Αφηρημένο

Η παρατήρηση ότι γκαλεκτίνη-7 (gal-7) είναι ειδικά εκφράζεται σε μαστικούς κύτταρα μυοεπιθηλιακά (βασική) μας ώθησε να διερευνήσει κατά πόσο αυτή η πρωτεΐνη εκφράζεται στα βασικά κύτταρα άλλων ιστών. Δεδομένου ότι μαστού και τον καρκίνο του προστάτη έχουν αξιοσημείωτες ομοιότητες των βασικών βιολογικών και λόγω του σημαντικού ρόλου των βασικών κυττάρων του καρκίνου του προστάτη, εξετάσαμε τις μορφές έκφρασης και του ρόλου των gal-7 σε ανθρώπινο καρκίνο του προστάτη. Χρησιμοποιώντας μικροσυστοιχίας ιστών, βρήκαμε ότι παρόλο gal-7 εύκολα εκφράζεται σε βασικά κύτταρα σε φυσιολογικό ιστό του προστάτη, είναι μειωτικά σε κύτταρα καρκίνου του προστάτη (PCA).

De ηονο

έκφραση του gal-7 στα κύτταρα του καρκίνου του προστάτη αυξάνει την ευαισθησία τους στην απόπτωση σε απόκριση προς ετοποσίδη και σισπλατίνη. Η αξιολόγηση ενός τομέα υδατάνθρακα-αναγνώρισης (CRD) -defective μεταλλαγμένη μορφή του gal-7 (R7S) έδειξε ότι η ικανότητα αυτής της πρωτεΐνης να διαμορφώνει απόπτωση ήταν ανεξάρτητη από CRD δραστηριότητάς της. Αυτή η δραστηριότητα ήταν επίσης ανεξάρτητη από την ικανότητά του να μετατοπίζονται προς τα μιτοχονδριακά και πυρηνικά διαμερίσματα. Ωστόσο, η δραστηριότητα ΟΚΑ ήταν αναγκαία για την αναστολή των επεμβατική συμπεριφορές των κυττάρων καρκίνου του προστάτη.

In vivo

, gal-7 υπερέκφραση σε κύτταρα προστάτη οδήγησε σε μέτρια αλλά σημαντική μείωση του μεγέθους του όγκου, ενώ CRD-ελαττωματικός μεταλλαγμένη μορφή σημαντικά αυξημένη ανάπτυξη του όγκου του σε σύγκριση με τους μάρτυρες. Λαμβανόμενα μαζί, αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι αν και

de novo

έκφραση του gal-7 μπορεί να είναι ένα ενδιαφέρον μέσο για την αύξηση των ογκογόνων φαινοτύπους των κυττάρων προστάτη, οι μεταβολές στη δραστηριότητα CRD αυτής της πρωτεΐνης οδηγεί ένα φαινοτυπική αλλαγή στο ρόλο της στα κύτταρα του προστάτη. Αυτή η δραστηριότητα CRD-ανεξάρτητο αντιπροσωπεύει μια παραδειγματική στροφή στην κατανόηση των λειτουργιών της γκαλεκτίνη. Το μοντέλο R74S θα ήταν χρήσιμο να γίνει διάκριση CRD-εξαρτώμενη και CRD-ανεξάρτητες λειτουργίες του gal-7 στην εξέλιξη του καρκίνου

Παράθεση:. Labrie Μ, Vlădoiu Μ, Leclerc BG, Grosset ΑΑ, Gaboury L, Stagg J, et al. (2015) Μια μετάλλαξη στο υδατανθράκων Αναγνώριση τομέα οδηγεί ένα φαινοτυπική Switch στο ρόλο του γκαλεκτίνη-7 στον καρκίνο του προστάτη. PLoS ONE 10 (7): e0131307. doi: 10.1371 /journal.pone.0131307

Επιμέλεια: Zoran Culig, Innsbruck Medical University, ΑΥΣΤΡΙΑ

Ελήφθη: 9, Ιανουαρίου 2015? Δεκτές: 1 του Ιούνη του 2015? Δημοσιεύθηκε: 13 Ιουλίου 2015

Copyright: © 2015 Labrie et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Δεδομένα Διαθεσιμότητα: Όλα τα σχετικά δεδομένα είναι εντός του Υποστηρίζοντας αρχεία πληροφοριών του χαρτιού και

Χρηματοδότηση:. η μελέτη αυτή χρηματοδοτήθηκε από τις καναδικές Ινστιτούτα Ερευνών Υγείας (Grant Νο MOP-89697) για να YSP (http: //www.cihr-irsc. gc.ca/). Ο χρηματοδότης δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:. Παρακαλώ σημειώστε ότι Yves St-Pierre είναι ένα PLoS ONE Συντακτική μέλος του Διοικητικού Συμβουλίου. Αυτό δεν αλλάζει την τήρηση των συγγραφέων σε όλες τις PLoS ONE πολιτικές για την ανταλλαγή δεδομένων και υλικών.

