Αφηρημένο

Πρόσφατες μελέτες έχουν συνδέσει την έκφραση της λεκτίνη-όπως υποδοχέα ΟΧ-LDL 1 (

OLR1

) για καρκινογένεση. Αναλύσαμε τα δεδομένα μικροσυστοιχιών από

Olr1

knockout (ΚΟ) και άγριου τύπου (WT) ποντίκια για γονίδια που εμπλέκονται στον κυτταρικό μετασχηματισμό και αξιολογήθηκαν επιδράσεις των

OLR1

υπερέκφραση σε φυσιολογικά επιθηλιακά κύτταρα μαστού (ΜΟΡ10Α ) και κύτταρα καρκίνου του μαστού (HCC1143) από την άποψη της γονιδιακής έκφρασης, η μετανάστευση, προσκόλληση και διαενδοθηλιακή μετανάστευση. Είκοσι έξι από 238 γονίδια είχαν ανασταλεί σε ιστούς των ποντικών OLR1 KO? η συντριπτική πλειοψηφία των ευαίσθητων OLR1 γονιδίων περιείχε ΝΡ-κΒ ιστοσελίδες με υποκινητές τους δέσμευσης. Περαιτέρω μελέτες αποκάλυψαν ευρεία αναστολή των γονιδίων στόχων ΝΡ-κΒ εκτός του μετασχηματισμού που σχετίζεται με γονιδιακή δεξαμενή, με εμπλουτισμό θέματα της άμυνας απόκρισης, ανοσοαπόκριση, απόπτωση, τον πολλαπλασιασμό, και την επούλωση τραυμάτων. Μεταγραφικό του

ποντίκια Olr1

ΚΟ αποκάλυψε επίσης την αναστολή της

de novo λιπογένεση

, ένζυμα περιορισμού του ρυθμού της συνθάσης των λιπαρών οξέων (

Fasn

), στεαροϋλ-ΟοΑ (

SCD1

) και την οικογένεια ELOVL μέλος 6 (

Elovl6

), καθώς και λιπολυτική ομάδα φωσφολιπάση Α2 IVB (

Pla2g4b

). Σε μελέτες που συνέκριναν ΜΟΡ10Α και HCC1143, ο τελευταίος εμφανίζεται το 60% υψηλότερα

OLR1

έκφρασης. Εξαναγκασμένη υπερέκφραση

OLR1

οδήγησε σε προς τα πάνω ρύθμιση του NF-κΒ (ρ65) και του στόχου του προ-ογκογονίδια που εμπλέκονται στην αναστολή της απόπτωσης (

BCL2

,

BCL2A1

,

TNFAIP3

) και ρύθμιση του κυτταρικού κύκλου (

CCND2

) στις δύο κυτταρικές σειρές. Βασική έκφραση

FASN

,

SCD 1

και

PLA2G4B

, καθώς και τους παράγοντες μεταγραφής λιπογένεση

PPARγ και

,

SREBF2

και

CREM

, ήταν υψηλότερη σε HCC1143 κύτταρα. Υπερ-έκφραση του

OLR1

σε HCC1143 κύτταρα ενισχυμένη επίσης τη μετανάστευση των κυττάρων, χωρίς να επηρεάζουν την προσκόλλησή τους ΤΝΡα-ενεργοποιημένο ενδοθήλιο ή δια μέσω του ενδοθηλίου μετανάστευση. Από την άλλη πλευρά,

OLR1

αντίσωμα εξουδετέρωσης ανέστειλε τόσο την προσκόλληση και μετανάστευση των μη επεξεργασμένων κυττάρων HCC1143. Καταλήγουμε στο συμπέρασμα ότι

OLR1

μπορεί να δράσει ως ογκογονίδιο από την ενεργοποίηση των γονιδίων στόχων NF-kB υπεύθυνο για τον πολλαπλασιασμό, τη μετανάστευση και την αναστολή της απόπτωσης και

de novo

γονιδίων λιπογένεσης.

Παράθεση: Khaidakov Μ, Mitra S, Kang ΑΠΟ, Wang Χ, Kadlubar S, Novelli G, et al. (2011) οξειδωμένη LDL υποδοχέων 1 (

OLR1

) ως πιθανή σχέση μεταξύ της παχυσαρκίας, της δυσλιπιδαιμίας και του καρκίνου. PLoS ONE 6 (5): e20277. doi: 10.1371 /journal.pone.0020277

Επιμέλεια: Carlo Gaetano, Istituto Dermopatico dell’Immacolata, Ιταλία

Ελήφθη: 20 Δεκέμβρη 2010? Αποδεκτές: 28η Απριλίου 2011? Δημοσιεύθηκε: May 26, 2011

Copyright: © 2011 Khaidakov et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Οι συγγραφείς δεν έχουν καμία υποστήριξη ή χρηματοδότηση για να αναφέρετε

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

OLR1

, μια λεκτίνη -όπως υποδοχέα καθαριστή, είναι εξαιρετικά διατηρημένη στα θηλαστικά [1] και είναι ικανό να αναγνωρίζει διάφορα προσδέματα περιλαμβανομένων του τμήματος πρωτεΐνη οξειδωμένης LDL-(ox-LDL), προχωρημένης γλυκοζυλίωσης τελικών προϊόντων, gram-θετικών και gram-αρνητικών βακτηρίων και αποπτωτικών κυττάρων [2].

