Αφηρημένο

Ιστορικό

πνεύμονα όγκοι είναι η κύρια αιτία των θανάτων από καρκίνο σε όλο τον κόσμο και πακλιταξέλη έχει αποδειχθεί ότι είναι χρήσιμη σε ασθενείς με καρκίνο του πνεύμονα, ωστόσο, επίκτητη αντίσταση είναι ένα σημαντικό πρόβλημα. Για να ξεπεραστεί αυτό το πρόβλημα, μία πολλά υποσχόμενη επιλογή είναι η χρήση του Συγκρότησης ανδροστανίου Receptor (CAR) συνδέτες σε συνδυασμό με χημειοθεραπευτικά ενάντια στα καρκινικά κύτταρα. Ως εκ τούτου, θέλουμε να διαφωτίσει τις συνέπειες των υποκαταστατών CAR για την αντινεοπλασματική αποτελεσματικότητα του paclitaxel σε καρκινικά κύτταρα του πνεύμονα.

Μεθοδολογία /Κύρια Ευρήματα

Τα αποτελέσματα από δοκιμασίες κυτταρικής βιωσιμότητας εκθέτοντας αγωνιστή αυτοκίνητο ή inverse- αγωνιστή προς ποντικού και ανθρώπου κύτταρα καρκίνου του πνεύμονα διαμορφωμένου την αντινεοπλασματική δράση της πακλιταξέλης. Οι αγωνιστές CAR αύξησε την επίδραση της πακλιταξέλης σε 6 κυτταρικών σειρών καρκίνου του πνεύμονα 7, ενώ το αντίστροφο αγωνιστή είχε καμία επίδραση στην πακλιταξέλη κυτταροτοξικότητα. Είναι ενδιαφέρον ότι η MCAR αγωνιστής TCPOBOP ενίσχυσε την έκφραση δύο γονιδίων καταστολής όγκων, δηλαδή WT1 και MGMT, τα οποία προσθετικά ενισχυμένη σε κύτταρα κατεργασμένα με αγωνιστή CAR σε συνδυασμό με πακλιταξέλη. Επίσης,

in silico

ανάλυση έδειξε ότι τόσο η πακλιταξέλη και αγωνιστή CAR TCPOBOP αγκυροβολημένο στη δομή οποίο πρόκει- ται, αλλά δεν το androstenol αντίστροφος αγωνιστής. Η πακλιταξέλη per se αυξάνει την έκφραση του CAR σε καρκινικά κύτταρα. Επιτέλους, αναλύσαμε την έκφραση του αυτοκινήτου σε δύο δημόσια ανεξάρτητες μελέτες από τον καρκίνο Genome Atlas (TCGA) της μη μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα (NSCLC). CAR εκφράζεται σε διάφορα επίπεδα στα δείγματα NSCLC και καμία συσχέτιση με τη συνολική επιβίωση παρατηρήθηκε.

Συμπεράσματα /Σημασία

Στο σύνολό τους, τα αποτελέσματά μας έδειξαν ότι οι αγωνιστές CAR διαμορφώνουν την αντινεοπλασματική αποτελεσματικότητα της πακλιταξέλης στο ποντίκι και ανθρώπινων καρκινικών κυτταρικών σειρών. Αυτή η επίδραση πιθανότατα σχετίζεται με την αυξημένη έκφραση δύο γονιδίων καταστολής όγκων, δηλ. WT1 και MGMT. Οι περισσότερες των περιπτώσεων NSCLC παρούσας γονιδιακής έκφρασης CAR μετατρέποντας τη δυνατότητα να κερδοσκοπούν με τη χρήση της διαμόρφωσης CAR από συνδέτες μαζί με πακλιταξέλη στη θεραπεία NSCLC

Παράθεση:. Fukumasu Η Rochetti AL, Pires PRL, Silva ER, Mesquita LG, Strefezzi RF, et al. (2014) Συστατική ανδρο Receptor Ligands κανονίζει την αντι-όγκου αποτελεσματικότητα της πακλιταξέλης σε μη-μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα κύτταρα. PLoS ONE 9 (6): e99484. doi: 10.1371 /journal.pone.0099484

Επιμέλεια: Ruby John Άντο, Rajiv Gandhi Κέντρο Βιοτεχνολογίας, Ινδία

Ελήφθη: 6, Αύγ, 2013? Αποδεκτές: 15 Μάη, 2014? Δημοσιεύθηκε: 24, Ιουνίου, 2014

Copyright: © 2014 Fukumasu et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Οι συγγραφείς χάρη Fundação de Apoio ένα Pesquisa κάνει Estado de São Paulo (FAPESP) για τη χρηματοδοτική στήριξη (διαδικασία αριθμοί:. 2008/56584 – 2? 2009/11081-6? 2010/00535-3? 2010/05650 – 5? 2011 /05690- 0. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

όγκοι Εισαγωγή

πνεύμονα είναι η κύρια αιτία των θανάτων από καρκίνο σε όλο τον κόσμο, και είναι υπεύθυνη για περίπου 1,2 εκατομμύρια θανάτους ετησίως [1]. κατά τα τελευταία 30 χρόνια, αρκετές πρόοδοι στη θεραπεία του καρκίνου του πνεύμονα έχουν προκύψει με το βελτίωση της ανοσοθεραπείας, ακτινοθεραπεία και χημειοθεραπεία, όμως το κέρδος στο χρόνο επιβίωσης των ασθενών με καρκίνο του πνεύμονα συνεχίζουν να είναι μέτρια [2]. Η θεραπεία για τον καρκίνο του πνεύμονα εξαρτάται από τον ιστολογικός τύπος, η παρουσία της μετάστασης και κατάσταση απόδοσης του ασθενούς. Οι πιο κοινές προσεγγίσεις θεραπείας περιλαμβάνουν ένα συνδυασμό χειρουργικής επέμβασης (όταν οι όγκοι είναι χειρουργήσιμη), ακτινοθεραπεία και χημειοθεραπεία. Όσον αφορά το τελευταίο, η χρήση ενός ή περισσοτέρων κυτταροτοξικών φαρμάκων κατά την ίδια στιγμή, όπως οι ταξάνες, οι ενώσεις πλατίνας, και /ή αναλόγων νουκλεοσιδίων είναι η πιο κοινή. Γενικά, χημειοθεραπεία πρώτης γραμμής για προχωρημένο μη μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα (NSCLC) χρησιμοποιεί ένα πρωτόκολλο με ένα ταξάνιο (paclitaxel ή docetaxel) που σχετίζεται με cisplatin ή γεμσιταβίνη [3].