Εισαγωγή

γκαλεκτίνη-7 (gal-7) είναι ένα γονίδιο p53 που προκαλείται από τα οποία είναι κατά κύριο λόγο που εκφράζεται σε στρωματοποιημένο επιθηλιακά κύτταρα [1, 2]. Η έκφρασή του μπορεί επίσης να προκληθεί και από άλλους παράγοντες μεταγραφής, συμπεριλαμβανομένων των μεταλλαγμένων μορφών της ρ53 και CCAAT /ενισχυτή πρωτεΐνη δέσμευσης βήτα (C /ΕΒΡβ) [3, 4]. Η έκφρασή του ρυθμίζεται επίσης από επιγενετικές μηχανισμούς, συμπεριλαμβανομένων μεθυλίωσης του DNA [5, 6]. Ο ρόλος της στη UVB επαγόμενη απόπτωση κερατινοκυττάρων [7], και την εκ νέου επιθηλίωση των τραυμάτων του κερατοειδούς [8] υποστηρίζουν την ιδέα ότι gal-7 είναι σημαντική για τη διατήρηση της ομοιόστασης σε επιθηλιακά κύτταρα. Unsuprisingly, ένας αριθμός από μελέτες έχουν δείξει ότι απορύθμιση των gal-7 έκφραση έχει μια ισχυρή επίδραση στην εξέλιξη της πολλαπλών τύπων καρκίνων επιθηλιακής προέλευσης. Σε μαστικούς ιστούς, για παράδειγμα, gal-7 είναι ειδικά εκφράζεται σε μυοεπιθηλιακά κύτταρα (βασική), και η υπερέκφραση του σε ιστούς καρκίνου του μαστού συσχετίζεται με αντοχή στην απόπτωση και την εξάπλωση της μετάστασης στα οστά και στους πνεύμονες [9]. Η υπερέκφραση του gal-7 συνδέεται επίσης με κακή επιβίωση σε ασθενείς με επιθηλιακό καρκίνο των ωοθηκών [6, 10] και με κακοήθεια σε ασθενείς με πλακώδες καρκίνωμα της γλώσσας [11]. Αυτές οι συσχετίσεις μεταξύ αφύσικα υψηλά επίπεδα gal-7 και κακή πρόγνωση είναι επίσης παρούσα σε οισοφαγική και υποφάρυγγα καρκινώματα πλακωδών κυττάρων [12, 13]. Ωστόσο, καθώς ένας αριθμός μελετών έχουν δείξει, gal-7, παρόμοια με άλλες γαλεκτίνες, παίζει διπλό ρόλο στον καρκίνο και μπορεί να έχει ένα προστατευτικό ρόλο σε ορισμένες περιπτώσεις, κυρίως αυξάνοντας την ευαισθησία των καρκινικών κυττάρων σε προ-αποπτωτικά ερεθίσματα και με τη μείωση της κυτταρικής ανάπτυξης και της αγγειογένεσης. Οι δραστηριότητες αυτές έχουν σχετικά καλά τεκμηριωθεί σε γαστρικό, ουροθηλιακά, και καρκίνους του παχέος εντέρου, καθώς και στην τραχηλικού πλακώδους καρκινώματος [6, 14, 15]. Στην πραγματικότητα, οι παρατηρήσεις που γενετικά τραχήλου της μήτρας, του στομάχου και του καρκίνου του παχέος εντέρου κύτταρα που υπερεκφράζουν gal-7 αποτυγχάνουν να επάγουν γαστρικών όγκων σε ξενομοσχευμένο ποντίκια υποδεικνύουν ότι επιγενετικές ναρκωτικά ή gal-7-ειδική γονιδιακή θεραπεία θα μπορούσε να χρησιμοποιηθεί για να καταστείλει την ανάπτυξη συγκεκριμένων τύπων καρκίνος [6, 14, 15]. Με δεδομένη την αυξανόμενη δημοτικότητα των επιγενετικών θεραπείες για τον καρκίνο, είναι επομένως επιτακτική ανάγκη να προσδιοριστεί αν gal-7 έχει μια λειτουργία προ- ή αντι-όγκου σε οποιονδήποτε τύπο καρκίνου, κυρίως εκείνες της επιθηλιακής προέλευσης.

Η διάφορους ρόλους του gal-7 σε καρκίνους επιθηλιακής προέλευσης είναι επί του παρόντος ασαφής και μπορεί να σχετίζεται με μια ποικιλία παραγόντων. Κάποιος πρέπει πρώτα να εξετάσει τη σημασία της υποκυτταρικών διαμερισματοποίηση των gal-7, η οποία έχει βρεθεί στο κυτοσολικό, μιτοχονδριακό και πυρηνικό διαμερίσματα [15-17]. Gal-3, για παράδειγμα, είναι σε θέση να επάγει αντίσταση στην απόπτωση, και αυτή η δραστηριότητα εξαρτάται από την μετατόπιση του από το κυτοσόλιο στο μιτοχόνδρια [18]. Είτε τέτοιων ενδοκυτταρικών διαμερισματοποίηση είναι επίσης σημαντική για gal-7 για τη ρύθμιση της απόπτωσης είναι άγνωστη. Εναλλακτικά, ο διπλός ρόλος του gal-7 μπορεί να εξαρτάται από τους εταίρους δέσμευσης της, διότι είναι καλά γνωστό ότι δεσμεύει γλυκοσυλιωμένες πρωτεΐνες μέσω της περιοχής υδατάνθρακα αναγνώριση της (CRD). Υπάρχουν αυξανόμενες ενδείξεις, ωστόσο, ότι γαλεκτίνες αλληλεπιδρούν επίσης με μη γλυκοζυλιωμένες πρωτεΐνες σε μία CRD-ανεξάρτητο τρόπο [19]. Αυτή η παρατήρηση έχει τεκμηριωθεί καλά για ενδοκυτταρική γαλεκτίνες. Το πιο σημαντικό χαρακτηριστικό της ενδοκυτταρικής γαλεκτίνες μπορεί να είναι η ικανότητά τους να δεσμεύονται άμεσα Bcl-2 μελών της οικογένειας μέσω μιας αλληλεπίδρασης CRD-ανεξάρτητη. Αυτή η δραστηριότητα έχει αποδειχθεί για πολλές γαλεκτίνες, συμπεριλαμβανομένων gal-7 [16]. Η αλληλεπίδραση γκαλεκτίνη /Bcl-2 μετατοπίζει την ισορροπία της δραστηριότητας μεταξύ προ- και αντι-αποπτωτικά μέλη της οικογένειας Bcl-2 για να ρυθμίζουν την απόπτωση [16, 20, 21]. Άλλες CRD-ανεξάρτητες λειτουργίες του γαλεκτίνες περιλαμβάνουν την επεξεργασία του RNA στον πυρήνα [22] και της ρύθμισης του κυτταρικού κύκλου εξέλιξης [23]. Όλα αυτά τα CRD-ανεξάρτητες λειτουργίες βασίζονται σε αλληλεπιδράσεις πρωτεΐνης-πρωτεΐνης. Στην πραγματικότητα, ορισμένα γαλεκτίνες, όπως gal-10, λιμάνι αξιοσημείωτα χαμηλές συγγένειες για γαλακτοσίδια και πιστεύεται ότι δρουν κυρίως μέσω άλλων παραγόντων [24]. Αυτά τα CRD-ανεξάρτητες λειτουργίες αντιπροσωπεύουν μια παραδειγματική στροφή στην κατανόηση της λειτουργίας γκαλεκτίνη και στην ανάπτυξη των αναστολέων γκαλεκτίνη ειδικών.

Η παρατήρηση που gal-7 είναι ειδικά εκφράζεται σε επιθηλιακά κύτταρα, ιδιαίτερα του μαζικού μυοεπιθηλιακά (βασική ) κυττάρων (αλλά όχι σε αυλού κύτταρα), μας ώθησε να διερευνήσει κατά πόσο αυτή εκφράζεται στα βασικά κύτταρα άλλων ιστών. Δεδομένου ότι μαστού και τον καρκίνο του προστάτη έχουν αξιοσημείωτες ομοιότητες των βασικών βιολογικών [25] και με δεδομένο το σημαντικό ρόλο των βασικών κυττάρων στον καρκίνο του προστάτη [26], μελετήσαμε την μορφή έκφρασης και του ρόλου των gal-7 σε ανθρώπινο καρκίνο του προστάτη.

