Αφηρημένο

Ανθρώπινο CMTM3 έχει προταθεί ως ένα υποθετικό ογκοκατασταλτικό γονίδιο. Η απώλεια της CMTM3 έχει βρεθεί σε πολλά καρκινώματα. Ωστόσο, η ρύθμιση της έκφρασης CMTM3 και τη λειτουργία του στην πρόοδο του όγκου παραμένουν σε μεγάλο βαθμό άγνωστες. Εδώ, ερευνήσαμε την ρύθμιση της έκφρασης CMTM3, λειτουργία και μοριακός μηχανισμός σε ανθρώπινα καρκινικά κύτταρα όρχεων. CMTM3 ήταν συχνά μειωτικά ή σιγήσει στο όρχεων καρκινικές κυτταρικές σειρές και ιστούς όγκων αλλά άκρως εκφράζεται σε φυσιολογικούς ιστούς των όρχεων. Η εκ νέου έκφραση του CMTM3 κατέστειλε σημαντικά τον σχηματισμό αποικίας, τον πολλαπλασιασμό, και την ικανότητα μετανάστευση των καρκινικών κυττάρων των όρχεων με την επαγωγή μίας διακοπή κύκλου G2 κυττάρου και απόπτωση. Επιπλέον, η εκ νέου έκφραση του CMTM3 ενεργοποιήσει τη μεταγραφή του p53, p53 συσσώρευση που επάγεται, επάνω ρυθμισμένη την έκφραση της ρ21, και αύξησε την διάσπαση της κασπάσης 9, 8, 3, και PARP. Η ρύθμιση προς τα κάτω του

CMTM3

σε κλινικές ιστούς όγκων συσχετίστηκε με τη μεθυλίωση του ένα μόνο χώρο CpG βρίσκεται εντός της Sp1 /Sp3 αποκρίνονται περιοχή του πυρήνα υποκινητή. Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι CMTM3 μπορεί να λειτουργήσει ως καταστολέας όγκου μέσω της επαγωγής της σύλληψης κύκλου G2 κυττάρου και απόπτωση. CMTM3 είναι έτσι εμπλέκονται στην παθογένεση των όρχεων καρκίνο, και είναι συχνά, τουλάχιστον εν μέρει φιμώνονται από την μεθυλίωση μιας ενιαίας, ειδική θέση CpG σε ιστούς όγκων

Παράθεση:. Li Ζ, Xie J, Wu J, Λι W , Nie L, Sun Χ, et al. (2014) CMTM3 αναστέλλει την ανθρώπινη καρκίνο των όρχεων ανάπτυξη των κυττάρων μέσω της επαγωγής του κυτταρικού κύκλου σύλληψης και την απόπτωση. PLoS ONE 9 (2): e88965. doi: 10.1371 /journal.pone.0088965

Επιμέλεια: Θωμάς Γ Hofmann, γερμανικής Cancer Research Center, Γερμανία

Ελήφθη: 15 Οκτωβρίου του 2013? Αποδεκτές: 16 Ιαν, 2014? Δημοσιεύθηκε: 28 Φεβρουαρίου, 2014

Copyright: © 2014 Li et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από επιχορηγήσεις από το Εθνικό Πρόγραμμα βασικής Έρευνας της Κίνας (Grant Νο 2014CD745200, https://www.973.gov.cn/AreaAppl.aspx), το Εθνικό Ίδρυμα Φυσικών Επιστημών της Κίνας (Grant Νο 81272840, http: //www.nsfc.gov.cn/Portal0/default152.htm), και το Ταμείο Νέων Επιστημόνων του Εθνικού Ιδρύματος Φυσικών Επιστημών της Κίνας (Grant Νο 81201579, https://www.nsfc.gov.cn/Portal0/default152.htm). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

οι όγκοι των όρχεων γεννητικών κυττάρων (TGCTs) είναι συχνή στους άνδρες ηλικίας 15 έως 35 ετών και αντιπροσωπεύουν το 1% όλων των κακοήθων νεοπλασμάτων στους άνδρες [1]. Η συχνότητα εμφάνισης της TGCTs έχει αυξηθεί δραματικά τον τελευταίο αιώνα [2].

TGCTs προέρχονται από μετασχηματισμένα γονοκύτταρα ή αδιαφοροποίητα σπερμογονίων, τα οποία προέρχονται από εμβρυϊκά βλαστικά κύτταρα και τα ενήλικα βλαστικά κύτταρα φύτρου, αντίστοιχα. TGCTs ταξινομούνται ως σεμινώματα ή μη seminomatous όγκους γεννητικών κυττάρων, σύμφωνα με ιστολογικές χαρακτηριστικά τους [1]. Σεμινώματα είναι οι πιο συχνές (50-70%) όγκους γεννητικών κυττάρων των όρχεων. Μη seminomatous όγκους γεννητικών κυττάρων περιλαμβάνουν καρκίνωμα εμβρυονικό κύτταρο, όγκους λεκιθικό σάκο, χοριοκαρκίνωμα, και τερατώματα [1]. TGCTs έχουν γίνει ένα από τα πιο ιάσιμη στερεά νεοπλάσματα, λόγω της προόδου σε διαγνωστικές και θεραπευτικές μεθόδους [3]. Πάντως, οι μοριακοί μηχανισμοί που λειτουργούν σε TGCTs δεν είναι πλήρως κατανοητοί.

CKLF-σαν MARVEL τρανσμεμβράνης που περιέχει 3 (CMTM3) ανήκει στην χημειοκίνη-όπως γονίδιο του παράγοντα υπεροικογένειας, μία νέα οικογένεια που είναι παρόμοια με την χημειοκίνη και διαμεμβρανική 4 υπεροικογένειες μορίων σηματοδότησης.

CMTM3

είναι ένα από τα πολλά γονίδια παράγοντα χημειοκινών που μοιάζουν βρίσκεται σε ένα σύμπλεγμα στο χρωμόσωμα 16q22. CMTM3 πρωτεΐνη περιέχει ένα φερμουάρ λευκίνης και δύο μοτίφ μοτίβα. Αυτή η πρωτεΐνη 20-kDa εντοπίζεται στο κυτταρόπλασμα και χρησιμεύει ως ένα ικρίωμα για πρωτεΐνες στο ενδοπλασματικό δίκτυο και την πυρηνική μεμβράνη [4].

CMTM3

εκφράζεται έντονα στο αρσενικό αναπαραγωγικό σύστημα, με το υψηλότερο επίπεδο έκφρασης στους όρχεις [4].

