Abstract

Ανώμαλη ενεργοποίηση του Ηχητικού ακανθόχοιρου (SHH) μονοπάτι έχει περιγραφεί σε μία ευρεία ποικιλία ανθρώπινων καρκίνων και σε καρκινικά βλαστοκύτταρα (ΚΕΠ), ωστόσο, ο ρόλος των SHH πορείας στα γαστρικά ΚΕΠ έχει δεν έχουν αναφερθεί. Σε αυτή τη μελέτη, διερευνήσαμε την πιθανότητα ότι η ανώμαλη ενεργοποίηση του μονοπατιού SHH διατήρησε τα χαρακτηριστικά του γαστρικού ΚΕΠ. Πρώτον, προσδιορίζονται καρκινικά βλαστικά κύτταρα που μοιάζουν με (CSLCs) από ανθρώπινο γαστρικό καρκίνο κυτταρικές γραμμές (HGC-27, MGC-803 και ΜΚΝ-45) με τη χρήση tumorsphere καλλιέργεια. Σε σύγκριση με τα προσκολλημένα κύτταρα, τα επιπλέοντα κύτταρα tumorsphere είχε περισσότερο αυτο-ανανέωση ικανότητας και χημειοαντίσταση. Τα κύτταρα που εκφράζουν δείκτες ΚΕΠ (CD44, CD24 και CD133) ήταν επίσης σημαντικά περισσότερο σε tumorsphere κύτταρα από ό, τι σε προσκολλημένα κύτταρα. Το πιο σημαντικό, in vivo μελέτες ξενομοσχεύματος έδειξαν ότι οι όγκοι θα μπορούσαν να παραχθούν με 2 × 10

4 tumorsphere κύτταρα, τα οποία ήταν 100 φορές μικρότερες από εκείνες που απαιτούνται για όγκους σπορά από προσκολλημένα κύτταρα. Στη συνέχεια, RT-PCR και κηλίδας Western έδειξε ότι τα επίπεδα έκφρασης του Ptch και Gli1 (γονίδια SHH στόχος οδού) ήταν σημαντικά υψηλότερα στην tumorsphere κύτταρα από ό, τι σε προσκολλημένα κύτταρα. Τα αποτελέσματα της ποσοτικής PCR πραγματικού χρόνου ήταν παρόμοια με εκείνα του RT-PCR και στυπώματος Western. Περαιτέρω ανάλυση αποκάλυψε ότι η Shh οδός αποκλειστεί από κυκλοπαμίνη ή 5Ε1 προκάλεσε μεγαλύτερη μείωση στην αυτο-ανανέωση ικανότητας των HGC-27 tumorsphere κύτταρα από εκείνη των προσκολλημένων κυττάρων. Βρήκαμε επίσης ότι η Shh αποκλεισμού έντονα οδού ενίσχυσε την αποτελεσματικότητα των χημειοθεραπευτικών φαρμάκων σε HGC-27 tumorsphere κυττάρων in vitro και in vivo, αλλά δεν είχε καμία σημαντική επίδραση σε προσκολλημένα κύτταρα. Τέλος, απομονώσαμε τα tumorspheres από γαστρικό δείγμα καρκίνου, τα κύτταρα αυτά είχαν επίσης χημειοαντίσταση και ογκογόνο ικανότητα, και ΕΛΕΡΠΕ οδός διατήρησε τα γαστρικά CSLCs χαρακτηριστικά tumorsphere κυττάρων από δείγματα πρωτογενούς όγκου. Συμπερασματικά, τα δεδομένα μας πρότεινε ότι ΕΛΕΡΠΕ οδού ήταν απαραίτητη για τη διατήρηση της CSLCs σε ανθρώπινο γαστρικό καρκίνο

Παράθεση:. Τραγούδι Ζ, Yue W, Wei Β, Wang Ν, Li Τ, Guan L, et al. (2011) Sonic Hedgehog δρόμος είναι απαραίτητη για τη διατήρηση της καρκινικά βλαστικά κύτταρα που μοιάζουν με τα ανθρώπινα γαστρικού καρκίνου. PLoS ONE 6 (3): e17687. doi: 10.1371 /journal.pone.0017687

Επιμέλεια: Μιχαήλ Blagosklonny, Roswell Park Cancer Institute, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 27 Νοεμβρίου του 2010? Αποδεκτές: 10η Φεβρουαρίου, 2011? Δημοσιεύθηκε: 4 Μαρ 2011

Copyright: © 2011 Song et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από το Εθνικό υψηλής Τεχνολογίας Έρευνας και Ανάπτυξης του Προγράμματος της Κίνας (# 2006AA402A04, # 2006AA02A107), το Major μέλος πρόγραμμα βασικής έρευνας της Κίνας (# 2009CB521704), και το Εθνικό Ίδρυμα Φύση Επιστημών της Κίνας (# 30872468, # 30873031). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

ΚΕΠ παίζουν ένα σημαντικό ρόλο στην ανάπτυξη του καρκίνου, αυτό υποπληθυσμό εντός του όγκου έχει τα χαρακτηριστικά της αυτο-ανανέωση ικανότητας, χημειοαντίσταση και ογκογόνο ικανότητα έτσι μπορεί να διαδραματίσει κρίσιμο ρόλο στην έναρξη, την εξέλιξη και την υποτροπή του καρκίνου. Εξετάζοντας και το χειρισμό των βιοχημικών οδών που εμπλέκονται στην εν λόγω χαρακτηριστικών είναι ένας από τους καλύτερους τρόπους που συμβάλλουν στην ΚΕΠ, που οδηγεί στην ανάπτυξη νέων φαρμάκων και διαδικασίες επεξεργασίας. μονοπάτι SHH διαδραματίζει έναν κρίσιμο ρόλο σε πολλές ΚΕΠ, όπως πολύμορφο βλαστοκύτταρα [1], [2], CD34 + λευχαιμικά κύτταρα [3], [4] και CSCs μαστού [5], επιπλέον, είναι ζωτικής σημασίας για την ανάπτυξη και ομοιόσταση του γαστρικού αδένα [6], ανώμαλη ενεργοποίηση της οδού SHH θα μπορούσε να οδηγήσει σε καρκίνο του στομάχου [7], [8], ωστόσο, ο ρόλος του SHH πορείας στα γαστρικά ΚΕΠ δεν είναι σαφής.