Υλικά και Μέθοδοι

οι κυτταρικές σειρές και τα ζώα

PC3 [27] και DU-145 [28] κυτταρικές γραμμές ήταν μια γενναιόδωρη δωρεά από τον Dr. Benoit Ochietti (Πανεπιστήμιο McGill, Montreal, QC) , και τα κύτταρα LNCaP [29] ευγενικά από τον Dr. Thomas Sandersons (INRS-Institut Armand-Frappier, Laval, QC. Η HaCaT κυτταρική γραμμή [30] παρασχέθηκε από τον Δρ Thierry Magnaldo (Génétique et des Physiopathologie καρκίνοι Épidermiques, Faculté de Médecine, Nice, France). Όλες οι κυτταρικές σειρές που χρησιμοποιούνται σε αυτήν τη μελέτη είχαν αρχικά ελήφθησαν από την American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA, USA). Οι κυτταρικές γραμμές DU-145 και HaCaT διατηρήθηκαν σε μέσο Eagle τροποποιημένο κατά Dulbecco . Οι κυτταρικές γραμμές LNCaP PC3 και διατηρήθηκαν σε ένα F-12K θρεπτικό μείγμα και RPMI 1640, αντιστοίχως. Τα μέσα καλλιέργειας συμπληρώνονται με 10% (ν /ν] εμβρυϊκό βόειο ορό, 2 mmol /L Ε-γλουταμίνη, 10 mmol /L ρυθμιστικού διαλύματος HEPES, και 1 mmol /L πυρουβικό νάτριο. Όλα τα προϊόντα κυτταρικής καλλιέργειας αγοράσθηκαν από τη Life Technologies (Burlington , ON, Καναδάς). NOD /SCID ποντίκια ελήφθησαν από το Εργαστήριο Jackson. τα ζώα στεγάστηκαν κάτω από στείρες συνθήκες με

κατά βούληση

πρόσβαση σε τροφή και νερό. Όλες οι μελέτες σε ζώα εγκρίθηκαν από την Υγειονομική υπηρεσία και Χρήση Επιτροπή του Centre de Recherche du Centre νοσοκομειακό de l’Université de Montréal

η ανοσοϊστοχημεία

μικροσυστοιχίες ιστών χρησιμοποιήθηκαν για την ανάλυση 32 δειγμάτων ιστού αδενοκαρκινώματος του προστάτη, 20 υπερπλασία, 5 σφαιρικού εκτασίας και 3 του καρκίνου -adjacent φυσιολογικούς ιστούς προστάτη (US Biomax, Rockville, MD, USA και τη διάρκεια ζωής BioSciences, Seattle, WA, USA). Η ανοσοχρώση αντιδράσεις για gal-7 διεξήχθησαν χρησιμοποιώντας ένα Discovery XT αυτοματοποιημένο ανοσοκηλιδωτή (Ventana Medical Systems). αποπαραφινοποιήθηκαν τομές επωάστηκαν σε διάλυμα κύτταρο κλιματισμού, ρΗ 8.0 (Ventana Medical Systems), για ανάκτηση αντιγόνου και στη συνέχεια βάφτηκαν για 60 λεπτά με ένα αντι-ανθρώπινο gal-7 πολυκλωνικό αντίσωμα (R &? D Systems, Minneapolis, ΜΝ, USA) σε αραίωση 1: 150. Τα πλακίδια με αιματοξυλίνη. Τα τμήματα σαρώθηκαν σε υψηλή ανάλυση με τη χρήση ενός σαρωτή Nanozoomer Digital Pathology (Hamamatsu, Bridgewater, NJ).

ανοσοφθορισμού

Τα κύτταρα σταθεροποιήθηκαν σε 3% (w /v) παραφορμαλδεϋδη για 15 λεπτά , διαπερατά σε 0.1% (ν \\ ν) PBS /Triton Χ-100 για 5 λεπτά και μπλοκαρίστηκαν για όλη τη νύχτα σε 4 ° C σε 1% (w /v). PBS /BSA (ΔΔΕ). Μια κατσίκα αντι-ανθρώπινο gal-7 (αραίωση 1: 750) πρωτογενές αντίσωμα και κουνελιού αντι-κατσίκας Alexa Fluor 488 (αραιωμένο 1: 500) δεύτερο αντίσωμα χρησιμοποιήθηκαν (Life Technologies). Νηματοειδής ακτίνη βάφτηκε με Alexa Fluor 594 συζευγμένο με φαλλοειδίνη (1: 500 αραίωση? Life Technologies). Όλοι οι αντιοροί αραιώνονται σε 1% (w /v) ΡΒΑ, και όλα τα στάδια πλύσης εκτελέστηκαν με PBS. Οι πυρήνες βάφτηκαν με Αντιδραστήριο Gold παρατείνει αντιξεθωριάσματος με 4 ‘, 6-διαμιδινο-2-φαινυλινδόλη (ϋΑΡΙ) (Life Technologies). Τα κύτταρα οπτικοποιήθηκαν υπό μία Carl Zeiss LSM780 συνεστιακό μικροσκόπιο, και ψηφιοποιημένες εικόνες παρήχθησαν χρησιμοποιώντας λογισμικό Carl Zeiss ΖΕΝ (Zeiss, Jena, Germany).

απομόνωση RNA και RT-PCR

Ολικό κυτταρικό RNA απομονώθηκε από κύτταρα χρησιμοποιώντας αντιδραστήριο ΤΚΙζοΙ (Life Technologies) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Πρώτου κλώνου cDNA παρασκευάστηκε από 2 μg κυτταρικού RNA σε συνολικό όγκο αντίδρασης 20 μι χρησιμοποιώντας Omniscript αντίστροφης μεταγραφάσης (QIAGEN, Mississauga, ΟΝ, Canada). Μετά την αντίστροφη μεταγραφή, την ανθρώπινη

gal-7

(γονίδιο ID 3963, αίσθηση αστάρι: 5′-TCC CAA TGC CAG CAG Γ.Ο.Σ. CCA TGT-3 ‘και αντιπληροφοριακό εκκινητή: 5’-GAA GCC GTC GTC TGA CGC GAT GAT-3 ‘) και

GAPDH

(γονίδιο ID 2597, αίσθηση αστάρι: 5′-CGG AGT CAA CGG ΑΤΤ ΤΟΟ TCG ΤΑΤ-3′ και αντιπληροφοριακό εκκινητή: 5′-CAG ΑΑΟ ΤΟΟ ΤΟΟ TAC CTC TTC CGA -3 ‘) cDNA ενισχύθηκαν κάτω από τις ακόλουθες συνθήκες: 94 ° C για 3 λεπτά, ακολουθούμενη από 35 κύκλους στους 94 ° C για 40 sec, 60 ° C για 40 δευτερόλεπτα και 72 ° C για 40 δευτερόλεπτα και στη συνέχεια μια τελική επέκταση βήμα στους 72 ° C για 10 λεπτά. Η PCR πραγματοποιήθηκε σε ένα θερμικό κυκλοποιητή (MJ Research, Watertown, ΜΑ). Τα ενισχυμένα προϊόντα αναλύθηκαν επί 1% (w /v) γέλες αγαρόζης με ηλεκτροφόρηση που ακολουθείται από χρώση με γέλη SYBR Safe (ϋίβ Technologies).

