Αφηρημένο

καρκίνου της ουροδόχου κύστης είναι η τέταρτη πιο κοινή αιτία του καρκίνου στους άνδρες στις Ηνωμένες Πολιτείες. Επεμβατική συμπεριφορά είναι ένας σημαντικός καθοριστικός παράγοντας της πρόγνωσης. Σε αυτή τη μελέτη, εντοπίσαμε στόχος θηλαστικών συμπλόκου ραπαμυκίνης 2 (mTORC2) ως κεντρικός ρυθμιστής της μετανάστευσης καρκίνου της ουροδόχου κύστης κυττάρων και εισβολή. δραστηριότητα mTORC2 εκτιμήθηκε από την έκταση της φωσφορυλίωσης του Ser473 σε ΑΚΤ και προσδιορίστηκε να είναι περίπου 5 φορές υψηλότερη σε δείγματα του διηθητικού ανθρώπινου καρκίνου της ουροδόχου κύστης, σε αντίθεση με μη επεμβατικό ανθρώπινου καρκίνου της ουροδόχου κύστης. Οι αθανατοποιημένες κυτταρικές σειρές κακοήθων κύστη, UMUC-3, J82 και T24 αποδεικνύεται υψηλότερα αρχικά mTORC2 δραστηριότητα σε σχέση με την καλοήθη κύστη θηλώματος κυτταρική γραμμή που λαμβάνεται RT4 και της κανονικής ουροφόρων HU1 κυτταρική γραμμή. Τα κακοήθη καρκινικά κύτταρα κύστης έδειξαν επίσης αυξημένη μετανάστευση σε δοκιμασίες φρεατίων και απογύμνωση, αυξημένη εισβολή matrigel, και αυξημένη ικανότητα να εισβάλει δείγματα ανθρώπινης ουροδόχου κύστης. Γονιδιακή σίγηση του rictor, ένα κρίσιμο συστατικό της mTORC2, ουσιαστικά ανέστειλε τη μετανάστευση των κυττάρων καρκίνου της ουροδόχου κύστης και της εισβολής. Αυτό συνοδεύτηκε από μια σημαντική μείωση στην ενεργοποίηση Rac1 και φωσφορυλίωση παξιλλίνη. Οι μελέτες αυτές προσδιορίζουν mTORC2 ως ένα σημαντικό στόχο για την εξουδετέρωση εισβολή του καρκίνου της ουροδόχου κύστης

Παράθεση:. Gupta S, Hau AM, Παραλία JR, Harwalker J, Mantuano Ε, Γωνιάς SL, et al. (2013) θηλαστικών στόχος της ραπαμυκίνης Συγκρότημα 2 (mTORC2) είναι ένας κρίσιμος καθοριστικός παράγοντας της ουροδόχου κύστης εισβολή. PLoS ONE 8 (11): e81081. doi: 10.1371 /journal.pone.0081081

Επιμέλεια: Νατάσα Κυπριανού, Πανεπιστήμιο του Κεντάκι College of Medicine, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 11 Ιουλίου 2013? Αποδεκτές: 8 Οκτώβρη του 2013? Δημοσιεύθηκε: 27 Νοεμβρίου του 2013

Copyright: © 2013 Gupta et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από το Πανεπιστήμιο Case Western Reserve /Cleveland Clinic CTSA Grant Αριθμός UL1 RR024989 από το Εθνικό Ινστιτούτο Καρκίνου, και ένα βραβείο KL2 εξέλιξη της σταδιοδρομίας (RR024990) σε DE Χάνσελ. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

καρκίνου της ουροδόχου κύστης λογαριασμούς για περισσότερο από 70.000 νέα κρούσματα καρκίνου στις Ηνωμένες Πολιτείες κάθε χρόνο, με εκτιμώμενη παγκόσμια επίπτωση των 386.000 περιπτώσεις ετησίως [1,2]. Ουροθηλιακά καρκίνωμα (UCA) αντιπροσωπεύει περίπου το 95% όλων των καρκίνων της ουροδόχου κύστης, με την έκβαση των ασθενών επηρεάζεται κυρίως από την παθολογική βαθμό και το στάδιο [3]. Βαθμός είναι μια πρωταρχική συμβολή στην συμπεριφορά σε μη επεμβατικές UCA, το οποίο υποδιαιρείται σε χαμηλής ποιότητας και υψηλής ποιότητας κατηγορίες. Χαμηλής ποιότητας ασθένεια δείχνει συχνή τοπική υποτροπή στην επιφάνεια της ουροδόχου κύστης, αλλά σπάνια εξέλιξη σε διεισδυτική νόσο [4]. Υψηλής ποιότητας νόσος εξελίσσεται σε εισβολή σε 40-50% των ασθενών [5]. Μόλις συμβεί εισβολή, συγκεκριμένες ασθένειες επιβίωση μειώνεται με την αύξηση της παθολογικά στάδιο (δηλαδή, το βάθος της εισβολής εντός του τοιχώματος της ουροδόχου κύστης), παρά θεραπευτική παρέμβαση.

καρκίνου της ουροδόχου κύστης παραμένει μια σχετικά μελετημένο νόσου και οι κυτταρικοί μηχανισμοί που καθορίζουν την εξέλιξη του καρκίνου είναι ελλιπώς κατανοητή. Υψηλής ποιότητας ασθένεια παρουσιάζει συχνά

RB

και

TP53

μεταλλάξεις και

PTEN

διαγραφή? Ωστόσο, αυτές οι γενετικές αλλαγές μπορούν να παρατηρηθούν τόσο επεμβατικές και μη επεμβατικές αλλοιώσεις. Αναγνώριση των προ-επεμβατική μονοπάτια στον καρκίνο της ουροδόχου κύστης ήταν πιο δύσκολο. Πρόσφατη εργασία έχει δείξει ότι υποδοχέα-1 αυξητικού παράγοντα ινοβλαστών (FGFR1) προωθεί εισβολή του καρκίνου της ουροδόχου κύστης κυττάρων που εκφράζουν ZEB1, ένα δείκτη της μεταβάσεως επιθηλίου-μεσεγχύματος (ΕΜΤ) [6]? FGFR αναστολή σε αυτή τη μελέτη μειωμένη μεταστατική εξάπλωση του ορθοτοπικά εμφυτευμένων καρκινικών κυττάρων κύστης. έκφραση FOXQ1 επίσης συσχετίστηκε με υπογραφή EMT σε καρκινικά κύτταρα της κύστης και σίγηση του FOXQ1 αυξημένη έκφραση Ε-καδερίνης, μειωμένη έκφραση βιμεντίνη και εξασθενημένα επεμβατική συμπεριφορά [7]. Η φωσφοϊνοσιτίδη-3 κινάση ΑΚΤ-στόχο θηλαστικού της ραπαμυκίνης (mTOR) οδού έχει αναγνωριστεί ως υποψήφια μονοπάτι στην εξέλιξη του καρκίνου της ουροδόχου κύστης σε αρκετές πρόσφατες μελέτες κλινικοπαθολογοανατομικές [8,9]. Παρά το γεγονός ότι έχουμε εντοπίσει ένα ρόλο για mTORC1 στην προώθηση του πολλαπλασιασμού του καρκίνου της ουροδόχου κύστης

in vitro

και την ανάπτυξη του καρκίνου της ουροδόχου κύστης ξενομοσχεύματος

in vivo

[9], ο ρόλος του mTOR σηματοδότησης σε εισβολή καρκίνου της ουροδόχου κύστης δεν υπήρξε διερευνηθούν.