Προηγούμενες μελέτες έδειξαν επίσης ότι αρκετά μέλη της υπεροικογένειας CMTM μπορεί να παίζουν σημαντικό ρόλο στην το ανοσοποιητικό και το αρσενικό αναπαραγωγικό σύστημα και στην ογκογένεση [5] – [12]. Εχει πρόσφατα αποδειχθεί ότι

CMTM3

σίγηση ή προς τα κάτω ρυθμισμένα σε γαστρικό, μαστού, ρινοφαρυγγικό, του οισοφάγου, του παχέος εντέρου και νεφρικών καρκινωμάτων [8], [13]. έκφραση της ήταν αντιστρόφως ανάλογη με την ιδιότητα του υποκινητή CpG μεθυλίωση [8], [13]. Η εκ νέου έκφραση του CMTM3 σε καρκινικά κύτταρα δεν έχουν έκφραση της οδηγεί στην καταστολή της κυτταρικής ανάπτυξης και της απόπτωσης, γεγονός που υποδηλώνει ότι CMTM3 είναι ένας νέος καταστολέας όγκων [8]. Ωστόσο, ο ρόλος του στην ανάπτυξη και εξέλιξη του καρκίνου δεν έχει σαφώς καθορισμένες μέχρι σήμερα.

Σε αυτή τη μελέτη, παρατηρήσαμε ότι

CMTM3

ήταν συχνά κάτω-ρυθμίζονται σε όρχεων ιστούς του καρκίνου μέσω μεθυλίωσης σε ένα Συγκεκριμένα, ενιαίο χώρο CpG που βρίσκεται εντός του Sp1 /Sp3-απόκρισης περιοχή του υποκινητή. Η έκτοπη έκφραση του

CMTM3

ανέστειλε το σχηματισμό αποικίας, τον πολλαπλασιασμό, τη μετανάστευση και επεμβατική ικανότητα των όρχεων καρκινικών κυττάρων. Αυτές οι λειτουργίες της CMTM3 επιτεύχθηκαν διαμορφώνοντας την εξέλιξη του κυτταρικού κύκλου και της απόπτωσης.

Υλικά και Μέθοδοι

καρκινικά κύτταρα και κλινικά δείγματα

Ένα σεμίνωμα ανθρώπινη κυτταρική σειρά (NCCIT), του προστάτη καρκινικές κυτταρικές σειρές (LNCaP, DU145, PC3 και 22RV1), νεφρικές κυτταρικές σειρές καρκίνου (OSRC-2 και 786-O), κυτταρικές γραμμές όγκου κύστης χρησιμοποιήθηκαν (HTB9-5637 και Τ24) και μια ανθρώπινη επιθηλιακή κυτταρική σειρά νεφρού ΗΕΚ-293 . Τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε RPMI 1640 (GIBCO /BRL) συμπληρωμένο με 10% ορό εμβρύου βοός (FBS) στους 37 ° C με μία ατμόσφαιρα 5% CO

2.

Είκοσι ζεύγη όρχεων καρκινικούς ιστούς και τα συμφωνημένα μη-καρκινικές όρχεων ιστών ελήφθησαν από ασθενείς που υποβάλλονται σε πρωτογενή χειρουργική επέμβαση στο Νοσοκομείο Shenzhen Δεύτερη Λαϊκής και το Πανεπιστήμιο του Πεκίνου Shenzhen Νοσοκομείο με τους ασθενείς »ή των κηδεμόνων έγγραφη συγκατάθεση και έχει εγκριθεί από την επιτροπή δεοντολογίας του νοσοκομείου για τον Shenzhen Δεύτερον Λαϊκής, Shenzhen, Κίνα. Τα δείγματα είτε αμέσως σταθεροποιήθηκαν σε 10% ουδέτερη φορμαλίνη για ιστολογία και ανοσοϊστοχημεία ή καταψύχθηκαν σε υγρό άζωτο και αποθηκεύτηκαν στους -80 ° C για περαιτέρω PCR. H & amp? E-βάφονται διαφάνειες από όλες τις περιπτώσεις εξετάστηκαν για την επιβεβαίωση των διαγνώσεων. Οι όγκοι των όρχεων γεννητικών κυττάρων αποτελείτο από 15 περιπτώσεις σεμίνωμα, εμβρυονικό καρκίνωμα 2, 1 τεράτωμα, 1 μικτή εμβρυονικό καρκίνωμα και τεράτωμα, και 1 όγκος κυττάρων Leydig σύμφωνα με τα κριτήρια του Παγκόσμιου Οργανισμού Υγείας [14]. Πέντε φυσιολογικά δείγματα ορχικού ιστού από ενήλικες που είχαν υποβληθεί σε νεκροψία ρουτίνας χρησιμοποιήθηκαν επίσης για τους ελέγχους. Οι ασθενείς είναι 6-58 ετών με μέσο όρο 38 χρόνια.

ποσοτικαί ανάστροφης μεταγραφής-ΡΟΡ και σε πραγματικό χρόνο PCR

Η απομόνωση του συνολικού RNA και ανάστροφη μεταγραφή πραγματοποιήθηκαν όπως περιγράφηκε προηγουμένως [15]. Η ημι-ποσοτική ανάλυση PCR του

CMTM3

πραγματοποιήθηκε με τη χρήση ειδικών εκκινητών, και

GAPDH

χρησιμοποιήθηκε ως εσωτερικός έλεγχος.

CMTM3

και

GAPDH

εκκινητών ήταν

CMTM3

-F: 5′-TTTTATCTGCTATGTGGCGTCC-3 ‘, και

CMTM3

-R: 5′-TGTCTTGTGGGCTGTGGTCTC -3 ‘?

GAPDH

-F: 5′-GTCAACGGATTTGGTCGTATTG-3 ‘, και

GAPDH

-R: 5′-CTCCTGGAAGATGGTGATGGG-3′. PCR δοκιμασίες σε πραγματικό χρόνο διεξήχθησαν χρησιμοποιώντας Platinum SYBR Green Supermix qPCR UDG (Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA). Η δοκιμασία διεξήχθη εις τριπλούν χρησιμοποιώντας διαφορετικά σύνολα εκκινητής:

CMTM3

-F: 5′-GCTTCTTTGCTACCATCGTGTTTG-3 ‘, και

CMTM3

-R: 5′-GCCTTCAGTCAG AGTCCGAGTC-3′?

GAPDH

-F: 5′-CGCTCTCTGCTCCTCCTGTTC -3 ‘?

GAPDH

-R: 5′-ATCCGTTGACTCCGACCTTCAC-3 ‘. Το σχετικό επίπεδο έκφρασης του

CMTM3

προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας το 2

-ΔΔCt μέθοδο [16].

