Αφηρημένο

ειδική ουβικιτίνης πρωτεάση 42 (USP42) είναι μέλος του αποουβικιτινίωσης ενζύμων (αποκαλεί). Οι αλλοιώσεις του Dubs εμπλέκεται στην παθογένεση μιας μεγάλης ποικιλίας όγκων. Ωστόσο, υπάρχουν ελάχιστες μελέτες επί της έκφρασης και η βιολογική λειτουργία των USP42 σε γαστρικό καρκίνο (GC). Εδώ, τα επίπεδα έκφρασης του USP42 ήταν σημαντικά υψηλότερα σε ιστούς GC από ότι σε μη-ογκογόνους ιστούς. έκφραση USP42 συσχετίστηκε σημαντικά με το μέγεθος του όγκου, το στάδιο TNM, μετάσταση λεμφαδένα και τη συνολική επιβίωση των ασθενών με GC. Επιπλέον, USP42 φίμωση σε δύο κυτταρικές σειρές GC, AGS και ΜΚΝ-45, ο πολλαπλασιασμός κυρίως ανέστειλε κυττάρων, αλλά τόνωσε G1 σύλληψη φάση. Οι πρωτεΐνες προώθηση πρόοδο του κυτταρικού κύκλου (Κυκλίνη D1, κυκλίνη Ε1 και PCNA) έχουν κάτω-ρυθμιζόμενη σε κύτταρα USP42-καταστέλλεται. Επιπλέον, η αναστολή της USP42 σε κύτταρα GC εξασθενημένη κυτταρική εισβολή μέσω επηρεάζουν την έκφραση των μεταλλοπρωτεϊνασών μήτρας (MMPs) και επιθηλιακά-μεσεγχυματικά μετάβαση (ΕΜΤ) ρυθμιστές. Εν κατακλείδι, USP42 υπερέκφραση θα μπορούσε να είναι ένας πιθανός προγνωστικός δείκτης για GC, ρυθμίζουν την επιβίωση και την επεμβατική ιδιότητες του GC, και μπορεί να αντιπροσωπεύει μια νέα θεραπευτική μοριακός στόχος για αυτού του όγκου

Παράθεση:. Χου K, Zhu Ζ, Γουάνγκ Υ, Ζανγκ C, Yu S, Zhu Q, et al. (2016) Η υπερέκφραση και η βιολογική λειτουργία των ειδικών-ουβικιτίνης πρωτεάση 42 σε γαστρικό καρκίνο. PLoS ONE 11 (3): e0152997. doi: 10.1371 /journal.pone.0152997

Επιμέλεια: Jung Weon Lee, Εθνικό Πανεπιστήμιο της Σεούλ, Δημοκρατία της Κορέας

Ελήφθη: 29 Δεκέμβρη 2015? Αποδεκτές: 22 Μάρ 2016? Δημοσιεύθηκε: 31 Μαρ, 2016

Copyright: © 2016 Hou et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Δεδομένα Διαθεσιμότητα:. Όλη η δεδομένα είναι εντός του χαρτιού

Χρηματοδότηση:. η μελέτη αυτή χρηματοδοτήθηκε από την επιστημονική Έρευνα Έργο της Σαγκάης Δημοτική Επιτροπή Υγείας και Οικογενειακού Προγραμματισμού (20124321)

Αντικρουόμενα συμφέροντα:. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα.

Εισαγωγή

Καρκίνος στομάχου (GC) είναι η πέμπτη πιο κοινή μορφή καρκίνου [1] και η τρίτη κύρια αιτία του καρκίνου του θανάτου [2]. Επί του παρόντος, γνωστών κύριων παραγόντων κινδύνου για GC περιλαμβάνουν το ελικοβακτηρίδιο του πυλωρού (H. pylori), το περιβάλλον διαβίωσης, τη διατροφή, τη γενετική και ανοσολογικοί παράγοντες, και χρόνιες παθήσεις του στομάχου [3]. Η πρόγνωση μεταξύ των ασθενών με GC είναι γενικά κακή, επειδή ο όγκος έχει κάνει μετάσταση συχνά και οι περισσότεροι ασθενείς είναι ηλικιωμένοι (μεσαία ηλικία άνω των 70 ετών) κατά τη στιγμή της διάγνωσης. Το ποσοστό επιβίωσης 5 ετών για GC αναφέρεται ότι είναι λιγότερο από 25% [4]. Είναι μεγάλη κλινική σημασία για τον προσδιορισμό ευαίσθητων διαγνωστικών και προγνωστικών δεικτών του GC, τη διερεύνηση μοριακών μηχανισμών της ανάπτυξης GC, και να εξερευνήσετε νέους στόχους θεραπεία της ασθένειας αυτής.