mTORC2 είναι ένας ελκυστικός στόχος για την αναστολή της ουροδόχου κύστης εισβολή καρκίνου επειδή έχει αποδειχθεί ότι επηρεάζουν κυτταροσκελετική αναδιαμόρφωση, προσκόλληση των καρκινικών κυττάρων, και τη μετανάστευση [10-12]. mTORC2 διακρίνεται από mTORC1 από την παρουσία του rictor, protor και υπομονάδες mSin1, τα οποία απαιτούνται για την πλήρη δράση κινάσης [13,14]. Οι μεταγενέστεροι τελεστές περιλαμβάνουν ΑΚΤ και την Rho ΘΤΡάσες (Rho, Rac και Cdc42) που ρυθμίζουν την προσκόλληση και τη μετανάστευση [12,15,16]. mTORC2 επίσης μπορεί να ρυθμίζει ΕΜΤ [17] και έχει εμπλακεί στην εισβολή και τη μετάσταση στο παχύ έντερο και τον καρκίνο του μαστού [10,18]. Επιλεκτική στόχευση των mTORC2 μειώνει μετάσταση καρκίνου σε μοντέλα ποντικών [10]? Ωστόσο, ο ρόλος του στην εισβολή του καρκίνου της ουροδόχου κύστης και η μετάσταση είναι άγνωστη.

Σε αυτή τη μελέτη, έχουμε εξετάσει το ρόλο των mTORC2 στην κύστη καρκινικών κυττάρων εισβολή. Έχουμε χρησιμοποιήσει δείγματα ανθρώπινου καρκίνου της ουροδόχου κύστης για να δείξει ότι η αυξημένη δραστηριότητα mTORC2 σχετίζεται με μια επεμβατική φαινότυπο. Οι μελέτες αυτές σε συνδυασμό με

in vitro

και τα νέα

ex vivo δοκιμασίες

ανθρώπινη εισβολή τοίχωμα της ουροδόχου κύστης για να δείξει τον κρίσιμο ρόλο της mTORC2 στη μετανάστευση των κυττάρων καρκίνου της ουροδόχου κύστης και εισβολή. Μεταβολές στο Rho ΟΤΡάσης σηματοδότηση είναι λεπτομερείς. Τα αποτελέσματα αυτής της μελέτης δείχνουν ότι mTORC2 μπορεί να είναι ένα συναρπαστικό μυθιστόρημα στόχο την αναστολή της εξέλιξης του καρκίνου της ουροδόχου κύστης.

Υλικά και Μέθοδοι

κυτταρικής καλλιέργειας και αντιδραστηρίων

RT4, UMUC3, T24 και τα κύτταρα J82 αγοράστηκαν από την American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA). κύτταρα HU1 ήταν ένα γενναιόδωρο δώρο από τον R. Rackley (Cleveland Clinic). Τα κύτταρα αναπτύχθηκαν σε RPMI-1640 (GIBCO, Invitrogen Corp., Grand Island, ΝΥ) συμπληρωμένο με 10% εμβρυϊκό βόειο ορό (FBS, GIBCO) και διάλυμα αντιβιοτικού /αντιμυκητιακού (Sigma, Inc., St. Louis, ΜΟ). Όλες οι κυτταρικές γραμμές διατηρήθηκαν στους 37 ° C σε υγροποιημένη ατμόσφαιρα που περιέχει 5% CO

2. Ορός λιμοκτονία εκτελέστηκε για 16 ώρες με διατήρηση κυττάρων σε μέσο που στερείται ορού, με τρία αλατόνερο ρυθμισμένο με φωσφορικό (PBS) πλύσεις κατά τη διάρκεια αυτής της χρονικής περιόδου. Για ορό κύτταρα διεγείρουν, 10% FBS προστέθηκε. Η ραπαμυκίνη ελήφθη από την Santa Cruz Biotechnology (Ντάλας, Τέξας).

Ασθενών Δείγματα

Όλες οι έρευνες που αφορούν τα ανθρώπινα συμμετέχοντες εγκρίθηκε από το IRB Cleveland Clinic και γραπτή συγκατάθεση λήφθηκε από τους ασθενείς. Δείγματα Φρέσκα ιστού ελήφθησαν κατά το χρόνο της χειρουργικής επέμβασης, καταψύχθηκε και αποθηκεύθηκε στους -80 ° C. Κατεψυγμένες τομές αναλύθηκαν με μικροσκοπία για να επιβεβαιωθεί ότι η μεγαλύτερη από & gt? 90% των κυττάρων σε δείγματα υποβάλλονται σε ανάλυση ανοσοστυπώματος ήταν καρκινικά κύτταρα. Βαθμός του όγκου επιβεβαιώθηκε από έναν παθολόγο. Για την ανοσοαποτύπωση ανάλυση, δείγματα ιστού ομογενοποιούνται χρησιμοποιώντας το Power Gen 500 ομογενοποίησης (Thermo Scientific, San Diego, CA).

Rictor αποσιώπηση

siGENOME ελέγχου μη στόχευσης (NTC) siRNA και siGENOME SMARTpool Rictor-ειδική siRNA ελήφθη από Dharmacon (Thermo Scientific). Οι επιμολύνσεις πραγματοποιήθηκαν για 48 ώρες με τη χρήση του αντιδραστηρίου LipofectAMINE® RNAiMAX (Invitrogen). Αποσιώπηση επιβεβαιώθηκε με ανάλυση ανοσοστύπωσης.

