σημαντική πηγή που φιλοξενεί τις αιτιολογικός γενετικές παραλλαγές του καρκίνου [9]. miRNA, συχνά 19-25 νουκλεοτιδίων μήκους μη κωδικεύουσα RNA, δεσμεύεται εντός της 3 ‘μη μεταφραζόμενη περιοχή (UTR) του μεταγραφές στοχευμένων γονιδίων για την αναστολή και ακόμη και να καταργήσει τη μετάφρασή του σε πρωτεΐνη. Εκτιμάται ότι περίπου το 30% των ανθρώπινων γονιδίων ρυθμίζονται από miRNAs [10]. Gene απορρύθμιση είναι ένας από τους κύριους μηχανισμούς με τους οποίους τα κύτταρα μπορούν να εξελιχθούν σε καρκίνο [11]. miRNA μπορεί να συμμετέχει στην καρκινογένεση μέσω μετα-μεταγραφική ρύθμιση πολλών σχετίζονται με τον καρκίνο γονίδια, συμπεριλαμβανομένων των ογκογόνων και ογκοκατασταλτικών γονιδίων. Η ανώμαλη έκφραση των miRNAs συμβάλλει στην αιτιολογία της πολλαπλής καρκίνων, συμπεριλαμβανομένου του καρκίνου του τραχήλου της μήτρας [12]. miRNA προφίλ ανάλυση του καρκίνου του τραχήλου αποκάλυψε ότι Mirs-9, 21, 135b, 146a, 199α, 203 και 205 συχνά υπερεκφράζονται σε καρκινικούς ιστούς ή κυτταρικές σειρές [12]. Επιπλέον, miR-205 δρα ως ένα ογκογονίδιο να προωθήσει τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων και τη μετανάστευση των ανθρώπινων κυττάρων καρκίνου του τραχήλου της μήτρας [13]. Σε αντίθεση, miR-214 στοχεύει άμεσα το γονίδιο GALNT7 να καταστείλει την ανάπτυξη και την διεισδυτικότητα του τραχήλου της μήτρας καρκινικών κυττάρων λειτουργώντας ως ογκοκατασταλτικό ένα ογκοκατασταλτικό [14]. Η αλλαγή ζεύγους βάσεων εντός της περιοχής miRNA-στόχος των γονιδίων σχετιζόμενων με τον καρκίνο θα μπορούσε να καταστρέψει ή να δημιουργήσει μια θέση πρόσδεσης ή να τροποποιήσει την συγγένεια πρόσδεσης και μετα-μεταγραφικό έλεγχο του mRNA με miRNA και, ως εκ τούτου, θα μπορούσαν να επηρεάσουν τον μετασχηματισμό από τα φυσιολογικά κύτταρα σε καρκινικά κύτταρα [9].

ανάλυση Βιοπληροφορική έχει εντοπίσει πολλές SNPs που βρίσκονται στις υποθετικές θέσεις πρόσδεσης miRNA του καρκίνου υποψήφιων γονιδίων και ότι επηρεάζει σημαντικά την ενέργεια δέσμευσης του υποθετικού miRNA :: mRNA μεζονέτες [15]. Ένα μικρό κλάσμα από αυτά έχουν περαιτέρω αποδειχθεί ότι μεταβάλλει την έκφραση γονιδίων στόχων με τη δοκιμασία ανταποκριτή λουσιφεράσης και να εμφανίσει μια σημαντική συσχέτιση με την ευαισθησία στον καρκίνο [16], [17]. Landi et al. διαλογή έξω 57 SNPs εντός θέσεις miRNA δέσμευσης από 104 υποψήφια γονίδια για τον ορθοκολικό καρκίνο, βρέθηκε οκτώ SNPs από αυτά που δείχνουν διάφορες ελεύθερη ενέργεια Gibbs της πρόσδεσης μεταξύ των δύο αλληλόμορφων του κάθε SNP, και απέδειξαν τελικά ένα SNP, rs17281995, εντός του miRNA δέσμευσης θέσεις του CD86, καθώς η παραλλαγή κίνδυνος διαμόρφωσης για τον ορθοκολικό καρκίνο [16]. Χρησιμοποιώντας μια παρόμοια στρατηγική έρευνας, SNPs εντός miRNA θέσεις άλλων σημαντικών υποψήφιων καρκίνο γονίδια, όπως γονίδια επιδιόρθωσης του DNA [17] δεσμευτική, ιντεγκρίνης γονίδια [18] και τα γονίδια της κασπάσης [19], έχουν επίσης ταυτοποιηθεί και περαιτέρω αξιολογούνται ως παραλλαγές ευαισθησίας για καρκίνο ουροδόχου κύστης, καρκίνο του μαστού, καρκίνο του παχέος εντέρου, και το κεφάλι και τον κίνδυνο εμφάνισης καρκίνου του λαιμού. Πρόσφατα, Shi et al. έδειξαν ότι το αλληλόμορφο G rs11064 εντός ο

TNFAIP8

γονίδιο αποδυναμώνει τη συγγένεια δέσμευσης του miR-22 στο TNFAIP8 3′- UTR και σχετίζεται με αυξημένο κίνδυνο καρκίνου του τραχήλου [20], το οποίο υποδηλώνει ότι miRNA- θέσεις πρόσδεσης είναι επίσης τα hot spots που φιλοξενούν τραχήλου της μήτρας παραλλαγές ευαισθησίας στον καρκίνο.