Καρκίνοι συνήθως παρόν σαν ένας ετερογενής πληθυσμός κακοήθων κυττάρων, με κάποια που είναι ευαίσθητα σε φάρμακο και μερικά που είναι ανθεκτικά στα φάρμακα. Κυτταροτοξική χημειοθεραπεία σκοτώνει ευαίσθητα σε φάρμακο κύτταρα, αλλά δεν επηρεάζει ανθεκτικών στα φάρμακα κυττάρων που είναι γενικά σε λανθάνουσα κατάσταση [4]. Καθώς ο όγκος αρχίζει να αυξάνεται και πάλι, η χημειοθεραπεία συχνά αποτυγχάνει επειδή τα υπόλοιπα κύτταρα του όγκου είναι κυρίως ανθεκτικά στα φάρμακα [5]. Η πακλιταξέλη, ένα ευρέως χρησιμοποιούμενο αντινεοπλασικό φάρμακο για τον καρκίνο του πνεύμονα, είναι ένας παράγοντας σύνδεσης τουμπουλίνης που μπλοκάρει την εξέλιξη της μίτωσης που τελικά οδηγεί σε κυτταρικό θάνατο με απόπτωση [3]. Αυτό ταξάνη έχει αποδειχθεί ότι είναι ένα χρήσιμο φάρμακο για ασθενείς με καρκίνο του πνεύμονα? Ωστόσο, όπως και με άλλα χημειοθεραπευτικά φάρμακα, επίκτητη αντίσταση από τα καρκινικά κύτταρα παρατηρείται συνήθως.

Ως εκ τούτου, η αύξηση της αποτελεσματικότητας του paclitaxel είναι ιδιαίτερα επιθυμητή. Chen

et al

. [6] θεωρείται μια πολλά υποσχόμενη εναλλακτική δυνατότητα που περιλαμβάνει τη χρήση του CAR (Καταστατική ανδρο Receptor, NR1I3) και PXR (υποδοχέας πρεγνανο-X, NR1I2) συνδετήρες σε συνδυασμό με χημειοθεραπευτικά που ενεργοποιούν PXR και ΑΥΤΟΚΙΝΗΤΟΥ να ξεπεράσει, ή τουλάχιστον να μετριάσει την αντίσταση σε πολλαπλά φάρμακα (MDR) σε καρκινικά κύτταρα. Είναι ενδιαφέρον ότι, η πακλιταξέλη είναι ένας ισχυρός ενεργοποιητής PXR και επαγωγέας της P-gp μεσολάβηση κάθαρση του φαρμάκου [7]. Επιπλέον, τα διάφορα χημειοθεραπευτικά φάρμακα διαμορφώνονται ή μεταβολίζονται από το ένζυμο του κυτοχρώματος P450 CYP3A4 [8], ένα γνωστό μεταγραφικός στόχος των ενεργοποιημένων PXR και ΑΥΤΟΚΙΝΗΤΟΥ [9], [10].

CAR και PXR είναι στεροειδών των πυρηνικών υποδοχέων γνωστή ως κύριος xenosensors [11] που είναι ικανά να αναγνωρίζουν δομικά διαφορετικών ενώσεων [12]. Αμφότεροι οι υποδοχείς, όταν ενεργοποιείται από προσδέματα, μετατοπίζονται στον πυρήνα και επάγουν τη μεταγραφή αρκετών γονιδίων που εμπλέκονται στο μεταβολισμό των φαρμάκων και της απέκκρισης, το μεταβολισμό της γλυκόζης και των λιπιδίων και ορμονική ρύθμιση [13], [14]. Πρόσφατα, η σημασία της PXR στην παθογένεση του καρκίνου και των όγκων MDR υπήρξε θέμα συζήτησης, αλλά όχι συναίνεση σχετικά με τον ειδικό ρόλο του έχει επιτευχθεί μέχρι σήμερα [15], [16]. Παρόμοια με PXR, ο ρόλος του CAR στον καρκίνο είναι επίσης αμφιλεγόμενη. Από το ένα χέρι, CAR προσδιορίσθηκε να είναι απαραίτητη για την προώθηση του ήπατος όγκου με Φαινοβαρβιτάλη [17], [18], και από την άλλη CAR χέρι δείχθηκε να είναι ένα νέο θεραπευτικό στόχο για τον εγκέφαλο και αιματοποιητικούς όγκους [19], [20 ]. Ως εκ τούτου, στόχος μας ήταν να διευκρινισθεί η σημασία της διαφοροποίησης CAR με επιλεκτική συνδετών και για τον προσδιορισμό των κατάντη επιδράσεις στην αντινεοπλασματικών αποτελεσματικότητα ενός από τα πιο κοινά χρησιμοποιούμενων χημειοθεραπευτικών φαρμάκων για τον καρκίνο του πνεύμονα.

Υλικό και Μέθοδοι

Αντιδραστήρια και κυτταρικές σειρές

Η πακλιταξέλη, CITCO, TCPOBOP, androstenol και ΜΤΤ ελήφθησαν από την Sigma-Aldrich (St. Louis, ΜΟ, USA). Media και αντιδραστήρια για την καλλιέργεια κυττάρων αποκτήθηκαν από την Invitrogen (Carlsbad, CA, USA). ΤπζοΙ, ολιγοΤ αστάρια, ένζυμο Superscript II και η δύναμη SYBR Green βασικού μείγματος ήταν από την Life Technologies (Grand Island, Νέα Υόρκη, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής). Άλλα αντιδραστήρια ήταν αναλυτικής ποιότητας. Οι κυτταρικές σειρές που χρησιμοποιούνται σε αυτό το πείραμα ήταν το κυτταρική γραμμή ποντικού Ε9 [21] και τις κυτταρικές γραμμές Α549 ανθρώπινα, H2023, Η460, H2030, H1792 και Η23 [22]. Όλες αυτές οι κυτταρικές γραμμές ήταν ένα δώρο από τον Dr. Μ Lucy Anderson από το Εργαστήριο Συγκριτικής Καρκινογένεσης στο Εθνικό Εργαστήριο Frederick Cancer Research για (Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής).

πειράματα κυττάρων με το ποντίκι και καρκινικών κυττάρων ανθρώπινου πνεύμονα γραμμές

Ποντίκια πνεύμονα κυτταρική σειρά καρκίνου Ε9 προήλθε από αυθόρμητες μετασχηματισμό των αθανατοποιημένων μη νεοπλαστικά επιθηλιακά κύτταρα πνεύμονα απομονώθηκαν από το ποντίκι BALB /c [23]. Αυτά τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε CMRL 1066 μέσο (Invitrogen, New York, ΝΥ), συμπληρωμένο με 10% ορό εμβρύου μόσχου (Invitrogen), 200 mM L-γλουταμίνη (Invitrogen) και αντιβιοτικών (100 μονάδες /ml πενικιλλίνη και 100 mg /mL στρεπτομυκίνη? Invitrogen) σε υγροποιημένο επωαστή στους 37 ° C και 7% CO

2. Ανθρώπινες κυτταρικές σειρές καρκίνου του πνεύμονα αναπτύχθηκαν σε RPMI 1640 (Invitrogen, New York, ΝΥ), με 10% εμβρυϊκό βόειο ορό (Invitrogen) συν 2% Ε-γλουταμίνη (Invitrogen) και 1% Pen-strep (Invitrogen) σε υγροποιημένο επωαστή στους 37 ° C και 5% CO

2.