OLR1

εκφράζεται κυρίως σε αγγειακά κύτταρα και αγγείωση πλούσια όργανα [3], και την ενεργοποίηση της από ένα ευρύ φάσμα διεγέρσεων ενδεικτική της δυσλιπιδαιμίας, φλεγμονή και βλάβη εκκινεί αρκετές καταρρακτών σηματοδότησης περιλαμβανομένων MAPKs, άλλες πρωτεϊνικές κινάσες, καθώς ως παράγοντες μεταγραφής ΝΡ-κΒ και ΑΡ-1 [4], [5].

η υπερέκφραση του

OLR1

έχει δειχθεί σε κυτταρικά συστατικά των αρτηριοσκληρωτικών αλλοιώσεων [6]. Διαγραφή του

Olr1

στο

LDLR

νοκ-άουτ (KO) ποντίκια αποτελέσματα σε πολύ μικρότερο αθηρωματικών βλαβών που σχετίζονται με τη δραστική μείωση της φλεγμονής στο τοίχωμα της αορτής [7].

Olr1

κατάργηση μειώνει επίσης την αγγειοτενσίνη ΙΙ υπέρταση [8]. Ομοίως, κατάργηση των

Olr1

μειώνει την έκταση της βλάβης ισχαιμίας /επαναιμάτωσης [9].

Μια σύνδεση μεταξύ της παχυσαρκίας και της αθηροσκληρωτικής νοσηρές καταστάσεις στον άνθρωπο είναι καλά εδραιωμένη [10], [11]. Οι ενώσεις με την παχυσαρκία έχουν βρεθεί για διάφορες μορφές καρκίνου, συμπεριλαμβανομένων των νεοπλασμάτων του μαστού και του προστάτη [12], [13], γεγονός που υποδηλώνει μια μηχανιστική επικάλυψη στην παθολογία της αθηρωματικής πλάκας και της ογκογένεσης. Πρόσφατα,

Olr1

, ενεργώντας μέσω NF-κΒ με τη μεσολάβηση φλεγμονώδη σηματοδότηση, έντονα εμπλέκονται στην καρκινογένεση [14].

Το επίκεντρο της παρούσας μελέτης ήταν να διασαφηνίσει περαιτέρω το ρόλο του

OLR1

ως ογκογονίδιο βασίζεται στην παραδοχή ότι ως αισθητήρας της δυσλιπιδαιμίας και ενός μορίου εμπλέκεται στην ενεργοποίηση του NF-kB,

OLR1

μπορεί να είναι ένας σύνδεσμος μεταξύ της δυσλιπιδαιμίας και του καρκίνου. Το πρώτο μέρος της μελέτης βασίστηκε στην ανάλυση μικροσυστοιχιών του άγριου τύπου (WT) και

olr1

KO ποντίκια. Το δεύτερο μέρος καθορίζει τη σχέση μεταξύ του

olr1

και απόπτωση και λιπογένεση γονιδίων στον καρκίνο του μαστού κυτταρική γραμμή HCC1143 και τη μετανάστευση και την προσκόλληση των κυττάρων αυτών.

Αποτελέσματα

Σύγκριση

OLR1

ΚΟ και του μετασχηματισμού transcriptomes

Οι κυριότερες διαπιστώσεις από την ανάλυση των δεδομένων των μικροσυστοιχιών από τις καρδιές του άγριου τύπου (WT) και

Olr1

KO από την ομάδα μας, έχουν αναφερθεί αλλού [15]. Μια πρόσθετη ανάλυση κατά τη σώρευση σύνολο γονιδίων (n = 238) βρέθηκε να ρυθμίζεται προς τα πάνω κατά τη διάρκεια της μετατροπής σε δύο ισογονιδιακά τύπους κυττάρων [14] έδειξε ότι 26 γονίδια από αυτήν τη λίστα ανεστάλησαν στο

Olr1

KO μεταγραφικό κατά τουλάχιστον 20% (Πίνακας 1). Μεταξύ αυτών ήταν διάφορα συστατικά της ανοσολογικής απόκρισης (

Isg20

,

C1s

,

S1R

,

Ifrd1

) και μια σειρά από παράγοντες μεταγραφής συμπεριλαμβανομένων καλά γνωστά ογκογονίδια (

JunB

,

Σχετ

,

Irf2

,

Crem

). ανάλυση υποστηρικτής της που απορρέουν σύνολο των γονιδίων [16] εντοπίζονται εμπλουτισμό τους για NF-κΒ θέσεις δέσμευσης (p & lt? 0.03), οι οποίες βρίσκονται σε απόσταση 500 νουκλεοτίδια εγγύς με μεταγραφικές ξεκινήσει τοποθεσίες σε όλες εκτός από μία (

C1s

)

Olr1

ευαίσθητα γονίδια (n = 25, Εικ. 1).