ειδική ουβικιτίνης πρωτεάση 42 (USP42) είναι ένα ένζυμο αποουβικιτινίωσης (DUB) που εκφράζεται ευρέως σε διάφορους ανθρώπινους ιστούς [5]. Ουβικιτινίωση, ένας αναστρέψιμος μετα-μεταφραστική τροποποίηση, εμπλέκεται σε πολλαπλές κυτταρικές διεργασίες, όπως τον κυτταρικό κύκλο, την επιδιόρθωση του DNA και την απόπτωση [6, 7]. Αύξηση απόδειξη έχει αποδείξει ότι αλλαγμένη λειτουργία DUB εμπλέκεται στην παθογένεση μιας μεγάλης ποικιλίας όγκων [8]. Η υπερέκφραση του USP9X, USP9Y, USP10 και USP25 αποκαλύφθηκε στον καρκίνο του μαστού με δισδιάστατη ηλεκτροφόρηση σε πήκτωμα πολυακρυλαμιδίου και πρωτεομική ανάλυση [9]. Μερικές μελέτες έχουν δείξει ότι η υπερέκφραση USP22 προωθείται εξέλιξη του καρκίνου και κακή πρόγνωση του γλοιώματος, καρκίνου του παγκρέατος, καρκίνο του τραχήλου της μήτρας και του καρκίνου του πνεύμονα [10-13]. USP42 έχει προηγουμένως βρεθεί να αναδιαμορφωθούν στην οξεία μυελογενή λευχαιμία [14]. Ωστόσο, απ ‘όσο γνωρίζουμε, καμία έρευνα έχει διεξαχθεί επί του προτύπου έκφρασης και βιολογικές λειτουργίες του USP42 σε GC.

Στην παρούσα μελέτη, τα επίπεδα mRNA USP42 σε ιστούς GC βρέθηκαν να είναι σημαντικά υψηλότερα σε επίπεδα ελέγχων . Περαιτέρω ανάλυση έδειξε κλινικά χαρακτηριστικά ότι το επίπεδο έκφρασης USP42 συσχετίστηκε με τη συνολική επιβίωση των ασθενών GC. Στη συνέχεια εφαρμόζεται η τεχνολογία παρεμβολής RNA (RNAi) για να χτυπήσει κάτω την έκφραση της USP42 σε δύο κυτταρικές σειρές GC (AGS και ΜΚΝ-45 κύτταρα), και διερευνήθηκαν τον πολλαπλασιασμό, του κυτταρικού κύκλου και επεμβατική ικανότητα στις δύο κυτταρικές σειρές. Τα στοιχεία μας δείχνουν ότι USP42 είναι ένα ισχυρό ογκογονίδιο σε GC, παρέχοντας μας με ένα μελλοντικό στόχο για θεραπεία GC.

Υλικά και Μέθοδοι

δείγματα ιστών

Ένα σύνολο των 90 GC ασθενείς που υποβάλλονται σε χειρουργική επέμβαση στο Τμήμα Γενικής Χειρουργικής, Λαϊκό Νοσοκομείο, Pudong New District (Σανγκάη, Κίνα) τον Φεβρουάριο του 2007 και τον Ιούνιο του 2009 συμμετείχαν σε αυτή τη μελέτη. Η μέση ηλικία των ασθενών ήταν 56 έτη (εύρος: 34 με 68 ετών). Όλοι οι ασθενείς έλαβαν γραπτή ενημερωμένη συγκατάθεση. Η μελέτη εγκρίθηκε από την επιτροπή ανεξάρτητη ηθική της Shanghai Pudong Περιφερειακό Νοσοκομείο Λαϊκό (Σαγκάη, Κίνα). Δείγματα ιστού του όγκου ελήφθησαν από όλους τους ασθενείς GC. Εν τω μεταξύ, 42 συμφωνημένα μη-νεοπλασματικές δείγματα που βρίσκεται & gt? 3 εκατοστά μακριά από τον όγκο συλλέχθηκαν. Όλα τα χειρουργικά δείγματα καταψύχθηκαν σε υγρό άζωτο αμέσως μετά από χειρουργική εκτομή, και αποθηκεύτηκαν στους -80 ° C μέχρι την εκχύλιση του RNA.

Οι κυτταρικές σειρές

Οι κυτταρικές σειρές που προέρχονται από ανθρώπινο γαστρικό καρκίνο, συμπεριλαμβανομένων AGS, SGC-7901, BGC-823, ΜΚΝ-28 και ΜΚΝ-45 ελήφθησαν από το Ινστιτούτο Βιοχημείας και Βιολογίας Κυττάρου, κινεζική Ακαδημία Επιστημών (Σαγκάη, Κίνα). Όλες οι κυτταρικές γραμμές διατηρήθηκαν σε μέσο RPMI 1640 (Gibco, Grand Island, ΝΥ, USA) συμπληρωμένο με 10% ορό εμβρύου βοός (FBS) και αντιβιοτικά στους 37 ° C σε υγροποιημένη ατμόσφαιρα με 5% CO

2.

επιλέχθηκαν σίγαση του USP42 από μικρό παρεμβαλλόμενο RNA (siRNA)

siRNA ειδικό για την ανθρώπινη USP42 (5′-AUGGCCUCUGGUAUCAAAU-3 ‘). Ένα μη-ειδική ακολουθία αγωνίζομαι siRNA (sinc) χρησιμοποιήθηκε ως αρνητικός μάρτυρας. Τα siRNAs επιμολύνθηκαν παροδικά σε AGS ή ΜΚΝ-45 κύτταρα χρησιμοποιώντας lipofactamine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Οι δοκιμασίες διεξήχθησαν 48 ώρες μετά την επιμόλυνση.