Προσδιορισμός MCAR συνδετήρων επιδράσεις στη βιωσιμότητα των κυττάρων.

κύτταρα Ε9 σπάρθηκαν σε 2000 /φρεάτιο σε πλάκες 96 φρεατίων (Corning, ΗΠΑ ) που περιέχει 100 μΙ συμπληρωμένου μέσου όπως περιγράφεται. Μετά από 24 ώρες, μέσα μαζικής ενημέρωσης πήρε εξιτήριο και να αλλάξει με τα νέα μέσα προστεθεί με διαφορετικές συγκεντρώσεις αγωνιστή CAR (TCPOBOP) ή το αυτοκίνητο αντίστροφο αγωνιστή (androstenol) από 10

-4 μΜ έως 10 μΜ. Σαράντα οκτώ ώρες αργότερα, 11 μΐ 3- (4,5-διμεθυλθειαζολ-2-υλ) -2,5-διφαινυλ τετραζόλιο (ΜΤΤ – 5 mg /mL) προστέθηκε σε κάθε πηγάδι και οι κρύσταλλοι φορμαζάνης παρήχθησαν πάνω από ένα 2 ώρες περίοδο επώασης. Το μέσο απομακρύνθηκε από κάθε φρεάτιο και 100 μΐ 0,4Ν HCl σε ισοπροπυλική αλκοόλη προστέθηκαν για να διαλυθεί κρυστάλλων. Η οπτική πυκνότητα στα 540 nm μετρήθηκε σε ένα Fluorstar Optima (BMG Labtech, Germany).

Προσδιορισμός ήμισυ της μέγιστης ανασταλτικής συγκέντρωσης του Paclitaxel (IC50).

κύτταρα Ε9 χρησιμοποιήθηκαν με το ίδιο πρωτόκολλο που περιγράφεται παραπάνω με συγκεντρώσεις από 1 ηΜ έως 1600 ηΜ πακλιταξέλης.

Αξιολόγηση των αποτελεσμάτων της MCAR συνδετήρες επί πακλιταξέλη κυτταροτοξικότητα.

κύτταρα Ε9 χρησιμοποιήθηκαν με το ίδιο πρωτόκολλο που περιγράφεται παραπάνω, όπου συνδετήρες προστίθενται ταυτόχρονα με την IC50 του paclitaxel και η βιωσιμότητα των κυττάρων αξιολογήθηκε όπως περιγράφεται.

Προσδιορισμός προσδεμάτων HCAR αποτελέσματα επί της βιωσιμότητας των κυττάρων, τον υπολογισμό του IC50 του paclitaxel και από κοινού έκθεση πειράματα.

Όλα αυτά πειράματα χρησιμοποιώντας ανθρώπινες κυτταρικές γραμμές καρκίνου διεξήχθησαν όπως περιγράφεται για το ποντίκι Ε9 καρκινικά κύτταρα με ειδικές συνθήκες για καλλιέργεια κυττάρων, όπως περιγράφεται.

ανάλυση

η γονιδιακή έκφραση του MCAR

κύτταρα Ε9 σπάρθηκαν σε 3,10

5 κύτταρα /πλάκα σε πλάκες Τ25 (Corning, USA) υπό τις ίδιες συνθήκες που περιγράφονται παραπάνω με την προσθήκη TCPOBOP (10 μΜ), androstenol (10 μΜ), TCPOBOP (10 μΜ) συν Paclitaxel (IC50), androstenol (10 μΜ) συν πακλιταξέλη (IC50) ή DMSO μόνο για τον έλεγχο. Ολικό RNA εκχυλίστηκε από πέντε επαναλήψεις της κάθε κατεργασίας και ελέγχων με ΤπζοΙ σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Τα δείγματα του RNA στη συνέχεια ποσοτικοποιούνται (Biophotometer, Eppendorf, Γερμανία) και παρατηρήθηκε η αναλογία 260/280. Μόνο δείγματα τα οποία παρουσιάζονται 1.7-2.0 και επέδειξε καλή ποιότητα (δεν διασπάται) μετά την ανάλυση με ηλεκτροφόρηση σε μια γέλη αγαρόζης (1,5%, Τρις-ρυθμιστικό αλατούχο διάλυμα) χρησιμοποιήθηκαν. Έτσι, 1 μg ολικού RNA μεταγράφηκε αντίστροφα με εκκινητές oligodT και Superscript II σε cDNA. Όλοι οι εκκινητές σχεδιάστηκαν με Primer-3 λογισμικού [24] και έτρεξαν στο BLAST [25] για να επαληθεύσει την απουσία των τοπικών ευθυγραμμίσεις με το DNA και άλλες ακολουθίες μεταγραφής RNA του ποντικιού. Ισχύς SYBR Green χρησιμοποιήθηκε για πραγματικού χρόνου PCR με εκκινητές για MCAR (NM_009803.5? F: 5′-GGGCCTCTTTGCTACAAGAT-3 ‘? R: 5′-AGGTTTTTATGGAAGTGGAGGA-3′). Το γονίδιο οικοκυρική που χρησιμοποιήθηκε ήταν η 18 s ριβοσωμικό RNA (NR_003278.3? F: 5’-CCTGCGGCTTAATTTGACTC-3 ‘? R: 5′-CTGTCAATCCTGTCCGTGTC-3’). Οι αντιδράσεις διεξήχθησαν σε ένα ΑΒΙ Prism 7500 θερμοκυκλοποιητή (τεχνολογίες Life, Grand Island, ΝΥ, USA) με το αντιδραστήριο πράσινο Master Mix Ισχύς SYBR και την ανάλυση των σχετικών δεδομένων γονιδιακής έκφρασης πραγματοποιήθηκε σύμφωνα με Delta-Delta-CT μέθοδο [26 ].

array PCR RT

2 profiler ανάλυση

Το RT

2 Profiler ποντίκι ογκογονίδια και τα ογκοκατασταλτικά γονίδια PCR array (PAMM-502Z, SABiosciences, USA), που περιέχει 84 γονίδια που προάγουν την ογκογένεση, συν οικοκυρική γονιδίων και των ελέγχων, χρησιμοποιήθηκε για να αναλυθούν τα αποτελέσματα της TCPOBOP συν γονιδιακής έκφρασης Paclitaxel που σχετίζονται με κύτταρα Ε9. Τα κύτταρα σπάρθηκαν και υποβλήθηκε σε επεξεργασία όπως περιγράφηκε παραπάνω, το συνολικό RNA εκχυλίστηκε με το RNeasy Mini Kit (Qiagen, USA) και τρεις επαναλήψεις ανά αγωγή, όπου συγκεντρώνονται για την ανάλυση (πείραμα εκτελέστηκε εις διπλούν). Ομαδοποιημένα RNA μεταγράφηκε αντίστροφα με το κιτ First Strand (SABiosciences), σε συνδυασμό με το SYBR Green /ROX PCR κύριο μείγμα (SABiosciences), και προστέθηκαν σε κάθε φρεάτιο της πλάκας RT2 Profiler PCR, που περιέχει το προ-διανέμεται έναυσμα ειδικού γονιδίου σκηνικά. Η αντίδραση διεξήχθη σε έναν ΑΒΙ Prism 7500 θερμοκυκλοποιητή. Η ανάλυση των δεδομένων με βάση τη μέθοδο Ct, με κανονικοποίηση προς τέσσερα διαφορετικά γονίδια καθαριότητας. Διπλώστε αλλαγές 2Χ (προς τα πάνω ή προς τα κάτω ρύθμιση) θεωρήθηκαν για ανάλυση.

