Αφηρημένο

Ιστορικό

ιού JC είναι ένα DNA polyomavirus πολύ καλά προσαρμοσμένος στους ανθρώπους. Παρά το γεγονός ότι ιού JC DNA έχει ανιχνευθεί σε καρκίνους του παχέος εντέρου (CRC), η συσχέτιση μεταξύ του ιού JC και CRC παραμένει αμφιλεγόμενη. Στην Κίνα, η παρουσία της λοίμωξης του ιού JC σε ασθενείς CRC δεν έχει αναφερθεί. Εδώ, ερευνήσαμε μόλυνση ιού JC και το ιικό φορτίο DNA σε Κινέζους ασθενείς CRC και να καθοριστεί εάν το DNA του ιού JC στο περιφερικό αίμα (ΡΒ) μπορεί να χρησιμοποιηθεί ως διαγνωστικός δείκτης για JCV σχετίζονται CRC.

Μεθοδολογία /Principal Εκτίμηση

ιστούς όγκων, μη-καρκινικό όγκο-παρακείμενους ιστούς και ΡΒ δείγματα συλλέχθηκαν από 137 ασθενείς με CRC. Επιπλέον, 80 δείγματα φυσιολογικού ορθοκολικό ιστό από ασθενείς χωρίς CRC και ΡΒ δείγματα από 100 υγιείς εθελοντές επίσης συγκομίζονται ως έλεγχοι. Ιού JC DNA ανιχνεύθηκε από ένθετη PCR και γυαλί slide-based κηλίδωση dot. Το ιικό φορτίο DNA των θετικών δειγμάτων προσδιορίστηκαν με ποσοτική πραγματικού χρόνου PCR. Ιού JC DNA ανιχνεύθηκε σε 40.9% (56/137) των ιστών CRC σε ένα ιικό φορτίο των 49,1 – 10,3 × 10

4 αντίγραφα /μg DNA. Τριάντα τέσσερις (24,5%) μη-καρκινικούς ιστούς παχέος εντέρου (192,9 – 4,4 × 10

3 αντίγραφα /μg DNA) και 25 (18,2%) ΡΒ δείγματα (81,3 – 4,9 × 10

3 αντίγραφα /μg DNA) από CRC ασθενείς ήταν θετικοί για JCV. ιστούς όγκων είχαν υψηλότερα επίπεδα του ιού JC από τους μη-καρκινικούς ιστούς (

P

= 0.003) ή ΡΒ δείγματα (

P

& lt? 0.001). Δεν παρατηρήθηκε συσχέτιση μεταξύ της παρουσίας του ιού JC και δημογραφικά ή ιατρικά χαρακτηριστικά. Ο επιπολασμός του ιού JC στο ΡΒ δείγματα συσχετίστηκε σημαντικά με την ιδιότητα του ιού JC σε δείγματα ιστών (

P

& lt? 0.001). Έντεκα (13,8%) κανονική του παχέος ιστούς και επτά (7,0%) ΡΒ δείγματα από υγιείς δότες ήταν θετικά για ιού JC.

Συμπεράσματα /Σημασία

μόλυνση ιού JC είναι συχνά παρούσα σε παχέος ιστούς όγκων του CRC ασθενείς. Αν και η σχέση μεταξύ παρουσίας ιού JC σε δείγματα PB και την κατάσταση του ιού JC σε δείγματα ιστού που προσδιορίζονται στην παρούσα μελέτη, αν η ανίχνευση του ιού JC PB μπορεί να χρησιμεύσει ως δείκτης για την ιού JC καθεστώς της CRC απαιτεί περαιτέρω μελέτη

Παράθεση:. Mou Χ, Chen L, Liu F, Lin J, Diao P, Wang H, et al. (2012) Ο επιπολασμός της JC ιών στα κινέζικα ασθενείς με καρκίνο του παχέος εντέρου. PLoS ONE 7 (5): e35900. doi: 10.1371 /journal.pone.0035900

Επιμέλεια: Herman Τσε, Το Πανεπιστήμιο του Χονγκ Κονγκ, Χονγκ Κονγκ

Ελήφθη: 30, Νοεμβρίου 2011? Αποδεκτές: 23 του Μαρτίου του 2012? Δημοσιεύθηκε: 11 Μαΐου, 2012