στην παρούσα μελέτη, επιδιώξαμε να εντοπίσουν νέες παραλλαγές του κινδύνου για τον καρκίνο του τραχήλου της μήτρας μεταξύ των δικτυακών τόπων miRNA-στόχο στα γονίδια που σχετίζονται με τον καρκίνο. Με την αναθεώρηση της βιβλιογραφίας και της βιοπληροφορικής βάσεις δεδομένων, βρήκαμε 37 γονίδια που σχετίζονται με τον καρκίνο με παραλλαγές σε υποθετικές θέσεις πρόσδεσης 3′-UTR miRNA. Η ισχύς σύνδεσης αυτών των παραλλαγών με καρκίνο του τραχήλου της μήτρας αξιολογήθηκε από μια μελέτη ελέγχου σε δύο στάδια. Για τη σχετική παραλλαγή, λειτουργική επιρροή της στην miRNA μεσολάβηση ρύθμιση της έκφρασης των γονιδίων στόχων ερευνήθηκε χρησιμοποιώντας τη δοκιμασία ανταποκριτή λουσιφεράσης.

Υλικά και Μέθοδοι

1 Πληθυσμός μελέτης

έχουμε προσληφθεί 840 ασθενείς με καρκίνο του τραχήλου της μήτρας από τους ασθενείς που έλαβαν ενδονοσοκομειακή θεραπεία σε τρία νοσοκομεία από τον Μάιο του 2008 και τον Απρίλιο του 2012. μεταξύ αυτών, 338 άτομα από το Νοσοκομείο Liaocheng Λαϊκής (LCPH) χρησιμοποιήθηκαν στη μελέτη πρώτο στάδιο (μελέτη 1), η οποία διερεύνησε όλα των επιλεγμένων SNPs, και 502 άτομα από το πρώτο συνδεδεμένες νοσοκομείο της Xi’an Jiaotong University (TFAHXJTU) και μητέρας και Παιδιού Νοσοκομείο Υγείας της επαρχίας Shaanxi (MCHHSP) χρησιμοποιήθηκαν στη δεύτερη μελέτη στάδιο (μελέτη 2), η οποία επρόκειτο να αναπαράγουν το αξιοσημείωτο ευρήματα (

P

& lt? 0,05) από την Μελέτη 1. Όλοι οι ασθενείς διαγνώστηκαν με ιστολογική εξέταση της βιοψίας υπό κολποσκόπιο ή /και εκτομή ιστών. Το κλινικό στάδιο και ιστολογικού τύπου του καρκίνου του τραχήλου της μήτρας των ασθενών συλλέχθηκαν από ιατρικά αρχεία και φαίνονται στον Πίνακα 1. Ένα σύνολο 934 υγιείς μάρτυρες είχαν προσληφθεί από τις γυναίκες που συνήθως παρακολούθησαν φυσική εξέταση σε αυτά τα τρία νοσοκομεία, 334 άτομα από LCPH στη Μελέτη 1 και 600 άτομα από TFAHXJTU και MCHHSP στη Μελέτη 2. Όλα τα στοιχεία ελέγχου δεν είχαν ιστορικό νεοπλασματικής ή σχετίζονται με τον καρκίνο ασθένεια, και είχαν κανονική εξέταση τραχηλικής βλέννας σε τουλάχιστον δύο διαδοχικές ετήσιες εξετάσεις. Όλα τα άτομα ήταν γενετικά άσχετη, και την ηλικία τους, τη φυλή, το κάπνισμα, κοινωνικο-οικονομική κατάσταση, και η οικογενειακή κατάσταση ερευνήθηκαν επίσης από την ανάγνωση ιατρικών αρχείων ή από συνεντεύξεις. Η μελέτη αυτή εγκρίθηκε από τις Επιτροπές Ηθικής Ιατρικής του LCPH, TFAHXJTU και MCHHSP και όλοι οι συμμετέχοντες έδωσαν την έγγραφη συγκατάθεση.