εκχύλιση πρωτεϊνών και blot ανάλυση Western

Οι ιστοί ή κύτταρα λύθηκαν με ρυθμιστικό διάλυμα RIPA (Sigma-Aldrich, St. Louis, ΜΟ, USA) συμπληρωμένο με ένα κοκτέιλ αναστολέα πρωτεάσης και αναστολείς φωσφατάσης. Μία ποσότητα 30 μg της συνολικής πρωτεΐνης διαχωρίστηκαν σε SDS-12% γέλες πολυακρυλαμιδίου και μεταφέρθηκαν σε μεμβράνες PVDF (Ηγοοηά-P, Amersham Biosciences Piscataway, NJ, USA). Μετά τον αποκλεισμό με 5% BSA σε Τρις-ρυθμιστικό αλατούχο διάλυμα με 0.1% Tween 20 (TBST) σε θερμοκρασία δωματίου για 2 ώρες, η μεμβράνη ανιχνεύτηκε με πρωτογενές αντίσωμα στους 4 ° C όλη τη νύκτα. Μετά από πλύση τρεις φορές με ρυθμιστικό διάλυμα TBST, οι μεμβράνες επωάστηκαν με υπεροξειδάση κρένου συζευγμένη με IgG. Τα σήματα κηλίδωση έγιναν ορατά με το υπόστρωμα σήμα υπέρ West Pico χημειοφωταύγειας (Pierce, Rockford, IL, USA). Οι μεμβράνες απογυμνώθηκαν με ρυθμιστικό απογύμνωσης στους 40 ° C για 30 λεπτά με ήπια ανακίνηση και ξαναϊχνηθετούνται με ένα πολυκλωνικό αντίσωμα κουνελιού έναντι β-ακτίνης (1:10000, Santa Cruz Biotechnology) ως έλεγχος για την πρωτεΐνη φόρτωση.

Κατασκευή πλασμιδίων υποκινητή, επιμόλυνση και λουσιφεράσης

δοκιμασία

Για την κατασκευή μιας σειράς

CMTM3

υποκινητή με γνώμονα λουσιφεράσης πλασμίδια αναφοράς, έξι τμήματα DNA του ανάντη του

CMTM3

κωδικόνιο έναρξης ενισχύθηκαν με PCR (PCR εκκινητές σε πίνακα S1 στο S1 File) και κλωνοποιήθηκε εντός του pGL3-βασικό φορέα (Promega). Οι ενθέσεις επιβεβαιώθηκαν με άμεση αλληλούχιση. 293FT και PC3 κύτταρα επιστρώθηκαν σε πλάκες καλλιέργειας 24-φρεατίων σε 1 × 10

5 κύτταρα /φρεάτιο και παροδικά επιμολυσμένα με τον ανταποκριτή pGL3 προαγωγό και pRLSV40 όπως περιγράφηκε προηγουμένως [15], [17]. Όταν ενδείκνυται, pCMV-Sp1 ή pCMV-Sp3 πλασμίδια έκφρασης (ΟηΟεηε, Rockville, MD, USA) συν-επιμολύνθηκαν μέσα στα κύτταρα. Η δραστικότητα λουσιφεράσης προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας το Dual-Luciferase Reporter System Assay (Promega, Madison, WI) και ομαλοποιούνται στη δραστικότητα λουσιφεράσης Renilla. Κάθε πείραμα διεξήχθη τρεις φορές εις τριπλούν. Η δραστικότητα ορίζεται ως ο λόγος της λουσιφεράσης της πυγολαμπίδας να λουσιφεράση της Renilla. Για το

in vitro δοκιμασία

μεθυλίωσης στο

CMTM3

θραύσμα υποκινητή, Sss Ι μεθυλάση χρησιμοποιήθηκε όπως αναφέρθηκε προηγουμένως [15].

θεραπεία όξινο θειώδες DNA και ανάλυση μεθυλίωσης

Η τροποποίηση διθειώδους των DNA και όξινο θειώδες γονιδιωματική αλληλούχιση (BGS) διεξήχθησαν όπως περιγράφηκε προηγουμένως [15], [18]. Όξινο θειώδες αλληλουχίας εκκινητών PCR (BGS-F, TAGATAGTTTTTTTGGATAGGGGTAGA και BGS-R, ACCTTTAAAAAAACAAAAAAAAACCC) σχεδιάστηκαν χρησιμοποιώντας το online πρόγραμμα, MethPrimer (https://itsa.ucsf.edu/urolab/MethPrimer) [19]. PCR διεξήχθη για 40 κύκλους με HotStart Taq πολυμεράση (Qiagen, Hilden, Germany). Τα προϊόντα PCR κλωνοποιήθηκαν στον φορέα ρΟΕΜ-Τ (Promega, Madison, WI). Οκτώ έως δέκα λευκό κλώνοι για κάθε δείγμα επιλέχθηκαν τυχαία για αλληλούχιση.

Ανοσοϊστοχημεία

Η ανοσοϊστοχημική ανάλυση των CMTM3 διεξήχθη χρησιμοποιώντας πρότυπη τεχνική δύο σταδίων όπως περιγράφηκε προηγουμένως [15]. Μετά αποπαραφίνωση και την επανυδάτωση, slides ιστού μαγειρεύονται για να ανακτήσετε το αντιγόνο σε ένα φούρνο μικροκυμάτων με 10 mM κιτρικό ρυθμιστικό (ρΗ 6) για 15 λεπτά. Τα πλακίδια βυθίστηκαν σε 3% Η

2O

2 για 20 λεπτά για να εμποδίσει την ενδογενή δραστηριότητα υπεροξειδάσης, πλύθηκαν με PBS και επωάστηκαν με 3% φυσιολογικό ορό βοοειδούς σε TBS για 30 λεπτά για να αποτραπεί η μη ειδική δέσμευση του το πρωτογενές αντίσωμα. Στη συνέχεια, τα πλακίδια ιστού επωάστηκαν με καθαρισμένο πολυκλωνικό αντίσωμα κουνελιού έναντι CMTM3 (1:500, ευγενική προσφορά από τον Dr. Han, Πανεπιστήμιο Κέντρο Πεκίνου για τις ανθρώπινες ασθένειες Genomics) ή κανονικό IgG κουνελιού ως μάρτυρα σε 4 ° C όλη τη νύκτα. Μετά από πλύση με PBS τρεις φορές, τα πλακίδια επωάστηκαν με αντίσωμα κατσίκας αντι-κουνελιού IgG-HRP (sc-2030, Santa Cruz, CA, USA). Μετά το πλύσιμο, οι ιστοί βάφτηκαν με πρόσφατα παρασκευασμένο διάλυμα DAB (DAKO, Carpinteria, CA) και ορατό και φωτογραφήθηκε με μια Leica DM4000B (Leica Microsystems, Inc.).