ένα διάγραμμα που απεικονίζει ένα σύνολο επικαλυπτόμενων γονιδίων μεταξύ μετασχηματισμό και

Olr1

KO transcriptomes. Από το σύνολο των 238 γονιδίων ρυθμίζεται προς τα πάνω κατά τη διάρκεια του μετασχηματισμού, 26 γονίδια βρέθηκαν να ανασταλεί σε ποντίκια

Olr1

KO. Η συντριπτική πλειονότητα αυτών των γονιδίων διεξάγεται sites ΝΡ-κΒ σε αλληλουχίες τους εγγύς υποκινητή. Συνολικά, 86 ΝΡ-κΒ γονιδίων-στόχων βρέθηκαν να αναστέλλεται σε

ποντίκια Olr1

ΚΟ με εμπλουτισμό για τη ρύθμιση της απόπτωσης (p = 0,0002), πολλαπλασιασμό (ρ = 0,00003), την επούλωση των πληγών (ρ = 0,0002) , η απάντηση της άμυνας (p = 0,0011), ανοσολογική απόκριση (p = 0,0003) και τη μετανάστευση των κυττάρων (p = 0,0009).

Η

OLR1

διαγραφή αποτελέσματα σε μια ευρεία αναστολή των γονιδίων στόχων του NF-κΒ

Περαιτέρω έρευνα για NF-κΒ ρυθμιζόμενων γονιδίων χρησιμοποιώντας μια λίστα που καταρτίζονται από τις διαθέσιμες βάσεις δεδομένων web-based και τη λογοτεχνία αποκάλυψε ότι η αναστολή του p65 υπομονάδας παρατηρήθηκε στο

Olr1

KO μεταγραφικό συμπληρώθηκαν με προς τα πάνω ρύθμιση της ανασταλτικής

Ikbα

υπομονάδα (1,36 φορές, ρ = 0,002, Πίνακας 1) και συνοδεύονται από σημαντική ρύθμιση προς τα κάτω αρκετών γονιδίων (n = 61) στόχος του ΝΡ-κΒ (Πίνακας 2). Το συνδυασμένο σύνολο των

Olr1

ευαίσθητα γονιδίων στόχων του NF-κΒ εμφανίζεται εμπλουτισμού για τη ρύθμιση της απόπτωσης (p = 0,0002), πολλαπλασιασμό (p = 0,00003), την επούλωση των πληγών (p = 0,0002), η ανταπόκριση της άμυνας (p = 0,0011 ), ανοσολογική απόκριση (ρ = 0,0003) και μετανάστευση κυττάρων (ρ = 0.0009) (Σχήμα 1). Μεταξύ των γονιδίων που εμπλέκονται στην απόπτωση (n = 11) και τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό (n = 12), 6 και 5, αντίστοιχα, ήταν αρνητικοί ρυθμιστές (David Bioinformatics Database, 17).

Η

OLR1

διαγραφή καταστέλλει τα γονίδια λιπογένεση

Τα ευρήματα μικροσυστοιχιών επικυρώθηκαν για επιλεγμένα γονίδια χρησιμοποιώντας ποσοτική PCR πραγματικού χρόνου. Για τις περισσότερες από τις εξετασθείσες γονιδίων, τα μεταγραφικά μετατοπίσεις σε

Olr1

ΚΟ παρατηρήθηκαν σε μικροσυστοιχίες επιβεβαιώθηκαν (Σχήμα 2Α). Επιπλέον,

Olr1

διαγραφή οδήγησε σε αναστολή των βασικών ενζύμων για λιπογένεση (Σχήμα 2Β), συμπεριλαμβανομένων των κιτρικού ΑΤΡ λυάση (

ακυλ

), ακετυλο-συνένζυμο Α καρβοξυλάση άλφα (

Acaca

), συνθάσης των λιπαρών οξέων (

Fasn

), στεαροϋλ-ΟοΑ 1 (

SCD1

) και ELOVL μέλος της οικογένειας 6 (

Elovl6

). Είναι ενδιαφέρον το γεγονός ότι καμία από τις θέσεις σύνδεσης

Olr1

ευαίσθητου λιπιδίων γονίδια που σχετίζονται με τον μεταβολισμό πραγματοποιείται NF-κΒ σε υποστηρικτές τους. Αυτό υποδηλώνει ότι τα αποτελέσματα του

Olr1

σε λιπογένεση μπορεί να είναι ανεξάρτητη από το χέρι της σηματοδότησης του NF-κΒ. Από την άλλη πλευρά, διάφοροι παράγοντες μεταγραφής λιπιδίων μεταβολισμού, συμπεριλαμβανομένων των στερολών ρυθμιστικό στοιχείο σύνδεσης παράγοντα 2 (

Srebf2

), ανταποκρινόμενος στο οΑΜΡ διαμορφωτή στοιχείο (

Crem

), περοξυσώματος ενεργοποιείται από πολλαπλασιαστή υποδοχείς άλφα και γάμμα (

PPARγ και

και

PPARg

), καθώς και CCAAT /πρωτεΐνη δέσμευσης ενισχυτή (C /EBP) βήτα, βρέθηκαν να είναι προς τα κάτω σε

Olr1

ΚΟ ποντίκια (Εικόνα 2Β ).