SHH μονοπάτι σε κύτταρα θηλαστικών μεσολαβείται από συνδετήρες Shh [9]. Εν απουσία Shh, ο υποδοχέας διαμεμβράνης patched (Ptch) αναστέλλει τη δράση μιας άλλης διαμεμβρανικής πρωτεΐνης, smoothened (SMO), με αποτέλεσμα την απενεργοποίηση του SHH οδού [9], [10]. Η δέσμευση της Shh να Ptch καταργεί το ανασταλτικό αποτέλεσμα του Ptch και Smo αποκαταστέλλεται, ενεργοποιώντας έτσι παράγοντα μεταγραφής Gli (Gli1, Gli2 και Gli3) [9], [10]. Gli1 είναι μια ισχυρή θετική ενεργοποιητής της κατάντη γονιδίων στόχων και είναι η ίδια ένας μεταγραφικός στόχος του μονοπατιού SHH [11]. Ως εκ τούτου, Gli1 θεωρείται ένας δείκτης SHH οδού ανώμαλη ενεργοποίηση [10], [12]

Πρόσφατα, διάφοροι τύποι ΚΕΠ ή CSLCs έχουν ταυτοποιηθεί και απομονωθεί από κακοήθεις όγκους [13] – [25].. Σε καρκίνο του στομάχου, μεθοδολογικά, είναι δύσκολο να απομονωθεί και να ενισχυθεί ΚΕΠ από κυτταρικές γραμμές ή δείγματα ιστού του όγκου. Προς το παρόν, CD44 φαίνεται να είναι η πιο χρήσιμος δείκτης για τους υποψήφιους καθαρισμό του γαστρικού ΚΕΠ, ωστόσο, δεν είναι πολύ ειδική για το γαστρικό ΚΕΠ [26].

Σε αυτή τη μελέτη, απομονώσαμε CSLCs από ανθρώπινο γαστρικό καρκινικές κυτταρικές σειρές (HGC-27, MGC-803 και ΜΚΝ-45) με τη χρήση tumorsphere καλλιέργεια σε μέσο ελεύθερο ορού και προσδιόρισε την ικανότητα αυτο-ανανέωση, χημειοαντίσταση και ογκογόνο ικανότητα των κυττάρων tumorsphere? Στη συνέχεια, εξετάσαμε την έκφραση της ΕΛΕΡΠΕ μορίων μονοπάτι που σχετίζονται, συμπεριλαμβανομένων των Shh, Ptch, ΠΕΑ, Gli1 και Gli2 στην tumorsphere κύτταρα και προσκολλημένα κύτταρα, ειδικά η έκφραση του Ptch και Gli1.Then, έχουμε μπλοκάρει ΕΛΕΡΠΕ μονοπάτι από κυκλοπαμίνη ή tomatidine ελέγχου, 5Ε1 ή τον έλεγχο PBS για να διερευνήσει κατά πόσον τα χαρακτηριστικά των CSLCs σε tumorsphere κύτταρα διατηρούνται από ανώμαλη ενεργοποίηση του μονοπατιού ΕΛΕΡΠΕ. Τέλος, χρησιμοποιήσαμε πρωτογενείς γαστρικό καρκίνο δείγματα για την ανάλυση των λειτουργικές πτυχές του SHH πορείας στα γαστρικά CSLCs.

Η κυκλοπαμίνη είναι ένα κύτταρο-διαπερατό στεροειδές αλκαλοειδές. Είναι διαταράσσει χοληστερίνη βιο-συνθέσεως και ειδικώς ανταγωνίζεται SHH οδό σηματοδότησης μέσω της άμεσης αλληλεπίδρασης με Smo (smoothened), ένα μακρινό συγγενή του G-πρωτεΐνη-συζευγμένων υποδοχέων. Είναι ένα πολύτιμο εργαλείο για τη μελέτη της εμπλοκής της σηματοδότησης ΕΛΕΡΠΕ στην ανάπτυξη των διαφόρων όγκων. Tomatidine είναι ένα στεροειδές αλκαλοειδές που μοιάζει δομικά με κυκλοπαμίνη, αλλά δεν έχει την ικανότητα να αναστέλλει τη σηματοδότηση ΕΛΕΡΠΕ. Μπορεί να χρησιμοποιηθεί ως αρνητικός έλεγχος. 5Ε1 είναι ένα μονοκλωνικό αντίσωμα αντι-Hh, το οποίο εξουδετερώνει τη δράση ΕΛΕΡΠΕ και ΙΗΗ.

Αποτελέσματα

1. κύτταρα Tumorsphere διέθετε τα χαρακτηριστικά του CSLCs

αυξήθηκε HGC-27, MGC-803 και ΜΚΝ-45 προσκολλημένα κύτταρα σε μέσο χωρίς ορό περιγράφεται στην ενότητα μεθόδων. Μετά από 7 ημέρες, παρατηρήθηκαν tumorspheres αποτελείται από περίπου 50 έως 100 κύτταρα (Σχ. 1Α).

(Α) Tumorspheres σχηματίστηκε μετά από 14 ημέρες. (Β) Η ικανότητα σχηματισμού υπο-tumorspheres των tumorsphere κυττάρων (λευκές ράβδοι) και τα προσκολλημένα κύτταρα (μαύρες μπάρες). * = P & lt? 0,05. Μπαρ = 1000 μm. (Γ) Η ικανότητα σχηματισμού αποικιών των tumorsphere κυττάρων (λευκές ράβδοι) και τα προσκολλημένα κύτταρα (μαύρες ράβδοι) υπό ανεξάρτητη από προσκόλληση συνθήκες με μαλακό δοκιμασίες άγαρ. * = P & lt? 0,05. (D) Επίδραση των 48 ωρών την έκθεση της tumorsphere κυττάρων (λευκές ράβδοι) και τα προσκολλημένα κύτταρα (μαύρες μπάρες) έως 1000 μΜ χημειοθεραπευτικό φάρμακο. Ox = οξαλιπλατίνη, Mi = mitomysin. * = P & lt?. 0.05

Η

Η αυτο-ανανέωση ικανότητας αυτών των tumorspheres εκτιμήθηκε από διαχωρίζοντας τους σε ενιαίο κυττάρων και αυξάνεται σε κλωνική πυκνότητα 1.000 κύτταρα ανά χιλιοστόλιτρο. Μετά από 2 εβδομάδες, και μόνο κύτταρο που προέρχεται από HGC-27 tumorsphere κύτταρα που δημιουργούνται υπο-tumorspheres κατά 41,83% ± 3,13%, σε σύγκριση με 8,17% ± 2,40% των προσκολλημένων κυττάρων, εξάλλου, σε MGC-803 και ΜΚΝ-45, ο σχηματισμός υπο-tumorspheres ρυθμός tumorsphere κυττάρων ήταν επίσης υψηλότερη από εκείνη των προσκολλημένων κυττάρων. (Εικ. 1Β). Αυτά τα δεδομένα πρότειναν ότι η αυτο-ανανέωση χωρητικότητα tumorsphere κυττάρων ήταν σημαντικά υψηλότερη από εκείνη των προσκολλημένων κυττάρων. κύτταρα Tumorsphere έδειξε επίσης αυξημένη ικανότητα να σχηματίζουν αποικίες κάτω από αγκύρωση ανεξάρτητη προϋποθέσεις σε μια τυποποιημένη δοκιμασία σε μαλακό άγαρ μετά από 14 ημέρες σε HGC-27 και ΜΚΝ-45 (Εικ. 1Γ).