Η ανοσοϊστοχημική έκφραση της CMTM3 αξιολογήθηκε με βάση ένα αντιπροσωπευτικό πεδίο υψηλής ισχύος από σημεία συστοιχία 2 ιστού από δύο ανεξάρτητους ερευνητές. Η έκφραση της CMTM3, με βάση τον υπολογισμό μιας βαθμολογίας συνολική ανοσοχρώση (TIS) ως το προϊόν μιας βαθμολογίας ποσοστό (PS) και μία βαθμολογία έντασης (IS), προσδιορίστηκε ποσοτικά κάτω από το μικροσκόπιο και ταξινομούνται σε τέσσερις υποομάδες: καμία έκφραση (0-4) ? ασθενής έκφραση (+: 5,6,8)? μέτρια έκφραση (++: 9,10,12)? έντονη έκφραση (+++: 15). [20]

αδενοϊό λοίμωξη

Η αδενοϊό που φέρει το

CMTM3

γονίδιο (Ad-

CMTM3

) και το κενό αδενοϊό (Ad-null) ήταν ευγενική προσφορά Lab Δρ Χαν [7]. κύτταρα NCCIT σπάρθηκαν στα 5000 κύτταρα /cm

2 σε πλάκες καλλιέργειας ιστών, και μετά από 24 ώρες, μόλυνση επιτεύχθηκε με έκθεση των κυττάρων σε αδενοϊό στην απαιτούμενη πολλαπλότητα μόλυνσης (ΜΟΙ) σε μέσα κυτταρικής καλλιέργειας χωρίς ορό για 60 min, ακολουθούμενο από την προσθήκη του μέσου που περιέχει ορό επί 1-4 ημέρες.

ο πολλαπλασιασμός των κυττάρων

για την ανάλυση του κυτταρικού πολλαπλασιασμού, τα κύτταρα NCCIT μολύνθηκαν όπως παραπάνω, και ο πολλαπλασιασμός των κυττάρων μετρήθηκε στις 24, 48 και 72 ώρες με τη χρήση της μέτρησης κυττάρων Kit-8 (CCK-8) ακολουθώντας τις οδηγίες του κατασκευαστή. Η φασματοφωτομετρική απορρόφηση στα 490 nm μετρήθηκε χρησιμοποιώντας έναν αναγνώστη μικροπλακών. Τα δεδομένα αναφέρονται ως μέσος όρος τουλάχιστον τριών ανεξάρτητων πειραμάτων.

Colony δοκιμασία σχηματισμού

Τα κύτταρα μολύνθηκαν με Ad-

CMTM3

ή Ad-null. 24 ώρες μετά τη μόλυνση, 1000 κύτταρα τοποθετήθηκαν σε κάθε φρεάτιο πλακών 6-φρεατίων και διατηρήθηκαν σε πλήρες μέσο για 2 εβδομάδες. Επιβίωση αποικιών (≥50 κύτταρα ανά αποικία) σταθεροποιήθηκαν με μεθανόλη, βάφτηκαν με κρυσταλλικό ιώδες, μετρήθηκαν και φωτογραφήθηκαν. Κάθε πείραμα διεξήχθη εις τριπλούν και εκτελείται τρεις φορές.

επούλωση της πληγής δοκιμασία

Για τον προσδιορισμό επούλωση της πληγής in vitro, τα κύτταρα που έχουν μολυνθεί με Ad-

CMTM3

ή Ad -null καλλιεργήθηκαν σε πλάκες έξι φρεατίων μέχρι συρροή. Μια ευθεία γρατσουνιά δημιουργήθηκε σε όλη την κυτταρική στοιβάδα χρησιμοποιώντας ένα στείρο άκρο μικροπιπέτας, και το θραύσματα απομακρύνθηκαν με έκπλυση των κυττάρων με μέσο χωρίς ορό. Τα κύτταρα φωτογραφήθηκαν 0 και 36 ώρες μετά τον τραυματισμό. Τα πειράματα πραγματοποιήθηκαν εις τριπλούν.

Δοκιμασίες απόπτωσης

Ο αποπτωτικός κυτταρικός θάνατος εκτιμήθηκε με κυτταρομετρία ροής χρησιμοποιώντας το αννεξίνης V-FITC /ΡΙ Apoptosis Detection Kit σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Μετά από 72 ώρες, τα κύτταρα συλλέχθηκαν και επωάστηκαν με Αννεξίνη V-FITC και ΡΙ για 30 λεπτά στο σκοτάδι στους 4 ° C. Η ανάλυση κυτταρομετρίας ροής πραγματοποιήθηκε αμέσως. Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως bi-παραμετρικές διαγράμματα στιγμών δείχνει αννεξίνης V-FITC πράσινου φθορισμού έναντι ΡΙ κόκκινο φθορισμό. Τα πειράματα εκτελέστηκαν τρεις φορές.

Ποσοτική PCR για την πορεία της απόπτωσης

Σαράντα οκτώ ώρες μετά τα κύτταρα μολύνθηκαν με Ad-

CMTM3

ή Ad-null, τα κύτταρα συλλέχθηκαν και το ολικό RNA απομονώθηκε και καθαρίστηκε με τη RNeasy κιτ απομόνωσης RNA (Qiagen). Μία ποσότητα 2 μg ολικού RNA χρησιμοποιήθηκε για να συνθέσει cDNA που με την RT2 First Strand Kit (SABiosciences, QIAGEN). Τα cDNA προστέθηκαν σε πλάκα 96 φρεατίων από την RT

2 array σύστημα Profiler PCR (ανθρώπινη απόπτωση PCR array). Ποσοτική RT-PCR για 84 γονίδια που σχετίζονται με την ανθρώπινη απόπτωση εκτελέστηκε χρησιμοποιώντας την iCycler iQ5 PCR Πραγματικού χρόνου System (Bio-Rad, Hercules, CA). Η ανάλυση των δεδομένων έγινε με τη χρήση του ΔΔ

C

T

μέθοδο με πέντε γονίδια καθαριότητα (

GAPDH

,

RPL13A

,

B2M

,

ACTB

, και

HPRT1

) που έχουν επιλεγεί για την ομαλοποίηση. Μεταγραφές θεωρήθηκαν απούσα, αν C

t & gt? 35 και αφαιρέθηκαν από την ανάλυση. Αλλαγές στην έκφραση γονιδίου προσδιορίστηκαν με σύγκριση των επιπέδων μεταγραφής γονιδίων σε κύτταρα μολυσμένα με Ad-CMTM3 σε κύτταρα μολυσμένα με Ad-null.