Copyright: © 2012 Mou et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτή η μελέτη χρηματοδοτήθηκε από τις επιχορηγήσεις από το Εθνικό Επιστημονικό Κίνας και Τεχνολογίας Μεγάλου Έργου Αρ 2012ZX10002006-003, του Εθνικού προγράμματος βασικής Έρευνας της Κίνας (973 πρόγραμμα) αριθ 2007CB513001, και Qiu Shi Καθηγητή του Πανεπιστημίου Zhejiang για να CX. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Ο ιός John Cunningham (ιού JC) είναι ένα πανταχού παρόν, μικρό, χωρίς περίβλημα polyomavirus με ένα κλειστό, κυκλικό, δίκλωνο γονιδίωμα DNA που βρίσκεται συχνά στα νεφρά των υγιών ατόμων και απεκκρίνεται στα ούρα του ένα μεγάλο μέρος του πληθυσμού των ενηλίκων. μόλυνση ιού JC είναι υποκλινική και οδηγεί σε ισόβια λανθάνουσα κατάσταση, αλλά μπορεί να επανενεργοποιηθεί όταν το ανοσοποιητικό σύστημα είναι μειωμένη [1] – [3]. JCV σχετίζεται με τη νόσο κυρίως σε ανοσοκατασταλμένα άτομα και αντιγραφή του σε νευρογλοιακά κύτταρα θα μπορούσε να οδηγήσει σε προοδευτική πολυεστιακή λευκοεγκεφαλοπάθεια (PML), μια συχνά θανατηφόρα ασθένεια του κεντρικού νευρικού συστήματος [4]. Όπως και άλλοι ιοί πολυώματος, του ιού JC κωδικοποιεί μια έκδοση ενός μεγάλου Τ-αντιγόνου που μπορεί να συνδέονται και απενεργοποιούν ογκοκατασταλτικό πρωτεΐνες ρ53 και pRB και να παρεμβαίνει με διάφορες οδούς κυτταρικής σηματοδότησης [5] – [7]. Επιπλέον, JCV αλληλουχίες γονιδιωματικού DNA και η έκφραση Τ-αντιγόνου έχουν ανιχνευθεί σε ένα ευρύ φάσμα τύπων κυττάρων ανθρώπινου όγκου συμπεριλαμβανομένων ολιγοδενδροκύτταρα, αστροκυτώματα, γλοιοβλαστώματα, επενδυμώματα, και τα περισσότερα άλλα είδη οι όγκοι του εγκεφάλου [8], υποδεικνύοντας ότι μόλυνση ιού JC μπορεί να σχετίζεται με την ανθρώπινη καρκινογένεση.

Πιο πρόσφατα, JCV βρέθηκε επίσης σε μη-νευρικά καρκίνων, όπως γαστρικών καρκίνων [9] και του πνεύμονα [10]. μόλυνση ιού JC αναφέρθηκε για πρώτη φορά ως πιθανός παράγοντας κινδύνου για καρκίνο του παχέος εντέρου (CRC) σε ένα έργο από Laghi et al. [11], η οποία διαπίστωσε ότι το 96% των ιστών CRC ήταν θετικοί για JCV DNA αλληλουχίες. Στη συνέχεια, άλλες μελέτες έχουν δημοσιευθεί δείχνουν ότι ιού JC ακολουθίες βρέθηκαν στο 26% -88,9% ιστών CRC, με τα μεγέθη δείγματος που κυμαίνονται 18 έως 105 [12] – [15]. Σε αντίθεση, άλλες μελέτες έχουν δείξει ότι στη συνέχεια καμία ανιχνεύσιμη JCV DNA ήταν παρούσα σε ορθοκολικό ιστούς υποδεικνύει καμία συσχέτιση μεταξύ του ιού JC και νεοπλασία κόλον [16] – [17]. επιπολασμός του ιού JC σε διάφορα σύνολα CRC δείγμα μπορεί να οφείλεται σε διαφορές στις ευαισθησίες δοκιμασία σε όλες τις μελέτες, η μόλυνση μεταξύ των δειγμάτων ή γεωγραφικές θέσεις του επιλεγμένου πληθυσμού. Αν και επίδειξη της παρουσίας των ιικών συστατικών του όγκου είναι το πρώτο βήμα για να χαρακτηρίσει τον ρόλο του ιού JC σε CRC καρκινογένεση, πρόσθετα στοιχεία, όπως υψηλό ιικό φορτίο, είναι απαραίτητη για να υποστηρίξει ένα ρόλο συνάφειας. Ωστόσο, μόνο δύο μελέτες ανέφεραν το ιικό φορτίο του ιού JC σε CRC [11], [15]. Λαμβάνοντας υπόψη τις αμφιλεγόμενες εκθέσεις σχετικά με την αιτιολογία της ιού JC σε CRC, φαίνεται ότι η σύνδεση μεταξύ μόλυνση ιού JC και CRC πρέπει να διερευνηθεί περαιτέρω.

Πολλές μελέτες έχουν αποδείξει ότι JCV DNA ή αντιγόνα μπορεί να ανιχνευθεί στο περιφερειακό αίμα (PB) ή ορό. Ιικά συστατικά ανιχνεύεται στο αίμα έχουν ιστορικά θεωρείται ότι προέρχεται από μετάσταση καρκινικών κυττάρων ή από ιό που περιέχει κυτταρικά θραύσματα ρίξει από ένα τοπικό σημείο της μόλυνσης [18]. Παρά το γεγονός ότι έχουν δύο προοπτικές μελέτες ασθενών-μαρτύρων έχουν πραγματοποιηθεί για να προσδιοριστεί η σχέση μεταξύ του ιού JC οροθετικότητας και ανάπτυξης CRC [19] – [20], δεν έχει υπάρξει καμία έκθεση που περιγράφει την παρουσία του ιού JC DNA στο αίμα των ασθενών CRC δημοσιευθεί μέχρι σήμερα. Σε αυτή τη μελέτη, ερευνήσαμε την επικράτηση του ιού JC σε Κινέζους ασθενείς CRC για να καθοριστεί μια πιθανή σχέση. Επιπλέον, ερευνήσαμε αν ιού JC DNA σε PB είναι κατάλληλο ως διαγνωστικό δείκτη για την ιού JC που σχετίζονται με CRC.

Μέθοδοι

Δήλωση Ηθικής

Το έργο εγκρίθηκε από την Ηθική Επιτροπή του πρώτου Ενταγμένο Νοσοκομείο, Ιατρική Σχολή, Πανεπιστήμιο Zhejiang, Hangzhou, Κίνα. Γραπτή συγκατάθεση δόθηκε από τους ασθενείς και τους ελέγχους.