Η

2 επιλογής Πολυμορφισμός και γονοτυπική

Προηγούμενες μελέτες έχουν συστηματικά διαλογή των SNPs σε miRNA χώρους πολλών σχετίζονται με τον καρκίνο γονίδια δεσμευτική. Εν συντομία, θα προβληθεί το πρώτο του καρκίνου που σχετίζονται με γονίδια από τη βάση δεδομένων και τη λογοτεχνία αναζητήσεις, και στη συνέχεια, εντόπισαν τις πιθανές θέσεις-στόχους των miRNAs σε αυτά τα γονίδια από εξειδικευμένους αλγορίθμους (όπως miRBase, Miranda, PicTar και TargetScan) και επιλέγονται τα SNPs που κατοικούν στο miRNA-θέσεις σύνδεσης από την αναζήτηση dbSNP και BLAST, τέλος, τον προσδιορισμό του SNPs των οποίων αλληλόμορφα κάνουν την αλληλουχία στόχο έχουν διαφορική σημαντικά δεσμευτική ενέργεια για να miRNA σε ένα προγνωστικό μοντέλο του υπολογιστή [16], [18]. Επειδή πολλά σχετίζονται με τον καρκίνο γονίδια κοινά σε πολλούς καρκίνους [21], επιλέξαμε την SNPs από την προηγούμενη βιβλιογραφία που καλύπτει τα θέματα για τα miRNA-δεσμευτική περιοχή /περιοχές-στόχους των miRNAs, πολυμορφισμοί και ο καρκίνος /όγκου. Η βάση δεδομένων Medline /PubMed ήταν έψαξε να βρει βιβλιογραφία που δημοσιεύθηκε από το 2000 τον Ιανουάριο έως το 2013 τον Ιανουάριο. Εμείς, τέλος, επιλέγονται 41 SNPs σε προβλεπόμενες θέσεις miRNA δέσμευσης εντός 37 σχετίζονται με τον καρκίνο γονίδια με μικρές συχνότητες αλληλόμορφο μεγαλύτερο από 0,1 στον πληθυσμό κινεζική Han (Πίνακας 2). Γενωμικό DNA εκχυλίστηκε από λευκοκύτταρα περιφερικού αίματος χρησιμοποιώντας το Blood DNA Midi Kit (Omega Biotech, Norcross, USA), σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. Τα επιλεγμένα SNPs ήταν ο γονότυπος στους ασθενείς και τους ελέγχους με τη χρήση MALDI-TOF εντός του συστήματος MassARRAY (Sequenom Inc., San Diego, CA, USA) [22].

Η

3 HPV του γονότυπου

Ανθρώπινο HPV από το τεστ Παπανικολάου απόξεση ή /και την εκτομή ιστών γονότυπου χρησιμοποιώντας το κιτ τεστ HPV GenoArray (HybriBio Ltd, Guangdong, Κίνα). Πρώτον, HPV DNA ενισχύθηκε με το L1 συναίνεση HPV εκκινητές ΜΥ09 /ΜΥ11 και HMB01. Στη συνέχεια, το προϊόν PCR επεξεργασία υβριδοποίησης διαμέσου ροής με τον τρόπο ενός μακροσυστοιχία μορφή με μία μεμβράνη νάϋλον επί της οποίας ακινητοποιήθηκαν HPV γονότυπο ολιγονουκλεοτιδικούς ανιχνευτές ειδικούς. Αυτή η τεχνική μπορεί να προσδιορίσει 21 HPV γονοτύπων, συμπεριλαμβανομένων των 5 τύπων χαμηλού κινδύνου (6, 11, 42, 43, και 44), 14 υψηλού κινδύνου τύπους (16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52 , 56, 58, 59, 66, και 68), και 2 τύποι ενδιάμεσου κινδύνου (CP8304 και 53).

4 ορού IL-16 επίπεδα

αίμα των ασθενών και των ελέγχων » δείγματα συλλέχθηκαν μεταξύ 8 και 10 π.μ. Οι οροί υποβλήθηκαν σε φυγοκέντρηση σε 3000 rpm για 10 λεπτά και καταψύχθηκαν στους -80 ° C. Ορός IL-16 επίπεδα μετρήθηκαν με εμπορικά διαθέσιμα ανοσορροφητική δοκιμασία (ELISA) κιτ ένζυμο-συνδεδεμένη (PIERCE Endogen) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Το ελάχιστο επίπεδο ανίχνευσης για την IL-16 ήταν 0,10 pg /ml. Δεν παρατηρήθηκε διασταυρούμενη ανίχνευση άλλων κυτοκινών. Η διακύμανση ενδο-δοκιμασίας ήταν & lt?. 10%

5 κυττάρων πολιτισμού

Ανθρώπινο καρκίνο του τραχήλου κυτταρικές σειρές, HeLa [23] και SiHa [24], αγοράστηκαν από τη Συλλογή Τύπος Πολιτισμού η κινεζική Ακαδημία Επιστημών (Σαγκάη, Κίνα). Αυτά τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε Dulbecco τροποποιημένο μέσο Eagle συμπληρωμένο με 100 U /ml πενικιλλίνη, 100 mg /ml στρεπτομυκίνη, και 10% εμβρυϊκό βόειο ορό και αναπτύχθηκαν στους 37 ° C σε ένα υγροποιημένο 5% διοξειδίου του άνθρακα επωαστήρα.