Α. qPCR επικύρωση επιλέξτε γονιδίων από επικαλυπτόμενα σετ (από τον Πίνακα 1)? B. Η έκφραση των γονιδίων λιπογένεσης και παραγόντων μεταγραφής στο

olr1

KO ποντίκια. Λευκές ράβδοι – μικροσυστοιχιών δεδομένων? μαύρες γραμμές – δεδομένων qPCR. Όλες οι τιμές P & lt?. 0.05

Η

Επιπτώσεις του

OLR1

υπερέκφραση σε φυσιολογικά επιθηλιακά και τα καρκινικά κύτταρα

Η επιμόλυνση των ΜΟΡ10Α και HCC1143 κύτταρα με

OLR1

φορέα έκφρασης οδήγησε σε 5-8 φορές αύξηση του

OLR1

έκφρασης, η οποία εμπίπτει εντός του εύρους OLR1 ρύθμιση προς τα πάνω. Σε επιθηλιακά κύτταρα εκτίθενται σε ox-LDL [18]. Αυτό οδήγησε σε μέτρια προς τα πάνω ρύθμιση

RELA

(p65) και σημαντικές αυξήσεις στο μήνυμα RNA για

BCL2, BCL2A1, TNFAIP3 και CCND2

(Εικόνα 3Β). Σε σύγκριση με τα κύτταρα ΜΟΡ10Α, HCC1143 κύτταρα εμφάνισαν αυξημένη βασικά επίπεδα του

OLR1

(59%, p & lt? 0.05),

FASN

(24%, p & lt? 0.03),

SCD 1

(21%, p & lt? 0,01) και

PLA2G4B

(153%, p & lt? 0,01) (Σχήμα 3C). Η απάντηση από τα γονίδια λιπογένεση στο

OLR1

επιμόλυνσης διέφερε σε αυτές τις κυτταρικές σειρές (Σχήμα 3D). Σε κύτταρα ΜΟΡ10Α, η υπερέκφραση του

OLR1

τόνωσε σημαντικά τη μεταγραφή του

SCD 1

(37%, p & lt? 0.02),

ELOVL6

(38%, p & lt? 0,05) και

PLA2G4B

(153%, p & lt? 0,02) ταυτόχρονα με προς τα πάνω ρύθμιση του

CREM

, ενώ σε HCC1143 κύτταρα

CREM

μεταγραφή μειώθηκε και

SCD1

και

PLA2G4B

ανεστάλησαν συγκριτικά με καλλιέργειες ελέγχου επιμολυσμένα με άδειο φορέα.

Αυτά τα κύτταρα διαμολύνθηκαν είτε με κενό φορέα ή

OLR1

cDNA (ΟηΟεηε, Rockville, MD) χρησιμοποιώντας Λιποφεκταμίνη 2000 (Invitrogen). Η αποτελεσματικότητα της επιμόλυνσης (70-80%) αξιολογήθηκε χρησιμοποιώντας φορέα GFP. RNA εκχυλίστηκε 48 ώρες μετά την επιμόλυνση, μετατρέπονται σε cDNA και η έκφραση των γονιδίων καθορίστηκε με ποσοτική PCR. A. αποτελεσματικότητα της επιμόλυνσης (κύτταρα επιμολυσμένα με φορέα GFP). οικόπεδο Β Ποσοτική PCR. Σημειώστε την ενίσχυση της έκφρασης OLR1 τόσο τον έλεγχο και OLR1-επιμολυσμένων καλλιεργειών σε απάντηση βόδι-LDL. C. Η έκφραση των γονιδίων που εμπλέκονται στην απόπτωση και τον πολλαπλασιασμό. Προκειμένου να τονωθεί η

OLR1

συνδέονται σηματοδότησης που απαιτούν OLR1-συνδετήρα αλληλεπίδραση,

OLR1

επιμολυσμένα κύτταρα υποβλήθηκαν σε θεραπεία με 40 μg /ml βόδι-LDL για 24 ώρες? γραφήματα αντιπροσωπεύουν σύγκριση με μη επεξεργασμένα κύτταρα ελέγχου επιμολύνθηκαν με άδειο φορέα? Δ βασική έκφραση του

OLR1

,

PLA2G4B

και γονίδια λιπογένεση σε φυσιολογικά ανθρώπινα επιθηλιακά κύτταρα μαστού (ΜΟΡ10Α) και κύτταρα καρκίνου του μαστού (HCC1143)? Ε Έκφραση

OLR1

,

PLA2G4B

και γονίδια λιπογένεση σε ΜΟΡ10Α και HCC1143 κύτταρα επιμολυσμένα με OLR1 αγωγή σύμφωνα με το πρωτόκολλο που περιγράφεται παραπάνω. F. Έκφραση παραγόντων μεταγραφής λιπογένεση σε ΜΟΡ10Α και κύτταρα επιμολυσμένα με HCC1143 OLR1 και υποβλήθηκε σε επεξεργασία σύμφωνα με το πρωτόκολλο που περιγράφεται παραπάνω. Όλα τα πειράματα διεξήχθησαν εις τριπλούν. (*) Ρ & lt? 0,05 σε σύγκριση με την αντίστοιχη του ελέγχου? (†) – p & lt?. 0.05 σε σύγκριση με ΜΟΡ10Α

Η

Η υπερέκφραση του

OLR1

διευκολύνει την επούλωση των πληγών, αλλά δεν έχει καμία επίδραση στην πρόσφυση

Έχει ανέφεραν ότι η αναστολή της

OLR1

χρησιμοποιώντας siRNAs οδήγησε σε μείωση της ανάπτυξης του όγκου

in vivo

και καρκίνος κυτταρική μετανάστευση

in vitro

[14]. Για την αξιολόγηση των επιδράσεων του

OLR1

αυξορρύθμιση, επιμολύναμε HCC1143 κυττάρων είτε με κενό πλασμίδιο ή

OLR1

φορέα έκφρασης και δοκιμάζονται μετανάστευσης σε μια πληγή δοκιμασία επούλωσης (Σχήμα 4Α). Υπερέκφραση του