ανοσοκηλιδώσεως ανάλυση

Κύτταρα και δείγματα ιστών εκχυλίσθηκαν σε ρυθμιστικό RIPA που περιέχει κοκτέιλ αναστολέων πρωτεάσης (Sigma) και φωσφατάσης κοκτέιλ αναστολέα 1 και 2 (Sigma) και υποβλήθηκαν σε SDS-PAGE σε γέλες κλίσης 4-15%. Πρωτεΐνες μεταφέρθηκαν σε Hybond ECL μεμβράνες (GE Healthcare, Pittsburgh, PA) χρησιμοποιώντας την Bio-Rad transblot semidry σύστημα μεταφοράς (Life Science Research, Hercules, CA). Οι μεμβράνες μπλοκαρίστηκαν με 1% αλβουμίνη βόειου ορού και επωάστηκαν με πρωτεύοντα αντισώματα όλη τη νύχτα στους 4 ° C εντός διαλύματος αποκλεισμού. Αντισώματα, τα οποία ελήφθησαν από την Cell Signaling Technology (Danvers, ΜΑ), στοχευμένες rictor (1: 1000), ρ-ΑΚΤ (Thr308? 1: 1000), ρ-ΑΚΤ (Ser473? 1: 1000), παν-ΑΚΤ (1 : 2000), ρ-S6 (1: 2000), το συνολικό-S6 (1: 2000), και ακτίνη (1: 5000). Οι κηλίδες επωάστηκαν με συζευγμένο με αλκαλική φωσφατάση δευτερογενή αντισώματα (Jackson ImmunoResearch, West Grove, ΡΑ) σε θερμοκρασία δωματίου για 1 ώρα και αναπτύχθηκαν με χρήση ECF ™ κηλίδωση Western συσκευασίες αντιδραστηρίων (GE Healthcare). Πυκνομετρία πραγματοποιήθηκε με τη χρήση Imagequant λογισμικού (GE Healthcare).

εξάπλωση των κυττάρων και μορφομετρική ανάλυση

Τα κύτταρα τρυψινοποιήθηκαν και καλλιεργήθηκαν με χαμηλή πυκνότητα στο εκκαθαριστικό σημείωμα θάλαμο βοριοπυριτικό coverglass (Nalge Νυηο International, Naperville, IL) επικαλυμμένα με 20 μg /ml ινονεκτίνης. απεικόνισης πάροδο του χρόνου πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας μια Leica TCS-SP2 με ένα σχέδιο-Αχρωματικός 63x /1.4 NA στόχος πετρελαίου (Leica, Buffalo Grove, IL) για 24 ώρες και η μορφολογία των κυττάρων αναλύθηκε χρησιμοποιώντας το λογισμικό J εικόνας (http: //rsbweb.nih .gov /θ /). Η συνολική έκταση των μεμονωμένων κυττάρων προσδιορίστηκε ποσοτικά για κάθε αντίστοιχου χρονικό σημείο και απεικονίζονται σε σχέση με το χρόνο που παρήλθε.

Τροποποιημένο μηδέν πληγή δοκιμασίες μετανάστευσης

Τροποποιημένο δοκιμασίες μετανάστευσης μηδέν τραύματος διεξήχθησαν όπως περιγράφηκε προηγουμένως [19 ]. Εν συντομία, πλακίδια καλλιέργειας ιστού προ-επεξεργασία με 20 ng /mL ινωδονεκτίνης σε PBS για 1 ώρα. Μία λεπτή λωρίδα του πολυδιμεθυλοσιλοξανίου (PDMS) τοποθετήθηκε στο μέσον της κάθε φρεάτιο και αφέθηκαν να προσκολληθούν. Τα κύτταρα σπάρθηκαν στην κορυφή και επωάστηκαν για 18 ώρες, μετά την οποία οι λωρίδες PDMS απομακρύνθηκαν για να αποκαλύψουν ένα ατάραχος μήτρα ινονεκτίνη. Πολλαπλά πεδία της προβολής ανά καλά απεικονίστηκαν σε τακτά χρονικά διαστήματα, χρησιμοποιώντας το μικροσκόπιο Leica DM IRE2 (Leica) και λογισμικό απεικόνισης MetaMorph (Molecular Devices, Sunnyvale, CA).

προσδιορισμούς εισβολής Transwell

Transwell εισβολή δοκιμασίες διεξήχθησαν όπως περιγράφηκε προηγουμένως [9] χρησιμοποιώντας 8 micron μεμβράνες ΡΕΤ (Corning Life Sciences, Tewksbury ΜΑ) επικαλυμμένα με Matrigel (BD Biosciences, San Jose, CA). Τα κύτταρα σπάρθηκαν πάνω σε μεμβράνες σε μέσο ελεύθερο ορού (SFM) και αφέθηκαν να μεταναστεύσουν για 24 ώρες προς μια αντιστοιχισμένη θάλαμο μέσο συμπληρωμένο με 10% FBS που περιέχει. Οι μεμβράνες σταθεροποιήθηκαν με 4% παραφορμαλδεΰδη, κατέστησαν διαπερατά σε 0.1% Triton Χ-100, και χρωματίστηκαν με ϋΑΡΙ. Η κορυφή της μεμβράνης καθαρίζονται με μια μπατονέτα, έτσι ώστε μόνο διαμετακινήθηκαν κύτταρα μετρήθηκαν. Οπτικά πεδία σε μεγέθυνση 200χ τυχαία απεικονίστηκαν με τη χρήση του μικροσκοπίου Leica DMR και τον αριθμό των κυττάρων που υπάρχουν προσδιορίστηκε ποσοτικά χρησιμοποιώντας το λογισμικό ImageJ.

ουροδόχου κύστης τοίχο εισβολή δοκιμασία

Για προσδιορισμούς φέτα της ουροδόχου κύστης, φρέσκο, πλήρες -thickness φέτες του τοιχώματος της ουροδόχου κύστης ελήφθησαν από ασθενείς που υποβάλλονται σε ριζική κυστεκτομή και λήφθηκαν από τμήματα απαλλαγμένα από ασθένειες του τοιχώματος της ουροδόχου κύστης από ουρολογικές παθολογοανατόμο. Η βασική μεμβράνη απογυμνώθηκε για να εκτεθεί το συνδετικό ιστό (lamina propria) και την εξωτερική όψη της perivesical λίπους εμπεδώθηκε σε άγαρ. Ο ιστός διατηρήθηκε σε RPMI /10% FBS με αντιβιοτικά /αντιμυκητιασικά για 7-10 ημέρες. καρκινικά κύτταρα ουροδόχου κύστης σημάνθηκαν με CellTrackerTM Red, σπάρθηκαν πάνω στην φέτα του ιστού, και επωάζονται για 3-7 ημέρες με τακτικές αλλαγές του μέσου σε διαστήματα 24 ωρών. Προκειμένου να εκτιμηθεί επεμβατική βάθος των κυττάρων του όγκου, ο ιστός κάθετα χωρισμένο κατά διαστήματα 10 micron για να δείτε όλα τα στρώματα των ιστών και κυττάρων οπτικοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας αιματοξυλίνη και ηωσίνη (Η &? Ε) χρώση, ανοσοϊστοχημεία και ανοσοφθορισμό. Εικόνες συλλήφθηκαν χρησιμοποιώντας ένα μικροσκόπιο φθορισμού Leica DMR και Προηγμένο λογισμικό Spot (SPOT Imaging Solutions, Sterling Heights, MI). Το βάθος της εισβολής μετρήθηκε χρησιμοποιώντας Image-Pro Plus λογισμικό για εικόνες που έχουν ληφθεί (Media Cybernetics, Rockville, MD). Ανοσοϊστοχημεία για την ανίχνευση κυτοκερατίνη ΑΕ1 /3 πραγματοποιήθηκε όπως περιγράφηκε προηγουμένως [9] χρησιμοποιώντας ένα Discovery XT αυτοματοποιημένη χρώσης.