6 παροδικές επιμολύνσεις και προσδιορισμούς λουσιφεράσης

το 3′-UTR του IL-6 mRNA, συμπεριλαμβανομένου του αλληλόμορφου C ή Τ αλληλόμορφο του rs1131445, ενισχύθηκαν χρησιμοποιώντας τους εκκινητές 5′-TGGCCTGGGCCTCCTCACAA-3 ‘(προς τα εμπρός) και 5’-CTCCACCACCCTTCCCTA -3 ‘(reverse). Τα ενισχυμένα θραύσματα στη συνέχεια κλωνοποιήθηκαν εντός του προς τα κάτω του γονιδίου λουσιφεράσης πυγολαμπίδας στο pGL3-βασικό φορέα (Promega, Madison, USA). Αυτά τα πλασμίδια ανασυνδυασμού αλληλουχήθηκαν για να επιβεβαιωθεί η ακρίβειά τους. Για τις ανιχνεύσεις αναφοράς λουσιφεράσης, HeLa και SiHa καλλιεργήθηκε σε 24 φρεατίων για να συν-επιμολύνθηκαν με 100 ng pGL3-C ή pGL3-T κατασκευάσματα, 50 pmol /μL χημικά συνθετικών miRNAs miR-135b (GenePharma, Σαγκάη, Κίνα) ή αρνητικό miRNA ελέγχου χρησιμοποιώντας Lipofectamine 2000 αντιδραστήριο διαμόλυνσης (Invitrogen, Carlsbad, USA). Σε κάθε επιμόλυνση, 20 ng του πλασμιδίου pRL-ΤΚ (Promega, Madison, USA) χρησιμοποιήθηκε για τη διόρθωση για αποτελεσματικότητα μορφομετατροπής. Κάθε διαμόλυνση διεξήχθη εις τριπλούν. Τα κύτταρα συλλέχθηκαν 48 ώρες μετά την επιμόλυνση, και η δραστικότητα της λουσιφεράσης μετρήθηκε με ένα σύστημα διπλής λουσιφεράσης δοκιμασία ανταποκριτή (Promega, Madison, USA) και κανονικοποιημένες έναντι της δραστικότητας του γονιδίου της λουσιφεράσης της Renilla.

7. Η στατιστική ανάλυση

Εμείς υπολογίζεται η στατιστική ισχύς όπως περιγράφηκε προηγουμένως [25]. Μια χ

2 δοκιμή διεξήχθη για να κάνει μια σύγκριση των κατηγορικών μεταβλητών, συμπεριλαμβανομένης της συχνότητας του γονότυπου και κάποια δημογραφικά χαρακτηριστικά. έλεγχος τ, Mann-Whitney U-test ή ανάλυση διασποράς διεξήχθησαν για να συγκρίνουν τις συνεχείς μεταβλητές, όπως η ηλικία, το επίπεδο έκφρασης επίπεδο και ρεπόρτερ ορό IL-16, όταν χρειάζεται. Οι ενώσεις μεταξύ του

IL-16

παραλλαγές και ο κίνδυνος καρκίνου του τραχήλου της μήτρας εκτιμήθηκε υπολογίζοντας τις εξόχως απόκεντρες περιοχές και 95% ΚΠ τους από πολυπαραγοντική λογιστική παλινδρόμηση αναλύσεις με προσαρμογή για την ηλικία, το δείκτη μάζας σώματος, το κάπνισμα και την οικογένεια ιστορικό καρκίνου. Για να αποφευχθεί μια ψευδή ένωση που προκαλείται από πολλαπλές δοκιμές, η ψευδώς θετικά πιθανότητα έκθεσης (FPRP) υπολογίστηκε σύμφωνα με τη μέθοδο που περιγράφεται από Wacholder et al. [26]. Θέτουμε 0,2 ως όριο FPRP και αποδίδεται εκ των προτέρων πιθανότητα 0,01 να ανιχνεύσει μια Ή 1,50 (για τις επιπτώσεις του κινδύνου) ή 0,67 (για τις προστατευτικές επιδράσεις) για μια συσχέτιση με τα SNPs ή κλινικο-δημογραφικά χαρακτηριστικά. Η ισορροπία Hardy-Weinberg (HWE) των SNPs μεταξύ των ελέγχων αξιολογήθηκε από το 2 τεστ χ

. Όλες οι στατιστικές αναλύσεις πραγματοποιήθηκαν με SPSS (έκδοση 13.0, Chicago, IL, USA). Η τιμή του

P

& lt?. 0.05 θεωρήθηκε σημαντική (two-tailed)

Αποτελέσματα

1 χαρακτηριστικά του πληθυσμού

Εμείς ανέλυσε συνολικά 840 Οι ασθενείς με καρκίνο του τραχήλου της μήτρας και 934 έλεγχοι στις μελέτες 1 και 2. Τα δημογραφικά και κλινικά χαρακτηριστικά των ασθενών και των ελέγχων που παρουσιάζονται στον πίνακα 1. δεν υπήρχε σημαντική διαφορά στην κατανομή της ηλικίας, της φυλής, την κατάσταση, το μορφωτικό επίπεδο, την οικογενειακή και κάπνισμα κατάσταση μεταξύ των ελέγχων και των περιπτώσεων στη Μελέτη 1, Μελέτη 2 και όλα τα θέματα συνδυάζονται. Ωστόσο, οι περιπτώσεις ήταν πιο πιθανό να είναι νεότεροι σε ηλικία κατά την πρώτη παράδοση (

P

= 0,038) και με HPV λοίμωξη (

P

& lt? 0.001) από τους ελέγχους. HPV λοίμωξη παρέμεινε σημαντική συσχέτιση με τον καρκίνο του τραχήλου της μήτρας μετά την εξέταση του FPRP που ήταν λιγότερο από 0,2. Αυτές οι δύο μεταβλητές, προσαρμοσμένη για κάθε υπολειπόμενη συγχυτική δράση επίδραση στη μετέπειτα πολυπαραγοντική λογιστική παλινδρόμηση αναλύσεις.