Στο silico

ανάλυση για ελλιμενισμό των υποκαταστατών MCAR και paclitaxel στη δομή MCAR

Υπολογιστική ανάλυση διεξήχθη χρησιμοποιώντας την κρυσταλλική δομή του υποδοχέα CAR συν-κρυσταλλώνεται με androstenol (pdb 1XNX) [27] και TCPOBOP (pdb 1XLS) [28]. στόχος Υποδοχέα και βάση σύνδεσης συνδετήρες παρασκευάστηκαν χρησιμοποιώντας Χίμαιρα [29]. Η μοριακή επιφάνεια του στόχου παρήχθη με βάση την ανάπτυξη αλγορίθμου [30]. Σφαίρα παραγωγή πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας τον αλγόριθμο sphgen? οι σφαίρες διανεμήθηκαν με dock6 και επιλέγονται με τη χρήση «spheres_selector». γενιά πλέγμα επιτεύχθηκε με τη χρήση πλέγματος, το οποίο διανέμεται ως εξάρτημα να δέσει [31]. Ευέλικτη Dock χρησιμοποιήθηκε για να ελέγξει τις αλληλεπιδράσεις μεταξύ του υποδοχέα CAR-στόχο και τις χημικές ουσίες [32]. Τα αποτελέσματα που προκύπτουν από το docking έγιναν ορατά και αναλύθηκαν για Χίμαιρα έκδοση 1.4.1 (build 30365).

cBioPortal ανάλυση των συνόλων δεδομένων Καρκίνου Γονιδιώματος Atlas

cBioPortal, ένα εργαλείο που αναπτύχθηκε από το Κέντρο Βιολογίας Υπολογισμοί στο Sloan Kettering, είχε πρόσβαση σε https://www.cbioportal.org/public-portal/[33], [34]. Δύο σύνολα δεδομένων χρησιμοποιήθηκαν σε αυτή την εργασία: «αδενοκαρκίνωμα πνεύμονα (TCGA, in press)» με 230 περιπτώσεις και το «Lung Πλακώδες καρκίνωμα (TCGA, προσωρινό)» με 489 περιπτώσεις κατά το χρόνο της ανάλυσης, Μάρτιος 2014. Αμφότερες οι μελέτες ήταν χρησιμοποιούνται για την αξιολόγηση της παρουσίας των μεταλλάξεων του γονιδίου και αριθμό αντιγράφων αλλοιώσεις (CNA) απεικονίζεται με «oncoprints», αλλοιωμένη έκφραση mRNA και /ή DNA μεθυλίωση και η συνολική επιβίωση καμπύλες εντός αυτών των μεταβολών. Για να προσδιορίσετε ποια δείγματος παρουσίασε τροποποιημένη γονιδιακή έκφραση το Z-score ορίστηκε στο 1,96.

Η στατιστική ανάλυση

Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως μέση τιμή ± τυπική απόκλιση, εκτός αν αναφέρεται διαφορετικά. Graphpad Prism 5 για Windows (Graphpad Software, USA) χρησιμοποιήθηκε για όλες τις στατιστικές αναλύσεις πραγματοποιήθηκαν με μη παραμετρικές δοκιμές ως Mann-Whitney και Spearman. Αμφίδρομη ANOVA χρησιμοποιήθηκε για συγκρίσεις μεταξύ διαφορετικών επιδράσεων προσδεμάτων στη βιωσιμότητα των κυττάρων. Η συνολική επιβίωση από τα δεδομένα TCGA εκτιμήθηκαν με καμπύλες Kaplan-Meier και p-τιμές Logrank από την cBioPortal για τον Καρκίνο Genomics [33], [34]. Σημαντικές διαφορές θεωρήθηκαν όταν p & lt?. 0.05

Αποτελέσματα

Οι συνδέτες αυτοκίνητο δεν κυτταροτοξική για το ποντίκι ή τα ανθρώπινα καρκινικά κύτταρα του πνεύμονα

Αρχικά, αξιολογήσαμε τα κυτταροτοξικά αποτελέσματα της MCAR συνδέτες, συμπεριλαμβανομένου του αγωνιστή TCPOBOP και το αντίστροφο androstenol αγωνιστή, για τον καρκίνο του πνεύμονα κύτταρα Ε9 ποντικού. Η έκθεση σε TCPOBOP για 48 ώρες δεν είχε καμία επίδραση στη βιωσιμότητα του κυττάρου Ε9 ακόμη και σε υψηλή συγκέντρωση (Σχήμα 1). Από την άλλη πλευρά, η αντίστροφο αγωνιστή androstenol προκάλεσε μια δοσοεξαρτώμενη αύξηση του πολλαπλασιασμού των κυττάρων, με πάνω από το 60% των κυττάρων από την ομάδα ελέγχου στην υψηλή συγκέντρωση (ρ & lt? 0,0001? Εικ. 1). Αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι η χρήση των αγωνιστών MCAR σε καρκινικά κύτταρα ποντικού μπορεί να οδηγήσει σε διαφορετικά αποτελέσματα στην βιωσιμότητα των κυττάρων, ακόμη και αυξάνοντας τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων όπως παρατηρείται για androstenol.