Κλινικά δείγματα

Όλα τα κλινικά δείγματα ελήφθησαν από το Μάιο του 2007 και τον Οκτώβριο του 2011 από ασθενείς που εισήχθησαν στο πρώτο Affiliated Νοσοκομείο, Ιατρική Σχολή, Πανεπιστήμιο Zhejiang (Hangzhou, Κίνα). ιστούς όγκων, ιστούς μη καρκινικό όγκο-δίπλα και ΡΒ δείγματα από 137 CRC ασθενείς τυχαία (μέση ηλικία του ασθενούς, 62.99? εύρος, 27-86 ετών) συλλέχθηκαν λιγότερο από τρεις μήνες μετά την CRC διάγνωση. Οι ασθενείς που υποβάλλονται σε χειρουργική επέμβαση για υποτροπές αποκλείστηκαν. Μη-καρκινικό όγκο παρακείμενο ιστό που συλλέγονται από ένα εκατοστό άπω ​​περιοχή -15 από τον όγκο. Επιπλέον, το 80 παχέος ιστούς από μη παθολογικές βλεννογόνο ασθενών που υποβάλλονται σε κολονοσκόπηση για την αξιολόγηση των λειτουργικές διαταραχές όπως διάρροια ή δυσκοιλιότητα που δεν σχετίζονται με τον καρκίνο ή φλεγμονώδης νόσος του εντέρου (IBD) και 100 ΡΒ δείγματα από υγιείς δότες μετά από σωματική εξέταση χωρίς ιστορικό καρκίνου ή διάγνωση των πολυπόδων συλλέχθηκαν ως μάρτυρες. Δείγματα ιστών χωρίστηκαν? αφενός διατηρήθηκε για ιστοπαθολογική ανάλυση, και η άλλη μεταφέρθηκε σε κρυοσωλήνες, καταψύχθηκαν αμέσως σε υγρό άζωτο και φυλάχθηκαν στους -196 ° C για περαιτέρω ανάλυση. Όλα τα δεδομένα του δείγματος καταγράφηκαν σε μια βάση δεδομένων συλλογής δειγμάτων.

DNA εκχύλιση

Περίπου 50 mg από κάθε δείγμα ιστού ομογενοποιήθηκε σε 2 ml αποστειρωμένο σωλήνα με διάλυμα χλωριούχου νατρίου 1 ml 0,09% χρησιμοποιώντας ένα ηλεκτρικό ομογενοποιητή (PRO Scientific, Oxford, CT, USA). Για την ελαχιστοποίηση της διασταυρούμενης μόλυνσης μεταξύ των δειγμάτων, ο καθετήρας πλύθηκε σε φρέσκο ​​στείρο νερό τρεις φορές, 40% διάλυμα υπεροξειδίου του υδρογόνου δύο φορές, 75% αιθανόλη δύο φορές και θερμαίνεται σε έναν καυστήρα αιθανόλης 95% για 3 λεπτά μεταξύ των δειγμάτων. Τετρακόσια μικρολίτρα από κάθε δείγμα PB χρησιμοποιήθηκε για την απομόνωση του DNA. Το DNA του κάθε δείγματος εκχυλίζεται χρησιμοποιώντας το MasterPure DNA Purification Kit (Epicentre Biotechnologies, Madison, WI, USA) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Για να επιβεβαιωθεί η ακεραιότητα του DNA εκχυλίζεται, PCR χρησιμοποιώντας γλυκεραλδεΰδες φωσφορικής αφυδρογονάσης (GAPDH) εκκινητές διεξήχθη όπως περιγράφηκε προηγουμένως [21].

Nested PCR για το γονιδίωμα του ιού JC

ενίσχυση Nested PCR πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας ένα σετ εκκινητών για Τ-αντιγόνου όπως περιγράφηκε προηγουμένως [13]. Εν συντομία, ο στόχος 173 bp του ιού JC Τ-αντιγόνου ενισχύθηκε πρώτα με χρήση των εκκινητών ΣΚΟ-1F (5′-AGT CTT TAG GGT CTT CTA-3 ‘) και JCT-1R (5’-GGT GCC AAC CTA TGG AAC AG-3 ‘). Πρώτος γύρος κατάσταση PCR μετουσιώθηκε στους 95 ° C για 10 λεπτά, ακολουθούμενη από 30 κύκλους μετουσίωσης στους 95 ° C για 15 s, ανόπτηση στους 55 ° C για 30 s και επέκταση στους 72 ° C για 30 s. Nested PCR πραγματοποιήθηκε με τη χρήση 2 μΐ του πρώτου γύρου προϊόν ως εκμαγείο, με τους εκκινητές JCT-1F και JCT-2R (5’-TGA AGA CCT GTT TTG CCA TG-3 ‘). Η ένθετη PCR κατάσταση μετουσιώθηκε στους 95 ° C για 10 λεπτά, ακολουθούμενη από 30 κύκλους μετουσίωσης στους 95 ° C για 15 s, ανόπτηση στους 60 ° C για 30 s και επέκταση στους 72 ° C για 30 s. Η ένθετη διαδικασία PCR ενισχυμένο μία αλληλουχία-στόχο 110 bp. Για την αποφυγή πιθανών PCR ψευδώς θετικά αποτελέσματα, δύο έλεγχοι νερό συμπεριλήφθηκαν για πρώτο γύρο PCR και ένθετη PCR. Αν είτε ο έλεγχος των δύο ελέγχων του νερού έδωσε ψευδώς θετικά στην ένθετη PCR, το σύνολο των PCR και ένθετη PCR έγινε επανεκκίνηση με νέο αντιδραστήριο. Για κάθε δείγμα, 1 μΙ ϋΝΑ ενισχύθηκε με ένθετη PCR. Τέσσερα μικρολίτρα από κάθε προϊόντα ενίσχυσης αναλύθηκαν με ηλεκτροφόρηση επί πηκτής αγαρόζης χρώση με βρωμιούχο αιθίδιο και 2%.