2 Συλλόγου SNPs στο miRNA-δεσμευτικές θέσεις σχετίζονται με τον καρκίνο γονίδια με

του τραχήλου της μήτρας κίνδυνο καρκίνου

Περισσότερα από 99% των δειγμάτων γονότυπος επιτυχώς για κάθε SNP, και το πείραμα επαναληφθεί για τις τυχαία επιλεγμένες 300 δείγματα που αποκτήθηκαν εντελώς συνεπή δεδομένα γενότυπο με την αρχική ανάλυση. Ο Πίνακας 2 δείχνει τον κατάλογο των επιλεγέντων SNPs εντός των χώρων miRNA-δεσμευτικός ως προς όλα 3′-UTR των 37 γονιδίων που σχετίζονται με τον καρκίνο, τη δέσμευση miRNA ότι ενδεχομένως να επηρεάσει και τις συχνότητες γονότυπο τους και τις ενώσεις με τον καρκίνο του τραχήλου της μήτρας στη Μελέτη 1. Όλες οι παρατηρούμενες κατανομές γονότυπου ανάμεσα στους ελέγχους της μελέτης 1 ήταν σύμφωνα με την HWE. Μεταξύ των 41 SNPs που είχαν συμπεριληφθεί στη Μελέτη 1, πέντε SNPs (rs465646 στο

REV3L

γονίδιο, rs2239680 στο

BIRC5

γονίδιο, rs1476215 στο

FGF2

γονίδιο, rs3213180 στο

E2F1

γονίδιο, rs1131445 στο

IL-16

γονίδιο) παρουσίασαν σημαντικά διαφορετική κατανομή γονότυπο μεταξύ των περιπτώσεων με καρκίνο του τραχήλου της μήτρας και τους ελέγχους (

P

= 0.003~0.030). Για να διαπιστωθεί αν υπήρχε πραγματική σημαντική ενώσεις ή αν υπήρχαν πλαστά αποτελέσματα, πραγματοποιήσαμε μια επανάληψη για να αναλύσει αυτά τα SNPs σε άλλο πληθυσμό που κατοικεί στην επαρχία Shaan Xi της Βόρειας Κίνας. Στη Μελέτη 2, παρατηρήθηκε συχνότητες γονοτύπου τους ήταν επίσης συνεπής με HWE (Πίνακας 3). Επιπλέον, διαπιστώσαμε ότι μόνο

IL-16

rs1131445 συνέχισαν να δείχνουν μια σημαντική συσχέτιση με τον καρκίνο του τραχήλου της μήτρας. Τα άτομα με TC ή CC αλληλόμορφο του είχαν αυξημένο κίνδυνο για καρκίνο του τραχήλου της μήτρας (προσαρμογή OR = 1.51, 95% CI 1,18 έως 1,93,

P

= 0,001), με προσαρμογή για την ηλικία, το κάπνισμα κατάσταση, το μορφωτικό επίπεδο, ηλικία κατά primiparity, την οικογενειακή κατάσταση και την κατάσταση HPV λοίμωξη. Η συσχέτιση μεταξύ rs1131445 και του καρκίνου του τραχήλου της μήτρας ήταν πιο σημαντική στα δεδομένα που συνδυάζονται Μελέτη 1 και 2 (προσαρμογή OR = 1.49, 95% CI 1,22 έως 1,81,

P

= 0.00007) με ρύθμιση για τις εν λόγω μεταβλητές. Στη συνέχεια υπολογίζονται οι τιμές FPRP για όλες τις παρατηρήθηκαν σημαντικές συσχετίσεις. Όταν η υπόθεση της εκ των προτέρων πιθανότητα ήταν 0,01, η σύνδεση με το

IL-16

rs1131445 (TC /CC vs.TT) ήταν ακόμα αξιοσημείωτο σε δύο θέματα Μελέτη 1 (FPRP = 0,171) και όλα τα μαθήματα (FPRP = 0,011). Λαμβάνοντας υπόψη ένα ή 1,5 σε μια ονομαστική

P

= 0.05 για συχνότητες γονοτύπου κυμαίνονται 0,20 – 0,40, η στατιστική ισχύ της μελέτης μας για την ανίχνευση σύνδεσης του κάθε SNP με τον καρκίνο του τραχήλου της μήτρας στη Μελέτη 2 και σε συνδυασμό Μελέτη 1 και 2 εκτιμήθηκε σε 81,0 έως 91,5% και 95,0 έως 98,9%, αντίστοιχα. Η ανάλυση στρωματοποίησης δεν αποκάλυψε σημαντική αλληλεπίδραση των δημογραφικά και κλινικά χαρακτηριστικά και το γονότυπο rs1131445 σχετικά με τον κίνδυνο καρκίνου του τραχήλου της μήτρας (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Επιπλέον, δεν υπήρχαν σημαντικές συσχετίσεις μεταξύ των γονότυπων του rs1131445 και το κλινικό στάδιο και ιστολογικού τύπου του καρκίνου του τραχήλου της μήτρας (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται).