OLR1

επιβεβαιώθηκε χρησιμοποιώντας qPCR. Κύτταρα με αυξορρυθμίζεται

OLR1

γεφύρωσε τις πληγές πολύ ταχύτερα από καλλιέργειες ελέγχου (ρ & lt? 0.001). Αντίθετα, η προσκόλληση και του ενδοθηλίου μετανάστευση των

OLR1

επιμολυσμένα καρκινικά κύτταρα δεν διέφεραν από τις τιμές ελέγχου (δεν φαίνεται).

A. Πληγή δοκιμασία επούλωσης. Πάνω πίνακας – αντιπροσωπευτικών εικόνων του επούλωσης πληγών δοκιμασία πραγματοποιήθηκε με τη χρήση HCC1143 κύτταρα επιμολυσμένα με είτε κενό πλασμίδιο ή

OLR1

φορέα cDNA? Κάτω πίνακας – γράφημα που απεικονίζει την απόσταση μεταξύ των άκρων της πληγής μετά από 36 ώρες επώασης. (*) – P & lt? 0,01? Β δοκιμασία πρόσφυσης. Άνω Panel- αντιπροσωπευτικών εικόνων των προσκολλημένων μη επιμολυσμένα HCC1143 κύτταρα φορτωμένα με CellTracker Red CMTX (Invitrogen, Carlbad, CA) και εφαρμόστηκε σε μη ενεργοποιημένο ή ενεργοποιημένα (50 μg /ml oxLDL, 4 ώρες) συρρέοντα HUVECs επιμολυσμένα με OLR1 Silencer ή ομελέτα siRNA. Κάτω πίνακας – γραφική παράσταση που απεικονίζει τον αριθμό των προσκολλημένων κυττάρων κατά μέσο όρο από πολλαπλές οπτικά πεδία σε καλλιέργειες εις τριπλούν. (*) – Ρ & lt? 0,05 σε σύγκριση με μη ενεργοποιημένα ελέγχου ( «scrRNA»)? (†) – p & lt? 0,05 σε σύγκριση με κωδικοποιημένα RNA? δοκιμασία μετανάστευσης Γ Χρωματομετρική διαενδοθηλιακής. Άνω πάνελ – επαλήθευση της συμβολής των HUVECs στις μεμβράνες με χρώση των κυττάρων με CellTracker Red CMTX. Κάτω πίνακας – τιμές απορρόφησης των λεκέδων που εξάγεται από τα κύτταρα μετανάστευσαν μέσω ΤΝΡα-ενεργοποιημένα ενδοθηλιακά μονοστιβάδα σε παρουσία

OLR1

αντίσωμα εξουδετέρωσης ή ανθρώπινη IgG (έλεγχος)

Η

Ωστόσο, τα βασικά πρόσφυση. και του ενδοθηλίου μετανάστευση των μη επιμολυσμένα κύτταρα HCC1143 ήταν σημαντικά εξασθενημένα όταν OLR1 αναστάλθηκε ή εξουδετερώθηκε σε ενδοθηλιακά κύτταρα με τη χρήση siRNA ή προ-κατεργασία κυττάρων με

OLR1

αντισώματος εξουδετέρωσης (Σχήμα 4BC).

Συζήτηση

Αυτή η μελέτη προτείνει πολλαπλές πιθανές συνδέσεις μεταξύ των

OLR1

και την ευαισθησία στον καρκίνο. Πρώτον, η βάση δεδομένων μικροσυστοιχιών στα ποντίκια με

Olr1

κατάργηση παρουσίασε σημαντική μείωση στην έκφραση του NF-kB γονιδίων στόχων που εμπλέκονται στον κυτταρικό μετασχηματισμό [14], καθώς και γονίδια που σχετίζονται με λιπογένεσης. Δεύτερον, η υπερέκφραση του

OLR1

σε μια ανθρώπινη κυτταρική σειρά καρκίνου έδειξαν σημαντική αυξητική ρύθμιση αρκετών γονιδίων με ογκογόνο ιδιότητες και μια σημαντική αύξηση στην κυτταρική μετανάστευση.

ανάλυση μικροσυστοιχιών μας έδειξαν ότι η συντριπτική πλειοψηφία των γονιδίων που αναφέρθηκαν πρέπει να ρυθμίζεται προς τα πάνω κατά τη διάρκεια της μετατροπής των κυττάρων (αλλά αναστέλλεται σε

Olr1

KO ποντίκια) διεξάγεται NF-kB τοποθεσίες στη υποκινητές τους (Πίνακας 1) σύνδεση. Επιπλέον, ένα σημαντικό μέρος των γονιδίων στόχων ΝΡ-κΒ εκτός της πισίνας μετασχηματισμού που σχετίζονται, ειδικά εκείνων που εμπλέκονται στη ρύθμιση της απόπτωσης, του πολλαπλασιασμού και της μετανάστευσης, επίσης ρυθμίζεται προς τα κάτω στο

Olr1

KO μεταγραφικό (Πίνακας 2 ). Στον ποντικό

Olr1

KO μικροσυστοιχιών, τόσο Β-κυττάρου λευχαιμία /λέμφωμα 2 σχετίζονται πρωτεΐνη Α1 (

Bcl2a1

) και

Bcl2

ήταν μεταγραφικά αναστέλλεται.