Glass διαφάνεια με βάση dot blotting

Τα ένθετα-PCR προϊόντα καθαρίστηκαν με κιτ καθαρισμού MinElute PCR (QIAGEN, Hilton, Γερμανία) και τέλος εκλούεται σε 10 μΐ ρυθμιστικού διαλύματος ΕΒ (10 mM Tris-Cl, ρΗ 8,5). Καθαρισμένα δείγματα DNA αναμίχθηκαν με έναν όγκο DMSO, και στίγματα πάνω στις επιφάνειες του αμινοσιλανίου διαφάνειες (CapitalBio, Πεκίνο, Κίνα) και τρία αντίγραφα με SmartArrayer spotter (CapitalBio, Πεκίνο, Κίνα). Μετά το ψήσιμο για 1 ώρα στους 80 ° C, τα πλακίδια ξεπλύθηκαν σε 0,2% SDS για 5 λεπτά και καθαρίζονται με έκπλυση με DDH

2O. TAMRA-σημασμένο ολιγονουκλεοτιδικό ανιχνευτή (JCT-ανιχνευτή, 5′-GTT GGG ATC CTG TGT ΤΤΤ CAT CAT C-3 ‘) αγοράστηκε από την Invitrogen (Σαγκάη, Κίνα) και αραιώθηκε σε μία συγκέντρωση 10 μΜ. Ο υβριδισμός διεξήχθη στους 45 ° C για 2 ώρες. Τα πλακίδια πλύθηκαν σε 2 χ SSC /0,2% SDS στους 42 ° C για 5 λεπτά, και τελικά σε αναπτυξιακής δυσπλασίας του ισχίου

2O στους 42 ° C για 5 λεπτά. Οι πλάκες ξηραίνονται με φυγοκέντρηση και σαρώνεται με ένα σαρωτή GenePix 4100 (Αχοη, Ένωση, USA). Οι εικόνες αναλύθηκαν με GenePix Pro 5.0 λογισμικό (Αχοη).

Η ποσοτικοποίηση του ιικού φορτίου με πραγματικού χρόνου PCR

Ένα SYBR Green μέθοδος πραγματικού χρόνου PCR χρησιμοποιήθηκε για τον προσδιορισμό του ιού JC ιικού φορτίου σε δείγματα όπως περιγράφεται από τον Chapagain [22]. Ειδικά, οι εκκινητές RT-ΣΚΟ-F (5′-AGA ΟΤΟ TTG GGA TCC TGT GTT ΤΤ-3 ‘) και RT-ΣΚΟ-R (5′-GAG ΑΑΟ ΤΟΟ GAT GAA GAC CTG ΤΤΤ-3’) χρησιμοποιήθηκαν στην PCR πραγματικού χρόνου στόχευση μια ακολουθία γονιδίου Τ-αντιγόνου, παράγοντας ένα προϊόν 78 bp κατά την διάρκεια της αντίδρασης. JCV ποσοτικοποίηση ιικό φορτίο πραγματοποιήθηκε με τον Bio-Rad CFX96 πραγματικό χρόνο Σύστημα Ανίχνευσης PCR χρησιμοποιώντας 200 ng εκμαγείου DNA, 10 μΐ SYBR Green PCR Master Mix (Takara, Dalian, Κίνα) και 4 pmol κάθε ένα από τα εμπρός και αντίστροφους εκκινητές. Οι θερμικοί κύκλοι άρχισαν με ένα πρώτο στάδιο μετουσίωσης στους 95 ° C για 30 s, που ακολουθείται από 40 κύκλους των 95 ° C για 5 s και 60 ° C για 15 s και ο φθορισμός ενίσχυση παρακολουθήθηκαν στους 60 ° C στο τέλος της κάθε κύκλος. Μια πρότυπη καμπύλη κατασκευάστηκε χρησιμοποιώντας διαδοχικές αραιώσεις (1,0 έως 10

7 αντίγραφα του ιού JC DNA) του ιού JC Τ-αντιγόνου πλασμίδιο. Τρεις επαναλήψεις πραγματοποιήθηκαν για κάθε δείγμα και σε πραγματικό χρόνο δεδομένα PCR αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας το λογισμικό διαχείρισης Bio-Rad CFX. Οι κατά μέσο όρο αριθμούς αντιγράφων σε δείγματα υπολογίστηκαν σύμφωνα με την πρότυπη καμπύλη και οι παριστάνουν ως αντίγραφα του ιικού DNA ανά μικρογραμμάριο ϋΝΑ γονιδιώματος.