Η

3 Ορός IL-16 επίπεδο και ο συσχετισμός της με τον

IL-16

rs1131445 γονότυπο

Δεδομένου παρατηρήθηκε αξιοσημείωτη συσχέτιση μεταξύ της rs1131445 και του κινδύνου καρκίνου του τραχήλου της μήτρας, μπορούμε περαιτέρω διερεύνησης των IL-16 στον ορό σε ελέγχους και τους ασθενείς με καρκίνο του τραχήλου της μήτρας, καθώς και την πιθανή ρυθμιστική επιδράσεις του γονότυπου rs1131445 επί της IL-16 στον ορό. Επιλέξαμε 100 ασθενείς με καρκίνο του τραχήλου της μήτρας και 80 ελέγχους από τα θέματα της Μελέτης 2 και εξέτασε τα επίπεδα ορού της IL-16 με ELISA. Το IL-16 των ασθενών με καρκίνο του τραχήλου της μήτρας ορού σημαντικά αυξημένη σε σύγκριση με τους ελέγχους (

P

= 0,001, Σχήμα 1Α). Επιπλέον, σε ασθενείς με καρκίνο του τραχήλου της μήτρας, υπήρξε μια σημαντική συσχέτιση μεταξύ της ορό IL-16 και rs1131445 γονότυπο (

P

= 0,001). Οι ασθενείς αλληλόμορφο που φέρει rs1131445 C είχαν υψηλότερο IL-16 από τα μη-μεταφορείς ορού (

P

& lt? 0,05, Σχήμα 1Β). Επιπλέον, δεν είχαμε κανένα σημειωθεί στατιστικά σημαντική συσχέτιση της IL-16 με το κλινικό στάδιο και ιστολογικού τύπου του καρκίνου του τραχήλου της μήτρας ορού (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται).

A. Ορός IL-16 επίπεδα σε ελέγχους και τους ασθενείς με καρκίνο του τραχήλου της μήτρας, όπως μετρήθηκε με ELISA. B. Οι συσχετισμοί ορού επίπεδα της IL-16 με γονότυπο σε ελέγχους και ασθενείς. Τα δεδομένα εκφράστηκαν ως η μέση τιμή ± SEM. *

P

& lt? 0.05 έναντι των ελέγχων της ομάδας. +

P

& lt? 0,05 έναντι ασθενείς με γονότυπο ΤΤ

Η

4 Η επίδραση του rs1131445 στην αλληλεπίδραση μεταξύ miR-135b και

IL-16

3. «-UTR

Μια υποθετική θέση δέσμευσης εντός του 3′-UTR του

IL-16

για miR-135b έχει προσδιοριστεί χρησιμοποιώντας miRBase, Miranda, και το λογισμικό PicTar. Επίσης προέβλεψε ότι η υποκατάσταση από το Τ με το αλληλόμορφο C σε rs1131445 θα μπορούσε να μειωθεί δεσμευτικός την ελεύθερη ενέργεια Gibbs του miRNA-mRNA με 3,93 KJ /mol [16], το οποίο προτείνει ότι αυτή η SNP θα μπορούσε να επηρεάσει το

IL-16

έκφραση γονιδίων με αλλαγή της συγγένειας δέσμευσης miRNA-mRNA (Σχήμα 2Α). Για να ελεγχθεί αυτή η υπόθεση, ένας προσδιορισμός λουσιφεράσης εκτελέστηκε στην αυχενική καρκινικές κυτταρικές σειρές HeLa και SiHa, που επιμολύνονται με το pGL3-C-αλληλόμορφο ή pGL3-T-αλληλόμορφο κατασκευάσματα που συνοδεύεται από συντίθενται χημικά miRNAs miR-135b ή αρνητικός έλεγχος miRNA ( Σχήμα 2Α). Και για τις δύο κατασκευές, με την παρουσία του miR-135b μιμείται, η έκφραση της λουσιφεράσης ήταν σημαντικά μειωμένη (Σχήμα 2Β-C), το οποίο επιβεβαιώνει τη λειτουργική δυνατότητα της αλληλεπίδρασης miRNA-mRNA. Σε αντίθεση, οι αρνητικές miRNA μάρτυρα χωρίς πρόβλεψη θέση πρόσδεσης στο

IL-16

3′-UTR έχει καμία επίδραση στην έκφραση λουσιφεράσης (Σχήμα 2Β-C). Επιπλέον, βρήκαμε ότι το αλληλόμορφο C οδήγησε σε μικρή αλλά στατιστικά σημαντική αύξηση της έκφρασης λουσιφεράσης σε σύγκριση με εκείνη του Τ αλληλίου (Σχήμα 2Β-C).

A. Schema του

IL-16

3′-UTR φιλοξενούν ένα υποθετική θέση miR-135b δέσμευσης, τη θέση του rs1131445, και το κατασκεύασμα του pGL3-IL-16-3′-UTR-T /C. Β και δραστικότητα λουσιφεράσης Σχετική C. παρουσία miR-135b ή τον αρνητικό έλεγχο miRNA δείχνεται για το

IL-16

3′-UTR με το αλληλόμορφο Τ και C αλληλόμορφο στο HeLa (Β) και SiHa (C) καρκινικά κύτταρα? Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως το ποσοστό σε σχέση με τη δραστικότητα λουσιφεράσης των κυττάρων που επιμολύνθηκαν με το NC και Τ αλληλίου? η γραμμή σφάλματος αντιπροσωπεύει s.e. από τρία ανεξάρτητα πειράματα? *

P

& lt? 0,05, **

P

& lt? 0,05, ***

P

& lt? 0,01. NC αντιπροσωπεύει τον αρνητικό μάρτυρα.

