Αφηρημένο

Το κάπνισμα τσιγάρων είναι ένα τεκμηριωμένο παράγοντα κινδύνου για οισοφάγου καρκίνους. Ναι σχετιζόμενη πρωτεΐνη 1 (YAP1), ο βασικός παράγοντας μεταγραφής της οδού Hippo θηλαστικών, έχει αναφερθεί ότι είναι ένας ογκογόνος παράγοντας για πολλούς καρκίνους. Σε αυτή τη μελέτη, θα βρούμε τη χορήγηση νικοτίνης μπορεί να προκαλέσει πυρηνική μετατόπιση και ενεργοποίηση των YAP1 σε ESCC. Σταθερά, παρατηρήσαμε πυρηνική μετατόπιση και ενεργοποίηση των YAP1 με knockdown του CHRNA3, η οποία είναι ένας αρνητικός ρυθμιστής της σηματοδότησης νικοτίνης στο βρογχικό και του οισοφάγου καρκινικά κύτταρα. χορήγηση της νικοτίνης ή εξάντληση CHRNA3 αύξησε σημαντικά τον πολλαπλασιασμό και τη μετανάστευση σε καρκίνο του οισοφάγου κύτταρα. Είναι ενδιαφέρον, διαπιστώνουμε ότι YAP1 αλληλεπιδρά φυσικά με nAChRs, και nAChRs σηματοδότησης διασπάται YAP1 από την αρνητική ρυθμιστική συγκρότημα του που αποτελείται με α-κατενίνης, β-κατενίνης και 14-3-3 στο κυτταρόπλασμα, που οδηγεί σε ρύθμιση προς τα πάνω και την πυρηνική μετατόπιση της YAP1. Αυτή η διαδικασία πιθανότατα απαιτεί ενεργοποίηση της PKC, όπως PKC ειδικός αναστολέας Enzastaurin μπορεί να μπλοκάρει που προκαλείται από τη νικοτίνη ενεργοποίηση YAP1. Επιπλέον, βρίσκουμε σηματοδότηση νικοτίνη αναστέλλει επίσης την αλληλεπίδραση της YAP1 με Ρ63, η οποία συμβάλλει στην ανασταλτική επίδραση της νικοτίνης επί της απόπτωσης. Χρησιμοποιώντας την ανάλυση ανοσοϊστοχημείας παρατηρήσαμε αυξητική ρύθμιση του YAP1 σε ένα σημαντικό τμήμα του οισοφάγου δειγμάτων καρκίνου. Σταθερά, έχουμε βρει μια σημαντική συσχέτιση μεταξύ YAP1 ανοδική ρύθμιση και το κάπνισμα τσιγάρων στις κλινικές οισοφάγου δείγματα καρκίνου. Μαζί, αυτά τα ευρήματα υποδεικνύουν ότι η νικοτίνη ενεργοποιημένα nAChRs μονοπάτι το οποίο ενεργοποιεί περαιτέρω YAP1 παίζει σημαντικό ρόλο στην ανάπτυξη του καρκίνου του οισοφάγου σηματοδότησης, και αυτός ο μηχανισμός μπορεί να είναι ενός γενικού ενδιαφέροντος για την καρκινογένεση των καρκίνων που σχετίζονται με το κάπνισμα.

Παράθεση: Zhao Υ, Zhou W, Xue L, Ζανγκ W, Zhan Ε (2014) νικοτίνη Ενεργοποιεί YAP1 μέσω nAChRs σηματοδότηση μέσω του οισοφάγου σε καρκίνο εκ πλακωδών κυττάρων (ESCC). PLoS ONE 9 (3): e90836. doi: 10.1371 /journal.pone.0090836

Επιμέλεια: Xin Yuan-Γκουάν, το Πανεπιστήμιο του Χονγκ Κονγκ, Κίνα

Ελήφθη: 9, Ιαν, 2014? Αποδεκτές: 6 Φλεβάρη 2014? Δημοσιεύθηκε: 12 Μαρ του 2014

Copyright: © 2014 Zhao et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτή η μελέτη έχει υποστηριχθεί από τα κονδύλια από το 973 Εθνικό Key Θεμελιωδών Ερευνητικό Πρόγραμμα της Κίνας (2009CB521801) και το Εθνικό Ίδρυμα Φυσικών Επιστημών της Κίνας (81021061). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

το κάπνισμα τσιγάρων συνδέεται με αυξημένο κίνδυνο τόσο ακανθοκυτταρικό καρκίνωμα και το αδενοκαρκίνωμα του οισοφάγου [1] – [3]. Πρόσφατα ευρήματα υποδεικνύουν νικοτίνη και τα παράγωγά της, όπως ΝΝΝ (Ν-νιτροζονορνικοτίνη) και ΝΝΚ ((4-μεθυλονιτροζαμινο) -1- (3-πυριδυλ) -1-βουτανόνη) μπορεί να κατευθύνει την ενεργοποίηση νικοτινικών υποδοχέων ακετυλοχολίνης (nAChRs) για την τόνωση της ανάπτυξης και της αγγειογένεση και καταστέλλουν την επαγόμενη από φάρμακο απόπτωση των καρκινικών κυττάρων [4]. Το νικοτινικό υποδοχείς ακετυλοχολίνης (nAChRs) είναι μια οικογένεια συνδέτη διαύλων πύλης ιόντων που λειτουργούν ως ρυθμιστές των μεγάλων του νικοτινικού και ακετυλοχολινεργικού σηματοδότηση στα κύτταρα. α-nAChRs και β-nAChRs είναι τα πιο κοινά nAChRs. Ανισορροπία εκφράσεις διαφορετικών υποτύπων των nAChRs στα κύτταρα συμβάλλουν στην παθογένεση των ασθενειών, όπως ο καρκίνος [4]. nAChRs είναι επίσης γνωστό ότι ρυθμίζει την κυτταρική προσκόλληση και μετανάστευση μέσω της αλληλεπίδρασής τους με rapsyn και herparansulphate proteogly μπορεί όπως αγρίνης [5] – [7].