Στατιστικές μέθοδοι

Δημογραφικά χαρακτηριστικά συγκρίθηκαν μεταξύ ασθενών CRC (C) και τους ελέγχους (ασθενείς μη-CRC (Ν) ή υγιείς δότες (H)) χρησιμοποιώντας το

t του Student

-test για τις αριθμητικές μεταβλητές και το χ

2 τεστ για τις κατηγορικές μεταβλητές. Φύλο, η έκθεση του καπνού, η χρήση αλκοόλ, η κατοικία, το οικογενειακό ιστορικό CRC, παθογόνων στάδιο και όγκου ιστοσελίδα συγκρίθηκαν μεταξύ ιού JC-θετικά και -αρνητικοί CRC-ασθενείς που χρησιμοποιούν το χ

2 τεστ. κατάστασης διαφοροποίησης συγκρίθηκε μεταξύ του ιού JC-θετικών και -αρνητικοί CRC ασθενείς χρησιμοποιώντας το ακριβές τεστ του Fisher. Το ακριβές μοντέλο λογιστικής παλινδρόμησης, ρυθμίστηκε για την ηλικία, χρησιμοποιήθηκε για να εκτιμηθεί η συσχέτιση μεταξύ της λοίμωξης του ιού JC και CRC. R στατιστικού λογισμικού (ν 2.12.0, www.r-project.org/) χρησιμοποιήθηκε για τη στατιστική ανάλυση. Σε όλες τις αναλύσεις, ένα

P

-τιμή & lt? 0,05 θεωρήθηκε στατιστικά σημαντική

Αποτελέσματα

Τα δημογραφικά χαρακτηριστικά των 137 ασθενών CRC, 80 ασθενείς μη-CRC και 100 υγιείς δότες. βρίσκονται στον πίνακα 1. ασθενείς CRC ήταν μεγαλύτερα από ό, τι μη-CRC ασθενείς (

P

& lt? 0.001), αλλά δεν παρατηρήθηκε καμία διαφορά μεταξύ των ασθενών CRC και υγιείς δότες. Οικογενειακό ιστορικό CRC ήταν συχνότερη μεταξύ των CRC ασθενείς στίχους ασθενείς μη-CRC ή υγιών δοτών, αλλά οι διαφορές δεν ήταν στατιστικά σημαντικές (

P

= 0,491 για το C vs Ν,

P

= 0,162 για C vs η).

η

Όλα τα δείγματα ήταν θετικά για τον έλεγχο GAPDH, υποδεικνύοντας επαρκή ακεραιότητα των δειγμάτων. Οι αρνητικοί μάρτυρες και στους δύο γύρους της PCR δεν αποκάλυψαν ενδείξεις μόλυνση των αντιδραστηρίων. Χρησιμοποιώντας ένθετη PCR, η αλληλουχία νουκλεοτιδίων Τ-αντιγόνο του ιού JC ανιχνεύθηκε σε 40.9% (56 από 137) των ιστών όγκου και 24,8% (34 από 137) του όγκου-παρακείμενων ιστών από ασθενείς CRC (Σχήμα 1). Τα προϊόντα της PCR επιβεβαιώθηκαν ως αυθεντικές αλληλουχίες του ιού JC με ανάλυση συστοιχίας γυαλιού-ολίσθησης (Σχήμα 1Β). Βρήκαμε τις δύο ζεύγη του ιστού του όγκου και μη καρκινικούς ιστούς από 17,5% (24 από 137) των ασθενών CRC ήταν θετικοί για JCV DNA. 23,4% (32 από 137) και 7,3% (10 από 137) των ασθενών είχαν ιού JC DNA μόνο στον ιστό του όγκου ή μη καρκινικό όγκο-γειτονικό ιστό, αντίστοιχα (Σχήμα 1 C). 18,2% (25 από 137) του ΡΒ δείγματα από ασθενείς CRC ήταν θετικοί για JCV DNA. Ένα σημαντικά υψηλότερο παρουσία του ιού JC παρατηρήθηκε σε ιστούς CRC σε σύγκριση με μη-καρκινικές γειτονικούς ιστούς (Ή, 2.089? 95% CI, 1,213 έως 3,636?

P

= 0,007) και ΡΒ δείγματα (Ή, 3.084? 95% CI, 1,729 έως 5,619?

P

& lt? 0.001). παρουσία του ιού JC στο ΡΒ δείγματα ήταν θετικά που σχετίζονται με την ιδιότητα του ιού JC σε δείγματα ιστών (

P

& lt? 0.001)? Ωστόσο, δεν ήταν άσχετη με την ηλικία του ασθενούς, το φύλο, η έκθεση του καπνού, η χρήση αλκοόλ, η κατοικία, το οικογενειακό ιστορικό CRC, παθολογικό στάδιο και τοποθεσία του όγκου αλλά έτεινε να αυξηθεί με τη διαφοροποίηση των ιστών CRC, αν και η τάση αυτή δεν ήταν στατιστικά σημαντική (Πίνακας 2 ). Σε σύγκριση με ιστούς από ασθενείς CRC, μόνο 13,8% (11 από 80) του παχέος ιστών από ασθενείς που δεν είχαν ανιχνεύσιμη CRC JCV DNA. Στο μη παράμετρο στατιστική ανάλυση, JCV συχνότητες σε ασθενείς CRC και μη CRC ασθενείς ήταν σημαντικά διαφορετικές. Από την ηλικία των δύο ομάδων διέφεραν, η συσχέτιση μεταξύ της λοίμωξης του ιού JC και CRC υπολογίστηκε με ακριβή ανάλυση λογιστικής παλινδρόμησης, προσαρμοσμένο για την ηλικία. Η Ή του ιού JC σχετικό κίνδυνο CRC ήταν στατιστικά σημαντική (OR, 6.611? 95% CI, 2,928 έως 14,929?