μικροσκοπία ανοσοφθορισμού

χρώση ανοσοφθορισμού διεξήχθη όπως περιγράφηκε προηγουμένως [20]. Τα κύτταρα σταθεροποιήθηκαν σε PBS συμπληρωμένο με 2 mM MgCl

2, 2 mM EGTA, και 4% φορμαλδεΰδη, κατέστησαν διαπερατά σε PBS που περιείχε 0,5% Triton Χ-100, επωάζεται με ρ-παξιλλίνη αντίσωμα (κυτταρική σηματοδότηση? 1: 1000) και εμφανιζόμενα με αντι-κουνελιού συζευγμένο με Alexa δευτερογενή αντισώματα (Invitrogen). Οι πυρήνες χρωματίστηκαν χρησιμοποιώντας DAPI.

Rac1 /RhoA δοκιμασία ενεργοποίησης

RhoA /δοκιμασίες ενεργοποίησης Rac1 διεξήχθησαν όπως περιγράφεται από τον κατασκευαστή (Cell Biolabs, Inc., San Diego, CA). Εν συντομία, τα κύτταρα αναπτύχθηκαν σε 50-70% συρροή, υποβλήθηκε σε επεξεργασία με FBS για 30 λεπτά και επιμολύνθηκαν με siRNA 72 ώρες πριν από τη συγκομιδή. Δείγματα ελέγχου επωάζονται με ΟΤΡγδ. Ισοδύναμες ποσότητες πρωτεΐνης επωάστηκαν είτε με ΡΑΚ1-PBD αγαρόζη ή Rhotekin-PBD αγαρόζης (Millipore, Billerica, ΜΑ) για 1 ώρα στους 4 ° C. Τα σφαιρίδια αγαρόζης συζευγμένα με πλύθηκαν 3 φορές σε PBS και βράστηκαν σε ρυθμιστικό δείγματος SDS-PAGE. Ανοσοκηλίδωση διεξήχθη με πρωτεύοντα αντισώματα τα οποία ανιχνεύουν Rac1 (BD Biosciences? 1: 1000) και RhoA (Cell Signaling? 1: 1000).

Αποτελέσματα

σηματοδότηση mTORC2 αυξάνεται σε διηθητικό καρκίνο ουροδόχου κύστεως του ανθρώπου

μη επεμβατική χαμηλού βαθμού (LG) UCA ορίζεται από θηλώδες φύλλα επενδεδυμένα με ουροδόχου κύστης με διατηρηθεί πολικότητα και μόνο ελάχιστη ατυπία κυτταρολογική (Εικόνα 1Α). Αυτή η ιστολογία συσχετίζεται με συχνές μεταλλάξεις στο

FGFR3

και

RAS

[21]. Σε αντίθεση, μη επεμβατική υψηλού βαθμού (HG) UCA δείχνει πυρηνική διεύρυνση, υπερχρωμασία, και την απώλεια της πολικότητας που συνήθως συνδέεται με μεταλλάξεις στο

TP53

και

RB

γονίδια (Εικόνα 1Β) . Σε ένα υποσύνολο των περιπτώσεων HG UCA, επεμβατική συμπεριφορά παρατηρείται (Σχήμα 1C) και αυτό σχετίζεται με επιδείνωση των αποτελεσμάτων. Αξιολογήσαμε δραστηριότητα mTORC2 σε δείγματα LG UCA, HG UCA, και HG UCA με εισβολή από τον προσδιορισμό φωσφορυλίωσης της ΑΚΤ σε Ser473 (p-Ser473). Ανοσοαποτύπωση πρότεινε την αύξηση του p-Ser473 σε μη επεμβατικές HG UCA σε σύγκριση με την LG βλάβες (Σχήμα 1D) και επιπλέον αύξηση στην p-Ser473 στην επεμβατική βλάβες HG. Πυκνότητας συγκρίνοντας π-Ser473 συνολικές αναλογίες /AKT έγινε, με αποτέλεσμα ομαλοποιήθηκε σε μη επεμβατικές LG UCA (Σχήμα 1Ε). Παρά το γεγονός ότι ο μικρός αριθμός των δειγμάτων αποκλείεται στατιστικής σημαντικότητας, ρ-Ser473 εμφανίστηκε αυξημένη στις πιο προηγμένες παθολογίες.

Είμαστε σε σύγκριση

Μια

, μη επεμβατική, χαμηλού βαθμού θηλώδες UCA (μη-inv LG ? κλίμακα bar 80 μικρά)?

Β

, μη επεμβατική υψηλής ποιότητας θηλώδες UCA (μη-inv HG? Κλίμακα bar 80 μικρά)? και

C

, επεμβατική υψηλής ποιότητας UCA να προσδιορίσει δραστηριότητα mTORC2 (γραμμή κλίμακας 100 microns).

D

, ανοσοστύπωμα για ρ-Ser473 ως ένας δείκτης της δραστικότητας mTORC2 διεξήχθη και δείχνει υψηλότερη δραστικότητα mTORC2 τόσο μη επεμβατικές HG και επεμβατικές αλλοιώσεις.

E

, πυκνομετρία χρησιμοποιήθηκε για την ποσοτικοποίηση p-Ser473 /συνολικές εντάσεις σήματος ΑΚΤ? μέσοι όροι και το τυπικό σφάλμα της μέσης τιμής (SEM) ομαλοποιήθηκαν με τη μέση ένταση του σήματος για τα μη επεμβατική δείγματα LG.

Η

mTORC1 και mTORC2 ενεργοποιούνται σε κακοήθη κύτταρα του καρκίνου της ουροδόχου κύστης

Συγκρίναμε mTORC1 και mTORC2 σηματοδότησης σε φυσιολογικά ουροφόρων κύτταρα hTERT-απαθανάτισε (HU1) [22], καλοήθης κύστη κύτταρα RT4 θηλωμάτων που προέρχονται και στην επεμβατική UMUC-3, Τ24, και J82 καρκίνου της ουροδόχου κύστης κύτταρα. δραστικότητα mTORC1 προσδιορίστηκε με τη μέτρηση της φωσφορυλιώσεως της κινάσης ρ70 S6 (ρ-S6), ενώ mTORC2 δραστικότητα προσδιορίστηκε με τα επίπεδα ρ-Ser473 ΑΚΤ. Υπό τις συνθήκες βασικής γραμμής, σε μέσο που περιέχει ορό, HU1 και RT4 κύτταρα έδειξαν χαμηλά επίπεδα φωσφορυλίωσης ΑΚΤ σε θρεονίνη 308 (ρ-Thr308), η οποία αντανακλά την ενεργοποίηση της ΡΙ3Κ και PDK1 ανάντη του ΑΚΤ (Εικόνα 2Α). p-Ser473 και p-S6 ήταν επίσης χαμηλή σε HU1 και RT4 κύτταρα. Οι τρεις κακοήθεις κυτταρικές σειρές καρκίνου της ουροδόχου κύστης διαπιστώθηκε αυξημένη ρ-Thr308, ρ-S6, και ρ-Ser473 επίπεδα.