Η υπερέκφραση και αυξημένη πυρηνικό εντοπισμό του παράγοντα μεταγραφής ιπποπόταμος μονοπάτι YAP1have έχουν παρατηρηθεί σε πολλαπλούς τύπους ανθρώπινων καρκίνων, συμπεριλαμβανομένων των καρκίνων του ήπατος, καρκίνοι του παχέος εντέρου, των ωοθηκών, καρκίνους του πνεύμονα, και καρκίνων του προστάτη [8]. Και οι ενισχύσεις του γονιδιακού τόπου YAP1 παρατηρήθηκαν σε ενδοκρανιακή επενδυμώματα, στοματική καρκινώματα πλακωδών κυττάρων, και μυελοβλαστώματα [8]. YAP1 αναφέρθηκε ότι είναι το γονίδιο του καρκίνου οδήγηση στο ανθρώπινο ηπατοκυτταρικό καρκίνωμα (HCC) και του καρκίνου του μαστού 11q22 αμπλικόνια [9], [10]. Επιπλέον, YAP1 προσδιορίστηκε να αποτελεί ανεξάρτητο προγνωστικό δείκτη για την συνολική επιβίωση ηπατοκυτταρικού καρκινώματος και του οισοφάγου καρκινώματα πλακωδών κυττάρων [11], [12].

Dasgupta et al. ανέφεραν νικοτίνη μπορεί να προκαλέσει μέχρι και ρύθμιση των ΧΙΑΡ και Survivin (BIRC5) σε μη μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα να αναστέλλουν την απόπτωση που επάγεται από χημειοθεραπευτικά φάρμακα [13]. Και η νικοτίνη είναι γνωστό ότι επάγουν την έκφραση του CTGF (αυξητικός παράγοντας συνδετικού ιστού) σε ινοβλάστες των ούλων και περιοδοντικό σύνδεσμο κύτταρα η οποία συμβάλλει στην παθογένεση των περιοδοντικών ίνωσης [14]. Αξίζει να σημειωθεί ότι, Survivin και CTGF είναι δύο από τις συντηρημένες κατάντη γονίδια που ρυθμίζονται από παράγοντα μεταγραφής YAP1 της οδού Hippo [8], [15]. Πρόσφατα, Yu et al. αναφερόμενη ρύθμιση του μονοπατιού Hippo-YAP με G-πρωτεΐνη υποδοχέα σηματοδότηση [15]. Και β2-nAChR έχουν αναφερθεί ότι συνδέονται φυσικώς με την πρωτεΐνη G, Αγ πρωτεΐνη ρυθμιζόμενη επαγωγέα της έκφυσης έξω ανάπτυξης 1, και G πρωτεΐνη-ενεργοποιημένων Κ (+) του καναλιού 1, υποδεικνύοντας μια πιθανή σύνδεση μεταξύ nAChRs σηματοδότησης και κυτταρικών οδών πρωτεΐνη G [ ,,,0],16]. Επιπλέον, YAP1 αναφέρθηκε ότι ρυθμίζεται προς τα πάνω σε οισοφάγου καρκίνους και προσδιορίζεται ως ένα ογκογονίδιο σε καρκίνο του οισοφάγου [11], [17]. Έτσι προσπαθήσαμε να διερευνήσει την πιθανή σχέση μεταξύ της έκθεσης σε νικοτίνη και την ενεργοποίηση YAP1 σε καρκίνο του οισοφάγου σε αυτή τη μελέτη.

Μέθοδοι

ιστών Δείγματα

ESCC δείγματα ιστών μας από 83 ασθενείς με παθολογικό στάδιο Τ3 καρκίνωμα του οισοφάγου εκ πλακωδών κυττάρων συλλέχθηκαν. Οι ασθενείς διαδοχικά προσληφθεί στην Κινεζική Ακαδημία Ιατρικών Επιστημών Αντικαρκινικό Νοσοκομείο (Πεκίνο, Κίνα). Κατά την πρόσληψη, ενημερωμένη συγκατάθεση λήφθηκε από κάθε θέμα. Οι εγκρίσεις σε γραπτή μορφή, κάθε ασθενής είχε ενημερωθεί για την υπογραφή της συγκατάθεσης για τη χρήση δειγμάτων τους ιστούς αποκτήθηκαν από χειρουργική επέμβαση για την έρευνα της επιστήμης πριν από ελήφθησαν τα δείγματα. Εμείς διατηρηθεί το τραπέζι συναίνεση στην ιατρική μας βάση δεδομένων, και η επιτροπή δεοντολογίας /IRB του Καρκίνου Ινστιτούτο Κινεζικής Ακαδημίας Ιατρικών Επιστημών ενέκρινε τη διαδικασία συναίνεσης και τη μελέτη.