Δημιουργία σταθερών μορφομετατροπέων που εκφράζουν gal-7

Για ληφθούν σταθερές DU-145 μορφομετατροπείς που εκφράζουν gal-7

κβ ή gal-7

R74S, cDNA που κωδικοποιούν την άγριου τύπου ή μεταλλαγμένο (R74S) ανθρώπινο gal-7 γονίδιο κλωνοποιήθηκαν στον ευκαρυωτικό φορέα έκφρασης δΚα (ευγενώς από τον Δρ François Denis) όπως περιγράφηκε προηγουμένως [17] τα κύτταρα ελέγχου δημιουργήθηκαν χρησιμοποιώντας μια κενή δΚα φορέα. Οι επιμολύνσεις πραγματοποιήθηκαν με Lipofectamine 2000 σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή (Life Technologies). Μετά από 48 ώρες καλλιέργειας, τα επιμολυσμένα κύτταρα αφέθηκαν να αναπτυχθούν σε πλήρες μέσο που περιείχε 2 μg /ml πουρομυκίνη. Μεμονωμένες αποικίες επεκτάθηκαν και η έκφρασή gal-7 παρακολουθήθηκε με ανάλυση στυπώματος Western. Τουλάχιστον δύο κλώνοι από κάθε τύπο χρησιμοποιήθηκε για να επιβεβαιωθούν τα αποτελέσματα.

Western ανάλυση κηλίδος

Για εκχυλίσματα ολόκληρων κυττάρων, τα κύτταρα ομογενοποιήθηκαν και επαναιωρήθηκαν σε δοκιμασία ραδιο-ανοσοκαταβύθιση (RIPA) ρυθμιστικό ( Thermo Fisher Scientific, Ottawa, ON, Καναδάς) που περιέχει ένα κοκτέιλ αναστολέων πρωτεάσης (Roche, Mississauga, ON, Καναδάς). Τα μιτοχόνδρια και οι πυρήνες απομονώθηκαν χρησιμοποιώντας ένα κιτ απομόνωσης μιτοχονδριακό (Θερμός Scientific) και το κιτ της πυρηνικής εκχύλισης (Sigma-Aldrich, Oakville, ΟΝ, Canada), αντίστοιχα, σύμφωνα με τις οδηγίες των κατασκευαστών. Ίσες ποσότητες ολικού-κυττάρου, κυτταροπλασματική, μιτοχονδριακό ή πυρηνικά εκχυλίσματα διαχωρίστηκαν με SDS-PAGE και μεταφέρθηκαν σε μεμβράνες νιτροκυτταρίνης (Bio-Rad Laboratories, Mississauga, ΟΝ, Canada). Οι μεμβράνες πρώτα αποκλείστηκαν με 5% (w /v) γάλα σε PBS /0.5% Tween 20 (ν /ν) για 60 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου και στη συνέχεια στυπώνονται επί μία νύκτα σε ένα διάλυμα που περιέχει 3% ΡΒΑ, 0,5% Tween 20 και ο ακόλουθα αντισώματα: κατσίκα αντι-ποντικού gal-7 πολυκλωνικό αντίσωμα (αραιωμένο 1: 1000? Ε & amp? D Systems), ένα αντι-πολυ (ΑΟΡ-ριβόζη) πολυμεράσης (PARP) -1 (p25) πολυκλωνικό αντίσωμα κουνελιού (1: 5000 ? Epitomics, Burlingame, CA, USA), ένα αντι-β-ακτίνης ποντικού (1: 20.000? Sigma-Aldrich), ένα κουνέλι αντι-ΟΟΧ IV (1: 1000? Cell Signaling Technology, Beverly, ΜΑ, USA), ένα κουνελιού αντι-τουμπουλίνης (1: 1000? Cell Signaling Technology) ή ένα αντι-λαμίνη ποντίκι A /C (1: 1000? Cell Signaling Technology) αντίσωμα. Δευτερογενή αντισώματα που περιλαμβάνονται αντι-κουνελιού συζευγμένο με υπεροξειδάση αρμορακίας γάιδαρο (GE Healthcare, Baie-d’urfe, QC, Καναδάς), γάιδαρος αντι-αίγας (R &? D Systems) ή αντι-ποντικού προβάτου (GE Healthcare) IgG. Διεξήχθη ανίχνευση με την ενισχυμένη μέθοδο χημειοφωταύγειας (GE Healthcare).

Ηλεκτρονική μικροσκοπία

Τα κύτταρα σταθεροποιήθηκαν σε 0,1% (ν /ν) γλουταραλδεΰδη και 4% (β /ο) διάλυμα παραφορμαλδεΰδης και ενσωματωμένα σε ρητίνη Spurr του. Εξαιρετικά λεπτές τομές τοποθετήθηκαν σε πλέγματα νικελίου και επωάστηκαν σε μεταϋπεριωδικό νάτριο. Τα δείγματα στη συνέχεια αποκλείστηκε σε 1% ΡΒΑ επί 5 λεπτά και επωάστηκαν για 60 λεπτά με ένα αντι-ανθρώπινο gal-7 πολυκλωνικό αντίσωμα κατσίκας (1: 150) που ακολουθείται από επώαση με ένα αντι-κατσίκας κονίκλου 10 nm δευτερογενές αντίσωμα συζευγμένα με χρυσό ( 1:20, Ηλεκτρονικής Μικροσκοπίας Επιστημών, Hatfield, PA, USA). Τα δείγματα επίχρωση με οξικό ουρανύλιο και κιτρικό μόλυβδο πριν την οπτικοποίηση κάτω από ένα Hitachi Η-7100 ηλεκτρονικό μικροσκόπιο.

[

3Η] -θυμιδίνης

Ο πολλαπλασιασμός των κυττάρων προσδιορίστηκε με μέτρηση η ενσωμάτωση της [

3Η] -θυμιδίνης. Τα κύτταρα σπάρθηκαν σε τριπλούν σε πυκνότητα 2 χ 10

3 κύτταρα /φρεάτιο σε μία πλάκα 96 φρεατίων και στη συνέχεια επωάστηκαν με ή χωρίς 5 μΜ cisplatin για 96 ώρες. Μετά από 80 ώρες επώασης, 1 μCi [

3Η] -θυμιδίνης προστέθηκαν σε κάθε φρεάτιο. Στο τέλος της περιόδου επώασης, τα κύτταρα συλλέχθηκαν με ένα ημιαυτόματο συλλέκτη κυττάρων (Skatron Instruments, Lier, Norway) και μεταφέρεται σε μία Printed Filtermat Α (Wallak, Turky, Φινλανδία). Η ενσωματωμένη ραδιενέργεια προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας ένα RackBeta (ΕΚΒ, Turky, Φινλανδία) μετρητή σπινθηρισμού.