(Α) Η βιωσιμότητα των κυττάρων μετά από 48 ώρες διαφορετικών συγκεντρώσεων της MCAR αγωνιστή TCPOBOP ή το οποίο πρόκει- ται αντίστροφο αγωνιστή androstenol. TCPOBOP δεν έχει καμία επίδραση στη βιωσιμότητα των κυττάρων, ακόμη και στην υψηλότερη συγκέντρωση. Από την άλλη πλευρά, androstenol αυξάνει ο αριθμός των καρκινικών κυττάρων Ε9 δοσοεξαρτώμενο (* ρ & lt? 0,05 – Αμφίδρομο ANOVA που ακολουθήθηκε από το τεστ πολλαπλής σύγκρισης του Tukey για την επίδραση της θεραπείας). (Β) Επίδραση της MCAR συνδετήρων σχετικά με την αποτελεσματικότητα κατά του όγκου της πακλιταξέλης (IC50). TCPOBOP αυξάνει την αποτελεσματικότητα κατά του όγκου της πακλιταξέλης με σημαντική μείωση κυτταρικής βιωσιμότητας στο 1-10 μΜ σε σύγκριση με μόνο κύτταρα που έλαβαν θεραπεία με paclitaxel (ρ & lt? 0,05 – Αμφίδρομο ANOVA που ακολουθήθηκε από το τεστ πολλαπλής σύγκρισης του Tukey για την επίδραση της θεραπείας). Η androstenol καταργεί εν μέρει την αποτελεσματικότητα κατά του όγκου της πακλιταξέλης (ρ & lt? 0,05 – Αμφίδρομο ANOVA που ακολουθήθηκε από το τεστ πολλαπλής σύγκρισης του Tukey για την επίδραση της θεραπείας). (C) Gene έκφραση MCAR σε κύτταρα κατεργασμένα με συνδετήρες μόνο, paclitaxel μόνο του, ή σε συνδυασμό. Συνδέτες δεν μετέβαλε την έκφραση του γονιδίου το οποίο πρόκει- ται. Σημειώστε ότι όλα τα κατεργασμένα ομάδες paclitaxel παρουσίασε αυξημένη γονιδιακή έκφραση MCAR σε σύγκριση με την ομάδα ελέγχου (* ρ & lt? 0,05 – Ένας τρόπος ANOVA).

Η

Στη συνέχεια, εκτελέσαμε παρόμοια πειράματα σε έξι κυτταρικών γραμμών καρκίνου πνεύμονα ανθρώπου. Δοκιμάσαμε εάν η συγκεκριμένη αγωνιστής των ανθρωπίνων CAR, CITCO, και το αντίστροφο androstenol αγωνιστή, παρουσίασε κάποια κυτταροτοξικά αποτελέσματα σε αυτές τις κυτταρικές σειρές. Καμία επίδραση παρατηρήθηκε για CITCO ή androstenol ακόμη και στην υψηλότερη συγκέντρωση που δοκιμάστηκε (ρ & gt?. 0.05 για όλες τις κυτταρικές σειρές, Σχήμα S1).

Οι αγωνιστές CAR TCPOBOP και CITCO ενισχύσει την αντινεοπλαστική αποτελεσματικότητα της πακλιταξέλης σε ποντικού και ανθρώπου πνεύμονα καρκινικά κύτταρα

η υπόθεσή μας ήταν ότι η διαφοροποίηση CAR με συνδέτες της θα μπορούσε να μεταβάλλει την αποτελεσματικότητα κατά του όγκου της πακλιταξέλης, ένας αντινεοπλασματικός παράγοντας που χρησιμοποιείται συνήθως για τη χημειοθεραπεία του καρκίνου του πνεύμονα στους ανθρώπους. Πρώτον, προσδιορίσαμε την συγκέντρωση του paclitaxel που ανέστειλε το 50% της βιωσιμότητας των κυττάρων για κάθε κυτταρική σειρά (IC50, Πίνακας 1). Χρησιμοποιώντας αυτή τη συγκέντρωση, αξιολογήσαμε την επόμενη τις επιδράσεις των αγωνιστών CAR για την επίδραση κατά των όγκων των Paclitaxel με έκθεση των καρκινικών κυττάρων σε πακλιταξέλη συν διαφορετικές συγκεντρώσεις ενός αγωνιστή CAR ή αντίστροφο αγωνιστή.

Η

Όταν συνεργάζονται εκτιθέμενα πνεύμονα ποντικού κύτταρα καρκίνου σε διαφορετικές συγκεντρώσεις TCPOBOP συν paclitaxel στην ανασταλτική συγκέντρωση (IC50), ο αγωνιστής CAR βελτιωμένη paclitaxel αντικαρκινική αποτελεσματικότητα δοσοεξαρτώμενο, μειώνοντας την κυτταρική βιωσιμότητα κατά 40% περίπου σε σύγκριση με εκείνη στα κύτταρα τα επεξεργασμένα με πακλιταξέλη μόνο του (ρ & lt? 0,05? Εικ. 1). Από την άλλη πλευρά, ο αντίστροφος αγωνιστής androstenol μείωσε τις κυτταροτοξικές επιδράσεις της πακλιταξέλης σε κύτταρα Ε9 (ρ & lt? 0,05? Εικ. 1). Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι η ειδική διαμόρφωση του CAR από το TCPOBOP αγωνιστή βελτιώνει την αποτελεσματικότητα κατά του όγκου της πακλιταξέλης σε καρκινικά κύτταρα Ε9.

Πραγματοποιήσαμε αυτό το πείραμα σε έξι ανθρώπινες κυτταρικές σειρές καρκίνου του πνεύμονα, όπου ο συν-έκθεση ανθρώπινων CAR συνδετήρες αξιολογήθηκε για την επίδρασή της επί της κυτταροτοξικότητας της πακλιταξέλης. Ο αγωνιστής CAR CITCO σημαντικά ενισχυμένη αποτελεσματικότητα paclitaxel σε πέντε από τα έξι καρκινικών κυττάρων ανθρώπινου πνεύμονα δοκιμάστηκαν (ρ & lt? 0,05? Εικ. 2). Από την άλλη πλευρά, η CAR αντίστροφο αγωνιστή androstenol δεν οδήγησε σε σημαντικές διαφορές σε οποιεσδήποτε κυτταρικές σειρές (ρ & gt? 0,05? Εικ. 2). Αυτά τα αποτελέσματα καταδεικνύουν ότι οι αγωνιστές CAR ενισχύσει την αντινεοπλαστική δράση της πακλιταξέλης στην πλειονότητα των κυτταρικών σειρών καρκίνου του πνεύμονα (ποντίκι και άνθρωπο), που τους καθιστά μια ενδιαφέρουσα εστίαση για περαιτέρω χαρακτηρισμό.

Η βιωσιμότητα των κυττάρων μετά από 48-αγωνιστή σε συνδυασμό androstenol με πακλιταξέλη. CITCO ενισχύει paclitaxel κυτταροτοξικότητα σημαντικά σε πέντε από έξι κυτταρικές γραμμές (* ρ & lt? 0,05 – Αμφίδρομο ANOVA που ακολουθήθηκε από το τεστ πολλαπλής σύγκρισης του Tukey για την επίδραση της θεραπείας). Από την άλλη πλευρά, androstenol σε συνδυασμό με πακλιταξέλη δεν έχει καμία επίδραση σε σύγκριση με τα κύτταρα πακλιταξέλη φάρμακο.