Cell Culture και Επιμόλυνση και τη χορήγηση του φαρμάκου

κυτταρικές σειρές ανθρώπινου ESCC καλλιεργήθηκαν σε RPMI 1640 συμπληρωμένο με 10% εμβρυϊκό βόειο ορό στους 37 ° C υπό 5% CO2 και κεκορεσμένη υγρασία. Καρκίνο του οισοφάγου κυτταρικές σειρές KYSE510, KYSE30 δόθηκαν γενναιόδωρα από τον Dr. Yutaka Shimada (Πανεπιστήμιο του Κιότο). Για τους παροδικές επιμολύνσεις του πλασμιδίου και siRNA, τα κύτταρα αναπτύχθηκαν σε πλάκες 60-mm σε 50-90% συρροή και επιμολύνθηκαν με 200 ρ mol του siRNA χρησιμοποιώντας Λιποφεκταμίνη 2000 (Invitrogen). Τρεις Stealth siRNAs απευθύνονται σε CHRNA3 σχεδιάστηκαν και διέταξε από Invitrogen, TureClone πλασμίδιο ΤΟΡΡ-CHRNA3 αγοράστηκε από ΟηΟεηε. Τα κύτταρα επιμολύνθηκαν με ΤΟΡΡ-CHRNA3 πλασμιδίου ή CHRNA3 siRNA χρησιμοποιώντας Λιποφεκταμίνη 2000 (Invitrogen) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Φρέσκο ​​μέσο προστέθηκε 6 ώρες μετά την επιμόλυνση. Για χορήγηση νικοτίνης, τα κύτταρα επωάστηκαν σε μέσο που περιέχει 80 ηΜ νικοτίνης για 48 ώρες ή περισσότερο. Για χορήγηση Enzastaurin, Enzastaruin προστέθηκε στο μέσο σε συγκέντρωση 500 μΜ για 48 ώρες.

ΟβΙΙ Growth Καμπύλη

καμπύλη

Η ανάπτυξη μετρήθηκε με xCELLigence RTCA MP E-πλάκα 96 φρεατίων, 3 × 10

3 κύτταρα προστέθηκαν σε κάθε φρεάτιο σύμφωνα με το πρωτόκολλο του xCELLigence συστήματος, ο ρυθμός ανάπτυξης των κυττάρων παρακολουθήθηκε για 81 ώρες. Για τις καμπύλες ανάπτυξης των κυττάρων διαβάζεται με δοκιμασία ΜΤΤ, 100 μΐ κυτταρικής καλλιέργειας που περιέχει 3 χ 10

3 κύτταρα προστέθηκαν σε 30 φρεάτια μιας πλάκας 96-φρεατίων. 20 μΐ αντιδραστηρίου μεθανοθειοσουλφονικό (Promega) προστέθηκε σε 6 φρεάτια κάθε φορά σε διάστημα 24 h για 5 ημέρες, ακολουθούμενες με 1 ώρα επώασης στους 37 ° C και 5% CO

2, η απορρόφηση αναγνώστηκαν στα 490 nm με ένας αναγνώστης μικροπλάκας.

Transwell τη μετανάστευση και την εισβολή αναλύσεις

μετανάστευση και δοκιμασίες εισβολής διεξήχθησαν με Corning, 80 μm 24 και φρεατίων πλάκα επικαλυμμένα με 30% Matrigel (300 μl /κοιλότητα, Falcon) . Συνολικά, 1 × 10

5 κύτταρα σε 100 μΙ μέσου χωρίς ορό προστέθηκαν στον άνω θάλαμο της συσκευής, και ο κατώτερος θάλαμος γέμισε με 600 μΐ μέσου καλλιέργειας με 20% ορό εμβρύου μόσχου. Μετά από 6 ώρες επώασης στους 37 ° C, τα μη μεταναστεύοντα κύτταρα απομακρύνθηκαν από την άνω επιφάνεια της μεμβράνης με ένα βαμβάκι. Τα φίλτρα στη συνέχεια σταθεροποιήθηκαν σε μεθανόλη για 10 λεπτά, χρωματίστηκαν με διάλυμα Giemsa για 1 ώρα, και μετρήθηκαν. Πέντε τυχαία μικροσκοπικά πεδία (× 100) μετρήθηκαν ανά καλά, και προσδιορίστηκε η μέση τιμή.

Αντισώματα και Ειδικών Αντιδραστήρια

Κουνέλι YAP1 αντισώματος, CHRNA3 αντισώματα αγοράστηκαν από Proteintech Gourp (Chicago, IL 60612, USA), YAP ποντικού (63.7), GAPDH αντίσωμα αγοράστηκαν από την Santa Cruz Biotechnology (Ντάλλας, Τέξας 75220U.SA), Phospho-YAP (Ser127) αντίσωμα αντίσωμα και β-κατενίνης, αντίσωμα β-ακτίνης αγοράστηκαν από την Cell Signaling Technology (Danvers, ΜΑ 01923), CHRNB4 αντίσωμα, CHRNA5 αντίσωμα και αντίσωμα 14-3-3 αγοράστηκαν από Abgent. ΤΟΡΡ αντίσωμα, το αντίσωμα Ρ63, ΤΟΡΡ επισημανθεί CHRNA3 Tureclonevector αγοράστηκαν από ΟηΟεηε (Πεκίνο, Κίνα 101111), το αντίσωμα α-κατενίνης αγοράστηκε από Lifetechnologies (Carlsbad, CA 92008). Ανασυνδυασμένη GST επισημασμένο YAP1 πρωτεΐνη αγοράστηκε από Abnova (Taipei City Taiwan114). αναστολέας της PKC Enzastaurin αγοράστηκε από Σέλεκ Χημικών Προϊόντων (Μόναχο, Γερμανία 81829). Η νικοτίνη αγοράστηκε από την Sigma-Aldrich (St. Louis, ΜΟ 63103).