κυτταρικού κύκλου ανάλυση

Σαράντα οκτώ ώρες μετά τα κύτταρα μολύνθηκαν με ad-

CMTM3

ή Ad-null, τα κύτταρα θρυψινοποιήθηκαν, πλύθηκαν δύο φορές, επαναιωρήθηκαν σε ρυθμισμένο με φωσφορικό αλατούχο (PBS) και σταθεροποιήθηκαν σε παγωμένο 70% αιθανόλη. Αφού τα κύτταρα βάφτηκαν με ιωδιούχο προπίδιο (ΡΙ), ανάλυση κυτταρικού κύκλου εκτελέστηκε με κυτταρομετρία ροής σε ένα κύτταρο διαλογής σαρωτή φθορισμού που ενεργοποιείται. Η κατανομή κυτταρικού κύκλου αναλύθηκε με λογισμικό Cell Quest.

Στατιστικές αναλύσεις

Οι στατιστικές αναλύσεις πραγματοποιήθηκαν με τη χρήση SPSS έκδοση 19 του λογισμικού. Η ανάλυση έκφρασης των CMTM3 μεταξύ των όρχεων καρκινικούς ιστούς και τους αντίστοιχους γειτονικούς ιστούς αξιολογήθηκαν χρησιμοποιώντας t-test του Student. Οι συγκρίσεις των κατηγορικών μεταβλητών έγιναν με τη χρήση του x

2 δοκιμών ή 2-tailed t-test. Οι διαφορές θεωρήθηκαν στατιστικά σημαντικές εάν η αξία AP ήταν μικρότερη από 0,05.

Αποτελέσματα

CMTM3 συχνά μειωτικά σε καρκίνους των όρχεων

Για να διερευνήσουν το ρόλο CMTM3 στον καρκίνο του ουρογεννητικού συστήματος, πρέπει πρώτα να ερωτηθούν η Oncomine βάση δεδομένων [21] για την εκτίμηση των επιπέδων σχετικής έκφρασης του

CMTM3

στο ουρογεννητικό καρκίνο. Δύο ανεξάρτητες μελέτες έδειξαν ότι το

CMTM3

έκφραση μειώθηκε στατιστικά σημαντικά σε όρχεων όγκων [22], [23] (Σχήμα 1Α, 1Β). Επίσης μετράται

CMTM3

επίπεδα mRNA σε 10 ουρογεννητικό καρκινικές κυτταρικές σειρές. Σε σύγκριση με την υψηλή έκφραση του

CMTM3

σε φυσιολογικούς ανθρώπινους ιστούς των όρχεων, η έκφραση του

CMTM3

σίγησε σε ένα σεμίνωμα κυτταρική γραμμή (NCCIT) και ρυθμισμένα προς τα κάτω ή σιγήσει σε 2 από 4 προστάτη κυτταρικές σειρές καρκίνου, 2 από 3 νεφρικών καρκινικών κυτταρικών σειρών και σε καμία από τις κυτταρικές σειρές που μελετήθηκαν όγκου κύστης (Σχήμα 1 C). Αναλύσαμε περαιτέρω την έκφραση του

CMTM3

σε 20 ζεύγη ιστούς όγκων των όρχεων και των αντίστοιχων καλοήθεις παρακείμενους ιστούς.

CMTM3

επίπεδα mRNA σίγησαν ή έντονα προς τα κάτω σε 16 από 20 περιπτώσεις καρκίνου των όρχεων με συνολική 5-φορές μείωση σε σύγκριση με την αντίστοιχη καλοήθη παρακείμενο ιστό (

P

= 0,002) (Εικόνα 1D) . Τα αποτελέσματα επιβεβαιώθηκαν σε επίπεδα πρωτεΐνης με χρώση ανοσοϊστοχημείας (Σχήμα 1 Ε).

(Α και Β) Η έκφραση του CMTM3 σε μεμονωμένα δείγματα από φυσιολογικούς ιστούς των όρχεων ή ο καρκίνος των όρχεων που εμφανίζεται (δεδομένα κανονικοποιούνται με την κλίμακα log2 από τα σύνολα δεδομένων Sperger [23] και Korkola [22]). Οι συγκρίσεις μεταξύ των ομάδων πραγματοποιήθηκαν με τη χρήση t-test του Student, με τιμές Ρ υποδεικνύονται σε κάθε πίνακα. (Γ) Η έκφραση του

CMTM3

σε φυσιολογικούς ιστούς όρχεις και ουρογεννητικό κυτταρικές γραμμές καρκίνου προσδιορίστηκαν με πραγματικού χρόνου RT-PCR. Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως η μέση ± S.D. για τρία ανεξάρτητα πειράματα. (Δ) Η έκφραση του

CMTM

3 σε 20 όρχεων δείγματα όγκων και σε συνδυασμό φυσιολογικούς ιστούς των όρχεων καθορίστηκε με πραγματικού χρόνου RT-PCR. Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως η μέση ± S.D. από τρία ανεξάρτητα πειράματα. (Ε) Αντιπροσωπευτική χρώση ανοσοϊστοχημείας για CMTM3 σε δείγματα όγκων όρχεων και αντιστοιχισμένο φυσιολογικούς ιστούς των όρχεων.

Η

Επιπλέον, επέκτεινε την ανάλυση της έκφρασης CMTM3 σε ανεξάρτητο ομάδα των όρχεων μικροσυστοιχιών ιστού με ανοσοϊστοχημεία (Πίνακας 1, Εικόνα S1 στο S1 αρχείου). 75 περιπτώσεις όγκων όρχεων, 36 (48%) περιπτώσεις όγκων δεν έδειξε έκφραση CMTM3, 27 (36%) περιπτώσεις οι όγκοι είχαν χαμηλή έκφραση CMTM3, και 12 (16%) περιπτώσεις όγκων είχαν μέτρια έκφραση CMTM3. Όλες οι περιπτώσεις 18 (100%) του καρκίνου παρακείμενων φυσιολογικών ιστών και φυσιολογική όρχεων ιστούς είχε εντατικές ή ισχυρά εντατική έκφραση CMTM3 (Πίνακας 1). Όλα 8 (100%) περίπτωση ατροφίας είχε εντατικές έκφραση CMTM3. Σημαντικά, καμία μεμονωμένη περίπτωση δεν παρατηρήθηκε χρώση όπου CMTM3 ήταν πιο έντονη σε όγκο από ό, τι σε φυσιολογικούς όρχεις, τονίζοντας περαιτέρω την ειδικότητα του παρατηρηθέν πρότυπο (Πίνακας 1). Ερευνήσαμε επίσης τη συσχέτιση μεταξύ CMTM3 εκφράσεις στο σεμίνωμα με παθολογικές παραμέτρους, και παρατήρησα ότι μειώθηκε CMTM3 συνδέεται σημαντικά με προχωρημένο στάδιο T (Πίνακας S2 στο αρχείο S1).