Real-time PCR

Το συνολικό RNA εξήχθη χρησιμοποιώντας το αντιδραστήριο ΤΚΙζοΙ (Invitrogen) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Η αντίστροφη αντίδραση μεταγραφής πραγματοποιήθηκε με τυχαία εναύσματα εξαμερές και ένα κιτ μεταγραφάσης SuperScript Reverse (Invitrogen). Το προκύπτον cDNA χρησιμοποιήθηκε ως μήτρα για PCR πραγματικού χρόνου πραγματοποιήθηκε με ένα πρότυπο κιτ SYBR Green PCR (Fisher Scientific, Rockford, IL, USA) επί ABI7300 (Applied Biosystem, Foster City, CA, USA) θερμικό κυκλοποιητή. GAPDH χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος του επιπέδου RNA εισόδου. Όλες οι αντιδράσεις διεξήχθησαν χρησιμοποιώντας τις ακόλουθες παραμέτρους ποδηλασία, 95 ° C για 10 λεπτά, ακολουθούμενη από 40 κύκλους των 95 ° C για 15 s, 60 ° C για 45 s. Για την επαλήθευση ειδική ενίσχυση των προϊόντων, τα προϊόντα κατόπιν υποβλήθηκαν σε ανάλυση καμπύλης διαχωρισμού. Η έκφραση του γονιδίου υπολογίστηκε με τη μέθοδο της Δ Ct. Όλα τα δεδομένα αντιπροσωπεύουν το μέσο όρο τριών επαναλήψεων. Οι αλληλουχίες των ειδικών εκκινητών ήταν ως εξής: USP42 mRNA προς τα εμπρός, 5′-ATGGAAAGCAGGGATGAC-3 ‘, και USP42 mRNA-αντίστροφη, 5′- ACGCAGATTGGAACAGAG-3′? GAPDH mRNA προς τα εμπρός, 5’-CACCCACTCCTCCACCTTTG-3 ‘, και GAPDH mRNA αντιστραφεί, 5′-CCACCACCCTGTTGCTGTAG-3’.

Αντισώματα και κηλίδωση Western

Τα αντισώματα έναντι CyclinD1, E-cadherin, β κατενίνης, Snail1 και GAPDH αγοράσθηκαν από τη Cell Signaling Technology (Danvers, ΜΑ, USA). Αντισώματα έναντι USP42, CyclinE1, PCNA, και ΜΜΡ-9 ήταν από Abcam (Cambridge, ΜΑ, USA). Αντι-ΜΜΡ-2 ήταν από Epitomics (Burlingame, CA, USA). συζευγμένο με υπεροξειδάση δευτερογενή αντισώματα Χρένα ήταν από Beyotime Biotechnology (Shanghai, Κίνα).

Τα κύτταρα πλύθηκαν τρεις φορές με PBS και στη συνέχεια υπέστησαν λύση σε προ-ψυγμένο ραδιοανοσοκατακρήμνισης (RIPA) ρυθμιστικό δοκιμασίας σε πάγο για 10 λεπτά. Μετά την απομάκρυνση των κυτταρικών συντριμμάτων με φυγοκέντρηση (12.000 g, 10 λεπτά), η συγκέντρωση πρωτεΐνης των υπερκειμένων μετρήθηκε με BCA κιτ δοκιμασίας πρωτεΐνης (Thermo Fisher Scientific). Μετά από βρασμό για 5 λεπτά σε ρυθμιστικό διάλυμα δείγματος, ίση ποσότητα των πρωτεϊνών των διαφόρων ομάδων διαχωρίστηκαν με SDS-PAGE, και μεταφέρθηκαν σε σε μια μεμβράνη νιτροκυτταρίνης (Millipore, Bredford, USA). Μετά από αποκλεισμό με 5% αποβουτυρωμένο γάλα, οι μεμβράνες επωάστηκαν με τα πρωτογενή αντισώματα στους 4 ° C όλη τη νύκτα με ανάδευση, ακολουθούμενη από επώαση με αντίστοιχα δευτερογενή αντισώματα για 1 ώρα σε θερμοκρασία δωματίου με ανάδευση. Αντιδραστική πρωτεΐνη στη συνέχεια ανιχνεύεται με χρήση ECL σύστημα χημειοφωταύγειας (Bio-Rad, Richmond, CA, USA).

Προσδιορισμός πολλαπλασιασμού κυττάρων με CCK-8

Η δοκιμασία CCK-8 εκτελέστηκε με πρότυπες μεθόδους σε πιάτα 96 φρεατίων. Εν συντομία, 3 χ 10

3 κύτταρα σπάρθηκαν ανά φρεάτιο. Σε υποδεικνυόμενο χρονικό σημείο, διάλυμα CCK-8 (10 μλ σε 100 μΐ RPMI-1640) προστέθηκε σε κάθε φρεάτιο και επωάστηκαν για 1 ώρα. Απορρόφηση στα 450 nm ανιχνεύθηκε χρησιμοποιώντας μια συσκευή ανάγνωσης μικροπλάκας.