A

, ανοσοκηλίδωση δεικνύει υψηλότερη mTORC1 (ρ-S6) και mTORC2 (p -Ser473) δραστηριότητα σε κακοήθη UMUC-3, Τ24 και J82 καρκίνου της ουροδόχου κύστης κύτταρα, σε σύγκριση με τα φυσιολογικά κύτταρα ουροθηλιακά HU1 και καλοήθη κύτταρα RT4.

Β

, διέγερση δραστηριότητα mTORC2 ορού σε κακοήθη καρκίνο της ουροδόχου κύστης κύτταρα. σηματοδότηση mTORC1 ήταν να ανταποκρίνεται στις ραπαμυκίνης σε αυτό το μοντέλο? mTORC2 δεν ήταν.

Η

Στη συνέχεια αξιολογήθηκε mTORC1 και δραστικότητα mTORC2 σε καρκινικά κύτταρα κύστης που έγιναν αδρανείς με ασιτία ορού και στη συνέχεια διεγείρονται με την προσθήκη ορού (Σχήμα 2Β). Σε κύτταρα RT4, ρ-Ser473 ήταν μόλις ανιχνεύσιμη πριν και μετά τη διέγερση του ορού. Στα κύτταρα Τ24 και J82, ρ-Ser473 ήταν ελάχιστη μετά ασιτία ορού, αλλά αυξήθηκε σημαντικά με την προσθήκη ορού. UMUC-3 κύτταρα απέδειξαν π-Ser473 ακόμα και μετά από ασιτία ορού και μια μέτρια αύξηση στην p-Ser473 μετά την προσθήκη του ορού. Αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι mTORC2 ενεργοποιείται σε απόκριση προς διέγερση του ορού σε διηθητικό καρκίνο της ουροδόχου κύστης κύτταρα. Σε αντίθεση, ρ-S6 αυξήθηκε σε απόκριση προς διέγερση του ορού σε καλοήθεις όπως επίσης κακοήθη καρκινικά κύτταρα κύστης. ραπαμυκίνη χαμηλή δόση (10 ηΜ), ένας αναστολέας της mTORC1, μπλοκάρει επιλεκτικά ρ-S6 και είχαν μικρή ή καμία επίδραση στην δραστικότητα mTORC2 [9].

Σε πειράματα χρονικής πορείας στα κύτταρα J82, δραστηριότητα mTORC2 αυξήθηκε γρήγορα μετά διέγερση ορού και διατηρήθηκε διαμέσου τουλάχιστον 6 ώρες σε καλλιέργεια (Σχήμα 3Α). Η κινητική της mTORC2 (ρ-Ser473) ενεργοποίησης και απενεργοποίησης ήταν παρόμοια με εκείνα που προσδιορίζονται για mTORC1 (ρ-S6). Για να επιβεβαιωθεί ότι η p-Ser473 ειδικά αντανακλάται δραστηριότητα mTORC2, θα σιγήσει rictor στα κύτταρα J82 που χρησιμοποιούν κοινές πηγές siRNA. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 3Β, rictor γονίδιο-σίγηση ήταν αποτελεσματική και εντελώς αποκοπεί φωσφορυλίωση του υπολείμματος Ser473 επί ΑΚΤ σε απόκριση σε ορό. Η φωσφορυλίωση του στόχου mTORC1, S6, ήταν ανεπηρέαστη, καταδεικνύοντας εξειδίκευση σε περίπτωση σίγηση. Μη με στόχο τον έλεγχο (NTC) siRNA δεν μετέβαλε τα επίπεδα rictor ή απόκριση σε διέγερση του ορού. Παρόμοια αποτελέσματα ελήφθησαν σε πειράματα με κύτταρα Τ24 (τα αποτελέσματα δεν φαίνονται). Τα ευρήματα αυτά επιδεικνύουν αποτελεσματική rictor γονίδιο-αποσιώπηση και μια σχετική μείωση στην mTORC2 σηματοδότησης.

Μια

, διέγερση ορού σε κύτταρα J82 δείχνει υψηλά επίπεδα mTORC2 (p-Ser473) δραστηριότητα κατά 5 λεπτά ότι παραμένει έως 6 ώρες.

B

, rictor γονίδιο-σίγηση χρησιμοποίηση συγκεντρωμένων siRNA μειώνει δραματικά ανιχνεύσιμη πρωτεΐνη rictor και αφαιρεί ρ-Ser473 σε σχέση με αυτό που παρατηρήθηκε σε κύτταρα επιμολυσμένα με NTC siRNA. Καμία επίδραση στα mTORC1 σηματοδότησης (p-S6) ανιχνεύθηκε.

Η

mTORC2 είναι ένα κρίσιμο ρυθμιστής της κυτταρικής μετανάστευσης και εισβολή στον καρκίνο της ουροδόχου κύστης

Χρησιμοποιήσαμε μία τροποποιημένη δοκιμασία γρατσουνιά-πληγή για την αξιολόγηση κυτταρικής μετανάστευσης Τ24 καρκίνου της ουροδόχου κύστης κύτταρα που επιμολύνθηκαν με NTC ή rictor-ειδικό siRNA (Σχήμα 4Α). Το υπόστρωμα ήταν φιμπρονεκτίνης-επικαλυμμένο. Σε κύτταρα επιμολυσμένα με NTC siRNA, σημαντική μετανάστευση παρατηρήθηκε μόνο με την παρουσία του ορού. Rictor ειδικό siRNA ανέστρεψε τα αποτελέσματα του ορού για τη μετανάστευση των κυττάρων. Το Σχήμα 4Β συνοψίζει τα αποτελέσματα του rictor-σιγαστήρα για τη μετανάστευση των κυττάρων Τ24 ως μια συνάρτηση του χρόνου. Στατιστικά σημαντικές μειώσεις στην κυτταρική μετανάστευση συνδέθηκαν με rictor γονίδιο-σίγησης από 10 έως 24 ώρες. Παρόμοια αποτελέσματα ελήφθησαν όταν rictor σίγησε σε κύτταρα J82 και κυτταρική μετανάστευση μελετήθηκε (τα αποτελέσματα δεν φαίνονται).

A

, ασιτία ορού μπλοκάρει J82 κύστη κινητικότητα των καρκινικών κυττάρων. Η προσθήκη του ορού που επάγεται ισχυρή μετανάστευση των κυττάρων J82 που επιμολύνθηκαν με NTC siRNA, όπως προσδιορίζεται χρησιμοποιώντας μία τροποποιημένη δοκιμασία μηδέν. Η μετανάστευση αναστάλθηκε από rictor γονίδιο-αποσιώπηση. μπαρ κλίμακα 100 microns.