Bcl2a1

είναι ένα ανάντη αρνητικός ρυθμιστής της mitochondriocentric λειτουργία της απόπτωσης

μέσω

πρόληψη της απελευθέρωσης του κυτοχρώματος c στο κυτταρόπλασμα, η οποία απαιτείται για την έναρξη του αποπτωτικού καταρράκτη. Έχει αναφερθεί ότι η ενισχυμένη σύνθεση του

BCL2A1

και

BCL-XL

είναι η υποκείμενη αιτία του περίπου 1000 φορές μεγαλύτερη αντίσταση από υποσύνολα χρόνιας λεμφοκυτταρικής λευχαιμίας κυττάρων [19]. ΤΝΡα επαγόμενη πρωτεΐνη 3 (

TNFAIP3

) είναι ένας ρυθμιστής κλειδί της φλεγμονής και ανοσίας που εμπλέκονται στην ανάπτυξη των διαφόρων αυτοάνοσων νοσημάτων και απευαισθητοποιεί επίσης κύτταρα από ΤΝΡα-επαγόμενη κυτταροτοξικότητα και δείχθηκε να είναι αντι-αποπτωτική στο μητρικό Τα καρκινικά κύτταρα MCF7S1 [20]. Αναστολή της

TNFAIP3

ανάπτυξη συμβιβασμούς και την επιβίωση των βλαστικών κυττάρων γλοιοβλαστώματος

μέσω

αναστολή της εξέλιξης του κυτταρικού κύκλου και δραστικότητα ΝΡ-κΒ, και αυξάνει την επιβίωση των ποντικών που έφεραν ξενομοσχεύματα γλοιοβλαστώματος [21].

Παρατηρήσαμε μια σημαντική μείωση του

Ccnd2

μήνυμα σε ποντίκια

Olr1

ΚΟ και πολυ-φορές προς τα πάνω ρύθμιση του στο

OLR1

διαγονιδιακών κυττάρων HCC1143. Η κυκλίνη D2 είναι μια εξαιρετικά διατηρημένη ρυθμιστής εξαρτώμενων από κυκλίνη κινασών 4 και 6 υπεύθυνη για του G1 /S μετάβασης. Αυτό το γονίδιο επιγενετικώς σιγήσει στην πλειονότητα των καρκίνων του μαστού [22]. υπερέκφραση του σε LNCaP κύτταρα οδηγεί σε ένα εμπόδιο για πολλαπλασιασμό και αυξημένη απόπτωση [23]. Επιπλέον,

Olr1

διαγραφή εμφανίστηκε να θέσει σε κίνδυνο το σύνολο της τεχνολογικής αλυσίδας

de novo λιπογένεση

, συμπεριλαμβανομένης της σύνθεσης των κορεσμένων C16 και C18 λιπαρά οξέα (

Fasn

και

Elovl6

), και τη μετατροπή τους σε μονοακόρεστα (

SCD1

). Πολλές μορφές καρκίνου, συμπεριλαμβανομένων και εκείνων που αφορούν προστάτη και του μαστού [24], [25], βασίζονται σχεδόν αποκλειστικά σε

de novo

σύνθεση ανεξάρτητα από τη διατροφική διαθεσιμότητα. Ο διακόπτης για να

de novo λιπογένεση

συμβαίνει νωρίς και αποτελεί προϋπόθεση για την αποτελεσματική μετατροπή. Μυθιστόρημα δράση του

OLR1

στο μεταβολισμό των λιπιδίων μπορεί να ευθύνονται για μεγάλο μέρος των αναφερθέντων προ-ογκογόνο δράση του. Για παράδειγμα, το επίπεδο έκφρασης του

FASN

συσχετίζεται θετικά με κακή πρόγνωση του καρκίνου [26], γονιδιωματική ενίσχυση του είναι ένα σύνηθες φαινόμενο σε μερικούς καρκίνους [27], και η υπερ-έκφραση της προωθεί μετασχηματισμό των επιθηλιακών κυττάρων [28 ]. Παρομοίως, υπερέκφραση του

SCD1

έχει παρατηρηθεί σε διάφορους τύπους καρκίνων, συμπεριλαμβανομένου του καρκίνου του μαστού [29]? αυξορρύθμιση του συνδέεται με μετασχηματισμό και knock-down αποτελέσματά της σε μειωμένο πολλαπλασιασμό των κυττάρων, την απώλεια της αγκύρωσης ανάπτυξη ανεξάρτητη και μειωμένη απόπτωση [30]. Αξίζει να σημειωθεί ότι σε σύγκριση με ΜΟΡ10Α κύτταρα, η υπερέκφραση του

OLR1

στο HCC1143 κύτταρα δεν προκαλούν την αναμενόμενη ενεργοποίηση των γονιδίων λιπογένεσης. Αυτό μπορεί να εξηγηθεί από τη μέγιστη αύξηση της βασικής έκφρασης αυτών των γονιδίων στα κύτταρα HCC1143 κατά την έναρξη (Σχήμα 3D).