Η

Συζήτηση

Στην παρούσα μελέτη, εξετάσαμε μια τραχήλου της μήτρας παραλλαγή ευαισθησίας στον καρκίνο από την ιστοσελίδα miRNA-δέσμευσης SNPs εντός 37 γονίδια που σχετίζονται με τον καρκίνο από μια μελέτη σε δύο στάδια. Βρήκαμε ότι το αλληλόμορφο SNP rs1131445 C στο 3′-UTR του

IL-16

συσχετίστηκε με αυξημένο κίνδυνο καρκίνου του τραχήλου της μήτρας. Χρησιμοποιώντας μια δοκιμασία λουσιφεράσης, βρήκαμε ότι miRNA-135b μειώθηκε αισθητά τη λουσιφεράση έκφραση του pGL3-IL-16-3′-UTR κατασκευάσματα στις κυτταρικές σειρές καρκίνου του τραχήλου της μήτρας Hela και SiHa. Το πιο σημαντικό, αυτά τα ανασταλτικά αποτελέσματα των miRNA-135b έχουν αποδυναμωθεί από την υποκατάσταση από την T με το αλληλόμορφο C σε rs1131445. Αυτά τα αποτελέσματα υποστηρίζουν την υπόθεση ότι οι διακυμάνσεις των υποθετικές θέσεις-στόχους miRNA θα μπορούσε να αποτελέσει παράγοντα επιδεκτικότητας για καρκίνους του τραχήλου.

IL-16 συντίθεται από διάφορες άνοσο και παρεγχυματικά κύτταρα, συμπεριλαμβανομένων των CD4 και CD8 Τ κύτταρα, ηωσινόφιλα, μακροφάγα /δενδριτικά κύτταρα, σιτευτικά κύτταρα, βρογχικό επιθήλιο και ινοβλάστες [27]. Η πρωτεΐνη που μεταφράζεται απευθείας από

IL-16 mRNA

είναι ένα πρόδρομο μόριο και πρέπει να διασπώνται σε δύο θραύσματα από κασπάση-3. Το διασπασμένο βιοδραστικών IL-16 απελευθερώνεται μετά από διέγερση με ισταμίνη ή σεροτονίνη και δρα ως παράγοντας χημειοελκτικό για τη ρύθμιση της φλεγμονώδους απόκρισης [27]. Πρόσφατα, η IL-16 έχει αναγνωριστεί ως σημαντικό παράγοντα προώθησης για όγκους [28], [29], [30], [31]. Η παραγωγή της IL-16 συσχετίζεται με την εμφάνιση και την εξέλιξη των διαφόρων αιματοποιητικών καρκίνων και συμπαγείς καρκίνους [28]. Η συστατική IL-16 έκφραση έχει επίσης βρεθεί να ρυθμίζει αυξητικά στα γλοιώματα [29] και του καρκίνου του προστάτη [31]. Επιπλέον, η έκφραση του σε ιστό καρκίνου του προστάτη συσχετίστηκε με την επιθετικότητα του όγκου και βιοχημικών υποτροπή της νόσου [31]. Ορός IL-16 επίπεδο ανύψωση έχει παρατηρηθεί σε πολλές καρκίνους [32], [33]. Ορός IL-16 είναι ένα προγνωστικό για την ανάπτυξη των απομακρυσμένων μεταστάσεων του καρκίνου του μαστού [32]. Επιπλέον, στον καρκίνο του μαστού, η προς τα πάνω ρύθμιση της εκκρινόμενης IL-16 ενισχύει την διείσδυση μονοκυττάρων μέσα στον ιστό του όγκου [30].

Οι ρόλοι της IL-16 σε τραχήλου παθοφυσιολογία του καρκίνου παραμένουν σε μεγάλο βαθμό ασαφής. Τα ευρήματά μας της IL-16 ανύψωση του ορού μετά από τραχήλου της μήτρας καρκινογένεση και την αξιοσημείωτη συσχέτιση των

IL-16

με τον κίνδυνο εμφάνισης καρκίνου του τραχήλου της μήτρας δείχνουν ότι η IL-16 θα μπορούσε να ρυθμίσει τραχήλου της μήτρας καρκινογένεση. Αυτή η υπόθεση υποστηρίζεται από τις καρκινογόνες επιπτώσεις της επίμονης φλεγμονής σε τραχήλου της μήτρας. Διείσδυση ανοσοκυττάρων σε όγκους είναι ένας κρίσιμος προσδιοριστής για την αυχενική καρκινογένεση [30], [34]. Η μακροφάγων που διεισδύουν σε τραχήλου της μήτρας αυξάνεται γραμμικά με την εξέλιξη της νόσου του τραχήλου της μήτρας, από την κανονική τράχηλο, χαμηλής ποιότητας για υψηλού βαθμού πλακώδους ενδοεπιθηλιακής βλάβες, σε διηθητικό καρκίνο [35]. Tumor-σχετίζεται μακροφάγα συμβάλλουν στην εξέλιξη του όγκου εξασκώντας πολλαπλές λειτουργίες τους στον πολλαπλασιασμό κυττάρου όγκου, κυττάρου όγκου εισβολή, και αγγειογένεση όγκου [36]. Εκτός μακροφάγα, CD4

+ ρυθμιστικά Τ κύτταρα μπορούν να συμβάλουν στην καρκινογένεση περιορίζοντας την αποτελεσματικότητα των ανοσολογικών αποκρίσεων Τ κυττάρου έναντι καρκίνων [37]. Στον καρκίνο του τραχήλου της μήτρας, τον HPV-ειδικά CD4