P

& lt? 0.001). Μεταξύ των ΡΒ δείγματα από 100 υγιείς εθελοντές, διαπιστώσαμε ότι μόνο το 7% (7 από 100) ήταν θετικά για JCV DNA, το οποίο ήταν χαμηλότερο από το JCV θετικό ποσοστό σε ΡΒ δείγματα από ασθενείς CRC (OR, 0.339? 95% CI, 0.118 -0.852?

P

= 0.021)

(Α) Το θραύσμα 110 bp ενισχύθηκε από DNA που απομονώθηκε από αντίστοιχα δείγματα καρκίνου του παχέος εντέρου (άνω) και την κανονική του όγκου γειτονικούς ιστούς (κατώτερο) με. ένθετη PCR. Μ: DL 2.000 DNA δείκτης (Takara)? P: θετικός έλεγχος? Ν1: πρώτο γύρο αρνητικού ελέγχου? Ν2: αρνητικός μάρτυρας δεύτερο γύρο. (Β) Εικόνες από συστοιχίες προϊόν ιού JC ένθετη-PCR. Nested-PCR προϊόντα από ιστούς όγκων (αριστερά) και την κανονική του όγκου γειτονικούς ιστούς (δεξιά) κηλιδώθηκαν σε επιφάνειες αμινοσιλανίου διαφάνειες ως τρεις επαναλήψεις, υβριδοποιήθηκε με TAMRA-σημασμένο ανιχνευτή ολιγονουκλεοτίδιο και τελικά ορατά με ΑΞΩΝ σαρωτή. (Γ) Οι αριθμοί των δειγμάτων του ιού JC-θετική σε 137 ζεύγη του καρκινικού ιστού, μη καρκινικό ιστό παρακείμενο του όγκου και ΡΒ δείγματα από ασθενείς με CRC.

Η

Το ιικό φορτίο σε δείγματα ιού JC-θετικών από CRC ασθενείς προσδιορίσθηκαν με ποσοτική PCR πραγματικού χρόνου (qRT-PCR). Το ιικό φορτίο σε ιστούς όγκων κυμαίνονταν 49,15 – 1,03 × 10

4 αντίγραφα /μg DNA (μέση τιμή ± SD, 3795,64 ± 3054,58). Στην πραγματικότητα, οι απόλυτοι αριθμοί αντίγραφο του ιού JC DNA σε όγκους CRC ήταν χαμηλότερες από 1 αντίγραφο ανά κύτταρο. Χαμηλό ιικό φορτίο του ιού JC παρατηρήθηκε σε ιστούς 34 ιού JC-θετικό, μη-καρκινικές, όγκου-δίπλα (εύρος, 192,85 – 4,44 × 10

3 αντίγραφα /μg DNA? Μέσος όρος ± SD, 1470,09 ± 887,12) και 25 ΡΒ δείγματα ( φάσμα, 81,30 – 4.962,99 αντίγραφα /μg DNA? μέση τιμή ± SD, 945,17 ± 1140,39). ιστούς όγκων είχαν σημαντικά υψηλότερα επίπεδα του DNA του ιού JC από τους μη-καρκινικό όγκο-παρακείμενους ιστούς και ΡΒ δείγματα (Σχήμα 2).

JCV θετικών δειγμάτων προσδιορίζεται με ένθετη PCR αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας qRT-PCR. Οι κηλίδες αντιπροσωπεύουν κατά μέσο όρο αριθμούς αντιγράφων (3 φρεάτια επαναληπτικές) του ιού JC DNA για ιστό όγκου, μη καρκινικούς ιστούς και ΡΒ, αντίστοιχα, και τα μπαρ αντιπροσωπεύουν υπολογίζεται διαμέσους.

P

-τιμές υπολογίστηκαν με τη χρήση της δοκιμής του Wilcoxon του.