Πραγματοποιήσαμε επίσης μια περιοριστική αραίωση δοκιμασία για το σχηματισμό σφαιροειδών χρησιμοποιώντας HGC-27 κύτταρα tumorsphere και προσκολλημένα κύτταρα, αντίστοιχα. Όπως φαίνεται στον Πίνακα S1, περίπου 27-35% των κυττάρων tumorsphere θα μπορούσε να παράγει σφαιροειδή, ενώ λιγότερο από το 5% των προσκολλημένων κυττάρων θα μπορούσε να δημιουργήσει σφαιροειδή μετά από 3 εβδομάδες καλλιέργειας. Ως εκ τούτου, στα tumorsphere κύτταρα HGC-27, θα μπορούσαμε να εκτιμούν ότι τα σφαιροειδή που σχηματίζουν τα κύτταρα του πληθυσμού αποτελείται κατ ‘ανώτατο όριο του 35%.

χημειοαντίσταση είναι ένα άλλο χαρακτηριστικό των ΚΕΠ, έτσι ώστε να διερευνηθεί αν η διαφορετική χημειοαντίσταση υπήρχε μεταξύ tumorsphere κύτταρα και προσκολλημένα κύτταρα. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι, μετά από 48 ώρες, τα κύτταρα tumorsphere έδειξαν σημαντικά μεγαλύτερη αντίσταση σε φάρμακα, σε σύγκριση με προσκολλημένα κύτταρα κάτω από τις ίδιες συνθήκες (Σχ. 1D). Εκτιμήσαμε επίσης χημειοαντίσταση του tumorsphere κυττάρων HGC-27 και προσκολλημένα κύτταρα σε διαφορετικές συγκεντρώσεις των φαρμάκων, ωστόσο, και οι δύο tumorsphere κύτταρα και προσκολλημένα κύτταρα δεν έδειξε σημαντικά χημειοαντίσταση σε φάρμακα με έναν δοσο-εξαρτώμενο τρόπο (εικ. S1).

στη συνέχεια, εξετάσαμε την έκφραση του CD44 σε διαχωρισμένα κύτταρα tumorsphere και προσκολλημένα κύτταρα χρησιμοποιώντας ανίχνευση ανοσοφθορισμού και στύπωμα western. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι τα κύτταρα που εκφράζουν CD44 ήταν σημαντικά περισσότερο σε tumorsphere κύτταρα από ό, τι σε προσκολλημένα κύτταρα (Εικ. 2Α). Επιπλέον, η έκφραση άλλων ΚΕΠ δεικτών (CD24 και CD133) σε tumorsphere κύτταρα και προσκολλημένα κύτταρα εξετάστηκε με κηλίδα western, σε σύγκριση με tumorsphere κύτταρα, η έκφραση του CD24 ήταν σημαντικά χαμηλότερη σε προσκολλημένα κύτταρα, ενώ η έκφραση του CD133 ήταν παρόμοια (Σχ . 2Β). Περαιτέρω, έχουμε κλασματοποιήθηκαν HGC-27 κυττάρων με FACS διαλογή για CD44, βρήκαμε ότι CD44 (+) κλάσμα των κυττάρων θα μπορούσε να δημιουργήσει περισσότερες αποικίες σφαιροειδές σύγκριση με CD44 (-) κλάσμα των κυττάρων, επιπλέον, τα κύτταρα το μέγεθος του σφαιροειδούς αποικιών από CD44 (+) ήταν μεγαλύτερες από εκείνες από CD44 (-). κύτταρα (Εικ. 2C)

(Α) ανοσοφθορισμού (αριστερό πάνελ) και κηλίδωση Western (δεξιά πάνελ) ανάλυση του CD44 (πράσινο χρώμα) επί μηχανικά διαχωρισμένα κύτταρα tumorsphere και προσκολλημένα κύτταρα. Πυρήνες αντιχρωματίζεται με DAPI (μπλε χρώμα). TCs κύτταρα = tumorsphere, ACS = προσκολλημένα κύτταρα. Μπαρ = 100 μm. (Β) Η έκφραση των CD24 και CD133 σε tumorsphere κύτταρα και προσκολλημένα κύτταρα με κηλίδωση Western, β-ακτίνη παρεσχέθη ως έλεγχος. (Γ) Η ικανότητα σχηματισμού tumorspheres της HGC-27 CD44 (+) κύτταρα και CD44 – κύτταρα (). * = P & lt? 0,05. Μπαρ = 1000 μm.

Η

2. κύτταρα Tumorsphere θα μπορούσε να δημιουργήσει όγκους κατά την ξενομεταμόσχευσης

Για τις μελέτες ξενομοσχεύματος, ίσο αριθμό (2 × 10

4, 2 × 10

5, 2 × 10

6, 2 × 10

7) προσφάτως διαχωριστεί tumorsphere κύτταρα ή προσκολλημένα κύτταρα ελέγχου εγχύθηκε sc σε κάθε ποντικό (6 ποντικοί ανά ομάδα). Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι οι όγκοι δημιουργήθηκαν με 2 × 10

4 tumorsphere κύτταρα, τα οποία ήταν 100 φορές μικρότερες από εκείνες που απαιτούνται για σπορά όγκου από προσκολλημένα κύτταρα (Πίνακας 1). Επιπλέον, tumorsphere κύτταρα που παράγονται υποδόριων όγκων με μεγαλύτερο όγκο και μικρότερο χρόνο σε σύγκριση με εκείνα που παράγονται από προσκολλημένα κύτταρα (Σχ. 3Α, Β). Έτσι, η υποδόρια ένεση της χαμηλού αριθμού tumorsphere κυττάρων επιβεβαίωσε ότι τα κύτταρα που διατηρούνται σφαιροειδές ισχυρότερη ογκογόνα ικανότητα σε γυμνούς ποντικούς από προσκολλημένα κύτταρα.

(Α) υποδόρια ανάπτυξη όγκου σε γυμνά ποντίκια μετά από ένεση του HGC 27-tumorsphere κύτταρα ( 2 × 10

5) στο αριστερό οπίσθιο πλευρό κάθε ποντικού και ίσο αριθμό προσκολλημένων κυττάρων στο δεξί οπίσθιο πλευρό του κάθε ποντικού. (Β) Μέγεθος του υποδόριου όγκου μετά την ένεση των 2 × 10

5 HGC-27 tumorsphere κύτταρα, 2 × 10

5 HGC-27 προσκολλημένα κύτταρα και 2 × 10

6 HGC-27 προσκολλημένα κύτταρα. (Γ) Η &? Ε ανάλυση χρώση των ξενομοσχευμάτων που προέρχονται από HGC-27 tumorsphere κύτταρα. Bar = 100 μm. (D) Tumorspheres προέρχονται από ξενομοσχεύματα. Bar = 1000 μm. (Ε) Η υποδόρια ανάπτυξη όγκου σε γυμνά ποντίκια μετά από ένεση του tumorsphere κυττάρων (2 χ 10

5) που προέρχεται από ξενομοσχεύματα

Η

Η &?. Ε εξέταση των ξενομοσχευμάτων που προέρχονται από HGC-27 κύτταρα tumorsphere έδειξαν ότι αυτοί οι όγκοι ομοίαζε πολύ με το αρχικό ανθρώπινου όγκου, που περιέχει κυρίως διαφοροποιημένα κύτταρα (Σχ. 3C). Σημαντικά, tumorspheres μπορούσαν να επαναχρησιμοποιηθούν προέρχονται από τα ξένο μόσχευμα όγκους (Σχ. 3D), και θα μπορούσαν να σχηματίζουν όγκους και πάλι (εικ. 3Ε). Ως εκ τούτου, τα δεδομένα αυτά έδειξαν ότι τα κύτταρα tumorsphere εκπροσωπούνται CSLCs που είχε ογκογόνο ικανότητα.