ανοσοφθορισμού δοκιμασία

KYSE510 κύτταρα σπάρθηκαν επί γυάλινων καλυπτρίδων σε ένα 6-φρεατίων για 24-48 ώρες, τα κύτταρα σταθεροποιήθηκαν με μεθανόλη για 10 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου και πλύθηκε με PBS. Μετά την επώαση με αντίσωμα που συνδέεται επί 1 ώρα σε θερμοκρασία δωματίου, οι πλάκες πλύθηκαν και incu1’bated με IgG αντι-κουνελιού συζευγμένη με FITC κατσίκας. Μετά από πλύση με PBS, τα κύτταρα χρωματίστηκαν με ϋΑΡΙ και εξετάστηκαν με συνεστιακή λέιζερ σάρωσης μικροσκόπιο (Leica Microsystems Heiderg GmbH, Am Friedensplatz 3, Germany).

Ποσοτική Real Time PCR

Σύνολο RNA από κύτταρα KYSE510 εκχυλίζεται με ΤΚΙζοΙ (τεχνολογίες ζωής (Carlsbad, CA 92008)). Πρώτου κλώνου cDNA συντέθηκε χρησιμοποιώντας το κιτ Superscript II-ανάστροφης μεταγραφάσης (Invitrogen) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Real-time PCR (qPCR) διεξήχθη χρησιμοποιώντας SYBR πρόμιγμα Ex Taq (Takara) σε ένα ΑΒΙ 7300 Real-Time PCR System (Applied Biosystems). Όλα τα δείγματα ομαλοποιήθηκαν σε GAPDH

Τα ζεύγη εκκινητών PCR του γονιδίου-ειδικών που χρησιμοποιούνται σε αυτή τη μελέτη:.

YAP1 (GGCGCTCTTCAACGCCGTCATGAAC /CCTGTCGGGAGTGGGATTT)?

CTGF (CCAATGACAACGCCTCCTG /TGGTGCAGCCAGAAAGCTC) ?

Cyr61 (AGCCTCGCATCCTATACAACC /TTCTTTCACAAGGCGGCACTC)?

EDN1 (TGTGTCTACTTCTGCCACCT /CCCTGAGTTCTTTTCCTGCTT)?

PPP1ReB (GGACACGTTCTCCTTCGAC /AGATTTTAACTCAGCCCGGAT)?

SURVIVIN (CCTGGCTCCTCTACTGTT /CTCTATTCTGTCTCCTCATCC)?

GAPDH (GCTGAGAACGGGAAGCTTGT /GCCAGGGGTGCTAAGCAGTT)

ανάλυση

κηλίδωση Western, ανοσοκαταβύθιση, και GST pull-down αναλύσεις

Western blot πραγματοποιήθηκε ως εξής. Τα κύτταρα συλλέχθηκαν και φυγοκεντρήθηκαν για συγκομιδή. Τα κύτταρα lysedon πάγο για 40 λεπτά σε ρυθμιστικό διάλυμα RIPA (10 mMTris, ρΗ 7,4, 150 mMNaCl, 1% Triton Χ-100, 0.1% δεοξυχολικό νάτριο, 0.1% SDS, και 5 mM EDTA) που περιέχει πλήρες μείγμα αναστολέα πρωτεάσης (Sigma). Τα προϊόντα λύσης διαυγάστηκαν με φυγοκέντρηση στα 12,000relative φυγόκεντρη δύναμη για 20 λεπτά στους 4 ° C. Για στύπωμα Western, 40 μg ολικής πρωτεΐνης αιωρήθηκε σε ρυθμιστικό διάλυμα δείγματος. Για ανοσοκαταβύθιση, τα κυτταρολύματα επωάστηκαν με primaryantibody ακολουθούμενη από επώαση με σφαιρίδια Α-αγαρόζη πρωτεΐνη (Invitrogen). Τα άνοσα σύμπλοκα πλύθηκαν και suspendedin ρυθμιστικό διάλυμα δείγματος. Στην δοκιμασία pull-down GST, σφαιρίδια γλουταθειόνης (Sigma) επωάστηκαν με Escherichia coli-εκφράζεται GST-YAP1or GST μόνη της για 4 ώρες. Glutathionebeads στη συνέχεια πλύθηκαν και επωάστηκαν για 4 ώρες με λύματα KYSE510 κυττάρων. Μετά την πλύση, τα σύμπλοκα πρωτεΐνης εναιωρήθηκαν σε ρυθμιστικό δείγματος. Όλα πρωτεΐνη φορτώθηκε σε κάθε wellof 15% SDS-PAGE. Τα πηκτώματα μεταφέρθηκαν σε μεμβράνες PVDF (Bio-Rad), αποκλείστηκαν με 5% γάλα /ΡΒδ, και επωάστηκαν όλη τη νύκτα στους 4 ° C με πρωτεύοντα αντισώματα. Μετά την πλύση και επώαση με δευτερογενή αντισώματα σε 5% γάλα, η μεμβράνη πλύθηκε και τα θετικά σήματα αναπτύχθηκαν με αντιδραστήριο χημειοφωταύγειας (Amersham). Η μεμβράνη εξετέθη σε ιατρική φιλμ ακτίνων Χ (Fuji Ltd., Tokyo, Japan).