B

, ποσοτικοποίηση δείχνει μία μείωση στην απόσταση της μετανάστευσης των κυττάρων που επιμολύνθηκαν με rictor-ειδικό siRNA (□) σε σύγκριση με κύτταρα επιμολυσμένα με NTC siRNA (▲). Επίσης φαίνονται οι κύτταρα που δεν ήταν ορού που διεγείρεται (♦). Ένα σύνολο 6 πλαίσια αναλύθηκαν για κάθε χρονικό σημείο ανά συνθήκη.

C

, μεταξύ φρεατίων εισβολή στο Matrigel επικαλυμμένα με μεμβράνες εμφανίζει υψηλότερους αριθμούς των κακοήθων καρκίνου της ουροδόχου κύστης κύτταρα που εισβάλλουν. D, rictor γονίδιο-αποσιώπηση μειώνει σημαντικά την κυτταρική διείσδυση των τριών κακοήθων κυττάρων της ουροδόχου κύστης γραμμές σε φρεατίων δοκιμασία. (*) Στατιστικά σημαντική σχέση με τη χρήση Student t-test, p & lt?. 0.05)

Η

καρκίνου της ουροδόχου κύστης κυττάρων εισβολής αρχικά μελετήθηκε χρησιμοποιώντας ανασύσταση Matrigel σε θαλάμους Boyden. Κάθε ένα από τα τρία κακοήθεις κυτταρικές σειρές καρκίνου της κύστεως έδειξαν σημαντικά αυξημένη εισβολή μέσω Matrigel, σε σύγκριση με τα μη κακοήθη κύτταρα RT4 (Σχήμα 4C). Rictor γονίδιο-αποσιώπηση μειώθηκε σημαντικά εισβολή από τα κακοήθη καρκινικά κύτταρα κύστης (Σχήμα 4D). Σε J82 κύτταρα, εισβολή αναστάλθηκε κατά περισσότερο από 80%. Η αποτελεσματικότητα των rictor γονιδίου-αποσιώπηση πρότεινε ότι mTORC2 μπορεί να είναι ένας σημαντικός στόχος για την αναστολή εισβολή του καρκίνου της ουροδόχου κύστης.

Ανθρώπινο κύστη τοίχο εισβολή από τον καρκίνο της ουροδόχου κύστης κύτταρα απαιτεί mTORC2

Για να υποστηρίξει περαιτέρω την υπόθεση μας ότι mTORC2 μπορεί να είναι κρίσιμη για τη ρύθμιση της κύστης εισβολή των καρκινικών κυττάρων, έχουμε αναπτύξει μια νέα

ex vivo

μοντέλο σύστημα για τη δοκιμή εισβολή του κανονικού τοιχώματος της ουροδόχου κύστης. Πλήρους πάχους τομές του ενήλικα ανθρώπου κύστη που περιλαμβάνονται lamina propria (LP? Ινοβλαστών-κυρίαρχο του συνδετικού ιστού με τα αιμοφόρα αγγεία), muscularis propria (ΜΡ? Πυκνό δέσμες των λείων μυών) και περι-κυστική λίπος (PV λίπος? Πρωτίστως fibroadipose ιστού και τριχοειδή ) έχουν αγκυροβολημένα σε άγαρ και λούζονται σε μέσο κυτταρικής καλλιέργειας (Σχήμα 5Α). Εμείς σπάρθηκε αυτές τις προετοιμασίες με κύτταρα κακοήθη J82 φθορισμό σημασμένο και αφέθηκε αυτά τα κύτταρα να διαπεράσουν το τοίχωμα της ουροδόχου κύστης για 72 ώρες. κυττάρων J82 που υποβλήθηκαν σε rictor γονίδιο-σίγαση ή έχει υποστεί επεξεργασία με NTC siRNA επίσης εμβολιάστηκαν σχετικά με τις προετοιμασίες τοίχωμα της ουροδόχου κύστης. Εισβάλλοντα κύτταρα ταυτοποιήθηκαν εύκολα με μικροσκόπιο φωτός (Σχήμα 5Β). Ανοσοϊστοχημική χρώση για pancytokeratin (κυτοκερατίνη AE1 /3) επιβεβαιώθηκε ότι τα εισβάλλοντας κύτταρα επιθηλιακής προέλευσης (Σχήμα 5C). Φθορισμού απεικόνιση της εισβολής κυττάρων δείχνεται Σχήμα 5D. Μια σημαντική αύξηση εισβολή παρατηρήθηκε όταν τα κακοήθη κύτταρα J82 συγκρίθηκαν με κύτταρα RT4 (ρ & lt? 0,05? Σχήμα 5Ε). Rictor γονίδιο-φίμωση στα κύτταρα J82 μειωθεί σημαντικά επεμβατική βάθος (Σχήμα 5F), δείχνοντας ουσιαστικό ρόλο για mTORC2 στη ρύθμιση εισβολή των κυττάρων J82 σε μας

ex vivo

σύστημα ανθρώπινο μοντέλο.

Μια

, σχηματική δείχνει τον προσανατολισμό της ανάλυσης εισβολής ανθρώπινου τοίχωμα της ουροδόχου κύστης, που περιλαμβάνει propria lamina (LP), μυϊκή propria (MP) και perivesical λίπος (PV λίπος). B, H & amp? Ενότητα Ε δείχνει την εισβολή κυττάρων J82 στο χόριο μετά από 72 ώρες (κλίμακα bar 200 μικρά)

C

, τα κύτταρα επισημαίνονται στην προηγούμενη οθόνη έδειξε θετική ανοσοχρώση για pancytokeratin (γραμμή κλίμακας 100 microns).

D

, ανοσοφθορισμού λεκέ δείχνει εισβολή κακοηθών κυττάρων J82 (κόκκινο), σε 72 ώρες (γραμμή κλίμακας 50 μικρά).

E

, ποσοτικοποίηση της εισβολής ιστού με RT4 και J82 κύτταρα (μικρά).