3. μονοπάτι ΕΛΕΡΠΕ ήταν υψηλότερη εκφράζεται σε tumorsphere κύτταρα σε σχέση με τα προσκολλημένα κύτταρα

Για να διερευνήσουν τη σχέση μεταξύ ΕΛΕΡΠΕ μονοπάτι και CSLCs χαρακτηριστικά tumorsphere κύτταρα, εξετάσαμε για πρώτη φορά την έκφραση mRNA που της ΕΛΕΡΠΕ μορίων μονοπατιού που σχετίζονται, συμπεριλαμβανομένων των Shh, Ptch, ΠΕΑ, Gli1 και Gli2 με RT-PCR. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι όλα τα mRNAs ήταν υψηλά εκφρασμένα σε HGC-27 tumorsphere κύτταρα. Σε σύγκριση με tumorsphere κύτταρα, τα επίπεδα έκφρασης της Shh, Ptch, Smo και Gli1 ήταν σημαντικά χαμηλότερα σε προσκολλημένα κύτταρα, ενώ τα επίπεδα έκφρασης του Gli2 ήταν παρόμοια με tumorsphere κύτταρα. Σε MGC-803 και ΜΚΝ-45, τα επίπεδα έκφρασης της Shh, Ptch και Gli1 ήταν επίσης σημαντικά χαμηλότερη σε προσκολλημένα κύτταρα από ό, τι tumorsphere κύτταρα, ενώ τα επίπεδα έκφρασης του ΠΕΑ και Gli2 δεν είχαν σημαντική διαφορά μεταξύ προσκολλημένα κύτταρα και tumorsphere κύτταρα (Σχ . 4Α).

(Α) Η έκφραση του mRNA της Shh, Ptch, ΠΕΑ, Gli1 και Gli2 στην tumorsphere κύτταρα και προσκολλημένα κύτταρα αναλύθηκε με RT-PCR. Η έκφραση του GAPDH χρησιμοποιήθηκε σαν ένας έλεγχος. (Β) Η πρωτεΐνη έκφραση των γονιδίων στόχων SHH οδού (Ptch και Gli1) αναλύθηκε με κηλίδωση Western, β-ακτίνη παρεσχέθη ως έλεγχος. TCs κύτταρα = tumorsphere, ACS = προσκολλημένα κύτταρα. (Γ) ποσοτική πραγματικού χρόνου RT-PCR αναλύσεις SHH γονιδίων στόχων οδού (Ptch και Gli1) έδειξαν τα ίδια αποτελέσματα της ημι-ποσοτικής RT-PCR. Τα αποτελέσματα υπολογίστηκαν ως σήμαινε + Τ.Α. τιμές από μετρήσεις εις τριπλούν από τρία ξεχωριστά πειράματα. κύτταρα TCs = Tumorsphere, ACS = προσκολλημένα κύτταρα.

Η

Σε ΕΛΕΡΠΕ μονοπάτι, το Ptch και Gli1 είναι γονίδια στόχους, που θεωρούνται σημαντικά τους δείκτες της ΕΛΕΡΠΕ οδού ανώμαλη ενεργοποίηση. Έτσι, εξετάσαμε περαιτέρω τα επίπεδα έκφρασης του Ptch και Gli1 με κηλίδα Western και ποσοτική PCR πραγματικού χρόνου.

Όταν χρησιμοποιείτε Western blot, βρήκαμε ότι τα επίπεδα έκφρασης του Ptch και Gli1 ήταν επίσης υψηλότερη σε tumorsphere κύτταρα από σε προσκολλημένα κύτταρα (Σχ. 4Β). Είμαστε δίπλα αξιολόγησε τα επίπεδα έκφρασης των Ptch και Gli1 σε ξενομοσχεύματα από HGC-27 από ποσοτική PCR πραγματικού χρόνου. Ποσοτική PCR πραγματικού χρόνου αναλύσεις των γονιδίων στόχων ΕΛΕΡΠΕ (PTCH και GLI1) έδειξαν τα ίδια αποτελέσματα των ανωτέρω ημι-ποσοτική RT-PCR (Σχ. 4C).

4. μπλοκάρισμα ΕΛΕΡΠΕ οδός μείωσε την ικανότητα αυτο-ανανέωσης και χημειοαντίσταση της HGC-27 tumorsphere κύτταρα

Για να ελέγξετε για ένα πιθανό ρόλο της ΕΛΕΡΠΕ οδού στην αυτο-ανανέωση ικανότητας των tumorsphere κυττάρων, χρησιμοποιήσαμε κυκλοπαμίνης ή τον έλεγχο tomatidine, 5Ε1 ή ελέγχου PBS για να μπλοκάρουν την οδό.

Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι η θεραπεία με κυκλοπαμίνη οδήγησε σε σημαντικά μείωση της ικανότητας για το σχηματισμό του υπο-tumorspheres σε 27 HGC-tumorsphere κύτταρα σε ένα δοσο-εξαρτώμενο τρόπο, αλλά καμία τέτοια επίδραση παρατηρήθηκε σε προσκολλημένα κύτταρα (Εικ. 5Α). Έχουμε αξιολογηθεί περαιτέρω εάν η θεραπεία με κυκλοπαμίνη θα μπορούσε να επηρεάσει την ικανότητα σχηματισμού αποικιών των HGC-27 κύτταρα tumorsphere από το αγκυροβόλιο δοκιμασία ανεξάρτητη από την ανάπτυξη. Ομοίως, η ικανότητα να σχηματίσουν αποικίες μειώθηκε περισσότερο στα κύτταρα tumorsphere σε ένα δοσοεξαρτώμενο τρόπο σε σχέση με τα προσκολλημένα κύτταρα (Σχ. 5Β).