Η

Η πακλιταξέλη ενισχύει την έκφραση MCAR

επόμενο αξιολογήθηκαν ανεξάρτητα αν η πακλιταξέλη αλλοιωμένη έκφραση γονιδίου MCAR. Για το σκοπό αυτό, εκθέσαμε E9 κύτταρα με τις ακόλουθες διαφορετικές αγωγές: 10 μΜ TCPOBOP, 10 μΜ androstenol, η IC50 του Paclitaxel, ή ένας συνδυασμός αυτών. Τα αποτελέσματά μας έδειξαν ότι μία μόνο κατεργασία με TCPOBOP ή androstenol δεν είχε καμία επίδραση στην έκφραση του mRNA MCAR (Εικ. 1). Ωστόσο, όταν τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με μόνη ή σε συνδυασμό με TCPOBOP ή androstenol πακλιταξέλη, μια αύξηση στην έκφραση MCAR παρατηρήθηκε ανεξάρτητα του συνδέτη (p = 0,0102? Εικ. 1).

TCPOBOP και πακλιταξέλη μεταβάλλουν ογκοκατασταλτικών και ογκογονιδίου επίπεδα έκφρασης

Περαιτέρω πειράματα πραγματοποιήθηκαν μόνο με την κυτταρική σειρά καρκίνου του πνεύμονα ποντικού Ε9. Αξιολογήσαμε τις επιδράσεις της TCPOBOP και πακλιταξέλης στο προφίλ γονιδιακής έκφρασης των ογκογονιδίων 84 και ογκοκατασταλτικά γονίδια. Αρχικά, πέντε γονίδια αποκοπής από την ανάλυση επειδή παρουσιάστηκε CT τιμές μεγαλύτερες από 35 και /ή εντοπίστηκε η παρουσία περισσότερων από ένα προϊόν PCR. Από τα 79 υπόλοιπα γονίδια, η θεραπεία πακλιταξέλη μετέβαλε την έκφραση των γονιδίων 10, με τις αλλαγές φορές μεγαλύτερη από 2 (Πίνακας 2). Σύμφωνα με τις λειτουργικές ομάδες του γονιδίου από τη συστοιχία Rt2 Profiler PCR, τα περισσότερα από τα γονίδια ρυθμισμένα προς τα πάνω paclitaxel ήταν γονίδια καταστολείς όγκων, γονίδια που σχετίζονται με την απόπτωση, ογκογονίδια ή γονίδια τα οποία παρουσιάζουν ιδιότητες των ογκογονιδίων και γονιδίων καταστολής όγκου (Πίνακας 2).

Η έκθεση των κυττάρων Ε9 προς τον συνδετήρα CAR ποντίκι TCPOBOP αύξησε την έκφραση γονιδίων καταστολής δύο όγκων: MGMT και WT1 (Πίνακας 2). Είναι ενδιαφέρον ότι, όταν αξιολογήσαμε την γονιδιακή έκφραση των κυττάρων σε επεξεργασία με TCPOBOP συν πακλιταξέλη (με την ίδια συγκέντρωση που αυξάνει πακλιταξέλη κυτταροτοξικότητα), η έκφραση αυτών των δύο γονιδίων ενισχύθηκε περαιτέρω από ότι όταν χορηγήθηκε μόνο paclitaxel ή TCPOBOP, υποδηλώνοντας μια προσθετική δράση για την γονίδιο έκφρασης αυτών των γονιδίων. Επιπλέον, ο συνδυασμός του TCPOBOP συν paclitaxel είχε ως αποτέλεσμα την ρύθμιση προς τα κάτω του δύο ογκογονιδίων, ZHX2 και ESR1 (Πίνακας 2). Επιπλέον, φαίνεται ότι η συνδυασμένη έκθεση των κυττάρων Ε9 να TCPOBOP και πακλιταξέλη ενίσχυσε την υπογραφή γονιδιακής έκφρασης που προκαλείται από paclitaxel (Πίνακας 2). Λαμβανόμενα μαζί, αυτά τα αποτελέσματα είναι σύμφωνα με τις ανωτέρω περιγραφείσες και να εξηγήσει τις ιδιότητες διαμορφωτικές του TCPOBOP αγωνιστή MCAR για την επίδραση κατά των όγκων του paclitaxel σε καρκινικά κύτταρα πνεύμονα ποντικού.

Σε silico ανάλυση δείχνει ότι η πακλιταξέλη και TCPOBOP ταιριάζει στη δομή MCAR

Ευθυγράμμιση των 1XLS και τη δομή 1XNX έδειξε ότι η τοποθέτηση του TCPOBOP αγωνιστή και το αντίστροφο αγωνιστή androstenol στη δομή οποίο πρόκει- ται να είναι διακριτές (Εικ. 3). Η βάση σύνδεσης του TCPOBOP διεξήχθη ως έλεγχος, και έδειξε ένα καλό υπέρθεση TCPOBOP στην κρυσταλλική δομή του 1XLS (Εικ. 3). Η βάση σύνδεσης χρησιμοποιώντας τη δομή 1XLS αποκάλυψε ότι το αντίστροφο αγωνιστή androstenol δεν μπορούσε να δεσμεύει στη θέση του TCPOBOP αγωνιστή? androstenol έδειξε μια θετική ενέργεια πλέγματος (51.82), η οποία είναι δυσμενής να συνδεθεί στο εσωτερικό του υποδοχέα. Το ενεργειακό δίκτυο της TCPOBOP και πακλιταξέλη είναι αντίστοιχα -49.34 και -125,53. Από την άλλη πλευρά, βάση σύνδεσης χρησιμοποιώντας τη δομή 1XNX να καθοδηγήσει την καλύτερη ενέργεια για την αλληλεπίδραση υποδοχέα-συνδέτη επισήμαναν μια πιθανή άλλη θέση του υποδοχέα CAR για TCPOBOP δέσμευση (Εικ. 3) με ευνοϊκή ενέργεια πλέγματος (-32,01), παρόμοιο με εκείνη που λαμβάνεται για το androstenol (-40,44). Η πακλιταξέλη έδειξε επίσης την πιο ευνοϊκή ενέργεια και έκλεισε δεσμευτικές τιμές του δεσμεύουν και στις δύο δομές όπου TCPOBOP ή androstenol χρησιμοποιήθηκαν ως συνδέτης οδηγό σύνδεσης (πίνακας 3), το οποίο υποδεικνύει ότι η πακλιταξέλη θα μπορούσε επίσης να είναι ένας συνδέτης MCAR.

Α , D-androstenol? Β, Ε-Paclitaxel? C, F-TCPOBOP? G και H * androstenol και TCPOBOP υπέρθεση: G- θέα επιφάνεια και θέα Η- σύρμα συνδεσμικών. Σημειώστε ότι η πακλιταξέλη αγκυροβολημένο στις δύο δομές MCAR.