δοκιμασία Invasion

Serum επαγόμενη κυτταρική εισβολή εξετάστηκε χρησιμοποιώντας ένα 24 φρεατίων θάλαμος Matrigel εισβολής (BD Biosciences, Mississauga, ON, Καναδάς) με μια μεμβράνη μm-πόρων 8. Ένα σύνολο 5 χ 10

4 κύτταρα επωάστηκαν εντός του άνω θαλάμου σε μέσο χωρίς ορό. Το κάτω θάλαμος περιείχε μέσο συμπληρωμένο με 10% εμβρυϊκό βόειο ορό. Μετά από 24 ώρες επώασης, η άνω επιφάνεια του ένθετου σκουπίστηκε απαλά με μια μπατονέτα για να απομακρυνθούν τα μη μεταναστεύοντα κύτταρα. Τα κύτταρα που είχαν μεταναστεύσει στην κάτω επιφάνεια της μεμβράνης βάφτηκαν με μπλε τολουϊδίνης και μετρήθηκαν χωριστά με μικροσκοπία. Ελήφθησαν

επούλωσης πληγών ξυστό

δοκιμασία

Συρρέουσες μονοστιβάδες με σπορά 1 χ 10

5 κύτταρα σε ένα δίσκο 24-φρεατίων την ημέρα πριν από το πείραμα. Μια γρατσουνιά έγινε με το ρύγχος μιας πιπέτας στο κύτταρο μονοστιβάδα, που ακολουθείται από έκπλυση με PBS για την απομάκρυνση των κυτταρικών υπολειμμάτων. Αμέσως μετά και 24 ώρες μετά το στάδιο πλύσης PBS, τα μικροσκοπικά πεδία φωτογραφήθηκαν, και το πλάτος μηδέν μετρήθηκε χρησιμοποιώντας λογισμικό Image J. Για την απεικόνιση ζωντανών κυττάρων, μια μέρα πριν από το πείραμα, 4 x 10

5 κύτταρα σπάρθηκαν πάνω σε ένα γυάλινο πυθμένα πλάκα καλλιέργειας 6 φρεατίων (MatTek Corporation, Ashland, ΜΑ, USA). Μετά από το μηδέν έγινε, η πλάκα μεταφέρθηκε σε θερμοκοιτίδα PM S1, και η μετανάστευση έγινε ορατή κάτω από την Carl Zeiss LSM780 ομοεστιακό μικροσκόπιο (Carl Zeiss, Toronto, ON, Καναδάς). Εικόνες συλλήφθηκαν κάθε 10 λεπτά για 2 ώρες. Για κάθε τύπο κυττάρου, μετρήθηκαν οι κινήσεις των 30 χωριστών κυττάρων. μετακίνηση των κυττάρων αναλύθηκε χρησιμοποιώντας τις ακόλουθες Image J plugins:. εγχειρίδιο παρακολούθησης και εργαλείο χημειοταξία

Ο πολλαπλασιασμός των κυττάρων δοκιμασία

Ως μάρτυρας για τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων κατά τη διάρκεια της δοκιμής προσδιορισμού εισβολή και το μηδέν επούλωση των πληγών, ένα σύνολο 2,5 χ 10

4 κύτταρα σπάρθηκαν σε ένα 12-φρεατίων (Fisher Scientific). Στους χρόνους που υποδεικνύονται, τα κύτταρα πλύθηκαν με PBS, σε επεξεργασία με θρυψίνη, χρωματίστηκαν με trypan blue και απαριθμήθηκαν χρησιμοποιώντας αιμοκυτόμετρο.

παραγωγή ανασυνδυασμένων πρωτεϊνών

Gal-7 cDNA κλωνοποιήθηκε σε pET-22b (+) χρησιμοποιώντας τα ένζυμα περιορισμού Ndel και Hindlll. Η πρωτεΐνη που παράγεται στο

E

.

coli

BL21 (DE3) στους 37 ° C. Ισοπροπυλο β-D-1-θειογαλακτοπυρανοσίδη (

IPTG

) (1 mM) προστέθηκε στο βακτηριακή καλλιέργεια σε μια OD

600nm του 0,6-0,7, και τα βακτήρια επωάστηκαν περαιτέρω για 4 ώρες. Τα βακτηριακά ιζήματα επαναιωρήθηκαν σε ρυθμιστικό διάλυμα λύσης (0.7 mg /ml λυσοζύμη, 10 mM Tris, ρΗ 8, 100 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM DTT και αναστολέα πρωτεάσης κοκτέιλ), επωάστηκαν για 1 ώρα στους 37 ° C και φυγοκεντρήθηκε για 30 min στα 15.000 rpm (4 ° C). Το υπερκείμενο στη συνέχεια διηθήθηκε και εφαρμόστηκε σε μία στήλη λακτόζη-αγαρόζη, και η πρωτεΐνη εκλούστηκε σε 1-ml κλασμάτων με ένα διάλυμα 150 mM-λακτόζη. Καθαρισμένα κλάσματα αναλύθηκαν με SDS-PAGE. Gal-7 υποβλήθηκε σε διαπίδυση έναντι 20 mM φωσφορικού καλίου σε ρΗ 7,2 για όλα τα επόμενα πειράματα.

γλυκάνης σειρά

Ένα γλυκάνης σειρά θηλαστικού (V5.2) πραγματοποιήθηκε από την Κοινοπραξία για Λειτουργική Glycomics ( CFG). Εν συντομία, ανασυνδυασμένη gal-7

κβ και gal-7

πρωτεϊνών R74S ήταν συζευγμένο με FITC και εξετάστηκαν κατά την έκδοση 5.2 του τυπωμένου πίνακα. Αυτή η σειρά αποτελείται από 609 γλυκάνες σε επαναλήψεις 6. Οι κατάλογοι των γλυκανών και συνδετήρες τους που χρησιμοποιούνται στις διάφορες εκδόσεις της σειράς μπορούν να βρεθούν στο https://www.functionalglycomics.org/static/consortium/resources/resourcecoreh.shtml . FITC-συζευγμένο gal-7 επωάστηκε με τα σάκχαρα, και μετρήθηκαν σχετικές μονάδες φθορισμού (RFUs). Για να εξαλείψει ορισμένες από τις εσφαλμένες συμπτώσεις που περιείχε ένα μόνο πολύ υψηλό ή χαμηλό σημείο, αφαιρέθηκαν τα υψηλότερα και τα χαμηλότερα σημεία από κάθε σύνολο έξι επαναλήψεις. Κατά συνέπεια, οι μέσοι όροι περιλαμβάνουν 4 τιμές αντί 6.