(Α) Η ικανότητα σχηματισμού υπο-tumorspheres του HGC-27 κύτταρα tumorsphere και προσκολλημένα κύτταρα επεξεργασμένα με διαφορετικές συγκεντρώσεις κυκλοπαμίνης ή ελέγχου tomatidine (ανοικτός κύκλος = κυκλοπαμίνη? κλειστός κύκλος = tomatidine ελέγχου). Μαύρες γραμμές είναι tumorsphere κύτταρα, το κόκκινο είναι προσκολλημένα κύτταρα. * = P & lt? 0,05. κύτταρα TCs = tumorsphere. Μπαρ = 1000 μm. (Β) Ο σχηματισμός αποικιών HGC-27 tumorsphere κύτταρα και προσκολλημένα κύτταρα επεξεργασμένα με διαφορετικές συγκεντρώσεις κυκλοπαμίνης ή ελέγχου tomatidine υπό ανεξάρτητη από προσκόλληση συνθήκες (ανοικτός κύκλος = κυκλοπαμίνη? Κλειστός κύκλος = tomatidine ελέγχου). Μαύρες γραμμές είναι tumorsphere κύτταρα, το κόκκινο είναι προσκολλημένα κύτταρα. * = P & lt? 0,05. κύτταρα TCs = tumorsphere. (C) Ποσοστό της βιωσιμότητας των κυττάρων αναλύθηκε σε HGC-27 tumorsphere κύτταρα και τα προσκολλημένα κύτταρα (D) μετά την έκθεση σε διαφορετικές συγκεντρώσεις κυκλοπαμίνης ή 5 υΜ κυκλοπαμίνη με διαφορετικά φάρμακα για 48 ώρες. ομάδα ελέγχου είναι tomatidine. Cyc = κυκλοπαμίνη, Ox = οξαλιπλατίνη, Mi = mitomysin. * = P & lt?. 0.05

Η

Στη συνέχεια, μελετήθηκε η επίδραση της ΕΛΕΡΠΕ μονοπάτι για χημειοαντίσταση της HGC 27-tumorsphere κύτταρα, που αντιμετωπίζονται τα διαχωριζόμενα κύτταρα με κυκλοπαμίνη ή tomatidine ελέγχου για 48 ώρες, και στη συνέχεια τα ναρκωτικά αντίσταση του tumorsphere κυττάρων αξιολογήθηκε. Όταν κυκλοπαμίνη ακολουθήθηκε από φάρμακα, η αγωγή είχε ως αποτέλεσμα μια σημαντικά ενισχυμένη συνολικό ποσοστό κυτταρικού θανάτου. Τα καλύτερα αποτελέσματα ελήφθησαν όταν η κυκλοπαμίνη συνδυάστηκε με οξαλιπλατίνη συν Μιτομυκίνη (Εικ. 5C). Καμία τέτοια συνεργική επίδραση παρατηρήθηκε σε προσκολλημένα κύτταρα μετά από έκθεση σε φάρμακα με κυκλοπαμίνη για 48 ώρες (Σχ. 5D).

δοκιμάστηκαν επίσης την επίδραση διαφόρων συγκεντρώσεων της κυκλοπαμίνης (2,5 υΜ, 5 υΜ, 10 υΜ) επί του κυτταρικού θανάτου. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι η κυκλοπαμίνη και μόνο για να tumorsphere κύτταρα θα μπορούσε να κάνει μια μικρή αλλά σταθερή μείωση στον αριθμό βιώσιμων κυττάρων. Σε σύγκριση με HGC 27-tumorsphere κύτταρα, η επίδραση της κυκλοπαμίνης επί του κυτταρικού θανάτου σε προσκολλημένα κύτταρα ήταν πιο σημασία (Σχ. 5C, D).

Όταν SHH οδού εμποδίστηκε από 5Ε1 ή μάρτυρα PBS, τα αποτελέσματα της αυτο -ανανεωτική ικανότητα και χημειοαντίσταση του tumorsphere κυττάρων και προσκολλημένα κύτταρα ήταν παρόμοια με εκείνα μπλοκαριστεί από κυκλοπαμίνη ή tomatidine ελέγχου (Εικ. S2).

5. ΕΛΕΡΠΕ κλείδωμα αυξημένη ανταπόκριση του όγκου των ναρκωτικών στην οδό vivo

Για να ελεγχθεί αυτή η υπόθεση in vivo, αναλύσαμε το αν ΕΛΕΡΠΕ κλείδωμα ενισχυμένη αποτελεσματικότητα της χημειοθεραπείας, κυκλοπαμίνης ή τον έλεγχο tomatidine μονοπάτι χρησιμοποιήθηκε για να αναστείλει τις απαντήσεις οδό ΕΛΕΡΠΕ. HGC-27 tumorsphere κύτταρα αφέθηκαν να αναπτυχθούν σε δύο πίσω πλευρά γυμνών ποντικών έως ότου η μεγαλύτερη διάμετρος του όγκου έφθασε περίπου 2 mm. Οι ποντικοί στη συνέχεια κατεργάζεται δύο φορές την εβδομάδα για 3 εβδομάδες με κυκλοπαμίνη ή τον έλεγχο tomatidine 24 ώρες πριν από την παράδοση οξαλιπλατίνη. Σε όλα τα ποντίκια έλαβαν, οι όγκοι που έλαβαν θεραπεία με οξαλιπλατίνη ήταν σημαντικά μικρότερα από εκείνα δεν έλαβαν θεραπεία με οξαλιπλατίνη. Επιπλέον, οι όγκοι έδειξαν σημαντικά μεγαλύτερη αναστολή ανάπτυξης όγκου, όταν υποβλήθηκαν σε θεραπεία με οξαλιπλατίνη σε συνδυασμό με κυκλοπαμίνη, η απόκριση όγκου σε χημειοθεραπευτικό φάρμακο ενισχύθηκε με κυκλοπαμίνη (6Α Σχ., Β). Ερευνήσαμε επίσης αν μονοπάτι SHH μπλοκαριστεί από 5Ε1 ή μάρτυρα PBS ενισχυμένη αποτελεσματικότητα χημειοθεραπείας σε βιολογικό περιβάλλον, τα αποτελέσματα έδειξαν ότι 10 μg θεραπεία /ml 5Ε1 οδήγησε σε σημαντικά μεγαλύτερη αναστολή της ανάπτυξης του όγκου από εκείνους μόνο που έλαβαν θεραπεία με οξαλιπλατίνη (Σχ. 6Α, Β).

(Α) υποδόρια όγκους που προέρχονται από 2 × 10

5 HGC 27-tumorsphere κύτταρα αναπτύσσονται σε γυμνά ποντίκια 4 εβδομάδες μετά την ip αγωγή με PBS ή οξαλιπλατίνη σε συνδυασμό με 10 μΜ tomatidine ελέγχου στο αριστερό οπίσθιο πλευρό γύρω από τον όγκο, ή οξαλιπλατίνη σε συνδυασμό με 10 μΜ κυκλοπαμίνη στο πίσω δεξιό πλευρό γύρω από τον όγκο, ή οξαλιπλατίνη σε συνδυασμό με 10 μg /ml 5Ε1 στη σωστή πίσω πλευρά. Tom = tomatidine, Cyc = κυκλοπαμίνη, Ox = οξαλιπλατίνη. κύτταρα TCs = tumorsphere. μεγέθους (Β) όγκος που προέρχεται όπως στο (Α) μετά από 20 ημέρες. Tom = tomatidine, Cyc = κυκλοπαμίνη, Οξ = οξαλιπλατίνη.