Ανάλυση κυτταρομετρίας ροής

Η ζωτική, αποπτωτικά και κατεστραμμένα κύτταρα διαχωρίστηκαν με κυτταρομετρία ροής. Ο ποσοτικός προσδιορισμός του ποσοστού των κυττάρων που υφίστανται απόπτωση διεξήχθη χρησιμοποιώντας ένα κιτ αννεξίνη V-FITC ανίχνευσης απόπτωσης (Cliniscience S.A.) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Εν συντομία, 48 ώρες μετά τη θεραπεία με νικοτίνη, 2 × 10

5 κύτταρα σημάνθηκαν με φθορισμό για την ανίχνευση των αποπτωτικών και νεκρωτικών κυττάρων με την προσθήκη 195 μΙ ρυθμιστικού διαλύματος δέσμευσης αννεξίνης V και 5 μΐ αννεξίνης V-FITC σε κάθε δείγμα. Τα δείγματα αναμίχθηκαν ήπια και επωάζεται σε θερμοκρασία δωματίου στο σκοτάδι για 3 λεπτά, 10 μΐ ιωδιούχου προπιδίου (ΡΙ? Sigma) προστέθηκε σε κάθε δείγμα και επωάστηκαν σε θερμοκρασία δωματίου για 10 λεπτά. Πριν από κυτταρομετρική ανάλυση, το κυτταρικό εναιώρημα συμπληρώθηκε με 300 μΙ ρυθμιστικού διαλύματος αννεξίνης V-δεσμευτική. Ένα ελάχιστο 10000 κυττάρων εντός του περιορισμένου περιοχή αποκτήθηκαν και αναλύθηκαν με το λογισμικό Cell Quest.

Η ανοσοϊστοχημική χρώση και εκτίμηση

Όλοι οι ιστοί σταθεροποιήθηκαν σε 4% φορμαλδεΰδη εξουδετερώθηκε, ενσωματωμένο σε παραφίνη. Μπλοκ του ιστού δότη παραφίνη-ενσωματωμένες ελήφθησαν δείγματα χρησιμοποιώντας ένα εγχειρίδιο ιστών arrayer 1 μέσο (Beecher Instruments, Silver Spring, MA, USA). Δύο πυρήνες κόπηκαν από κάθε μπλοκ δότη για τα μπλοκ TMA. Τμήματα (5 μm) του μπλοκ ιστικού πίνακα κόπηκαν και τοποθετήθηκαν σε γυάλινες πλάκες επικαλυμμένες με πολυλυσίνη και επεξεργασία για IHC. Από τα διαθέσιμα δείγματα, επτά μπλοκ ιστικού πίνακα παρασκευάσθηκαν, το καθένα περιέχει 30 περιπτώσεις με όγκο, η κανονική και λεμφικό ιστούς κόμβο εάν είναι διαθέσιμη. Τα πλακίδια μικροσυστοιχιών ιστού αποπαραφινοποιήθηκαν σε ξυλόλιο και κλίση αιθανόλης. Το αντιγόνο ανάκτηση διεξήχθη τοποθετώντας τα πλακίδια σε μια κουζίνα υψηλής πίεσης σε ένα 0,01 mM κιτρικού ρυθμιστικού, ρΗ 6.0, για 2.5 λεπτά στους 100 ° C? είχαν στη συνέχεια ψύχεται για 20 λεπτά. Η ενδογενής δράση υπεροξειδάσης αποκλείστηκε με επώαση του τμήμα σε 3% Η

2O

2 για 10 λεπτά, ακολουθούμενο από έκπλυση σε διάλυμα PBS τρεις φορές. Οι τομές επωάστηκαν με αντίσωμα αντι-YAP1 κουνελιού (Proteintech) σε αραίωση 1:50 σε 4 ° C όλη τη νύκτα, οι πλάκες στη συνέχεια επωάστηκαν για 1 ώρα σε δευτερογενές αντίσωμα. Ένα κιτ EnVision (Dako, Carpinteria, CA, USA) χρησιμοποιήθηκε για την οπτικοποίηση σύνδεσης αντισώματος, και διαφάνειες στη συνέχεια με αιματοξυλίνη. Μια PBS μόνο χρώση δείγμα χρησιμοποιήθηκε ως μάρτυρας υποβάθρου. Οι διαφάνειες συστοιχία ιστού σαρώθηκαν και αναλύθηκαν με AperioScanScope CS. Με βάση την ένταση ανοσοχρώση, οισοφάγου ιστοί χωρίστηκαν σε τέσσερις κατηγορίες ως YAP1 αρνητικό (-), αδύναμη θετικότητα του YAP1 (+), διάμεση θετικότητα του YAP1 (+ +), ισχυρή θετικότητα του YAP1 (+ + +). Όλα τα πειράματα εκτελέστηκαν και επαναλήφθηκαν τουλάχιστον τρεις φορές. Τα δεδομένα αναλύθηκαν με το πρόγραμμα SPSS 11.5software. Οι συσχετίσεις μεταξύ των υποομάδων της χρώσης και το κάπνισμα τσιγάρων υπολογίστηκαν χρησιμοποιώντας δοκιμή του Pearson χ2.