Δεδομένου ότι τα περισσότερα από τα γονίδια ρυθμίζεται προς τα πάνω στο

OLR1

-TG HCC1143 κύτταρα είναι λειτουργικά πλειοτροπικές, αξιολογήσαμε την αθροιστική αποτέλεσμα της προς τα άνω ρύθμιση τους επί της επούλωσης τραύματος, την προσκόλληση και δοκιμασίες διαενδοθηλιακή μετανάστευση (Σχήμα 4). Αξίζει να σημειωθεί ότι η μετανάστευση των κυττάρων παρατηρήθηκε σε σχεδόν διπλάσια τιμή μάρτυρα σε κύτταρα με υπερέκφραση του

OLR1

, έντονα υποδηλώνοντας ένα ρόλο για αυτό το μόριο στην ανάπτυξη καρκίνου του μαστού. Από την άλλη πλευρά, την παρουσίαση του

OLR1

στην επιφάνεια των καρκινικών κυττάρων δεν φαίνεται να είναι απαραίτητη για την προσκόλληση σε ενεργοποιημένα ενδοθηλιακά κύτταρα ή για δια-ενδοθηλιακή μετανάστευση. Το επίπεδο του

OLR1

σε ενδοθηλιακά κύτταρα, πάντως, φαίνεται να είναι σημαντικό, όπως προσθήκη εξουδετέρωσης

OLR1

αντίσωμα στο μέσο ή την αναστολή της μεταγραφής OLR1 σημαντικά μειωμένη πρόσφυση και την διαενδοθηλιακή μετάβαση σε μη επιμολυσμένα καρκινικά κύτταρα. Αυτό είναι ενδεικτικό της

OLR1

ως πιθανός μηχανισμός του καρκινικού κυττάρου-ενδοθήλιο αλληλεπιδράσεις, καθώς τα καρκινικά κύτταρα χαρακτηρίζονται από αφθονία του

OLR1

phophatidylserine συνδετήρα επί των κυτταρικών μεμβρανών [31].

Εν περιλήψει, τα στοιχεία μας από πολλαπλές προσεγγίσεις σε διαγονιδιακά ποντίκια και τα ανθρώπινα φυσιολογικά επιθηλιακά γραμμές και καρκινικών κυττάρων δείχνουν ότι

OLR1

έχει πολλές προ-ογκογόνο δράσεις που βασίζονται σε: α) ενεργοποίηση του μονοπατιού σηματοδότησης ΝΡ-κΒ που προκύπτει σε αναστολή της απόπτωσης και διέγερση του πολλαπλασιασμού? β) ενεργοποίηση του de novo λιπογένεσης, και γ) πιο αποτελεσματική προσκόλληση και διαενδοθηλιακή μετανάστευση οφείλεται σε προς τα πάνω ρύθμιση του

OLR1

σε ενδοθήλιο. Πιστεύουμε ότι τα δεδομένα αυτά υποδεικνύουν έντονα ότι

OLR1

μπορεί να λειτουργήσει ως σύνδεσμος μεταξύ της παχυσαρκίας και την ευαισθησία στον καρκίνο του μαστού.

Υλικά και Μέθοδοι

Ζώα

C57BL /6 ποντίκια ελήφθησαν από Jackson Laboratories. Τα ομόζυγα

ποντίκια Olr1

ΚΟ αναπτύχθηκαν επί C57BL /6 υπόβαθρο όπως περιγράφηκε προηγουμένως [17]. Οι

Olr1

ΚΟ ποντικοί έδειξαν πλήρη απουσία

Olr1

όπως προσδιορίζεται με RT PCR και ανοσοχρώση, και τη σύνδεση του oxLDL στο αγγειακό χιτώνα ήταν εντελώς απούσα σε αυτά τα ζώα. Όλα τα ζώα έλαβαν ανθρώπινη φροντίδα σύμφωνα με την Πολιτική Υπηρεσία Δημόσιας Υγείας για την ανθρώπινη φροντίδα και χρήση των πειραματόζωων που δημοσιεύθηκε από τα Εθνικά Ινστιτούτα Υγείας. Οι παρούσες μελέτες εγκρίθηκαν από UAMS φροντίδα των ζώων και ο αριθμός έγκρισης Επιτροπή Χρήσης του 2484, με ημερομηνία Νοεμβρίου 2007.

μικροσυστοιχιών Ανάλυση

Το συνολικό RNA της καρδιάς που προέρχονται από ποντικούς WT και

Olr1

KO ποντίκια. ανάλυση μικροσυστοιχιών εκτελέστηκε από 430 γονιδίων 2,0 συστοιχία έκφρασης Affymetrix Mouse Genome GenChip (Affymetrix Inc. Santa Clara, CA) και αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας Affymetrix Microarray Analysis Suite (MAS) 5.0 για την αξιολόγηση της ποιότητας του RNA και υβριδισμού. Ένας μετασχηματισμός log βάση 2 εφαρμόστηκε στα δεδομένα πριν από τις συστοιχίες ομαλοποιήθηκαν. Όλες οι τιμές από κάθε συστοιχία κανονικοποιήθηκαν προς την 75η αξία εκατοστημόριο του πίνακα, η οποία αυθαίρετα καθορίστηκε σε ένταση ελάχιστο & gt? 100. Για γονιδιακή έκφραση σχολιασμό, την ευκολία (όπως περιγράφεται στο https://apps1.niaid.nih.gov/David) ανάλυση πραγματοποιήθηκε σε σημαντικές γονίδια που προσδιορίζονται από ένα δείγμα