Η

Αυτά τα δεδομένα πρότειναν ότι παρόλο πρότυπο χημειοθεραπευτικά φάρμακα καθυστερημένη έκφυση του όγκου κατά τη διάρκεια της θεραπείας, όταν συνδυάστηκαν με κυκλοπαμίνη ή 5Ε1, η αποτελεσματικότητα της χημειοθεραπείας ήταν σημαντικά ενισχυμένη αλλά και πιο παρατεταμένη μετά τη διακοπή της θεραπείας.

στη συνέχεια, να ερευνήσει εάν το κλείδωμα της οδού ΕΛΕΡΠΕ in vivo είχε μια συγκεκριμένη επίδραση στην HGC-27 tumorsphere κύτταρα. Τα ποντίκια υποβλήθηκαν σε αγωγή μόνο κυκλοπαμίνης στη σωστή πίσω πλευρό ή tomatidine ελέγχου στο πίσω αριστερό πλευρό (δύο φορές την εβδομάδα για 3 εβδομάδες) όταν οι όγκοι από HGC 27-tumorsphere κύτταρα έφθασαν περίπου 2 mm, που μετά από 3 εβδομάδες, πραγματοποιήσαμε μια δοκιμασία περιοριστικής αραίωσης για σφαιροειδή σχηματισμός χρησιμοποιώντας κύτταρα όγκου υποβλήθηκε σε επεξεργασία με κυκλοπαμίνη και κατεργάζεται με tomatidine, αντίστοιχα. Όπως φαίνεται στον Πίνακα S2, περίπου 9-15% των κυττάρων από ξένο μόσχευμα όγκου σε επεξεργασία με tomatidine θα μπορούσε να παράγει σφαιροειδή, ενώ λιγότερο από το 2,5% των κυττάρων από ξένο μόσχευμα όγκου αγωγή με κυκλοπαμίνη θα μπορούσε να δημιουργήσει σφαιροειδή. Ως εκ τούτου, το κλείδωμα της οδού ΕΛΕΡΠΕ in vivo θα μπορούσε να μειώσει τον αριθμό των γαστρικών CSLCs.

6. μονοπάτι ΕΛΕΡΠΕ διατήρησε τα γαστρικά CSLCs χαρακτηριστικά tumorsphere κυττάρων από δείγματα πρωτογενούς όγκου

Για να προσδιορίσετε αν οδού ΕΛΕΡΠΕ θα μπορούσαν να συμμετέχουν στα γαστρικά ΚΕΠ χαρακτηριστικά tumorsphere κυττάρων από γαστρικό καρκινικό ιστό, χρησιμοποιήσαμε πρωτογενείς γαστρικό καρκίνο δείγματα για να αναλύσει το λειτουργικές πτυχές της SHH πορείας στα γαστρικά CSLCs.

Πρώτον, μεγαλώσαμε πρόσφατα διαχωρισθεί χύμα κύτταρα από γαστρικό καρκίνο δείγματα σε μέσο χωρίς ορό περιγράφεται στην ενότητα μεθόδων, μετά από 10 ημέρες, παρατηρήθηκαν tumorspheres (Εικ. 7Α, ΣΙ). Στη συνέχεια ερευνήσαμε χημειοαντίσταση και ογκογόνο ικανότητα των κυττάρων από tumorsphere γαστρικό καρκινικό ιστό. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι tumorsphere κύτταρα από γαστρικό ιστό καρκίνου έδειξαν σημαντικά μεγαλύτερη αντίσταση σε φάρμακα από χύμα κυττάρων κάτω από τις ίδιες συνθήκες (Σχ. 7C). Επιπλέον, πρόσφατα διαχωρισθεί χύμα κύτταρα από γαστρικό δειγμάτων καρκίνου εγχύεται σε 2 × 10

7 κύτταρα ανά ποντικό ήταν ικανά να αποδείξουν υποδόριων όγκων, ενώ μόλις 2 × 10

4 των tumorsphere κυττάρων από γαστρικό δειγμάτων καρκίνου θα μπορούσαν να σχηματίσουν όγκων (Πίνακας 1), τα ξενομοσχεύματα όγκων που προέκυψαν από την έγχυση κυττάρων tumorsphere παρουσίασε τα ίδια χαρακτηριστικά ιστοπαθολογία οι αντίστοιχες ανθρώπινου όγκου τους (Σχ. 7F). Αυτά τα αποτελέσματα έδειξαν ότι τα κύτταρα από tumorsphere γαστρικό καρκινικό ιστό διέθετε τα χαρακτηριστικά του CSLCs. Στη συνέχεια, παρατηρήσαμε το αποτέλεσμα της SHH μπλοκάρισμα οδού επί χημειοαντίσταση του tumorsphere κυττάρων in vitro και όγκου απόκριση στα φάρμακα in vivo. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι η κυκλοπαμίνη ή 5Ε1 μπορούσαν είχε ως αποτέλεσμα μια σημαντικά ενισχυμένη συνολικό ποσοστό κυτταρικού θανάτου (Σχ. 7D) και την απόκριση του όγκου στο φάρμακο (σχ. 7Ε).

(Α, Β) Tumorspheres από γαστρικό καρκίνο δείγμα σχηματίστηκε μετά από 2 εβδομάδες αργότερα. Μπαρ = 1000 μm. (C) Επίδραση των 48 ωρών την έκθεση της tumorsphere κυττάρων (λευκές ράβδοι) και χύμα κύτταρα (μαύρες μπάρες) έως 1000 μΜ χημειοθεραπευτικό φάρμακο. Ox = οξαλιπλατίνη, Mi = mitomysin. * = P & lt? 0,05. βιωσιμότητα (D) Cell αναλύθηκε επί tumorsphere κύτταρα από γαστρικό καρκίνο δείγμα μετά από έκθεση σε κυκλοπαμίνη ή 5Ε1 με διαφορετικά φάρμακα για 48 ώρες. ομάδα ελέγχου PBS. Cyc = κυκλοπαμίνη, Ox = οξαλιπλατίνη, Mi = mitomysin. (Ε) υποδόρια όγκους που προέρχονται από 2 × 10

5 tumorsphere κύτταρα από γαστρικό δείγμα καρκίνο μετά από ε.π. αγωγή με PBS ή οξαλιπλατίνη σε συνδυασμό με tomatidine ελέγχου 10μΜ στο αριστερό οπίσθιο πλευρό γύρω από τον όγκο, ή οξαλιπλατίνη σε συνδυασμό με 10 μΜ κυκλοπαμίνη στο πίσω δεξιό πλευρό γύρω από τον όγκο. Tom = tomatidine, Cyc = κυκλοπαμίνη, Ox = οξαλιπλατίνη. κύτταρα TCs = tumorsphere. (F) Η &? Ε ανάλυση χρώση ανθρώπινων όγκων και ξενομοσχεύματα που προέρχονται από tumorsphere κύτταρα. Bar = 100 μm.