In vivo όγκου που φέρουν γυμνό μοντέλο ποντικών

Πειράματα σε ζώα έχουν εγκριθεί και εκτελείται σύμφωνα με τις κατευθυντήριες γραμμές της φροντίδας των ζώων και την Επιτροπή Χρήση της Shanghai Pudong Περιφέρεια Λαϊκό Νοσοκομείο (Σαγκάη, Κίνα). Δώδεκα BALB /c γυμνά ποντίκια ηλικίας 4-5 εβδομάδων (Animal SLAC, Σαγκάη, Κίνα) διατηρήθηκαν κάτω από ειδικές συνθήκες ελεύθερες παθογόνων χρησιμοποιώντας ένα ράφι στρωτή ροή αέρα και είχαν συνεχή ελεύθερη πρόσβαση σε αποστειρωμένη τροφή και νερό σε αυτόκλειστο. Τα πειράματα ξεκίνησαν μετά από 1 εβδομάδα εγκλιματισμού. AGS κύτταρα (2 χ 10

6) εγχύθηκαν υποδορίως στην δεξιά πλευρά γυμνών ποντικών για τη δημιουργία ξενομοσχεύματος μοντέλο όγκου που φέρει. Δέκα ημέρες μετά την υποδόρια ένεση, τα ποντίκια χωρίστηκαν τυχαία σε δύο ομάδες (η = 6 /ομάδα) και IV ένεση με USP42 siRNA ή Sinc περιέχουν σκευάσματα δύο φορές την εβδομάδα. Το ελάχιστο και το μέγιστο διάμετρος του όγκου μετρήθηκε με παχύμετρο σε διαστήματα 4 ημερών, και ο όγκος του όγκου (mm

3) υπολογίστηκε χρησιμοποιώντας τον ακόλουθο πρότυπο τύπο: (η μικρότερη διάμετρος)

2 × (η μεγαλύτερη διάμετρος ) × 0.5. 36 ημέρες μετά την τοποθέτηση του όγκου, οι ποντικοί θανατώθηκαν με αυχενική εξάρθρωση και ανακτήθηκαν οι όγκοι. Εξετάστηκαν Τα υγρά βάρη εκάστου όγκου. Κατά τη διάρκεια της πειραματικής διαδικασίας, όλοι οι ποντικοί παρακολουθήθηκαν καθημερινά. Αριθ ποντίκια πέθαναν πριν από την πειραματική παράμετρο.

κυτταρικού κύκλου ανάλυση

Τα κύτταρα θρυψινοποιήθηκαν, πλύθηκαν δύο φορές σε PBS και σταθεροποιήθηκαν επί μία νύκτα στους 4 ° C σε παγωμένο 70% αιθανόλη. Τα κύτταρα στη συνέχεια πλύθηκαν δύο φορές σε PBS, και επωάζονται σε ιωδιούχο προπίδιο (ΡΙ) χρώση ρυθμιστικό (5 μg /mL ΡΙ και 0,25 mg /mL RNase, Sigma, St. Louis, ΜΟ, USA) σε θερμοκρασία δωματίου για 30 λεπτά. Τα κύτταρα στη συνέχεια αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας ένα χρησιμοποιώντας ένα FACScan κυτταρομετρία ροής (BD Biosciences, San Jose, CA, USA). Τα ποσοστά των κυττάρων σε G0 /G1, S και G2 /M φάση προσδιορίσθηκαν με χρώση ΡΙ.

προσδιορισμούς κυττάρων εισβολή

Για να μετρηθεί η επεμβατική δυναμικό κυττάρου των κυττάρων, δοκιμασίες Transwell έγιναν χρησιμοποιώντας ένα Matrigel επικαλυμμένα θαλάμου Boyden (BD Biosciences). Τα κύτταρα στερούνται ορού επί μία νύκτα, συλλέχθηκαν και επαναιωρήθηκαν σε μέσο απαλλαγμένο από ορό. Κύτταρα (1 χ 10

5) στη συνέχεια προστέθηκε στον ανώτερο θάλαμο. Μέσο που περιέχει 10% FBS προστέθηκε στον κάτω θάλαμο. Αφού τα κύτταρα επωάστηκαν στους 37 ° C για 24 ώρες, τα κύτταρα επί της άνω επιφάνειας της μεμβράνης απομακρύνθηκαν πλήρως χρησιμοποιώντας τις άκρες βαμβάκι. Οι διακινούμενοι κύτταρα που συνδέονται με την κάτω επιφάνεια μονιμοποιήθηκαν σε 4% παραφορμαλδεΰδη και χρωματίστηκαν με 0.5% κρυσταλλικό ιώδες. Ο αριθμός των μετανάστευσαν κύτταρα στην κάτω επιφάνεια της μεμβράνης μετρήθηκε κάτω από ένα μικροσκόπιο σε πέντε τομείς στους 100 ×.

Βιοπληροφορική ανάλυση

Η γαστρική σύνολα δεδομένων καρκίνο είχαν κατεβάσει από το NCBI Gene Expression Omnibus βάση δεδομένων (ID πρόσβασης: GSE26253) και ο καρκίνος Γονιδιώματος Atlas (TCGA). Για να διερευνήσουν περαιτέρω τις βιολογικές οδούς που εμπλέκονται στην παθογένεια του γαστρικού καρκίνου μέσω USP42 οδού, Gene που εμπλουτισμό ανάλυση (GSEA) πραγματοποιήθηκε με τη χρήση της διαθέσιμης στο κοινό λογισμικό από το Ινστιτούτο Broad του MIT (https://www.broad.mit.edu/gsea/λογισμικού /software_index.html) όπως περιγράφηκε προηγουμένως [15]. Για κάθε σετ γονιδίων, GSEA ορίζει ένα αποτέλεσμα εμπλουτισμού (ES), η οποία αντανακλά τη συσχέτιση μεταξύ του συνόλου των γονιδίων και του δείγματος.