t-test

. Επιπλέον, Gene Ontology (GO) όρους https://www.geneontology.org) για τις βιολογικές διεργασίες και κυτταρικού συστατικού αναγνωρίστηκαν όπως προτείνεται από την GO Κοινοπραξία. Όλα τα δεδομένα μικροσυστοιχιών είναι MIAME συμβατό και ότι η ανεπεξέργαστα δεδομένα έχει κατατεθεί σε μια βάση δεδομένων συμβατή MIAME (ArrayExpress) όπως περιγράφεται στην ιστοσελίδα MGED Κοινωνία https://www.mged.org/Workgroups/MIAME/miame.html (αριθμός ένταξης Ε -MTAB-473).

αντιδραστήρια και κυτταρικές σειρές

Όλα τα αντιδραστήρια, εκτός αν αναφέρεται διαφορετικά, αγοράστηκαν από την Sigma (St. Louis, ΜΟ). Ανθρώπινου καρκίνου του μαστού κυτταρική γραμμή HCC1143 ήταν ένα είδος δώρο του Dr. A. Basnakian (Πανεπιστήμιο του Αρκάνσας Ιατρικών Επιστημών, Λιτλ Ροκ AR). Θηλαστικών φορέα έκφρασης (ρΟΜν5-XL5) με ανθρώπινη

OLR1

cDNA ελήφθησαν από ΟηΟεηε (Rockville, MD). Σιγαστήρα Επιλέξτε Επικυρώθηκε siRNA να OLR1 (s9843) αγοράστηκε από την Invitrogen (Carlsbad, CA). Τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν χρησιμοποιώντας πρότυπες RPMI 1640 μέσου αναπτύξεως που έχει συμπληρωθεί με ορό εμβρύου μόσχου (10%) και αμπικιλλίνη /στρεπτομυκίνη. Υψηλή TBAR βόδι-LDL (90 nmoles MDA /mg πρωτεΐνης) αγοράστηκε από την Biomedical Technologies Inc. (Stoughton, ΜΑ). Ανθρώπινη IgG αγοράστηκε από την Abcam (Cambridge, ΜΑ).

πραγματικού χρόνου ποσοτική PCR

Τα κύτταρα διαμολύνθηκαν είτε με κενό φορέα ή

OLR1

φορέα έκφρασης. Η αποτελεσματικότητα της επιμόλυνσης επιβεβαιώθηκε σε παράλληλα πειράματα με GFP που φέρει το πλασμίδιο. Μέρος των επιμολυσμένων καλλιεργειών (όλα εις τριπλούν) υποβλήθηκε σε επεξεργασία με oxLDL (40 μg /ml) για 24 ώρες πριν από την εκχύλιση συγκομιδή και RNA. RT qPCR διεξήχθη χρησιμοποιώντας το 7900 πραγματικού χρόνου σύστημα PCR Applied Biosystems. qPCR ειδικούς εκκινητές σχεδιάστηκαν χρησιμοποιώντας Probe-Finder (https://www.roche-appliedscience.com) web-based λογισμικό. Όλες οι αντιδράσεις qPCR διεξήχθησαν σε έναν τελικό όγκο 15 μΐ που περιείχε 1 χ του SYBR Green PCR Master Mix (Applied Biosystems, Carlsbad, CA), 300 ηΜ του κάθε συγκεκριμένου γονιδίου εκκινητές, 100 ng cDNA, σε αποστειρωμένο απιονισμένο νερό. Το πρότυπο κατάσταση ποδηλασίας ήταν 50 ° C για 2 λεπτά, 90 ° C για 10 λεπτά, ακολουθούμενη από 40 κύκλους των 95 ° C για 15 s και 62 ° C για 1 λεπτό. Τα αποτελέσματα αναλύθηκαν με τη χρήση SDS 2,3 σχετικό λογισμικό διαχείρισης ποσοτικοποίηση. Οι συγκριτικές τιμές κύκλοι όριο ομαλοποιούνται για τα γονίδια αναφοράς GAPDH. qPCR διεξήχθη εις τριπλούν για να εξασφαλιστεί η ακρίβεια ποσοτικά.

Η επιμόλυνση πρωτόκολλο

Τα κύτταρα διαμολύνθηκαν είτε με κενό φορέα ή

OLR1

cDNA κατασκευάσματα (ΟηΟεηε, Rockville, MD) χρησιμοποιώντας λιποφεκταμίνη 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή με μικρές τροποποιήσεις. Σε προκαταρκτικά πειράματα, διαπιστώσαμε ότι υψηλότερη αποτελεσματικότητα επιμόλυνσης επιτυγχάνεται με την εφαρμογή μια αναλογία 2:01 του DNA να Lipofectamine σε σχέση με την προτεινόμενη συγκέντρωση του DNA συνιστάται στο γενικό πρωτόκολλο. Χρησιμοποιώντας αυτές τις συνθήκες, παρατηρήσαμε συνήθως 70-80% απόδοση επιμόλυνσης.