F

, rictor γονίδιο-αποσιώπηση αναστέλλει σημαντικά την εισβολή της ουροδόχου κύστης όλα από τα κύτταρα J82. (*) Στατιστικά σημαντική σχέση με τη χρήση Student t-test, p & lt?. 0.05)

Η

Rac1 είναι ένας καθοδικός τελεστής του mTORC2 σε καρκινικά κύτταρα της ουροδόχου κύστης

Στη συνέχεια, εξετάσαμε τις επιδράσεις της rictor γονίδιο-σίγηση στο J82 εξάπλωση των κυττάρων. Τα κύτταρα που επιμολύνθηκαν με NTC siRNA και αφέθηκε να εξαπλωθεί επί φιβρονεκτίνης προέκυψε ευρεία κυτταροπλασματική επεκτάσεις και πεπλατυσμένο μορφολογική εμφάνιση (Σχήμα 6Α). Σε αντίθεση, rictor γονίδιο-σίγηση έδωσε μικρότερες κυψέλες ωοειδής που απέτυχε να εξαπλωθεί. Ποσοτικοποίηση της επιφάνειας που καλύπτεται από προσκολλημένα κύτταρα επιβεβαίωσαν ότι rictor γονίδιο-αποσιώπηση σημαντικά εξασθενημένος εξάπλωση των κυττάρων J82 (Σχήμα 6Β). Χρησιμοποιήσαμε δίπλα J82 κύτταρα για την αξιολόγηση φωσφορυλίωση παξιλλίνη, η οποία ρυθμίζει την εστιακή σχηματισμό πρόσφυσης και του κύκλου εργασιών και μπορούν να ρυθμίζουν το σχηματισμό lamellipodium [23]. Rictor γονίδιο-σίγηση μείωσε το επίπεδο φωσφο-παξιλλίνη σε κακοήθη κύτταρα J82 σε σχέση προς NTC επιμολυσμένων κυττάρων. Ανάλυση της ενεργοποίησης Rac1 σε κύτταρα J82 παρουσίασαν σημαντική μείωση του επιπέδου του GTP-φορτωμένο (ενεργοποιημένη) Rac1 (Rac1-GTP) όταν rictor σίγησε (Σχήμα 6D). Πυκνότητας έδειξε ότι rictor νοκ ντάουν μειωμένα επίπεδα Rac1 σε 60,2% των κυττάρων rictor εκφράζουν. Αντίθετα, GTP-ενεργοποιημένα RhoA ήταν συγκρατημένα μειώθηκε κατά rictor αποσιώπηση, με rictor νοκ ντάουν μείωση της δραστηριότητας RhoA στο 83,3% των κυττάρων rictor εκφράζουν (Σχήμα 6Ε).

κύτταρα J82 είτε επιμολύνθηκαν με rictor ειδικό siRNA ή NTC siRNA 72 ώρες πριν από την έναρξη του πειράματος.

A

, χρώση ανοσοφθορισμού δείχνει ευρεία κυτοπλασμικές διεργασίες και περιφερικό φωσφο-παξιλλίνη σε κύτταρα που επιμολύνονται με NTC siRNA. Αυτό ανάγεται σε κύτταρα με rictor γονίδιο-σίγηση. μπαρ κλίμακα 30 microns.

B

, περιοχές κυτταρικής επιφάνειας προσδιορίστηκαν για J82 κύτταρα επιμολυσμένα με NTC (♦) ή rictor ειδικό siRNA (▲) και αφέθηκε να εξαπλωθεί για τους υποδεικνυόμενους χρόνους (μέση ± SEM, η & gt? 15 για κάθε φορά σημείο? (*) p & lt? 0,05).

C

, ανοσοστύπωμα για φωσφο-παξιλλίνη σε κύτταρα J82 που επιμολύνθηκαν με rictor-ειδικές ή NTC siRNA και αφέθηκαν να προσκολληθούν για 30 λεπτά.

D

, GTP-Rac1 προσδιορίστηκε σε κύτταρα J82 επιμολυσμένα με NTC ή Rictor ειδικό siRNA. Rictor νοκ ντάουν μειωμένα επίπεδα Rac1 σε 60,2% του ελέγχου. Κύτταρα με ΟΤΡγδ αναλύθηκαν ως θετικός μάρτυρας και το ΑΕΠ ως αρνητικός μάρτυρας.

E

, GTP-φορτωμένο RhoA στα κύτταρα J82 επιμολυσμένα με rictor ειδικά ή NTC siRNA. Rictor νοκ ντάουν μειωμένα επίπεδα RhoA στο 83,3% του ελέγχου.

Η

Συζήτηση

Στον καρκίνο της ουροδόχου κύστης, τοπική εισβολή στο muscularis propria (εξωστήρα μυ) είναι ένας σημαντικός καθοριστικός παράγοντας για την πρόγνωση και την επακόλουθη ασθενή θεραπεία. Σηματοδότηση μονοπατιών που είναι μοναδικά εμπλέκονται στην εισβολή των κυττάρων του καρκίνου της ουροδόχου κύστης θα πρέπει να είναι πρωταρχικοί στόχοι για την ανάπτυξη θεραπευτικών. Ωστόσο, περιγράφεται συνήθως γενετική και τη σηματοδότηση αλλοιώσεις στον καρκίνο της ουροδόχου κύστης δεν έχουν εξεταστεί στο πλαίσιο της εισβολής. HG UCA, η οποία αναπτύσσει επεμβατική συμπεριφορά σε μια υποομάδα ασθενών, φιλοξενεί συχνά μεταλλάξεις στο

TP53

και

RB

. Μεταλλάξεις και /ή απώλεια αυτών των ογκογονιδίων έχουν εμπλακεί σε ελαττωματική ρύθμιση του κυτταρικού κύκλου [21]. έχουν μεταβολές στις φωσφατάση και tensin ομόλογο (ΡΤΕΝ) λιπιδίου /πρωτεΐνης φωσφατάσης καταδειχθεί σε περίπου 30% των ασθενών με καρκίνο της ουροδόχου κύστης και περιλαμβάνουν ομόζυγη διαγραφή του γονιδίου, η απώλεια της ετεροζυγωτίας (ΑΕ), και μετάλλαξη γονιδίου [24]. Ωστόσο, η τελική επίδραση του

PTEN

στις κατάντη καταρράκτες σηματοδότησης, όπως mTORC2 στην εισβολή του καρκίνου της ουροδόχου κύστης είναι ασαφής.

Στην παρούσα μελέτη, αποδείξαμε ότι η δραστηριότητα mTORC2 συσχετίζεται με την ανθρώπινη βαθμού και εισβολή καρκίνου της ουροδόχου κύστης. Στο μηχανιστικό επίπεδο, mTORC2 ελέγχει καρκίνου της ουροδόχου κύστης κύτταρο εξάπλωση, η μετανάστευση, και η εισβολή του Matrigel. mTORC2 ρυθμίζει επίσης κύστης εισβολή καρκίνου σε ένα μυθιστόρημα

ex vivo

μοντέλο ανθρώπινης ουροδόχου κύστης που συλλαμβάνει το συγκρότημα μικροπεριβάλλον του τοιχώματος της ουροδόχου κύστης. Η αυξημένη δραστηριότητα αποτελέσματα mTORC2 σε ενεργοποίηση του Rac1, το οποίο είναι γνωστό ότι προάγει την κυτταρική εξάπλωση και τη μετανάστευση [25]. Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι η ενεργοποιημένη mTORC2 μπορεί να αποτελέσει μια κρίσιμη και δυνατότητα στόχευσης στοιχείου σηματοδότησης στην εισβολή του καρκίνου της ουροδόχου κύστης.

mTORC2 αντιπροσωπεύει ένα από τα δύο σκέλη σηματοδότησης του καταρράκτη mTOR. mTORC2 υπάρχει ως ένα σύμπλοκο που περιλαμβάνει mTOR και mLST8 και διακρίνεται από το mTORC1 από την παρουσία rictor, protor και mSIN1 [26]. Σε αντίθεση με το σύμπλοκο mTORC1 που ρυθμίζει μετάφραση σε απόκριση σε θρεπτικούς παράγοντες κατάσταση και την ανάπτυξη, mTORC2 ελέγχει τις διαδικασίες που απαιτούν κυτταροσκελετική νέου μοντελοποίηση, όπως η διάδοση των κυττάρων και τη μετανάστευση. mTORC2 μπορεί να ενεργοποιείται από την ινσουλίνη που διεγείρεται ΡΙ3Κ, η οποία προάγει την ένωση των mTORC2 με ριβοσώματα [27,28]. Η κυκλική μονοφωσφορική αδενοσίνη (cAMP) και την κινάση συνθάση γλυκογόνου-3β αναστέλλουν την ενεργοποίηση mTORC2 [16,29].