Η

Ανθρώπινο χαρακτηρισμό CAR σε μη-μικροκυτταρικού καρκίνου δείγματα καρκίνου του πνεύμονα από δύο ανεξάρτητες μελέτες

Εμείς χαρακτήρισε την κατάσταση της HCAR σε NLSLC από δύο μελέτες με δημόσια διαθέσιμα στοιχεία μέσω TCGA. Στη μελέτη αδενοκαρκίνωμα, από 230 δείγματα, 17.8% των περιπτώσεων (41/230) παρουσίασαν γενετικές μεταβολές του HCAR, συμπεριλαμβανομένων Copy Number Αλλοιώσεις (CNA), οι μεταλλάξεις ή αλλαγμένη γονιδιακή έκφραση (Εικ. 4). Αυτές οι μεταβολές δεν συσχετίστηκαν με τη συνολική επιβίωση (OS, ρ = 0.40, Σχ. S2). Η πλειονότητα των δειγμάτων από τη μελέτη αυτή παρουσιάζονται με αυξημένη μεθυλίωση HCAR σύμφωνα με την ανάλυση HM450 (Εικ. 4). Που επιβεβαιώνουν αυτά τα δεδομένα, μόνο το 8% των περιπτώσεων (19/230) παρουσιάζονται με ρύθμιση προς τα άνω των HCAR mRNA.

(Α) Γενετικές αλλοιώσεις και συχνότητα HCAR στη μελέτη αδενοκαρκίνωμα πνεύμονα που διατίθενται από TCGA. (Β) Ίδια στοιχεία από την πλακωδών κυττάρων μελέτη του καρκινώματος των πνευμόνων που διατίθενται από TCGA. (Γ) μεθυλίωση του DNA vs γονιδιακή έκφραση των HCAR από δείγματα αδενοκαρκίνωμα πνεύμονα από TCGA. (Δ) Η μεθυλίωση του DNA vs γονιδιακή έκφραση HCAR από πνεύμονα πλακωδών δείγματα Καρκίνωμα από TCGA. Και τα δύο σύνολα δεδομένων που παρουσιάζονται ιδιαίτερα η μεθυλίωση του DNA και μεταβλητά επίπεδα έκφρασης του mRNA της NR1I3

Η

Στη συνέχεια, χρησιμοποιήσαμε πληροφορίες από μια άλλη μελέτη από TCGA για καρκίνωμα του πνεύμονα πλακωδών κυττάρων (LSCC, TCGA, προσωρινά στοιχεία -. 04/26 /2014). Η συχνότητα των μεταβολών HCAR συμπεριλαμβανομένων μεταλλάξεων, CNAs ή αλλοιωμένη έκφραση γονιδίων (Σχ. 4), ήταν 8,2% (40/489), η οποία δεν συνδέθηκε με OS (ρ = 0,81, σχ. S1). Παρόμοια με την μελέτη αδενοκαρκίνωμα, η πλειοψηφία των δειγμάτων παρουσιάζονται με αυξημένη μεθυλίωση του DNA του HCAR (Εικ. 4). Αυτό μπορεί να εξηγήσει γιατί

Με βάση τα αποτελέσματα από τις δύο μελέτες, είναι δυνατή μόνο 7,4% όλων των περιπτώσεων που παρουσιάζονται με προς τα πάνω ρύθμιση του HCAR mRNA (36/489). Ότι η πλειοψηφία των δειγμάτων από αδενοκαρκίνωμα του πνεύμονα και LSCC ασθενείς που δεν παρουσιάζουν μεταβολές στην έκφραση HCAR σε σχέση με την αντιστοίχιση, μη-καρκινικού ιστού, η οποία θα μπορούσε να εξηγηθεί από τα υψηλά επίπεδα μεθυλίωσης που βρέθηκαν και στις δύο μελέτες.

Συζήτηση

Ο καρκίνος του πνεύμονα συνεχίζει να είναι ένα σημαντικό πρόβλημα για τα συστήματα υγειονομικής περίθαλψης σε όλο τον κόσμο, καθώς οι περισσότερες περιπτώσεις αφορούν ασθενείς με περιελάμβανε τη λειτουργία των πνευμόνων, μετάσταση, την αντίσταση σε πολλαπλά φάρμακα και φτωχών αποτελεσμάτων. Η επιβίωση των ασθενών με καρκίνο του πνεύμονα μετά την ανίχνευση του όγκου είναι συνήθως μικρότερη από 5% σε πέντε έτη [35]. Πρόσφατα, τα αποδεικτικά στοιχεία έχει αρχίσει να δείχνουν ότι το αυτοκίνητό μπορεί να έχει κάποιο ρόλο στη θεραπεία του καρκίνου [19], [20]. Εδώ δείχνουμε ότι η ειδική διαμόρφωση CAR από αγωνιστές, αλλά όχι από αντιστρόφου αγωνιστές, αύξησε την αποτελεσματικότητα κατά του όγκου της πακλιταξέλης σε αμφότερες ποντικού και ανθρώπου κύτταρα καρκίνου του πνεύμονα. Αυτή η επίδραση συνοδεύτηκε από την ενίσχυση της υπογραφής γονιδιακής έκφρασης paclitaxel που προκαλείται όταν χρησιμοποιείται ένας συνδυασμός πακλιταξέλης και TCPOBOP. Επιπλέον, μία μοναδική έκθεση των καρκινικών κυττάρων να TCPOBOP αύξησε την έκφραση δύο γονιδίων καταστολής όγκου (WT1 και MGMT), η οποία θα μπορούσε επιβεβαιώνουν την βελτιωμένη αποτελεσματικότητα της πακλιταξέλης σε καρκινικές κυτταρικές σειρές. αγωγή με πακλιταξέλη αυξημένη έκφραση του γονιδίου CAR και ελλιμενίστηκε στη μοριακή δομή του CAR

in silico

. Τέλος, αναλύσαμε το προφίλ της HCAR σε δύο μελέτες TCGA και σημείωσε ότι αυτοκίνητο θα μπορούσε να είναι μια ενδιαφέρουσα στόχο για τους ασθενείς με NSCLC που λαμβάνουν θεραπεία πακλιταξέλη από το HCAR εκφράζεται σε δείγματα όγκων και δεν έχει καμία σχέση με OS.

Chen

et al.

πρόσφατα θεωρηθεί συνδέτες αυτοκίνητο να είναι μια πολλά υποσχόμενη επιλογή για τη συνδυασμένη χημειοθεραπεία, με σκοπό την υπερνίκηση MDR σε καρκινικά κύτταρα [6]. Τα αποτελέσματά μας υποστηρίζουν αυτή την πρόταση, δεδομένου ότι οι συνδετήρες αυτοκίνητο δεν προκαλεί κυτταροτοξικές επιδράσεις per se σε καρκινικά κύτταρα? Ωστόσο, όταν οι αγωνιστές CAR χρησιμοποιήθηκαν σε συνδυασμό με paclitaxel, μια ενδιαφέρουσα επίδραση ρυθμιστικών προέκυψε. Αυτή η ενισχυμένη κυτταροτοξική επίδραση παρατηρήθηκε επίσης σε πέντε από έξι διαφορετικές ανθρώπινες καρκινικές κυτταρικές γραμμές, δεδομένου CITCO, τον αγωνιστή HCAR, έδειξε παρόμοια επίδραση στην αποτελεσματικότητα paclitaxel. Ως εκ τούτου, υποστηρίζουμε την υπόθεση του Τσεν

et al.