Η

Συζήτηση

ΚΕΠ μοιράζονται πολλά κοινά χαρακτηριστικά με βλαστικά κύτταρα ιστού, όπως η αυτο-ανανέωση, τον πολλαπλασιασμό, χημειοαντίσταση, και είναι κυρίως υπεύθυνα για τη διατήρηση της ανάπτυξης των όγκων [27], [28]. Πολλοί ερευνητές έχουν χρησιμοποιήσει ενεργοποιούμενη με φθορισμό ταξινόμηση κυττάρων για τον εντοπισμό και την απομόνωση ΚΕΠ και προσδιορίστηκε ότι τα κύτταρα αυτά μπορούν να σχηματίσουν σφαίρες σε εξειδικευμένο μέσο χωρίς ορό. Σε αυτή τη μελέτη, πήραμε την αντίθετη προσέγγιση με την ανάπτυξη των κυττάρων tumorsphere και στη συνέχεια να καθοριστεί εάν τα κύτταρα αυτά αποκτήθηκαν χαρακτηριστικά ΚΕΠ.

Χρησιμοποιήσαμε ένα καθορισμένο μέσο ελεύθερο ορού που αποτελείται από EGF, FGF-2, B-27 συμπλήρωμα και Ν-2 συμπλήρωμα για να διατηρήσει γαστρικού καρκίνου κυτταρικές γραμμές. Αυτές οι συνθήκες είχαν χρησιμοποιηθεί προηγουμένως για να διατηρήσει ενδογενή νευρικά βλαστικά /προγονικά κύτταρα και βλαστικά κύτταρα όγκου από ανθρώπινους όγκους και κυτταρικές γραμμές όγκου. Για παράδειγμα, Kondo et al. [24] η οποία χαρακτηρίζεται την κυτταρική γραμμή όγκου αρουραίου C6 in vitro και in vivo και παρατηρείται ένας μικρός πληθυσμός των βλαστικών κυττάρων που μοιάζουν προέρχονται από το καλά χαρακτηρισμένο πλευρά πληθυσμού. Setoguchi et al. [29] κατέδειξε καρκίνος δυναμικό βλαστικών κυττάρων, όπως και σε άλλες καρκινικές κυτταρικές σειρές, συμπεριλαμβανομένης της γραμμής MCF7 καρκίνου του μαστού, B104 νευροβλάστωμα, και το αδενοκαρκίνωμα HeLa.

Στο πείραμά μας, χρησιμοποιήσαμε τρία γαστρικού καρκίνου κυτταρικές γραμμές (HGC- 27, ΜΚΝ-45 και MGC-803) για να tumorspheres πολιτισμό. HGC-27 κυτταρική σειρά ιδρύθηκε από τον πολιτισμό των μεταστατικών λεμφαδένων από γαστρικό ασθενή με καρκίνο διαγνώστηκε ιστολογική ως αδιαφοροποίητο καρκίνωμα. ΜΚΝ-45 ιδρύθηκε από τον κακώς διαφοροποιημένο αδενοκαρκίνωμα του στομάχου ενός 62-year-old γυναίκα. MGC-803 είναι ένα επιθηλιακά ελάχιστα διαφοροποιημένο ανθρώπινο γαστρικό βλεννογόνο αδενοκαρκινώματος κυτταρική γραμμή από ένα 74-year-old man.

Δύο διαφορετικές προσεγγίσεις έχουν τυπικά χρησιμοποιηθεί για τον εντοπισμό ΚΕΠ σε δημοσιευμένες μελέτες [30], [31] . Το ένα είναι ένα in vitro μέθοδο που ονομάζεται «σχηματισμός σφαιροειδές αποικία,» και ένα άλλο είναι στη μέθοδο vivo που περιλαμβάνει την εμφύτευση των υποψήφιων ΚΕΠ κάτω από το δέρμα ποντικών με ανοσοανεπάρκεια.

Η πρώτη μέθοδος περιλαμβάνει την καλλιέργεια υποψήφιος CSCs σε δίσκους καλλιέργειας με ειδική επίστρωση για noncell προσάρτησης με μέσο χωρίς ορό που περιέχει επιδερμικό παράγοντα ανάπτυξης και βασικό παράγοντα ανάπτυξης ινοβλάστης. Η ανάπτυξη των σφαιρικών αποικίες μετά από μερικές εβδομάδες, θεωρείται ενδεικτική της ικανότητας αυτο-ανανέωση, και θα είναι σύμφωνη με φαινότυπο CSC. Η τελευταία μέθοδος ανάπτυξης των κυττάρων σε ανοσοανεπαρκείς ποντικούς-απαιτείται να αποδειχθεί αληθές ογκογονικότητα και θεωρείται γενικά ως το χρυσό πρότυπο για την απόδειξη ύπαρξης ΚΕΠ. Ένας αριθμός μελετών έχουν υποδείξει ότι οι δύο αυτές προσεγγίσεις παρέχουν γενικά παρόμοια αποτελέσματα όσον αφορά την αξιολόγηση υποψήφιων ΚΕΠ για πολλούς συμπαγείς όγκους.

Προς το παρόν, η γαστρική ΚΕΠ δεν έχουν συγκεκριμένες διαμορφωτές επιφάνεια, έτσι, αναπτύξαμε tumorsphere κύτταρα και στη συνέχεια προσδιορίζεται κατά πόσον αυτά τα κύτταρα αποκτήθηκαν ΚΕΠ χαρακτηριστικά, συμπεριλαμβανομένης της αυτο-ανανέωση ικανότητας, χημειοαντίσταση και ογκογόνο ικανότητα.