Αποτελέσματα

Η νικοτίνη προάγει την ανάπτυξη και τη μετανάστευση από καρκίνο του οισοφάγου

Η νικοτίνη είναι γνωστό ότι είναι ένας σημαντικός παράγοντας κινδύνου για καρκίνο του οισοφάγου. Οι προηγούμενες εκθέσεις δείχνουν ότι η νικοτίνη προάγει την κυτταρική ανάπτυξη και μετανάστευση σε διαφορετικούς τύπους ανθρώπινων καρκίνων [4], [18]. Έτσι δοκιμάσαμε για πρώτη φορά τις διεγερτικές επιδράσεις της ανάπτυξης της νικοτίνης στο οισοφάγου κυτταρική σειρά καρκίνου KYSE510 με xCELLigence RTCA MP E-πλάκα 96 φρεατίων και παρατήρησε ότι η χορήγηση νικοτίνης ενισχυθεί σημαντικά το ρυθμό ανάπτυξης της KYSE510 κυττάρων (Σχήμα 1 Α). Επιπλέον, πραγματοποιήσαμε Transwell δοκιμασία για να μελετήσει τις επιδράσεις της νικοτίνης για τη μετανάστευση των κυττάρων και KYSE510 παρατηρήθηκε επίσης μια σημαντική αύξηση της μετανάστευσης του κυττάρου KYSE510 κατεργάζεται με νικοτίνη (Σχήμα 1 Β).

A. Η νικοτίνη διοίκηση διεγείρει την ανάπτυξη των καρκινικών κυττάρων του οισοφάγου KYSE510 μετριέται από το σύστημα E-Plateofx CELLigence RTCA MP. διοίκηση B. Η νικοτίνη αύξησε την εισβολή και τη μετανάστευση του οισοφάγου κυττάρων καρκίνου KYSE30 σε επικοινωνούντα προσδιορισμούς. Γ υποκυτταρικός εντοπισμός της YAP1 εξετάστηκαν με ομοεστιακό μικροσκόπιο φθορισμού. Μετατόπιση του YAP1 (πράσινο) από το κυτταρόπλασμα στον πυρήνα παρατηρήθηκε μετά τη χορήγηση νικοτίνης σε KYSE510 κύτταρα για 48 ώρες. κύτταρα D. KYSE510 υποβλήθηκαν σε θεραπεία με νικοτίνη για 48 hs, μειωμένη φωσφορυλίωση YAP1 και αυξημένη αποφωσφορυλιωμένο YAP1 παρατηρήθηκε με ανάλυση κηλίδος Western. Ε PCR πραγματικού χρόνου επαλήθευση της επαγωγής των mRNA των γονιδίων που ενεργοποιούνται από μεταγραφικά YAP1 κατά τη χορήγηση νικοτίνης. ΣΤ PKC αναστολέα Enzastaurin μπλοκάρει τη νικοτίνη που προκαλείται upregualtion του επιπέδου της πρωτεΐνης YAP1, και είχε ως αποτέλεσμα τη μείωση του επιπέδου της πρωτεΐνης YAP, ιδιαίτερα την αποφωσφορυλιωμένη μορφή YAP1 με κηλίδα Western.

Η

Η νικοτίνη προκαλεί YAP1 πυρηνική μετατόπιση και ενεργοποίηση

Κανονισμός

Μέχρι και αυξημένη πυρηνική εντόπιση του Hippo μεταγραφικού παράγοντα οδού YAP1 αναφέρθηκε για να είναι η ανεξάρτητη δείκτης για χειρότερη επιβίωση του καρκίνου του οισοφάγου [11]. Για να αξιολογηθεί εάν η έκθεση νικοτίνη θα είχε ως αποτέλεσμα την ενεργοποίηση του YAP1. Διερευνήθηκε η υποκυτταρική εντόπιση του YAP1 σε καρκίνο του οισοφάγου KYSE510 κυττάρων χρησιμοποιώντας συνεστιακό μικροσκόπιο ανοσοφθορισμού μετά από έκθεση σε νικοτίνη. Αφού τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε μέσα μαζικής ενημέρωσης που περιέχουν νικοτίνη σε συγκέντρωση 80 ηΜ για 48 ώρες, παρατηρήσαμε μια αυξημένη πυρηνική μετατόπιση του YAP1, όπως εκδηλώνεται από συσσώρευση YAP1 στον πυρήνα μετά κύτταρα κατεργασμένα με νικοτίνη (Σχήμα 1 C). Από πυρηνική μετατόπιση και ενεργοποίηση των YAP1 ρυθμίζεται από την φωσφορυλίωση του YAP1 επί S127 περιοχή [8], μπορούμε στη συνέχεια μετρήθηκαν οι αλλαγές του επιπέδου φωσφορυλίωσης των YAP1 πριν και μετά τη θεραπεία νικοτίνης. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 1 D, μειωμένη φωσφορυλίωση YAP1 και αυξημένο επίπεδο πρωτεΐνης του αποφωσφορυλιωμένου YAP1 παρατηρήθηκαν μετά την χορήγηση νικοτίνης. Εξετάσαμε περαιτέρω έκφραση mRNA του CTGF, ένα YAP1 στοχευμένη κατάντη γονίδιο, και βρήκε ότι τα επίπεδα mRNA του CTGF ανυψώθηκε με χορήγηση νικοτίνης. Ωστόσο, δεν παρατηρήσαμε σημαντική ρύθμιση προς τα άνω του YAP1 mRNA μετά τη χορήγηση νικοτίνης (Σχήμα 1 Ε). Αυτά τα αποτελέσματα υποδεικνύουν ότι μετά τη χορήγηση νικοτίνης, YAP1 υφίσταται πυρηνική μετατόπιση και με τη σειρά του ενεργοποιεί μεταγραφικά γονίδια κατάντη της, συμπεριλαμβανομένων των CTGF.