Η

Συζήτηση

Στην παρούσα μελέτη, ιού JC ανιχνεύθηκε στο 40,9% των ιστών CRC και το 24,8% των μη-καρκινικές παχέος ιστούς, τα οποία ήταν στην ενδιάμεση θέση του ρυθμού Τ-αντιγόνου σε προηγούμενες μελέτες (Πίνακας 3). Αρκετές πιθανούς λόγους ευθύνονται για την έλλειψη συμφωνίας μεταξύ των μελετών, συμπεριλαμβανομένης της πιθανής μόλυνσης κατά τη διάρκεια της συλλογής του δείγματος και τη διαδικασία κατά την εξαγωγή DNA και PCR ενίσχυση. Πολλές μελέτες δεν αναφέρουν κανένα βήμα για τον έλεγχο των ψευδώς θετικών αποτελεσμάτων [11] – [12], [14]. Στην παρούσα μελέτη, αποφύγαμε ψευδώς θετικά αποτελέσματα, όπως αναφέρεται στην προηγούμενη μελέτη μας [21]. Η ευαισθησία της μεθόδου είναι κρίσιμη, καθώς ένα χαμηλό ιικό φορτίο του ιού JC σε ορθοκολικό ιστό έχει τεκμηριωθεί [15]. Ανοσοϊστοχημεία, PCR, ένθετη PCR και q-RT PCR έχουν χρησιμοποιηθεί για την ανίχνευση του ιού JC [11], [14] – [15], [23]. JCV DNA ανιχνεύτηκε σε 1% και 0% των ιστών CRC σε δύο μεγάλες μελέτες [16] – [17] χρησιμοποιώντας ένα γενικό PCR δοκιμασία, η οποία είναι γνωστό ότι έχουν χαμηλότερη ευαισθησία. Ένθετη PCR είναι μια εξαιρετικά ευαίσθητη τεχνική για την ανίχνευση του ιού JC. Μικρότερα στόχοι PCR έχουν βρεθεί να είναι πιο εύκολα ενισχύεται από μακρές ακολουθίες για την ανίχνευση του ιού JC [11]. Όπως περιγράφεται από Hori et al. [13], χρησιμοποιήσαμε μια ένθετη PCR με σύνολα εκκινητών στόχευση ενός 110 bp JCV αλληλουχία Τ-αντιγόνου, η οποία ήταν σε θέση να ανιχνεύσει τόσο λίγα όσο 1 αντίγραφο του ιού JC DNA (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Έχει υποτεθεί το υπερελικωμένο τοπολογία του εξαιρετικά ομόλογου DNA του ιού JC μπορεί να περιορίσει την αποτελεσματικότητα επιμηκύνσεως PCR [11]. Ωστόσο, εμείς δεν χρησιμοποιούν τη θεραπεία της τοποϊσομεράσης Ι πριν την ενίσχυση PCR όπως περιγράφεται από Laghi et al. [11], η οποία μπορεί να οδηγήσει σε ελαφρώς χαμηλότερο ποσοστό της λοίμωξης του ιού JC. Την ηλικία, το φύλο, την περιοχή και τον τρόπο ζωής ενός επιλεγμένου πληθυσμού θα μπορούσαν να συμβάλλουν σε διαφορετικό ποσοστά μόλυνσης του ιού JC (Πίνακας 3). Ο πληθυσμός American CRC ήταν πιο συχνά επιλέγεται σε προηγούμενες μελέτες, στις οποίες διαπιστώθηκε JCV DNA σε 0% -96% των ιστών CRC [11], [14], [16] – [17], [24]. έχουν αντιφατικά αποτελέσματα έχουν αναφερθεί από δύο ιταλικές ομάδες έρευνας [12], [25]. Hori et al. [13] και Lin et al. [23] προσδιορίζονται ιού JC στο 26,1% και 86,4%, αντίστοιχα, των CRC ιστών από ασιατικούς πληθυσμούς. Στη μελέτη μας, του ιού JC DNA ανιχνεύθηκε στο 49,6% των ασθενών CRC κινέζικα.

Η

Ερευνήσαμε περαιτέρω την παρουσία του ιού JC DNA σε ιστό από ασθενείς μη-CRC. Σε ορισμένους ασθενείς υψηλού κινδύνου, όπως εκείνοι με πολύποδας ή IBD, η συχνότητα εμφάνισης CRC είναι σημαντικά υψηλότερο. Ως εκ τούτου, οι ασθενείς που υποβάλλονται σε κολονοσκόπηση για πολύποδα και IBD είχαν αποκλειστεί από την ομάδα ελέγχου πριν από τη συλλογή του δείγματος. Άλλα από την ηλικία, δεν υπήρχε αρχική χαρακτηριστική σημαντικά διαφορετική μεταξύ CRC και μη-CRC ασθενείς. Ωστόσο, η προσαρμογή για την ηλικία δεν αλλάζει τη σχέση μεταξύ της λοίμωξης του ιού JC και CRC. Συνδυάζοντας με την παρατήρηση της υψηλότερης συχνότητας του ιού JC στον ιστό του όγκου από ασθενείς CRC, προτείνουμε ότι JCV συσχετίζεται με CRC και μπορεί να συμμετέχει σε CRC καρκινογένεση ή, εναλλακτικά, ο ιός μολύνει τα κύτταρα όγκου ευκολότερα από μη καρκινικά κύτταρα.

στην παρούσα μελέτη, δεν παρατηρήθηκε συσχέτιση μεταξύ της παρουσίας του ιού JC και δημογραφικά ή ιατρικά χαρακτηριστικά όπως η ηλικία, το φύλο, την εκπαίδευση, κλινικό στάδιο, και θέση του όγκου, η οποία ήταν σύμφωνη με άλλες μελέτες [13], [15] . Είναι ενδιαφέρον, βρήκαμε ότι οι ιστοί από ασθενείς CRC που έλαβαν χημειοθεραπεία πριν από τη συλλογή του δείγματος είχε υψηλότερη συχνότητα εμφάνισης της λοίμωξης του ιού JC σε σύγκριση με τους ασθενείς χωρίς χημειοθεραπεία, αν και η διαφορά δεν ήταν σημαντική (Πίνακας 2). Η συσχέτιση μεταξύ ανοσοκαταστολή και αυξημένη ευπάθεια σε λοιμώξεις είναι καλά αναγνωρισμένη. Όπως αποδεικνύεται από Selgrad et al. [26] Σε μια αναδρομική μελέτη μεταξύ των δικαιούχων μεταμόσχευση ήπατος, ανοσοκατασταλμένους ασθενείς έχουν σημαντικά υψηλότερη παρουσία του ιού JC σε σύγκριση με την ομάδα ελέγχου με φυσιολογικό ανοσοποιητικό σύστημα. φάρμακα χημειοθεραπείας μπορούν να αναστέλλουν την ανοσολογική απάντηση και να επιτρέψει την επανενεργοποίηση της δυνητικά ογκογόνων ιών. ασθενείς CRC με οικογενειακό ιστορικό έχουν υψηλότερο επιπολασμό του DNA του ιού JC T-AG, η οποία είναι σύμφωνη με τα αποτελέσματα που περιγράφονται από Vilkin et al. [27]. μόλυνση ιού JC είναι συνήθως μια ασυμπτωματική λοίμωξη και συνήθως εμφανίζεται σε μεταγενέστερο παιδική και εφηβική ηλικία, μετά την οποία ο ιός παραμένει λανθάνων στο νεφρό. Εκτός από την πάθηση του ανοσοποιητικού αναφέρθηκε παραπάνω, το γενετικό υπόβαθρο θα μπορούσε επίσης να συνδέεται με την ευαισθησία της λοίμωξης του ιού JC σε CRC.