Μόλις ενεργοποιηθεί, mTORC2 φωσφορυλιώνει Ser473 στην ΑΚΤ, η οποία έχει προταθεί για τη ρύθμιση της δραστηριότητας ΑΚΤ και σταθερότητας [30]. Τα οικογενειακά Rho ΘΤΡάσες αναφερθεί να λειτουργεί ως μείζον κατάντη δράστες της mTORC2 [10,12,17,31]. μετανάστευση των ουδετερόφιλων προς χημειοελκτικά ρυθμίζεται από mTORC2 από ένα μηχανισμό που περιλαμβάνει MyoII και η ρύθμιση της δραστικότητας RhoA [32]. Στα καρκινικά κύτταρα του παχέος εντέρου, rictor γονίδιο-σίγηση επάγει μεσεγχυματικά-επιθηλιακά μετάβασης (ΜΕΤ) και αναστέλλει κυτταρική κινητικότητα από τις επιδράσεις τόσο RhoA και Rac1 [10]. Ενώ μειωμένη E-cadherin έχει αναφερθεί στις κακοήθεις κυτταρικές σειρές UMUC-3, κυτταρικές σειρές J82 και Τ24 σε σχέση με κύτταρα RT4 [6], knockdown του rictor στο σύστημά μας μοντέλο δεν φαίνεται να αντιστραφεί αυτή φαινότυπο (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται).

Στα πειράματά μας με καρκίνο της ουροδόχου κύστης J82 κύτταρα, rictor γονίδιο-αποσιώπηση σημαντικά μειωμένη ενεργοποίηση Rac1 ενώ έχοντας μια πιο μέτρια επίδραση στην RhoA. Σε πολλά συστήματα κυττάρων, υπάρχουν μονοπάτια για τη ρύθμιση Rac1 και RhoA αμοιβαία [33]. Έτσι, ακόμη και μια μέτρια μείωση στην ενεργοποίηση RhoA σε συνδυασμό με rictor γονίδιο-σίγηση μπορεί να είναι σημαντική στα καρκινικά κύτταρα κύστης. Οι ισχυρές επιδράσεις της rictor σιγαστήρα για την κυτταρική εξάπλωση, η μετανάστευση και εισβολή είναι συνεπείς με τα βιοχημικά αποτελέσματα μας γεγονός που υποδηλώνει ότι Rac1 είναι κύριος στόχος των mTORC2 στον καρκίνο της ουροδόχου κύστης. Ένας περιορισμός είναι ότι rictor downdown μειώνει επίσης ρ-Ser473, η οποία μπορεί να προκληθεί επιπλέον κατάντη αλλαγές στη σηματοδότηση AKT που θα μπορούσαν να επηρεάσουν την εισβολή ανεξάρτητα δραστηριότητας ΟΤΡάσης Rho.

Κατά τη σύγκριση της ενεργοποίησης mTORC2 στον καρκίνο της ουροδόχου κύστης κυτταρικές γραμμές, βρήκαμε ότι UMUC-3 κύτταρα ήταν μοναδικά στο εν λόγω ανιχνεύσιμο ρ-Ser473 ήταν παρούσα ακόμη και εν απουσία ορού. Η αύξηση του βασικού επιπέδου της ρ-Ser473 σε UMUC-3 κύτταρα πιθανότατα αντανακλά το ομόζυγο μηδενική διαγραφή του

ΡΤΕΝ

σε αυτά τα κύτταρα [9,34], εξαλείφοντας ένα σημαντικό καταστολέα της σηματοδότησης mTOR. UMUC-3 κύτταρα μπορεί να αντιπροσωπεύει ένα μοντέλο για τον καρκίνο της ουροδόχου κύστης κύτταρα στα οποία

ΡΤΕΝ

είναι μεταλλαγμένο. Καρκίνοι με

ΡΤΕΝ

εξάλειψη ή μετάλλαξη είναι συχνά ανθεκτικά σε στοχευμένες αντικαρκινικούς παράγοντες που λειτουργούν ανάντι του ΡΤΕΝ όπως αυτές έναντι υποδοχέα επιδερμικού αυξητικού παράγοντα [35]. Τα κύτταρα Τ24 και J82 μπορεί να προτιμώνται μοντέλα για καρκίνο της ουροδόχου κύστης που συμβαίνει εν τη απουσία του

ΡΤΕΝ

μετάλλαξη. Αυτά τα κύτταρα απέδειξαν ουσιαστικά μη ανιχνεύσιμα επίπεδα του Ρ-Ser473 απουσία ορού και ισχυρή διέγερση της δραστικότητας mTORC2 όταν προστέθηκε ορός.

Η συμμετοχή της Rac1 ως ένα σημαντικό κατάντη στόχος της mTORC2 στη ρύθμιση της εισβολής του καρκίνου της ουροδόχου κύστης μπορεί να συνδέσει μια σειρά από πρόσφατα ευρήματα στη βιβλιογραφία. Μια μελέτη έδειξε ότι Rac1 ρυθμίζει τον καρκίνο της ουροδόχου κύστης εισβολή των κυττάρων και την αναδιοργάνωση της ακτίνης κατάντη της ιντεγκρίνης που συνδέονται με κινάση (ILK) [36]. Μια άλλη ομάδα ανέφερε ότι rictor μπορούν να αλληλεπιδρούν φυσικά με ILK [37] για να διεγείρει φωσφορυλίωση της ΑΚΤ σε Ser473, η οποία αντιπροσωπεύει μια mTORC2 συγκεκριμένη υπογραφή. Rac1 έχει αναφερθεί ότι αλληλεπιδρά άμεσα με mTOR σε GTP-ανεξάρτητο τρόπο [38].

Εν κατακλείδι, οι μελέτες μας δείχνουν ότι mTORC2 είναι ένας κρίσιμος ρυθμιστής της μετανάστευσης καρκίνου της ουροδόχου κύστης και της εισβολής, με αποτελέσματα που προκαλούνται κυρίως μέσω Rac1.