PKC έχει αναφερθεί ότι απαιτείται για την ενεργοποίηση του nAChR με σχηματισμό ενός αυτο-θετικής ανάδρασης για την ενεργοποίηση νικοτινικών υποδοχέων ακετυλοχολίνης [19], [20]. Έχει επίσης αναγνωριστεί ως κινάση YAP1 [21]. Έτσι αντιμετωπίζονται τα κύτταρα με PKC ειδικό αναστολέα Enzastaurin για να δούμε αν η ενεργοποίηση YAP1 μπορεί να μπλοκαριστεί από την αναστολή PKC. Παρατηρήσαμε ότι η θεραπεία Enzastaurin μπλοκάρει ουσιαστικά την ενεργοποίηση YAP1 που επάγεται από τη νικοτίνη όπως υποδεικνύεται από μια δραματική μείωση του συνολικού επιπέδου της πρωτεΐνης YAP1, ιδιαίτερα το αποφωσφορυλιωμένο YAP1 (Σχήμα 1 F). Το αποτέλεσμα αυτό υποδεικνύει ότι η ενεργοποίηση του YAP1 που επάγεται από τη νικοτίνη επιτυγχάνεται με τη μεσολάβηση της PKC.

εξόντωση CHRNA3 επίσης επάγεται YAP1 ενεργοποίηση

Έχει δειχθεί ότι CHRNA5 (νευρωνική υπομονάδα υποδοχέα ακετυλοχολίνης άλφα-5) και CHRNA3 (υπομονάδα νευρωνική υποδοχέα της ακετυλοχολίνης άλφα-3) ως αρνητικοί ρυθμιστές της σηματοδότησης της νικοτίνης στο βρογχικό καρκίνο και καρκίνο του οισοφάγου κύτταρα [22]. Λόγω knockdown του CHRNA3 και CHRNA5 αύξησε τον πολλαπλασιασμό, τη μετανάστευση και ασβέστιο εισροή των κυτταρικών σειρών καρκίνου του πνεύμονα, ως αποτέλεσμα της αύξησης του αντισταθμιστική διάταξη του α7 nAChR-πάνω στη μεμβράνη κυτοπλάσματος το οποίο είχε υψηλότερη διαπερατότητα σε ασβέστιο σε απόκριση στη νικοτίνη. Έτσι χρησιμοποιήσαμε προσεγγίσεις siRNA να knockdown CHRNA3 σε KSYE-510 κύτταρο και στη συνέχεια εξέτασαν τις επιδράσεις της εξάντλησης CHRNA3 στην ανάπτυξη και τη μετανάστευση των κυττάρων KYSE510, και για την ενεργοποίηση των YAP1 επίσης. Παρατηρήσαμε μια αύξηση του ρυθμού ανάπτυξης και της μετανάστευσης στην KYSE510 κύτταρα με CHRNA3 knockdown, το οποίο είναι παρόμοιο με αυτό που παρατηρείται στη χορήγηση της νικοτίνης (Σχήμα 2 Α, Σχήμα 2 Β). Σταθερά, μια μείωση της φωσφορυλίωσης YAP1, ιδιαίτερα στη θέση του S127 YAP1 δείχθηκε με κηλίδα western (Σχήμα 2 C). Με ομοεστιακό μικροσκόπιο ανοσοφθορισμού παρατηρήσαμε επίσης πυρηνική μετατόπιση του YAP1 στα KYSE510 κύτταρα μετά CHRNA3 knockdown (Σχήμα 2 D). Επιπλέον, η μεταγραφική επαγωγή του CTGF και άλλων YAP1 κατάντη γονίδια παρατηρήθηκαν επίσης στα κύτταρα σιγήσει για CHRNA3 (Σχήμα 2Ε).

A. καμπύλη ανάπτυξης των κυττάρων μετρήθηκε με προσδιορισμό ΜΤΤ έδειξε siRNA μεσολαβεί νοκ ντάουν της CHRNA3 αύξησε το ποσοστό αύξησης των KYSE510 κυττάρων. δοκιμασία Β Transwell ανέφερε ότι νοκ ντάουν της CHRNA3 αύξησε την εισβολή και τη μετανάστευση των κυττάρων KYSE30. Γ ανάλυση Western blot έδειξε 3 Stealth siRNA κατασκευάσματα αποτελεσματικά γκρέμισε CHRNA3. Η εξάντληση των CHRNA3 οδήγησε σε μείωση του φωσφορυλιωμένου YAP1 και αυξημένη του αποφωσφορυλιωμένο YAP1, ιδίως μειωμένη S127 φωσφορυλίωση YAP1. Δ Παρατήρηση YAP1 υποκυτταρικού εντοπισμού με ομοεστιακό μικροσκόπιο φθορισμού μετά από εξάντληση των CHRNA3. Μετατόπιση του YAP1 (πράσινο) από το κυτταρόπλασμα στον πυρήνα παρατηρήθηκε μετά siRNA μεσολαβεί knockdown του CHRNA3 σε KYSE510 κύτταρα για 48 ώρες. Ε πραγματικό χρόνο δοκιμή PCR ενδεικνυόμενη YAP1 στοχευμένες γονίδια που προκαλείται από CHRNA3 νοκ ντάουν στην KYSE510 κυττάρων.