Η

Re-έκφραση CMTM3 αναστέλλει τον κυτταρικό την ανάπτυξη και τη μετανάστευση των κυττάρων

Η φίμωση του

CMTM3

του καρκίνου των όρχεων έδειξε ότι CMTM3 θα μπορούσε να είναι ένα λειτουργικό ογκοκατασταλτικό στο όρχεων καρκινογένεση. Για τη διερεύνηση της ανάπτυξης ανασταλτική επίδραση του

CMTM3

, η εκ νέου έκφραση του

CMTM3

στα παροδικά μολυσμένα κύτταρα NCCIT επιβεβαιώθηκε με RT-PCR και κηλίδωση Western (Σχήμα 2Α). Όπως φαίνεται στο Σχήμα 2Β, η κυτταρική ανάπτυξη μειώθηκε σημαντικά σε Ad-

CMTM3

μολυνθέντα NCCIT κύτταρα σε σύγκριση με τα κύτταρα ελέγχου Ad-null-μολυσμένα. Η κατασταλτική δράση στην ανάπτυξη των καρκινικών κυττάρων επιβεβαιώθηκε περαιτέρω με δοκιμασία σχηματισμού αποικίας. Οι αριθμοί των αποικιών ήταν σημαντικά μειωμένη σε σύγκριση με τα κύτταρα ελέγχου σε 32% σε κύτταρα μολυσμένα με NCCIT Ad-

CMTM3

(Ρ & lt? 0,01). (Σχήμα 2C)

(Α) Εκφραση σε CMTM3 NCCIT κύτταρα μετά από μόλυνση με Ad-CMTM3 επιβεβαιώθηκε χρησιμοποιώντας RT-PCR και στυπώματα Western. πολλαπλασιασμό (Β) Cell ανιχνεύθηκε με την δοκιμασία WST-1 σε κύτταρα NCCIT μετά από μόλυνση με Ad-null ή Ad-

CMTM3

. (Γ) Αντιπροσωπευτικά αποτελέσματα αναλύσεων αποικιών σχηματισμός με κύτταρα NCCIT. (Δ) Η μετανάστευση προσδιορίστηκε με μία δοκιμασία για επούλωση της πληγής σε κύτταρα NCCIT μολυνθεί με Ad-μηδενική ή Ad-

CMTM3

. Τα αποτελέσματα είναι αντιπροσωπευτικά τριών ανεξάρτητων πειραμάτων.

Η

Επιπλέον, η επίδραση της CMTM3 επί των όρχεων καρκίνο κυτταρική κινητικότητα εξετάστηκε με δοκιμασία επούλωση της πληγής. Συρρέουσες μονοστιβάδες κυττάρων γδαρμένο να σχηματίσουν πληγών και στη συνέχεια καλλιεργήθηκαν για 24 ώρες. Η έκτοπη έκφραση CMTM3 οδήγησε σε σημαντική μείωση της επούλωσης τραυμάτων μετανάστευση των κυττάρων σε σύγκριση με το Ad-null-μολυσμένα κύτταρα (Σχήμα 2D). Ad-

CMTM3

επιμολυσμένα κύτταρα έγιναν στρογγυλά και ανεξάρτητο, εκτιμώντας ότι κανένας προφανής αλλαγή δεν παρατηρήθηκε σε Ad null-μολυσμένα κύτταρα, τα οποία είναι συνεπής με μια προηγούμενη αναφορά [8].

Re- έκφραση του CMTM3 επάγει διακοπή του κυτταρικού κύκλου σε G2 φάγου και την κυτταρική απόπτωση

Η αξιοσημείωτη καταστολή του πολλαπλασιασμού από CMTM3 μας ώθησε να αξιολογηθούν τα αποτελέσματα της CMTM3 στην κατανομή του κυτταρικού κύκλου και της απόπτωσης των καρκινικών κυττάρων των όρχεων. Αντιπροσωπευτικά αποτελέσματα της κατανομής του κυτταρικού κύκλου σε Ad-τευθείαν ή Ad-

CMTM3

μολυνθέντα κύτταρα NCCIT δείχνονται στο Σχήμα 3Α. Η ανάλυση κυτταρομετρίας ροής έδειξε μία σημαντική διακοπή κύκλου G2 κυττάρου σε CMTM3-κύτταρα που εκφράζουν σε σύγκριση με τα κύτταρα ελέγχου μολυσμένα (Σχήμα 3Α).

(Α) Αντιπροσωπευτική ανάλυση κυτταρικού κύκλου. Τα αποτελέσματα παρουσιάζονται ως μέσος όρος ± Τ.Α και βασίζονται σε τρία ανεξάρτητα πειράματα (ρ & lt? 0,01). φάσεις G1 και G2 σε κόκκινο, S φάσεις σε λευκό. (Β) κύτταρα NCCIT μολυσμένα με Ad-null και Ad-

CMTM3

σημάνθηκαν με ΡΙΤΟ-αννεξίνης V /PI, και η απόπτωση εκτιμήθηκε με κυτταρομετρία ροής. (C) Ανάλυση Western blot των κυτταρικών κύκλου περίπου και πρωτεϊνών απόπτωση που σχετίζονται με Ad-τευθείαν και Ad-

CMTM3

μολυνθέντα κύτταρα NCCIT. β-ακτίνη χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος. Όλα τα πειράματα διεξήχθησαν τρεις φορές. (Δ) Μια σχηματική απεικόνιση του προτεινόμενου μοντέλου που απεικονίζει ένα ρ53-ανεξάρτητη απόπτωση μονοπάτι σε όγκους των όρχεων.

Η

Ερευνήσαμε επίσης την αποπτωτική δράση των CMTM3 στο όρχεων καρκινικά κύτταρα χρησιμοποιώντας αννεξίνη V-FITC χρώση /ΡΙ δοκιμασίες. Η αναλογία αννεξίνης ν-θετικής /ΡΙ-θετικών κυττάρων αυξήθηκε κατά 15,4% το Ad-

CMTM3

-transduced κύτταρα NCCIT (Σχήμα 3Β). Αυτά τα αποτελέσματα υποδεικνύουν ότι η ανασταλτική επίδραση στον πολλαπλασιασμό των κυττάρων με CMTM3 πιθανότατα διαμεσολαβείται από τη σύλληψη G2 του κυτταρικού κύκλου και της απόπτωσης.