Η στατιστική ανάλυση

ανάλυση επιβίωσης Kaplan-Meier διεξήχθη χρησιμοποιώντας MedCalc ( Mariakerke, Βέλγιο). Η Στατιστική Package for Social Sciences (SPSS) έκδοση 17.0 (SPSS Inc., Chicago, IL) χρησιμοποιήθηκε για την άλλη στατιστική ανάλυση. Τα αποτελέσματα των πειραμάτων εκφράζονται ως μέση τιμή ± SD. t δοκιμή Student χρησιμοποιήθηκε για να συγκρίνει τις τιμές των δειγμάτων δοκιμής και ελέγχου. Chi-square test χρησιμοποιήθηκε για να προσδιορίσει τις διαφορές μεταξύ κατηγορικών μεταβλητών. Στατιστικά σημαντικές διαφορές ορίζονται ως έχουσες

P

& lt?. 0.05

Αποτελέσματα

Η έκφραση της USP42 στο γαστρικό καρκίνο

Για να εξερευνήσετε την έκφραση της USP42 σε GC, εκτελέσαμε ανάλυση σε πραγματικό χρόνο PCR με GC (n = 90) και τα δείγματα noncancerous ιστού (n = 42). Η σχετική έκφραση των USP42 mRNA σε σύγκριση με GAPDH υπολογίστηκαν χρησιμοποιώντας τη μέθοδο △ Ct. Σαφώς, η έκφραση USP42 mRNA ήταν υψηλότερη σε ιστούς GC σε σχέση με το μη καρκινικό ιστούς (Σχήμα 1Α). Για την περαιτέρω επαλήθευση αυτή τη διαπίστωση, μπορούμε εκ νέου αναλύθηκαν τα δεδομένα μικροσυστοιχιών από TCGA σύνολο δεδομένων ανεξάρτητων GC. Σχήμα 1Β έδειξε εμφανή υπερέκφραση του USP42 σε ανθρώπινους ιστούς GC σε σχέση με φυσιολογικούς ιστούς.

A. Τα επίπεδα mRNA του USP42 σε σχέση με την έκφραση GAPDH σε GC και μη ογκογόνους ιστούς προσδιορίστηκαν χρησιμοποιώντας PCR πραγματικού χρόνου (

P

& lt? 0,0001). B. Η έκφραση των USP42 στο GC και φυσιολογικούς ιστούς βασίζεται σε TCGA σύνολο δεδομένων (

P

& lt? 0,0001). ανάλυση Γ επιβίωσης έδειξε ότι οι ασθενείς με όγκους έκφραση USP42-υψηλότερο έχουν χαμηλότερη συνολική επιβίωση από αυτούς με όγκους έκφραση USP42-κάτω (

P

= 0,0141). Ανάλυση Δ επιβίωσης για GSE26253 σύνολο δεδομένων.

Η

Χρησιμοποιώντας τη μέση τιμή των 2

-ΔCt (0.550) ως cut-off μεταξύ χαμηλού επιπέδου και υψηλού επιπέδου έκφραση USP42 mRNA, 90 ασθενείς ήταν κατατάσσονται σε χαμηλές (& lt? 0.550) και υψηλής υποομάδες έκφραση USP42 (≥0.550). Όπως φαίνεται στον Πίνακα 1, USP42 συσχετίστηκε σημαντικά με το μέγεθος του όγκου (

P

= 0.0328), το στάδιο TNM (

P

= 0,0059) και μετάσταση στους λεμφαδένες (

P

= 0,0184). Ωστόσο, δεν υπήρξε σημαντική συσχέτιση μεταξύ της έκφρασης UP42 και άλλων χαρακτηριστικών του ασθενούς, συμπεριλαμβανομένου του φύλου και της ηλικίας των ασθενών κατά τη διάγνωση και τη θέση του όγκου. Kaplan-Meier ανάλυση επιβίωσης έδειξε ότι ο συνολικός χρόνος επιβίωσης ήταν σημαντικά μικρότερη σε ασθενείς με υψηλότερη έκφραση USP42 από ότι σε ασθενείς με χαμηλότερη έκφραση USP42 (σχήμα 1Γ, P & lt? 0.05), η οποία επιβεβαιώθηκε περαιτέρω με ανάλυση επιβίωσης για ArrayExpress σύνολο δεδομένων (id Access : GSE26253, σχήμα 1Δ)

η

USP42 siRNA κατασταλεί η έκφραση USP42

Σύγκριση των διαφόρων κυτταρικών γραμμών γαστρικού καρκίνου αποκάλυψε ότι το επίπεδο έκφρασης της USP42 πρωτεΐνης στο AGS και ΜΚΝ-45 κύτταρα είναι. υψηλότερη από εκείνη των SGC-7901, BGC-823 και ΜΚΝ-28 κύτταρα (Σχ 2Α). Ως εκ τούτου, AGS και ΜΚΝ-45 κύτταρα επιλέχθηκαν για τα επόμενα πειράματα. Να διερευνήσει τις λειτουργίες του USP42 με GC, έχουμε χτυπήσει ήπιε έκφραση USP42 σε κυτταρικές σειρές GC με siRNA επιμόλυνση. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 2Β, siRNA ειδικό για USP42 αξιοσημείωτα κατέστειλε την έκφραση USP42 σε AGS και ΜΚΝ-45 κυττάρων με μία αναλογία καταστολής του 60,4% και 74,4%, αντίστοιχα. Στη συνέχεια ανέλυσε το αν η καταστολή της έκφρασης USP42 θα αλλάξει το ρυθμό ανάπτυξης των κυττάρων του GC. Όπως φαίνεται στο Σχ 2C, υπήρξε μια σημαντική μείωση στο ρυθμό ανάπτυξης του USP42-κατέστειλε κύτταρα σε σύγκριση με τα Sinc-επιμολυσμένα κύτταρα.