+ Τ κύτταρα καταστέλλουν την κυτοκίνη (IFN-γ, IL-2) παραγωγή να παρεμβαίνει στην αντινεοπλασματική ανοσοαπόκριση [38]. IL-16 μπορεί να εκφράζεται από επιθηλιακά κύτταρα υπό φλεγμονώδεις καταστάσεις [39] και χρησιμεύει για να χημειοέλκουν monocyptes /μακροφάγα και CD4

+ Τ κύτταρα στην τοποθεσία μόλυνσης [40]. Επιπλέον, εκκρίνεται η IL-16 διεγείρει monocyptes /μακροφάγα για την παραγωγή διαφόρων προφλεγμονωδών κυτοκινών [41]. Ως εκ τούτου, είναι πιθανό ότι η προς τα πάνω ρύθμιση της IL-16 σε HPV-επαγόμενη φλεγμονή θα μπορούσε να προωθήσει την καρκινογένεση από την υπερλειτουργία των μακροφάγων, HPV-ειδικά CD4

+ Τ κύτταρα, ή άλλα φλεγμονώδη κύτταρα.

Εδώ, παρέχουμε τα πρώτα στοιχεία που rs1131445 στην θέση πρόσδεσης miR-135b του

IL-16

3′-UTR, η οποία μπορεί να επηρεάσει την IL-16, η έκφραση της πρωτεΐνης παρεμβαίνοντας με τη λειτουργία κατασταλτική miR135b, συσχετίστηκε σημαντικά με τον κίνδυνο του καρκίνου του τραχήλου. Μια λειτουργική δοκιμασία in vitro έδειξαν ότι η επιμόλυνση των κυττάρων HeLa και SiHa φέρει το

IL-16

3′-UTR με miR-135b μιμούνται μειώνει σημαντικά την έκφραση της λουσιφεράσης, γεγονός που υποδηλώνει ότι η IL-16 μπορούν να αποτελέσουν στόχο από miR-135b. Η rs1131445 Τ σε C αλλαγή αναστέλλει την αλληλεπίδραση του miR-135b με

IL-16

3′-UTR και ρυθμίζει προς τα πάνω την έκφραση του. Σύμφωνα με αυτή την κερδοσκοπία, in vivo ανάλυση αποκάλυψε ότι οι ασθενείς που φέρουν το αλληλόμορφο rs1131445 C είχαν υψηλότερο ορό IL-16 από τους μη-φορείς, η οποία οδήγησε σε αυξημένη IL-16 των ασθενών σε σύγκριση με υγιείς μάρτυρες ορού. Η αυξητική ρύθμιση του miR-135b έχει βρεθεί σε καρκίνο του τραχήλου [42], η οποία θα μπορούσε να αναστείλει την έκφραση του

IL-16 από

στόχευση 3′-UTR της. Το αλληλόμορφο rs1131445 C μειώνει την πρόσδεση του miR-135b με τον στόχο και οδηγεί σε υψηλότερη συστατική έκφραση του

IL-16

και την επακόλουθη απελευθέρωση σε ορό. Δεδομένων των σημαντικών ρυθμιστικούς ρόλους απελευθέρωσης IL-16 στην ανοσοαπόκριση και την επακόλουθη επίπεδο της τοπικής φλεγμονώδους μικροπεριβάλλον, τα άτομα που φέρουν το αλληλόμορφο rs3134615 C θα αναμένεται να έχουν αυξημένο κίνδυνο για καρκίνο του τραχήλου της μήτρας. Συμπερασματικά, τα δεδομένα μας πρότεινε ότι rs1131445, ως λειτουργική παραλλαγή, θα μπορούσε να διαμορφώσει το ατομικό κίνδυνο του καρκίνου του τραχήλου της μήτρας πιθανόν από την απορύθμιση της μετα-μεταγραφική ρύθμιση των miRNA-135b στο

IL-16

έκφρασης. Αν και η μελέτη μας χρησιμοποιήθηκαν εύλογο αριθμό των ασθενών και των ελέγχων και αυστηρό στατιστικές μεθόδους, δεν θα μπορούσε να αποκλείσει εντελώς το ενδεχόμενο πλαστά αποτελέσματα προέκυψαν από τη νομολογία του ελέγχου του σχεδιασμού της μελέτης συλλόγου μας οφείλεται στην τύχη ή διαστρωμάτωση του πληθυσμού. Ως εκ τούτου, η περαιτέρω μελέτη αναπαραγωγή μεγάλης κλίμακας με τη χρήση διαφόρων εθνοτικών πληθυσμών, ή ανάλυση που βασίζεται στην οικογένεια, ή μελλοντικός σχεδιασμός ομάδα είναι υποχρεωμένη να παράγουν πολύ πειστικά αποτελέσματα. Πρόσθετες λειτουργικές αναλύσεις υποχρεούνται επίσης να διευκρινιστούν οι ακριβείς ρόλους των IL-16 στην αυχενική γένεση και εξέλιξη του καρκίνου στο μέλλον.

Ευχαριστίες

Εκτιμούμε βαθύτατα όλους τους ασθενείς και εθελοντές για τη συμμετοχή τους σε αυτή η μελέτη.