Δοκιμασία σύνδεσης

Εν συντομία, ένα ισοθειοκυανική φλουορεσκεΐνη (FITC) /διάλυμα DMSO προστέθηκε σε ανασυνδυασμένη gal-7 σε ένα 0,1-M NaHCO

3 (9,2 ρΗ) διάλυμα και κατόπιν επωάστηκαν για 2 ώρες σε θερμοκρασία δωματίου σε ένα κύλινδρο. FITC-συζευγμένο gal-7 στη συνέχεια καθαρίστηκε χρησιμοποιώντας μία στήλη PD-10 Sepharose (GE Healthcare) και εκλούεται με PBS που περιέχει 0,01% (ν /ν] αζίδιο του νατρίου. Για να μετρηθεί FITC-gal-7 πρόσδεσης στην κυτταρική επιφάνεια, 2,5 χ 10

5 κύτταρα επωάστηκαν για 30 λεπτά με τις υποδεικνυόμενες συγκεντρώσεις gal-7 και στη συνέχεια πλύθηκε δύο φορές με PBS και επαναιωρήθηκαν σε 500 μΐ PBS. για τις δοκιμασίες ανταγωνισμού, 0.1 Μ β-λακτόζη προστέθηκαν σε κύτταρα, τα οποία στη συνέχεια επωάστηκαν με FITC-συζευγμένο gal-7. τα δείγματα αναλύθηκαν με FACSCalibur (BD Biosciences) και ρέει λογισμικού.

In vivo πειράματα

Ένα μείγμα από 3 ανεξάρτητους κλώνους (2 χ 10

6 κύτταρα) για κάθε μορφομετατροπέα εγχύθηκε υποδορίως σε 6-εβδομάδων NOD ποντίκια /SCID. οι μετρήσεις του όγκου ελήφθησαν δύο φορές την εβδομάδα. Την ημέρα 61, οι ποντικοί θυσιάστηκαν, και οι πρωτογενείς όγκοι συλλέχθηκαν και snap -frozen σε υγρό άζωτο.

Η στατιστική ανάλυση

Η στατιστική σημαντικότητα των πειραμάτων αξιολογήθηκε χρησιμοποιώντας t-τεστ αταίριαστο του Student. τα αποτελέσματα θεωρήθηκαν στατιστικά σημαντικές σε P ≤ 0,05.

Αποτελέσματα

Gal-7 έκφραση σε ανθρώπινους ιστούς προστάτη και κυτταρικές σειρές καρκίνου του

Gal-7 έκφραση σε ανθρώπινους ιστούς του προστάτη δεν έχει προηγουμένως αναφερθεί. Χρησιμοποιώντας ανοσοϊστοχημεία (IHC), ερευνήσαμε πρώτα την μορφή έκφρασης του gal-7 σε φυσιολογικούς ιστούς του προστάτη. Τα αποτελέσματα μας αποκάλυψαν ισχυρή πυρηνική και κυτταροπλασματική έκφραση στα βασικών κυττάρων στρώματα κανονικούς αδένες προστάτη, χωρίς χρώση παρατηρήθηκε στα αυλού επιθηλιακά κύτταρα (Σχήμα 1Α). Στη συνέχεια ερευνήσαμε την παρουσία του gal-7 σε διάφορους τύπους κακοηθειών προστάτη (συμπεριλαμβανομένων 32 αδενοκαρκινώματα του προστάτη) χρησιμοποιώντας μικροσυστοιχίες εμπορική ιστών και βρέθηκε αμελητέα έκφραση πρωτεΐνης gal-7 στους ιστούς του όγκου (Σχήμα 1 Β και 1 C). Η χαμηλή έκφραση σε ιστούς προστάτη ήταν σύμφωνη με τα πρότυπα έκφρασης που βρέθηκαν κατά την διάρκεια των ερευνών μας gal-7 έκφραση σε mRNA και τα επίπεδα πρωτεΐνης στα πιο κοινός καρκίνος του προστάτη μοντέλα κυτταρικής γραμμής. πειράματα ανοσοστύπωσης έδειξαν ότι καμία από αυτές τις κυτταρικές σειρές που εκφράζονται εύκολα ανιχνεύσιμα επίπεδα gal-7? Ωστόσο, το mRNA εκφράστηκε σε χαμηλό αλλά ανιχνεύσιμο επίπεδο σε κύτταρα PC3 (Εικόνα 1). Λαμβανόμενα μαζί, αυτά τα αποτελέσματα έδειξαν ότι αν και gal-7 εύκολα εκφράζεται σε βασικά κύτταρα εντός φυσιολογικού ιστού προστάτη, είναι εντελώς απούσα σε κύτταρα καρκίνου του προστάτη.

Ανοσοϊστοχημική (IHC) χρώση του gal-7 σε 3-μm τομές πάχους του μονιμοποιηθεί με φορμαλίνη εμπεδωθεί με παραφίνη (Α) υγιείς ιστούς του προστάτη και (Β) σε ιστούς που συνδέεται με παθολογικές διαταραχές του προστάτη. (C) Ημι-ποσοτική RT-PCR και (δ) ανάλυση western blot του gal-7 έκφραση σε DU-145, PC3 και καρκινικές κυτταρικές σειρές ανθρώπινου προστάτη LNCaP. Η κερατινοκυττάρων HaCaT κυτταρική γραμμή χρησιμοποιήθηκε ως θετικός έλεγχος. GAPDH και β-τουμπουλίνης χρησιμοποιήθηκαν ως έλεγχοι φόρτωσης. LC: αυλού κυττάρων, BC: βασικά κύτταρα, και ECM:. Εξωκυττάρια μήτρα

Η

Παραγωγή και χαρακτηρισμός του άγριου τύπου και CRD-ελαττωματικό gal-7 πρωτεΐνη

Για να διερευνήσουν τις λειτουργίες του gal-7 σε καρκινικά κύτταρα του προστάτη και για να προσδιοριστεί η σημασία των ΟΚΑ του, δημιουργήσαμε μία σειρά από σταθερά επιμολυσμένα εκφράζουν άγριου τύπου gal-7 και μια μεταλλαγμένη μορφή (R74S) της πρωτεΐνης (Σχήμα 2Α). Αυτή η μετάλλαξη είναι γνωστό ότι αναστέλλει την ικανότητα του gal-7 να δεσμεύεται λακτόζη και να μειώσει τη μετατόπιση του από το κυτοσόλιο στο μιτοχόνδρια ή /και τον πυρήνα [17]. προηγούμενη ανάλυση NMR φασματοσκοπία χρησιμοποιώντας τη λύση μας έδειξε ότι η μετάλλαξη R74S που προκαλείται μόνο περιορισμένες και τοπικές αλλαγές στην gal-7 αναδίπλωση. Για να προσδιοριστεί περαιτέρω το βαθμό στον οποίο η CRD του gal-7 διαταράσσεται από τη μετάλλαξη R74S, συγκρίναμε δεσμευτικές ιδιότητες με εκείνες του άγριου τύπου gal-7 χρησιμοποιώντας ένα γλυκάνης σειρά CFG (έκδοση 5.2) [31]. Ολόκληρη η λίστα των γλυκανών δοκιμάζονται και τα αποτελέσματα των δοκιμασιών δέσμευσης μπορεί να βρεθεί στο διαδίκτυο (https://functionalglycomics.org/). Τα αποτελέσματά μας επιβεβαίωσαν ότι η μετάλλαξη R74S καταστέλλεται δραστηριότητα CRD ανεξάρτητη από τις γλυκάνης μοτίβα αξιολογείται (Σχήμα 2Β, S1 πίνακα). Αυτή η καταστολή της δραστηριότητας CRD επιβεβαιώθηκε με ανάλυση κυτταρομετρίας ροής της πρόσδεσης του FITC-επισημασμένο ανασυνδυασμένο gal-7