A. τα επίπεδα της πρωτεΐνης USP42 προσδιορίστηκαν σε διάφορες κυτταρικές σειρές GC με κηλίδα Western και κανονικοποιούνται σε GAPDH. B. USP42 φίμωση αποτελεσματικότητα των siRNA επιμόλυνσης σε AGS και ΜΚΝ-45 κύτταρα αξιολογήθηκε με στύπωμα Western. Γ USP42 σίγηση από siRNA διαμόλυνση είχε ως αποτέλεσμα την αναστολή της ανάπτυξης όπως ανιχνεύεται με CCK-8 δοκιμασία στην AGS και ΜΚΝ-45 κύτταρα. Κύτταρα επιμολυσμένα με USP42 siRNA ή μη φίμωση siRNA (sinc) για 48 ώρες, μαζί με μη επεξεργασμένα κύτταρα, σπάρθηκαν σε πλάκες 96-φρεατίων, και η βιωσιμότητα των κυττάρων προσδιορίστηκε σε υποδεικνυόμενα χρονικά σημεία. *

P

& lt? 0,05, **

P

& lt? 0,01, ***

P

& lt?. 0.001 σε σύγκριση με sinc

Η

USP42 siRNA κατέστειλε την ανάπτυξη του όγκου σε γυμνούς ποντικούς

για να προσδιοριστεί η επίδραση της USP42 siRNA για ογκογονικότητα ίη νίνο, ίσο αριθμό κυττάρων AGS εγχύθηκε υποδορίως σε γυμνούς ποντικούς και USP42-siRNA ήταν IV ενίεται μετά το σχηματισμό όγκων. Ο ρυθμός ανάπτυξης όγκου των ποντικών που έλαβαν ένεση με USP42-siRNA ήταν σημαντικά βραδύτερη από εκείνη των ποντικών που ενέθηκαν με έλεγχο siRNA (σχήμα 3Α). Ο όγκος και το βάρος των όγκων USP42-siRNA ήταν λιγότερο από το 25% των όγκων που ελέγχου (σχήμα 3Β). Περαιτέρω, σε σύγκριση με τους όγκους ελέγχου, USP42 και PCNA μειώθηκαν σημαντικά σε όγκους με έγχυση USP42-siRNA (Σχ 3C).

A. Ο όγκος του όγκου μετρήθηκε μετά USP42 siRNA (siRNA) ή ελέγχου siRNA (sinc) ένεση. B. Τα ποντίκια θυσιάστηκαν και οι όγκοι ανακτήθηκαν σε 36 ημέρες μετά από την τοποθέτηση του όγκου. Οι εικόνες (άνω πάνελ) και βάρους (η = 6, εκφράζονται ως μέση τιμή ± SD, κάτω πίνακας) της ανακτήθηκαν όγκοι εμφανίστηκαν. C. Η έκφραση του USP42 και PCNA σε όγκους από την γυμνούς ποντικούς προσδιορίστηκε με κηλίδα western. *

P

& lt? 0,05, **

P

& lt? 0,01, ***

P

& lt?. 0.001 σε σύγκριση με sinc

Η

Induced G0 σύλληψης /G1 φάση USP42-κατέστειλε τα καρκινικά κύτταρα

για να μάθετε πώς έκφρασης υψηλότερο USP42 επηρεάζονται πολλαπλασιασμό των κυττάρων GC, πραγματοποιήσαμε Gene Σετ Εμπλουτισμός Ανάλυση (GSEA) για TCGA σύνολο δεδομένων, αναλύοντας τη σχέση της έκφρασης USP42 και τα γονίδια σε εγκυκλοπαίδεια Κιότο γονιδίων και γονιδιωμάτων (KEGG) μονοπάτι κυτταρικού κύκλου. Είναι ενδιαφέρον, βρήκαμε ότι η έκφραση υψηλότερη USP42 συσχετίστηκε θετικά με την KEGG μονοπάτι κυτταρικού κύκλου σε ασθενείς GC με βάση TCGA σύνολο δεδομένων (Εικόνα 4Α). Στη συνέχεια αναλύθηκαν διανομή του κυτταρικού κύκλου των κυττάρων GC με USP42 knockdown. Καταστολή της έκφρασης USP42 μείωσε τον πληθυσμό των κυττάρων φάσης S και οδήγησε σε G1 σύλληψη στο AGS και ΜΚΝ-45 κύτταρα (Σχήμα 4Β). Για την περαιτέρω διερεύνηση του κυτταρικού μηχανισμού υποκείμενων πολλαπλασιασμό USP42-επαγόμενο κυτταρικό, αξιολογήθηκαν τα επίπεδα πρωτεΐνης των πρωτεϊνών του κυτταρικού κύκλου. USP42 knockdown μείωσε σημαντικά την έκφραση της κυκλίνης D1, κυκλίνης Ε1 και PCNA (Σχήμα 4C). Έτσι, αυτά τα αποτελέσματα έδειξαν ότι μια μείωση του επιπέδου της έκφρασης USP42 ανέστειλε Κυκλίνη D1, κυκλίνη Ε1 και έκφραση PCNA σε κύτταρα GC, το οποίο μπορεί να επάγει G0 /σύλληψη G1 φάση, να μειώσει σημαντικά τον αριθμό των κυττάρων φάσης S και αναστέλλει τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων.