Τα στοιχεία μας έδειξαν ότι κυτταρικές σειρές γαστρικού καρκίνου (HGC-27, MGC-803, ΜΚΝ-45) που καλλιεργούνται σε ένα καθορισμένο ελεύθερο ορού ελεύθερο μέσο θα μπορούσε να αποτελέσει tumorspheres που περιείχαν κύτταρα συμπεριφέρονται σαν CSLCs. In vitro, tumorsphere κύτταρα έδειξαν μία αυξημένη ικανότητα να σχηματίζουν αποικίες σε μαλακό άγαρ υπό ανεξάρτητο από αγκύρωση συνθήκες και αυξημένη ικανότητα να σχηματίζουν υπο-tumorspheres. Επίσης έδειξε ότι η ικανότητα αυτο-ανανέωσης για να σχηματίσουν υπο-tumorspheres του HGC 27 tumorsphere κύτταρα είχαν αύξηση κατά περάσματα 2 έως 8 (από 44,5% έως 70,5%), και στη συνέχεια διατήρησε μια σχετικά σταθερή αναλογία μετά από 8 ή περισσότερα περάσματα όταν αναπτύχθηκαν σε κλωνική πυκνότητα (Εικ. S3). Αυτά τα δεδομένα πρότειναν ότι η πολλαπλασιαστική δυναμικό των κυττάρων tumorsphere διατηρήθηκε μετά από παρατεταμένη περάσματα. Επιπλέον, tumorsphere κυττάρων in vitro ήταν πιο ανθεκτικά στην οξαλιπλατίνη και μιτομυκίνη σε σύγκριση με προσκολλημένα κύτταρα, αυτά τα δεδομένα υποδηλώνουν ότι tumorsphere κύτταρα αποτελούνται εμπλουτισμένου αριθμούς CSLCs, η οποία ενδεχομένως τους έκανε λιγότερο ευαίσθητα στις δράσεις των δύο οξαλιπλατίνη και Μιτομυκίνη. In vivo, tumorsphere κύτταρα θα μπορούσε να δημιουργήσει όγκους κατά την ξενομεταμόσχευσης σε ένα υψηλότερο ποσοστό από ό, τι προσκολλημένα κύτταρα. Επιπλέον, tumorsphere κύτταρα που παράγονται υποδόριων όγκων με μεγαλύτερο όγκο και μικρότερο χρόνο σε σύγκριση με εκείνα που παράγονται από προσκολλημένα κύτταρα, το σημαντικότερο, tumorspheres μπορούσαν να επαναχρησιμοποιηθούν προέρχονται από τα ξένο μόσχευμα όγκους, και θα μπορούσαν να σχηματίζουν πάλι όγκου, αυτά τα δεδομένα υποδηλώνουν ότι tumorspheres εμπλουτίστηκαν σε CSLCs .

Στη μελέτη μας, προσκολλημένα κύτταρα περιείχαν πιθανώς ένα σχετικά χαμηλό ποσοστό των ΚΕΠ, καθώς δεν χρησιμοποιήθηκε η μέθοδος για την απομόνωση ή την αφαίρεση αυτών των κυττάρων. Μπορεί να υποστηριχθεί ότι είναι αυτό το μικρό πληθυσμό ΚΕΠ που είναι υπεύθυνη για το σχηματισμό όγκου. Ανεξάρτητα, πιο ΚΕΠ ήταν εμφανής στα κύτταρα tumorsphere, η οποία μπορεί να εξηγήσει πιο επιθετική συμπεριφορά του.

Στη συνέχεια, ερευνήσαμε αν τα χαρακτηριστικά των CSLCs σε tumorspheres διατηρήθηκαν από την ανώμαλη ενεργοποίηση του μονοπατιού ΕΛΕΡΠΕ. Πρώτον, αποδείξαμε ότι τα επίπεδα έκφρασης του mRNA της SHH μορίων μονοπατιού που σχετίζονται με (Shh, Ptch και Gli1) ήταν σημαντικά υψηλότερα σε tumorsphere κύτταρα από ό, τι σε προσκολλημένα κύτταρα, ενώ Gli2 ήταν υψηλή εκφράζονται τόσο σε κύτταρα. Εξετάσαμε περαιτέρω τα επίπεδα έκφρασης του SHH γονιδίων στόχων οδού (Ptch και Gli1) με κηλίδα Western και ποσοτική PCR πραγματικού χρόνου, τα αποτελέσματα ήταν παρόμοια με εκείνα του RT-PCR. Δεύτερον, η αναστολή της δραστικότητας της οδού SHH με κυκλοπαμίνη ή 5Ε1 οδήγησε σε μειωμένη ικανότητα αυτο-ανανέωσης και αυξημένη ευαισθησία σε φάρμακα σε HGC-27 tumorsphere κύτταρα, αλλά αυτές οι επιδράσεις δεν προφέρεται στα προσκολλημένα κύτταρα. In vivo, σε όλα τα ποντίκια έλαβαν, οι όγκοι που έλαβαν θεραπεία με οξαλιπλατίνη ήταν σημαντικά μικρότερα από εκείνα δεν έλαβαν θεραπεία με οξαλιπλατίνη, μετά από αγωγή με κυκλοπαμίνη ή 5Ε1, η ανταπόκριση του όγκου σε χημειοθεραπευτικά φάρμακα ενισχύθηκε. Αυτά τα δεδομένα πρότειναν ότι παρόλο πρότυπο χημειοθεραπευτικά φάρμακα καθυστερημένη έκφυση του όγκου κατά τη διάρκεια της θεραπείας, όταν συνδυάστηκαν με κυκλοπαμίνη, η αποτελεσματικότητα της χημειοθεραπείας ήταν σημαντικά αυξημένη και επίσης πιο παρατεταμένη μετά τη διακοπή της θεραπείας.

Τέλος, χρησιμοποιήσαμε πρωτογενείς γαστρικό καρκίνο δείγματα για να αναλύσει τις λειτουργικές πτυχές της ΕΛΕΡΠΕ μονοπατιού στο γαστρικό CSLCs. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι tumorsphere κύτταρα από γαστρικό δείγμα καρκίνο είχαν επίσης χημειοαντίσταση και ογκογόνο ικανότητα, άλλωστε ΕΛΕΡΠΕ μπλοκάρισμα οδού μείωσε το χημειοαντίσταση των tumorsphere κυττάρων και αυξημένη ανταπόκριση του όγκου στα φάρμακα in vivo.

Όσον αφορά χημειοαντίσταση, αρκετά χαρακτηριστικά των ΚΕΠ μπορεί να καθιστούν δύσκολο να εξαλειφθούν. ΚΕΠ είναι σχετικά ήρεμη και αυτό τους επιτρέπει να ξεφύγουν από χημειοθεραπευτικά σχήματα που συνήθως στοχεύουν ενεργά ποδηλασία κύτταρα. Επιπλέον, όπως φαίνεται για την κανονική ομολόγου τους, ΚΕΠ έχουν προταθεί να εμφανίζουν υψηλό επίπεδο έκφρασης της οικογένειας μεταφορέα πολλαπλών φαρμάκων γονίδια, πιθανόν ως αποτέλεσμα πιο αποτελεσματική εκροή των χημειοθεραπευτικών φαρμάκων και έμφυτη αντίσταση σε πολλά φάρμακα, Επιπλέον, τα μονοπάτια σηματοδότησης, όπως Wnt, Hedgehog ή Notch, οι απορυθμίζεται σε ΚΕΠ που οδηγεί στην ανάπτυξη των όγκων. Ως εκ τούτου, η ανάπτυξη μιας αποτελεσματικής θεραπευτικής προσέγγισης θα απαιτήσει την αναγνώριση του διακριτικού μοριακών οδών που δραστηριοποιούνται σε ΚΕΠ και τον εντοπισμό των παραγόντων που μπορεί να είναι είτε μπλοκ CSC πολλαπλασιασμό ή να προκαλέσει CSC διαφοροποίηση, ενισχύοντας έτσι την ευαισθησία σε χημειοθεραπευτικά φάρμακα. Έτσι, σημαντικοί παράγοντες που επηρεάζουν την χημειοαντίσταση των ΚΕΠ είναι εγγενείς παράγοντες.