Το ιικό φορτίο σε δείγματα ιστών θα μπορούσε να δείξει το ρόλο του ιού JC σε CRC καρκινογένεση. Στην παρούσα μελέτη, JCV ιικό φορτίο σε θετικά δείγματα από ασθενείς CRC προσδιορίστηκαν με την Q-RT PCR. αριθμοί ιική αντιγραφή του ιού JC βρέθηκαν να είναι υψηλότερη σε ιστούς όγκων συγκριτικά με μη καρκινικό όγκο παρακείμενους ιστούς, η οποία είναι συνεπής με προηγούμενες μελέτες [11], [15]. Ωστόσο, οι απόλυτοι αριθμοί αντιγράφων σε ιστούς ήταν τόσο χαμηλή ώστε μόνο ένα μικρό μέρος του παχέος επιθηλιακά κύτταρα βρέθηκαν να είναι μολυσμένα με JCV. Το αποτέλεσμα αυτό υποστηρίζει τις παροδικές επιδράσεις του ιού JC στον κυτταρικό μετασχηματισμό, καθώς μπορεί να σιωπήσει ή του γονιδιώματος μπορεί να χαθούν κατά τη διάρκεια της εξέλιξης του καρκίνου (μετασχηματισμός «χτύπημα-και-run») [28]. Μια μόλυνση ιού JC εισαγωγή του Τ-αντιγόνου θα μπορούσε εύκολα να εξηγήσει την εμφάνιση της χρωμοσωμικής αστάθειας στην πολυσταδιακή καρκινογένεση, όπως αυτή που προτείνεται στο παρελθόν για την ακολουθία γνωστό αδένωμα-καρκινώματος [29].

Για το καλύτερο της γνώσης μας , η μελέτη αυτή είναι η πρώτη ανάλυση του ιού JC DNA σε PB από ασθενείς CRC. Δείξαμε ότι η μόλυνση του ιού JC είναι κοινή σε ΡΒ δείγματα από ασθενείς CRC και υποδεικνύεται κατάσταση JCV σε δείγματα ιστού. Σε αντίθεση με προηγούμενες μελέτες οροεπιδημιολογική, τα αποτελέσματά μας δεν μπορεί να χρησιμοποιηθεί για να προβλέψει τον κίνδυνο CRC επειδή όλα τα δείγματα συλλέχθηκαν εντός τριών μηνών από τη διάγνωση [19] – [20]. Επιπλέον, η παρουσία του ιού JC στο PB των ασθενών CRC ήταν υψηλότερη από ό, τι στο PB από υγιείς δότες. Αυτά τα αποτελέσματα υποστηρίζουν την άποψη ότι το DNA του ιού JC στο ΡΒ δείγματα θα μπορούσε να είναι ένας έγκυρος βιολογικός δείκτης για την ιού JC που σχετίζονται με CRC διάγνωση. Ωστόσο, τα ιατρικά χαρακτηριστικά από υγιείς δότες που καταγράφηκαν κυρίως μέσω της αυτο-έκθεση, η οποία μπορεί να οδηγήσει σε εσφαλμένη κατάταξη. Το πιο σημαντικό, JCV παραμένει σχεδόν πάντοτε λανθάνουσα στο νεφρό και μπορεί να ανιχνευθεί εύκολα στα ούρα [1] – [3]. Αν και το DNA του ιού στο αίμα είναι ευρέως θεωρείται ότι προέρχονται από κύτταρα που αποβάλλονται από τον ιστό του όγκου, η προέλευση του ιού JC σε δείγματα PB παραμένει άγνωστη.

Εν κατακλείδι, η μόλυνση ιού JC παρουσιάζει συχνά σε ασθενείς CRC και θα μπορούσε να είναι μια παράγοντας κινδύνου για CRC. Προτείνουμε συνεχιζόμενη μοριακό, κυτταρικό και

in vivo μελέτες

για τη διαλεύκανση των μηχανισμών του ιού JC καρκινογένεσης να καθοριστεί αν JCV είναι ένας αιτιολογικός παράγοντας της CRC. Παρά το γεγονός ότι βρήκαμε ιού JC DNA σε δείγματα ΡΒ θα μπορούσε να χρησιμεύσει ως βιοδείκτη για την ιού JC που σχετίζονται με CRC, οι περισσότερες μεγάλης κλίμακας πληθυσμιακές μελέτες ενθαρρύνονται να αξιολογήσει αυτή τη συσχέτιση.

Ευχαριστίες

Οι συγγραφείς ευχαριστήσω Xiaoyi Chen, Li Yuan, Yiming Τανγκ, και Xutao Χονγκ για την τεχνική υποστήριξή τους, Michael Brownstein για κριτική ανάγνωση του χειρογράφου μας.