Α. ανάλυση GSEA σε ασθενείς GC με υψηλότερη έκφραση USP42 έναντι χαμηλότερη έκφραση USP42 με βάση TCGA σύνολα δεδομένων. KEGG μονοπάτι κυτταρικού κύκλου συνδέθηκε με USDP42-υψηλότερη έκφραση. Ο εμπλουτισμός βαθμολογία (ES, πράσινη γραμμή) αντανακλά τη συσχέτιση μεταξύ της οδού του κυτταρικού κύκλου και του δείγματος. Μαύρο μπάρες δείχνουν προηγουμένως γνωστά γονίδια που συνδέονται με μονοπάτι κυτταρικού κύκλου. Β USP42 σίγασης που προκάλεσε G0 /G1 σύλληψη στα κύτταρα GC. ιστογράμματα FACS και ανάλυση του κυτταρικού κύκλου του AGS και ΜΚΝ-5 κύτταρα. Ποσοτικοποίηση του ποσοστού των κυττάρων σε G0 /G1, S και G2 /M φάση δείχθηκε. C. Έκφραση των βασικών πρωτεϊνών σε κυτταρικό κύκλο προσδιορίστηκε με κηλίδα western. Όλες οι δοκιμασίες πραγματοποιήθηκαν εις τριπλούν. *

P

& lt? 0,05, **

P

& lt? 0,01, ***

P

& lt?. 0.001 σε σύγκριση με sinc

Η

χαμηλό επεμβατική δυναμικό της USP42-κατέστειλε τα καρκινικά κύτταρα

GSEA ανέφερε επίσης ότι η έκφραση USP42 συσχετίστηκε θετικά με μετάσταση (σχήμα 5Α). Για την επαλήθευση αυτών των ευρημάτων σε μια in vitro δοκιμασία, εξετάσαμε την επιθετική πιθανότητα των USP42-κατασταλεί κύτταρα χρησιμοποιώντας έναν προσδιορισμό εισβολής σε Matrigel vitro (Σχήμα 5Β). Τα κύτταρα USP42-κατέστειλε εμφάνισαν σημαντικά λιγότερο επεμβατική δυναμικό από τις sinc-επιμολυσμένα κύτταρα (

P

& lt? 0.01)., Γεγονός που υποδηλώνει ότι η υψηλή έκφραση USP42 ενισχυμένη εισβολής όγκου

Α. ανάλυση GSEA σε ασθενείς GC με υψηλότερη έκφραση USP42 έναντι χαμηλότερη έκφραση USP42 με βάση TCGA σύνολα δεδομένων. μονοπάτι κυττάρων μετάσταση συσχετίστηκε με USDP42-υψηλότερη έκφραση. Ο εμπλουτισμός βαθμολογία (ES, πράσινη γραμμή) αντανακλά τη συσχέτιση μεταξύ μετάσταση οδού και του δείγματος. Μαύρο μπάρες δείχνουν προηγουμένως γνωστά γονίδια που συνδέονται με μονοπάτι κυττάρου μετάσταση. B. USP42 σίγηση μειώθηκε κύτταρο εισβολή όπως ανιχνεύεται με δοκιμασία σε εισβολή vitro. C, D. Έκφραση των βασικών πρωτεϊνών σε μετάσταση και EMT προσδιορίστηκε με κηλίδα western. *

P

& lt? 0,05, **

P

& lt? 0,01, ***

P

& lt?. 0.001 σε σύγκριση με sinc

Η

η αποδόμηση της εξωκυττάριας μήτρας μέσω των μεταλλοπρωτεϊνασών μήτρας (MMPs), είναι μια κρίσιμη διαδικασία κατά τη διάρκεια της κυτταρικής εισβολής [16]. Όπως φαίνεται στο Σχ 5C, αποσιώπηση USP42 μειωτικά την έκφραση της ΜΜΡ-2 και ΜΜΡ-9.

Περαιτέρω, τα επίπεδα πρωτεΐνης του επιθηλίου-μεσεγχύματος μετάβασης (ΕΜΤ) ρυθμιστές διαδρομής, τα οποία συνδέονται στενά με μετάσταση καρκινικά κύτταρα, αναλύθηκαν με κηλίδα Western (Σχήμα 5D). Επιμόλυνση του USP42 siRNA μείωσε σημαντικά τα επίπεδα έκφρασης της β-κατενίνης, Twist και Snail1, αυξάνοντας παράλληλα E-cadherin.

Συζήτηση

Πολλά μέλη της οικογένειας DUB γνωστό ότι συμβάλλουν στην καρκινογένεση, συμπεριλαμβανομένων USP1 [17], USP2 [18], USP7 [19, 20] και USP22 [10-12, 21], ενώ άλλες Dubs ρυθμίζονται προς τα κάτω σε ανθρώπινους καρκίνους, συμπεριλαμβανομένων USP10 [22] και BAP1 [23]. Ωστόσο, λίγα είναι γνωστά σχετικά με το ρυθμό έκφρασης και βιολογικές λειτουργίες του USP42, ενός DUB για ρ53 [24] και Η2Β ιστόνης [25], σε ανθρώπινους καρκίνους. Στη μελέτη μας, δείξαμε για πρώτη φορά ότι οι ιστοί GC εκφράζουν υψηλά επίπεδα mRNA USP42 σύγκριση με τον αντίστοιχο μη ογκογόνους ιστούς. Επιπλέον, η έκφραση USP42 συσχετίστηκε με το μέγεθος του όγκου, το στάδιο TNM, μετάσταση λεμφαδένα και τη συνολική επιβίωση των ασθενών GC (Σχήμα 1). Τα ευρήματά μας έδωσαν πολύτιμες πληροφορίες για την πρόβλεψη κλινική έκβαση των ασθενών με GC.