WT και gal-7

R74S στις επιφάνειες του DU-145 κύτταρα καρκίνου του προστάτη (Σχήμα 2C και 2D) . Στο σύνολό τους, τα αποτελέσματα αυτά δείχνουν ότι η R74S καταργεί τη δραστηριότητα CRD της ανθρώπινης gal-7.

(Α) 3D άποψη του gal-7

κβ και gal-7

R74S ΕΑΠ με ​​την παρουσία λακτόζης. (Β) Ένα γλυκάνης συστοιχία χρησιμοποιείται για την επαλήθευση της σύνδεσης του gal-7

WT και gal-7

R74S σε μία μεγάλη ποικιλία σακχάρων. Το γράφημα απεικονίζει τη δέσμευση της gal-7

κβ και gal-7

R74S με τα σάκχαρα. Μόνο RFUs μεγαλύτερο από 10.000 παρουσιάζονται. Τα ονόματα της ζάχαρης που αναφέρονται στον πίνακα S1. Οι μπάρες σφάλματος αντιπροσωπεύουν SDS (n = 6). Η ανάλυση κυτταρομετρίας ροής που δείχνει τη σύνδεση του gal-7

WT και gal-7

R74S στις επιφάνειες των DU-145 κύτταρα (C), απουσία ή (D) παρουσία 0,1 Μ β-λακτόζη. Οι δοκιμασίες πρόσδεσης διεξήχθησαν χρησιμοποιώντας τις υποδεικνυόμενες συγκεντρώσεις FITC-επισημασμένο ανασυνδυασμένο gal-7. MFI: μέση ένταση φθορισμού. Τα αποτελέσματα αντιπροσωπεύουν τρία ανεξάρτητα πειράματα.

Η

Χαρακτηρισμός της ενδοκυτταρικής εντόπισης του άγριου τύπου gal-7 και gal-7

R74S

Για να διερευνήσουν το ρόλο του gal-7 και CRD της στον καρκίνο του προστάτη, DU-145 επιμολύνσεις που εκφράζουν είτε gal-7

κβ ή gal-7

R74S παρήχθησαν. μορφομετατροπείς ελέγχου (που δημιουργούνται χρησιμοποιώντας κενούς φορείς έκφρασης) δεν εκφράζουν ανιχνεύσιμα επίπεδα του gal-7 (Σχήμα 3Α και 3Β). Ανοσοκηλίδωση των μιτοχονδρίων και πυρηνικό εμπλουτισμένα κλάσματα έδειξε ανιχνεύσιμη έκφραση του gal-7

wt στο κυτοσόλιο, μιτοχόνδρια και οι πυρήνες των DU-145 κύτταρα (Σχ 3C και 3D). Αντίθετα, δεν υπήρξε καμία ανιχνεύσιμη έκφραση του gal-7 στα μιτοχόνδρια των μορφομετατροπέων που εκφράζουν gal-7

R74S. Αμφότερες οι πρωτεΐνες βρέθηκαν στο εξωκυτταρικό μέσων των κυττάρων (Εικ 3Ε). Electron ανάλυση μικροσκοπίας των κυττάρων DU-145 επιβεβαίωσε την έκφραση του gal-7

κ.β. στο κυτταρόπλασμα, τον πυρήνα, και μιτοχονδριακή εξωτερικής μεμβράνης, ενώ η έκφραση του gal-7

R74S περιορίστηκε στο κυτοσόλιο (S1 Εικ ). Είναι ενδιαφέρον ότι, ηλεκτρονίων μικροσκοπική ανάλυση αποκάλυψε την παρουσία gal-7

wt- και gal-7

R74S πλούσια προεξοχές στην κυτταροπλασματική μεμβράνη (S1 Σχήμα) σύμφωνο με προηγούμενες αναφορές, υποδεικνύοντας ότι gal-7 συνδέεται με την ακτίνη κυτταροσκελετού να ρυθμίζει την κυτταρική κινητικότητα [10, 32, 33].

(Α) ανάλυση κηλίδας Western που δείχνει την έκφραση του gal-7 σε διάφορες σταθερές DU-145 κλώνοι επιμολυσμένα με φορείς έκφρασης που κωδικοποιούν άγριου τύπου και μεταλλαγμένων gal -7. Οι έλεγχοι περιελάμβαναν κύτταρα επιμολυσμένα με άδειο φορείς δΚα. β-ακτίνη χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης. (Β) Ομοεστιακή απεικόνισης δείχνει την ενδοκυτταρική διανομή του gal-7 σε DU-145 μορφομετατροπείς. (C-D) ανάλυση κηλίδας Western που δείχνει gal-7 έκφραση σε κυτοσολικά, πυρηνικών και μιτοχονδριακή κλάσματα που παρασκευάζονται από DU-145 κύτταρα. β-τουμπουλίνης, αναστολείς COX IV και λαμίνη A /C χρησιμοποιήθηκαν ως κυτοσολικές, μιτοχονδριακό και πυρηνικό δείκτες, αντίστοιχα. (Ε) ανάλυση κηλίδας Western που δείχνει την έκκριση του gal-7 στην εξωκυτταρική μέσα ενημέρωσης του DU-145 κύτταρα που εκφράζουν gal-7

κβ ή gal-7

R74S. β-τουμπουλίνης έκφραση παρακολουθήθηκε να αποκλειστεί η πιθανότητα της κυτταρικής λύσης. Η ενδοκυτταρική εκχυλισμάτων πρωτεΐνης από τον έλεγχο DU-145 κύτταρα και τα υπερκείμενα των κυττάρων HaCaT χρησιμοποιήθηκαν ως θετικοί μάρτυρες για έκφραση β-τουμπουλίνης και έκκριση gal-7, αντίστοιχα. Όλα τα αποτελέσματα αντιπροσωπεύουν τρία ανεξάρτητα πειράματα, συμπεριλαμβανομένων τουλάχιστον δύο ανεξάρτητες DU-145 κλώνους.