CMTM3 επάγει διακοπή του κυτταρικού κύκλου και της απόπτωσης σε ένα ρ53-ανεξάρτητο τρόπο

Για διερευνήσει το μοριακό μηχανισμό του CMTM3 επαγόμενη διακοπή του κυτταρικού κύκλου, εκτιμήσαμε την επίδραση της CMTM3 επανέκφραση στην έκφραση του ρυθμιστή του κυτταρικού κύκλου, p21. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 3C, CMTM3 μπορεί να αυξήσει τα επίπεδα mRNA και πρωτεΐνης ρ21.

Για τον προσδιορισμό του μοριακού μηχανισμού του CMTM3 απόπτωση, χρησιμοποιήσαμε το ανθρώπινο απόπτωση RT

2 Profiler PCR Array, το οποίο περιέχει 84 γνωστά αποπτωτικών γονιδίων, για την παρακολούθηση των προφίλ έκφρασης των κυττάρων NCCIT μολυνθεί με Ad-

CMTM3

. Προς έκπληξή μας, τα αποτελέσματα έδειξαν ότι το

TP53

και μια σειρά από γονίδια (

APAF1

,

ΒΑΧ

, και

BCL10

) ήταν σημαντικά ανάντη ρυθμιζόμενη (Πίνακας 2). Αυτά τα αποτελέσματα επαληθεύτηκαν με qPCR με διαφορετικούς εκκινητές από εκείνες που χρησιμοποιούνται στη συστοιχία PCR. Τα επίπεδα πρωτεΐνης αυξήθηκαν επίσης κατά ένα παρόμοιο μεγέθους (Σχήμα 3C, Πίνακας 2).

Η

Στη συνέχεια, διερευνήσαμε την ενεργοποίηση του αποπτωτικού μονοπατιού με ανάλυση Western. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 3C, η διασπασμένη κασπάση 3 θραύσμα ήταν σημαντικά αυξημένη, ενώ προ-κασπάση-3 ήταν σημαντικά μειωμένη σε CMTM3 όρχεων καρκινικά κύτταρα που εκφράζουν την εκ νέου σύγκριση με τους ελέγχους (Σχήμα 3C). Re-εκφράζουν CMTM3 επίσης σημαντικά προωθείται έκφραση πρωτεΐνης κασπάσης-9 σε όρχεων καρκινικά κύτταρα. Εν τω μεταξύ, η αυξημένη σχάση πολυ (ADP-ριβόζη) πολυμεράσης παρατηρήθηκε σε CMTM3-επιμολυσμένα κύτταρα αλλά σπανίως ανιχνεύεται σε κύτταρα ελέγχου (Εικόνα 3C). Αυτά τα δεδομένα υποδηλώνουν ότι CMTM3 διευκολύνει καρκίνο των όρχεων κυτταρικής απόπτωσης σε ένα ρ53-ανεξάρτητο τρόπο, το ρ53 δεν είναι πλήρως λειτουργική σε κύτταρα NCCIT [24] (Σχήμα 3D).

μεθυλίωσης ενός ειδικού, μόνο χώρο CpG σε κλινικές όρχεων δείγματα καρκίνου συνδέεται σημαντικά με την έκφραση μεταγραφή CMTM3

Όπως επιγενετική ρύθμιση εμπλέκεται στην έκφραση του

CMTM3

[8], ρωτήσαμε αν

CMTM3

μεθυλίωσης του DNA υποκινητής είναι συνδέεται με μια αντίστοιχη μείωση στην έκφραση CMTM3 σε καρκίνους των όρχεων.

Για να ορίσετε την περιοχή του υποκινητή ελέγχει

CMTM3

έκφρασης, δημιουργήθηκαν μια σειρά από κόλουρου κατασκευάσματα υποκινητή και εισάγεται στις pGL3 φορείς αναφοράς της λουσιφεράσης, και η δραστικότητα του προαγωγού προσδιορίστηκε με δοκιμασία για λουσιφεράσης. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 4Α, η πιο σημαντική δραστηριότητα προαγωγέα βρέθηκε σε ~ 400 bp θραύσμα (-343 να -83 bp από την αρχή τη θέση κωδικόνιο). Δύο πιθανές θέσεις πρόσδεσης για Sp1 /Sp3 στοιχεία στο θραύσμα ~ 400 bp εντοπίστηκαν από τα προγράμματα λογισμικού πρόβλεψης μοτίβο μεταγραφικού παράγοντα.

(Α) Ανάδοχος δραστηριότητα των ανθρώπινων κατασκευασμάτων διαγραφής CMTM3 στην 293FT και PC3 κύτταρα. Τα κύτταρα επιμολύνθηκαν με 0.8 μg pGL3-βασικό ή ανταποκριτή λουσιφεράσης κατασκευάσματα που περιέχουν διαφορετικά τμήματα προαγωγού μέγεθος. (Β) Επιπτώσεις του Sp1 /SP3 σε έκφραση του γονιδίου αναφοράς. 293FT και PC3 κύτταρα επιμολύνθηκαν με ρΟΜν

Sp1 /Sp3

πλασμίδια έκφρασης ή τον κενό φορέα ως μάρτυρα. (Γ) Το θραύσμα υποκινητή (pGL-D) και η in vitro μεθυλιωμένο θραύσμα (pGL-PD SSSI) επιμολύνθηκαν σε 293FT και PC3 κύτταρα και μία διεξήχθη δοκιμασία λουσιφεράσης. Όλα τα κατασκευάσματα συνδιαμολύνονται με φορέα pRLSV40 ως εσωτερικός έλεγχος για την αποτελεσματικότητα της επιμόλυνσης. Η δραστηριότητα της λουσιφεράσης εκφράζεται ως το ποσοστό δραστικότητας ελέγχου. Τα δεδομένα εκφράζονται ως το μέσο ± SE

Η

Για να επιβεβαιώσει εάν η σχετική

cis-δράσης

στοιχεία, Sp1 και SP3, εμπλέκονται στη ρύθμιση του

CMTM3

γονιδιακής έκφρασης, 293FT και PC3 κύτταρα συν-επιμολυσμένα με το κατασκεύασμα pGL3-

PD

και ρΟΜν

Sp1

ή ρΟΜν

Sp3

. δοκιμασίες γονιδίου ανταποκριτή λουσιφεράσης έδειξε ότι η υπερέκφραση του Sp1 ή Sp3 θα μπορούσε να αυξήσει σημαντικά την

CMTM3

δραστηριότητα υποκινητή (Σχήμα 4Β). Επιπλέον, η δραστηριότητα υποκινητή CMTM3 μειώθηκε δραματικά μετά την μεθυλίωση (Σχήμα 4C).