τεκμαίρεται ότι USP42 μπορεί να δράσει ως ένα ογκογόνο παράγοντα κατά τη διάρκεια της ανάπτυξης GC. Στη συνέχεια εφαρμόζεται η τεχνολογία RNAi, το οποίο χρησιμοποιείται ευρέως στην έρευνα για τον καρκίνο ή τη θεραπεία του καρκίνου, να χτυπήσει κάτω έκφραση USP42 σε δύο κυτταρικές σειρές GC (Σχήμα 2Β). Η μείωση της έκφρασης USP42 μειώθηκε αποτελεσματικά τον πολλαπλασιασμό των καρκινικών κυττάρων in vitro (Σχήμα 2C) και

in vivo

(Σχήμα 3). δεδομένων GSEA αποκάλυψε τη σύνδεση της οδού του κυτταρικού κύκλου με την έκφραση USP42 (Σχήμα 4Α). Στη συνέχεια εφαρμόστηκε μια ανάλυση κυτταρικού κύκλου με FACS (Σχήμα 4Β) και ανάλυση έκφραση της κυκλίνης D1, κυκλίνη Ε και PCNA με κηλίδα western (Σχήμα 4C). Τα στοιχεία μας αποκάλυψε ότι USP42 siRNA είχε ανασταλτική επίδραση στην ανάπτυξη των κυττάρων GC μέσω επαγωγής G0 /G1 σύλληψη.

GC είναι ένας από τους πιο κοινούς καρκίνους και συνέχισε να αποτελεί σοβαρό πρόβλημα δημόσιας υγείας στον κόσμο. Υψηλή συχνότητα μετάστασης εξακολουθεί να είναι μία από τις κύριες αιτίες για την κακή επιβίωση των ασθενών με GC [4]. GSEA για TCGA σύνολο δεδομένων αποκάλυψε τη σύνδεση της οδού μετάστασης με την έκφραση USP42 στο GC (σχήμα 5Α). Περαιτέρω, in vitro δοκιμασία εισβολής επισημανθεί ότι USP42 knockdown μείωσε την επεμβατική ικανότητα των αθανατοποιημένων κυτταρικών γραμμών GC (σχήμα 5Β). Έτσι, τα δεδομένα μας έδειξαν ότι η αυξημένη έκφραση του USP42 σε GC μπορεί να προωθήσει μετάσταση όγκου και σχετίζεται με την κλινική έκβαση των ασθενών GC. Στη συνέχεια, προσπαθήσαμε να διερευνήσει τις υποκείμενων μηχανισμών με την αξιολόγηση της έκφρασης των MMPs και των ρυθμιστικών αρχών EMT στο USP42-καταστολή καρκινικών κυττάρων. ΜΜΡ-2 [26] και ΜΜΡ-9 [27] είναι γνωστό ότι μεσολαβούν την αποικοδόμηση της εξωκυτταρικής μήτρας και σχετίζονται με λεμφαδένα μετάσταση του GC. EMT εμπλέκεται σε πολύπλοκες παθογένεση των όγκων [28]. Εδώ, αποσιώπηση USP42 προκάλεσε την έκφραση του κύριου παράγοντα EMT (Ε-καδερίνης), αλλά μείωσε την έκφραση των ΜΜΡ και τρεις γνωστούς επαγωγείς του ΕΜΤ (β-κατενίνης, Twist και Snail1) (Σχ 5C και 5D). Αυτές οι ανακαλύψεις πρότειναν τον ρόλο του USP42 ως υποκινητή γονιδίου εισβολή μέσω επηρεάζουν την έκφραση των MMPs και των ρυθμιστικών αρχών EMT, αν και απαιτούνται περαιτέρω μελέτες για να διευκρινιστούν οι ακριβείς μηχανισμοί.

Εν κατακλείδι, η παρούσα μελέτη έδειξε ότι η έκφραση USP42 ήταν σημαντικά αυξημένη σε ιστούς GC. Η αυξημένη έκφραση USP42 μπορεί να είναι σημαντικό για την εξέλιξη του όγκου και τη μετάσταση των GC, και μπορεί να χρησιμεύσει ως προγνωστικός δείκτης για την ασθένεια αυτή. in vitro ευρήματα μας έδειξαν ότι η αποσιώπηση των USP42 ανέστειλε τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων μέσω της επαγωγής G0 /G1 σύλληψη και την καταστολή των κυττάρων εισβολής μέσω MMPs και των ρυθμιστικών αρχών EMT. Έτσι, USP42 μπορεί να είναι μια νέα θεραπευτική μοριακός στόχος για GC.

Ευχαριστίες

Η μελέτη αυτή χρηματοδοτήθηκε από την Επιστημονική Έρευνα Έργο της Σαγκάης Δημοτική Επιτροπή Υγείας και Οικογενειακού Προγραμματισμού (20124321).