Η

Gal-7 προάγει την απόπτωση στα καρκινικά κύτταρα του προστάτη

Αρκετές μελέτες έχουν αναφέρει ότι η έκτοπη έκφραση της gal-7 καθιστά τραχήλου, του στομάχου και του καρκίνου του παχέος εντέρου κύτταρα πιο ευαίσθητα σε απόπτωση που διεγείρεται από προ-αποπτωτικών φαρμάκων [15]. Για να προσδιοριστεί αν αυτή η διαπίστωση αυτή ισχύει επίσης σε καρκινικά κύτταρα του προστάτη, DU-145 μορφομετατροπείς υποβλήθηκαν σε θεραπεία με αυξανόμενες δόσεις προ-αποπτωτικών φαρμάκων και αναλύθηκαν για διάσπαση του ΡΑΚΡ-1, το οποίο είναι ένα συνήθως χρησιμοποιούμενο δείκτη της απόπτωσης [34]. Τα αποτελέσματά μας έδειξαν ότι η έκτοπη έκφραση του gal-7 αύξησε την διάσπαση του ΡΑΚΡ-1 που προκαλείται από ετοποσίδη σε σύγκριση με τα κύτταρα ελέγχου (Εικόνα 4Α). Παρόμοια αποτελέσματα ελήφθησαν όταν ο κατακερματισμός των πυρήνων σε αποπτωτικά κύτταρα οπτικοποιήθηκε με ϋΑΡΙ βαφή (Σχήμα 4Β). Η ικανότητα των gal-7 για να αυξηθεί η ευαισθησία των DU-145 κύτταρα σε απόπτωση παρατηρήθηκε επίσης με χρήση σισπλατίνης ως προ-αποπτωτικών φάρμακο (Σχήμα 4C). Είναι ενδιαφέρον, gal-7

R74S ήταν τόσο αποτελεσματική όσο gal-7

κβ σε αύξηση της ευαισθησίας των DU-145 τόσο προ-αποπτωτικών φαρμάκων. Σε αμφότερες τις περιπτώσεις, η ενδοκυτταρική εντόπιση του gal-7 παρέμεινε αμετάβλητο κατά τη διάρκεια της διέγερσης απόπτωσης (S2 Εικ). Χρησιμοποιώντας ένα (

3Η] -θυμιδίνης δοκιμασία, μετρήσαμε επίσης τον πολλαπλασιασμό των μορφομετατροπέων σε απουσία ή παρουσία της σισπλατίνης. Βρήκαμε ότι τόσο gal-7

wt- και gal-7

R74S εκφράζουν DU-145 κύτταρα πολλαπλασιάστηκαν με τους ίδιους ρυθμούς σε σύγκριση με τα κύτταρα ελέγχου υπό κανονικές συνθήκες αλλά πολλαπλασιάστηκαν βραδύτερα σε παρουσία του cisplatin (Σχήμα 4D), που είναι συνεπής με την ικανότητα του gal-7 για την προώθηση του φαρμάκου που προκαλείται από απόπτωση. Λαμβανόμενα μαζί, αυτά τα τα αποτελέσματα δείχνουν ότι gal-7 ευαισθητοποιεί DU-145 κύτταρα για να προ-αποπτωτικών παραγόντων ανεξάρτητη από CRD δραστηριότητας και ενδοκυτταρική διαμερισματοποίηση της.

(Α) τα κύτταρα επωάστηκαν για 16 ώρες με τις υποδεικνυόμενες συγκεντρώσεις ετοποσίδης και ελέγχονται για απόπτωση με μέτρηση της PARP-1 διάσπασης με κηλίδα western. (Β) η απόπτωση επιβεβαιώθηκε με μέτρηση του αριθμού των κυττάρων με ένα κατακερματισμένο πυρήνα οπτικοποιούνται με χρώση DAPI. (C) Ανάλυση της PARP-1 διάσπασης σε κύτταρα DU-145 σε αγωγή για 16 ώρες με την υποδεικνυόμενη συγκέντρωση σισπλατίνης. (D) Cell πολλαπλασιασμό των DU-145 κύτταρα κατεργασμένα με ή χωρίς 5 μΜ cisplatin μετράται από (

3Η] -θυμιδίνης. Όλα τα αποτελέσματα αντιπροσωπεύουν τρία ανεξάρτητα πειράματα, συμπεριλαμβανομένων τουλάχιστον δύο ανεξάρτητων DU-145 κλώνων. * P ≤ 0.05, ** P ≤ 0,01 και *** P ≤ 0,001.

Η

Gal-7, αλλά δεν R74S μειώνει επεμβατική συμπεριφορές των DU-145 κύτταρα

επόμενο διερευνηθεί κατά πόσο gal-7 μπορούν να διαμορφώσουν τις επεμβατικές συμπεριφορές των DU-145 κύτταρα χρησιμοποιώντας ένα πρότυπο

in vitro

δοκιμασία εισβολής Matrigel. Βρήκαμε ότι η έκτοπη έκφραση του gal-7

WT μείωσε σημαντικά τις επεμβατικές συμπεριφορές των DU-145 κύτταρα σε σύγκριση με τα κύτταρα ελέγχου που στερούνται gal-7 (Σχήμα 5Α). Μια παρόμοια διαφορά δεν παρατηρήθηκε για DU-145 κύτταρα που εκφράζουν gal-7

R74S. Επειδή κυττάρων επεμβατική συμπεριφορές ενδέχεται να επηρεαστούν από την κυτταρική κινητικότητα, χρησιμοποιήσαμε την απεικόνιση ζωντανών κυττάρων να μετρήσει τις κινήσεις των κυττάρων κατά τη διάρκεια της επούλωσης τραυμάτων μηδέν δοκιμασία (Σχήμα 5Β). Τα αποτελέσματά μας έδειξαν ότι DU-145 κύτταρα που εκφράζουν gal-7

WT σημαντικά μειωμένη ταχύτητα κύτταρο σε σύγκριση με τα κύτταρα ελέγχου που στερούνται gal-7 ή κύτταρα που εκφράζουν gal-7

R74S (Σχήμα 5C). Αυτά gal-7

WT-κύτταρα που εκφράζουν, επίσης, είχαν χαμηλότερο συσσωρευτεί και Ευκλείδεια απόσταση της μετανάστευσης (Εικ 5D και 5Ε). Η κατευθυντικότητα των κυττάρων DU-145 δεν επηρεάστηκε από την έκφραση των gal-7

κβ ή gal-7

πρωτεϊνών R74S (Σχήμα 5F). Η χρήση ενός προτύπου επούλωσης πληγών γρατσουνιά δοκιμασία επιβεβαίωσε περαιτέρω ότι gal-7

κ.β. μείωσε την κυτταρική κινητικότητα των κυττάρων DU-145. Και πάλι, μια παρόμοια επίδραση δεν παρατηρήθηκε για το gal-7

R74S μεταλλαγμένα (S3 Εικ).