Είμαστε δίπλα πραγματοποιηθεί το όξινο θειώδες αλληλουχία των 53 CpG θέσεων, συμπεριλαμβανομένου του

CMTM3

περιοχή πυρήνα υποκινητή (-353 έως 126 bp από την αρχή του site κωδικόνιο) σε 13 ζεύγη δειγμάτων πρωτογενούς όγκου των όρχεων (Εικόνα 5Α). Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι μία μονή θέση CpG στο -155 bp, που βρίσκεται στη διασταύρωση των δύο θέσεων συνδέσεως Sp1 /SP3, ήταν πιο σημαντικά μεθυλιώθηκε σε ιστούς όγκων (40,4% και 9,0%, αντίστοιχα), στην οποία

CMTM3

ήταν ρυθμισμένα προς τα κάτω, σε σχέση με το αντίστοιχο μη καρκινικούς ιστούς (Σχήμα 5Β). Καμία σημαντική μεθυλίωση DNA παρατηρήθηκε στις άλλες 52 θέσεις CpG. Μια στατιστικά σημαντική αντίστροφη συσχέτιση παρατηρήθηκε μεταξύ της μεθυλίωσης του ενιαίου τόπου CpG σε -155 bp και το επίπεδο των

CMTM3

έκφραση mRNA σε κλινικά δείγματα (

P

= 0,01, Ρ

2 = 0.246) (Σχήμα 5C). Το εύρημα αυτό υποδηλώνει ότι

CMTM3

μεταγραφή του καρκίνου των όρχεων καθορίζεται, τουλάχιστον εν μέρει, από την μεθυλίωση μιας συγκεκριμένης, ενιαίας ιστοσελίδα CpG εντός του

CMTM3

περιοχή του υποκινητή.

(Α) Σχηματική δομή του γονιδίου CMTM3, νησίδες CpG, υποθετικές θέσεις πρόσδεσης παράγοντα μεταγραφής και της θέσης έναρξης μεταγραφής. Τα εξώνια υποδεικνύονται με πράσινα ορθογώνια. Η θέση έναρξης μετάφρασης υποδεικνύεται από ένα καμπύλο βέλος. Η προς τα κάτω βέλος δείχνει την πιθανή θέση δέσμευσης για Sp1 /SP3. Οι BGS εκκινητές για αναλύσεις μεθυλίωση ενδείκνυται. (Β) Η μεθυλίωση της περιοχής υποκινητή CMTM3 αναλύθηκε με BGS. Η μεθυλίωση των CpG θέσεων 8 στην περιοχή υποκινητή πυρήνα για 3 ζεύγη όγκου και της αντίστοιχης καλοήθης παρακείμενων ιστών δείχνεται. (Γ) Η μεθυλίωση του ενιαίου τοποθεσία CpG στο -155 bp της περιοχής προαγωγού CMTM3 για 13 ζεύγη όγκου και της αντίστοιχης καλοήθεις παρακείμενων ιστών, σχεδιάζονται ως έκφραση CMTM3 mRNA σε όρχεων καρκινικούς ιστούς. παρατηρείται μια στατιστικά σημαντική αρνητική συσχέτιση. Pearson συσχέτιση, ρ = 0,01, Ρ

2 = 0.246.

Η

Συζήτηση

CMTM3

εκφράζεται υψηλά σε φυσιολογικό όρχεις [25], αλλά της ρόλο στον καρκίνο των όρχεων παραμένει άπιαστο. Στην παρούσα μελέτη, διαπιστώσαμε ότι

CMTM3

ήταν συχνά μειωτικά ή σιγήσει στο όρχεων καρκινικές κυτταρικές σειρές και πρωτογενείς όγκους (Εικόνα 1, Πίνακας 1) Εμείς πραγματοποιηθεί περαιτέρω λειτουργικές μελέτες σε κύτταρα NCCIT να αποκαλύψει τη βιολογική λειτουργία του CMTM3. Βρήκαμε ότι η εκ νέου έκφραση του CMTM3 μειωμένη κινητικότητα έντονα NCCIT κυττάρων και του σχηματισμού αποικιών καταστέλλεται (Σχήμα 2), το οποίο ήταν σύμφωνο με προηγούμενες αναφορές σε άλλους καρκίνους [8], [13]. Η ανάλυση κυτταρικού κύκλου έδειξε ότι CMTM3 ανέστειλε τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό με την αύξηση του ποσοστού των κυττάρων σε φάση G2 και την προώθηση της κυτταρικής απόπτωσης (Εικόνα 3Α, 3Β). Αυτά τα δεδομένα πρότειναν ότι λειτουργεί CMTM3 ως καταστολέας όγκων σε TGCTs. Προηγούμενες μελέτες έδειξαν ότι η οικογένεια CMTM πρωτεΐνες, συμπεριλαμβανομένης CMTM3 [8], CMTM5 [26], [27], και CMTM8 [28], [29], μπορούν να επάγουν κυτταρική απόπτωση. Ωστόσο, η αποπτωτική παθολογική οδό και ο μηχανισμός παραμένει ασαφείς. Στην παρούσα μελέτη, διαπιστώσαμε ότι η εκ νέου έκφραση CMTM3 στα κύτταρα NCCIT προώθησε την μεταγραφή του

TP53

,

P21

, και

ΒΑΧ

, και την αύξηση τους σε πρωτεΐνες επίπεδα με ένα παρόμοιου μεγέθους (Πίνακας 2, Εικόνα 3C). ρ53 δεν είναι πλήρως λειτουργική σε κύτταρα NCCIT, υποδηλώνοντας ότι δεν υπάρχει σαφής συσχετισμός μεταξύ της trans-ενεργοποίησης της ρ53 και την επαγωγή απόπτωσης σε κύτταρα NCCIT [24]. Ωστόσο, ρ21 ήταν σημαντικά αυξημένη. Έτσι, η δυνατότητα αυξήθηκε ώστε CMTM3 θα μπορούσε να προκαλέσει μια διακοπή G2 του κυτταρικού κύκλου και να διευκολύνει την απόπτωση των κυττάρων μέσω p21 ή άλλων οδών σε ρ53-ανεξάρτητο τρόπο, όπως αναφέρεται σε άλλες μελέτες (Σχήμα 3D) [30] – [32].

Η προς τα κάτω ρύθμιση των καταστολείς όγκων συσχετίζεται με μεταγραφική αναστολή μέσω της επαγωγής κατασταλτικών επιγενετικές τροποποιήσεις στην υποκινητή, συμπεριλαμβανομένων μεθυλίωσης του DNA και την τροποποίηση ιστονών [33].