Ότι η ρύθμιση CAR μπορούσε πράγματι να είναι σημαντικό για τη χημειοθεραπεία του καρκίνου [6].

Ο ακριβής ρόλος του CAR στην καρκινογένεση και τη θεραπεία του καρκίνου εξακολουθεί να είναι ένα το θέμα της συζήτησης. Από τη μια πλευρά, CAR είναι απαραίτητη για την προώθηση του ήπατος όγκου με φαινοβαρβιτάλη σε ποντικούς [18] και ρυθμίζει ογκογένεση σε απόκριση προς ξενοβιοτικών στρες [36]. Από την άλλη πλευρά, ο Wang et al. περιγράφεται αυτοκίνητο ως ένα νέο θεραπευτικό στόχο που διευκολύνει την κυκλοφωσφαμίδη (CPA) -με βάση τη θεραπεία των αιμοποιητικών κακοηθειών [20], και πού κατέληξαν στο συμπέρασμα ότι η ενεργοποίηση CAR διευκολύνει τη χημειοθεραπεία CPA-based με την επιλεκτική προώθηση βιοενεργοποίηση του. Σε μια άλλη μελέτη, δείχθηκε CITCO να στοχεύσει στελέχους του εγκεφάλου καρκινικά κύτταρα, αναστέλλοντας την ανάπτυξη και την επέκταση [19] τους. Και τα δύο έγγραφα προτείνουν τη χρήση αγωνιστών CAR για τη θεραπεία των κακοηθειών του αίματος και καρκίνων του εγκεφάλου, αντιστοίχως.

Όπως αναφέρθηκε προηγουμένως, η πακλιταξέλη προκαλεί απόπτωση σε πολλαπλασιαζόμενα κύτταρα. Εδώ, η πακλιταξέλη που επάγεται κυτταρικό θάνατο σε όλες τις γραμμές ποντικού και ανθρώπου των καρκινικών κυττάρων, με μοναδικές τιμές IC50 για κάθε μία από αυτές. Ακόμα και μετά από την εξέταση ότι αυτά τα κύτταρα που υπάρχουν διαφορές στην αντοχή τους σε Paclitaxel (≈3600x), οι αγωνιστές CAR βελτίωσε την αποτελεσματικότητα της πακλιταξέλης σε όλες σχεδόν τις καρκινικές κυτταρικές σειρές (6/7). Από την άλλη πλευρά, η αντίστροφο αγωνιστή androstenol δεν προκάλεσε καμία επίδραση στην κυτταροτοξικότητα της πακλιταξέλης στην πλειονότητα των κυττάρων, και εξασθένησε την κυτταροτοξική της πακλιταξέλης σε μία κυτταρική σειρά. Αυτά τα αποτελέσματα οδηγούν στο συμπέρασμα ότι μόνο αγωνιστές αυτοκίνητο θα πρέπει να θεωρούνται για τη βελτίωση της θεραπείας του καρκίνου NSCLC.

Οι επιδράσεις των αγωνιστών CAR για την αποτελεσματικότητα κατά του όγκου της πακλιταξέλης ήταν παρόμοιες και στις δύο κύτταρα ποντικού και ανθρώπου. Έτσι, εστιάσαμε πειράματά μας με το μοντέλο ποντικού για δύο λόγους: έχουμε περισσότερη εμπειρία με αυτό το μοντέλο [37], [38] και το σύνολο των τεχνικών που χρησιμοποιούνται στο μοντέλο ποντικού ήταν ρουτίνα στο εργαστήριο μας. Επιπλέον, η χρήση του πνεύμονα ποντικού επιθηλιακών καρκινικών κυτταρικών γραμμών έχει καθιερωθεί για περισσότερα από 30 χρόνια τώρα και έχει παρουσιάσει παρόμοια αποτελέσματα με αυτά που ελήφθησαν με ανθρώπινες κυτταρικές γραμμές [23]. Έτσι, μπορούμε επίσης να καταδειχθεί σε αυτό το

in vitro

μοντέλο ποντικού ότι η γονιδιακή έκφραση πακλιταξέλη αυξήσεις αυτοκίνητο στο IC50, ανεξάρτητα από τη σχέση της με συνδέτες CAR. Θα μπορούσε κανείς να αναμένει ότι συνδέτες το οποίο πρόκει- ται να ρυθμίζουν την έκφραση του γονιδίου το οποίο πρόκει- ται, αλλά τα αποτελέσματά μας δεν έδειξαν αυτό το αποτέλεσμα. ενεργοποίηση CAR με ειδικούς συνδετήρες δεν μετέβαλλε πάντοτε επίπεδα γονιδιακής έκφρασης CAR ή πρωτεΐνη, αλλά μπορεί ακόμη να οδηγήσει σε αύξηση της μεταγραφικής δραστηριότητας του.

ανάλυση έκφρασης CAR σε καρκινικά κύτταρα ποντικού που έλαβαν θεραπεία με συνδετήρες CAR μόνο, paclitaxel μόνο , ή ένας συνδυασμός και των δύο, αποκάλυψε ότι η πακλιταξέλη αύξησε την έκφραση γονιδίων του CAR ανεξάρτητη από τη σύνδεσή της με TCPOBOP ή androstenol. Κατά συνέπεια Συμφωνώντας με αυτό το αποτέλεσμα,

in silico

ανάλυση σύνδεσης των TCPOBOP, androstenol και πακλιταξέλη σε πρωτεϊνική δομή CAR απέδειξε ότι η πακλιταξέλη χωράει στην τσέπη σύνδεσης συνδετήρα του υποδοχέα το οποίο πρόκει- ται, η οποία θα μπορούσε να αυξήσει την έκφραση CAR από το θετικό ανατροφοδοτεί. Καμία επίδραση στη γονιδιακή έκφραση CAR σημειώθηκε μετά CAR συνδετήρες έκθεση, γεγονός που επιβεβαιώνει την απουσία κυτταροτοξικότητας από αυτούς τους συνδετήρες.

Ένα άλλο ενδιαφέρον αποτέλεσμα που υποστηρίζουν την ρυθμιστική επίδραση των αγωνιστών CAR για την αποτελεσματικότητα πακλιταξέλη ενίσχυση τους πακλιταξέλης γονίδιο υπογραφή έκφραση, αυξάνοντας την έκφραση ορισμένων γονιδίων καταστολής όγκου και μειώνοντας την έκφραση δύο ογκογονίδια. Είναι ενδιαφέρον ότι, η θεραπεία με TCPOBOP μόνη επάγει επίσης την έκφραση δύο γονιδίων καταστολής όγκου MGMT και WT1. MGMT μεθυλίωση υποκινητής είναι ένα ισχυρότερο προγνωστικό παράγοντα από την ηλικία, το στάδιο, και ο βαθμός του όγκου για γλοιώματα [39].