Η

Φυσικές αλληλεπιδράσεις μεταξύ nAChRs και YAP1

Για να διερευνήσουν περαιτέρω το ρυθμιστικό ρόλο της nAChRs με YAP1, πραγματοποιήσαμε πειράματα ανοσοκατακρήμνισης να ερευνήσει αν nAChRs φυσικά αλληλεπιδρούν με YAP1. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 3, εντοπίστηκαν οι σαφείς αλληλεπιδράσεις μεταξύ YAP1 και CHRNA3 /CHRNA5 /CHRNB4. Η αλληλεπίδραση μεταξύ YAP1 και CHRNA3 επαληθεύτηκε με εξωγενώς επιμολυσμένα ΤΟΡΡ σημασμένο CHRNA3 στο KYSE510 κύτταρα (Εικόνα 3 Β). Επιπλέον, πραγματοποιήσαμε GST pull down δοκιμασία για την περαιτέρω επαλήθευση της αλληλεπίδρασης μεταξύ YAP1 και CHRNA3 με εξωγενώς εξέφρασε GST-επισημασμένη YAP1 (Abnova). GST-pull down πείραμα έδειξε, επίσης, με τη θετική αλληλεπίδραση μεταξύ ενδογενών CHRNA3 και GST-YAP1 (Εικόνα 3 C). Στη συνέχεια, χρησιμοποιήσαμε ομοεστιακό μικροσκόπιο ανοσοφθορισμού για να εξετάσει την colocalization μεταξύ CHRNA3 και YAP1. Βρήκαμε ότι τόσο CHRNA3 και YAP1 είχαν συνεντοπίστηκαν στην περιοχή της μεμβράνης και στο κυτταρόπλασμα των κυττάρων KYSE510 (Σχήμα 3 D). Συλλογικά, αυτές οι παρατηρήσεις υποδεικνύουν nAChRs φυσικώς συνδέουν με YAP1 σε καρκίνο του οισοφάγου κύτταρα. 14-3-3 είναι το δεσμευτικό εταίρο YAP1 στο κυτταρόπλασμα, παρατηρήσαμε επίσης θετικές αλληλεπιδράσεις μεταξύ 14-3-3 και CHRNA3 /CHRNA5 /CHRNB4 με δοκιμασία ανοσοκαταβύθισης σε KYSE510 κύτταρο (Σχήμα 3 Ε).

ΈΝΑ. Η ενδογενής τεστ IP έδειξε θετικές αλληλεπιδράσεις πρωτεϊνών μεταξύ YAP1 και CHRNA3 /CHRNB4 /CHRNA5 στο KYSE510 κύτταρα. B. Θετικές αλληλεπίδραση μεταξύ ΤΟΡΡ-CHRNA3 και YAP1 ανιχνεύθηκε σε κύτταρα επιμολυσμένα με ΤΟΡΡ-CHRNA3. Γ GST δοκιμασία Τραβήξτε έδειξε θετική αλληλεπίδραση των εξωγενώς εξέφρασε GST-YAP1 με CHRNA3 στο KYSE510 κυττάρων. Δ Ομοεστιακή μικροσκοπία ανοσοφθορισμού παρατηρήθηκε συνεντόπισης της YAP1 και CHRNA3 σε KYSE510 κυττάρων. Τα κύτταρα KYSE510 εκφράστηκαν παροδικά ΤΟΡΡ επισημασμένο CHRNA3 του φορέα TureClone (ΟηΟεηε). YAP1 σημάνθηκε με κόκκινο-FITC IgG αντι-κουνελιού συζευγμένο αντίσωμα κατσίκας. Οι κυτταρικοί πυρήνες οπτικοποιήθηκαν με DAPI. Ε ενδογενούς IP ανιχνεύονται θετικές αλληλεπιδράσεις μεταξύ 14-3-3 και CHRNA3 /CHRNB4 /CHRNA5.

Η

Ο διαχωρισμός των αρνητικών ρυθμιστών της YAP1 με επεξεργασία νικοτίνη

Η μεταγραφική δραστηριότητα και πρωτεΐνη επίπεδο YAP1 είναι γνωστό ότι ρυθμίζεται αρνητικά από 14-3-3, α-κατενίνης και β-κατενίνης [8], [23], [24]. Το φωσφορυλιωμένο YAP1 μπορεί να δεσμεύσει με ρ63, και τέτοια ένωση αυξάνει τη σταθερότητα του p63 και συμβάλλει στην ρ63 μεσολαβεί φάρμακο προκαλούμενη απόπτωση [21]. Έτσι προσπαθήσαμε να εξετάσει την επίδραση της νικοτίνης σχετικά με τις αλληλεπιδράσεις του με YAP1 α-κατενίνης, β-κατενίνης, 14-3-3, και ρ63. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 4, οι αλληλεπιδράσεις των YAP1 με α-κατενίνης, β-κατενίνης, 14-3-3, και ρ63 διασπάστηκαν με χορήγηση νικοτίνης (Σχήμα 4 Α), η οποία είναι σύμφωνα με τις παρατηρήσεις μας ότι η θεραπεία η νικοτίνη αύξησε την πυρηνική μετατόπιση και ενεργοποίηση των YAP1. Μειωμένη αλληλεπίδραση του YAP1 με 14-3-3, α-κατενίνης, β-κατενίνης θα είχε ως αποτέλεσμα την αύξηση του συνολικού επιπέδου της πρωτεΐνης YAP1. Σταθερά, έχουμε παρατηρήσει μια σημαντική αύξηση του επιπέδου της πρωτεΐνης YAP1 κατά την παρατεταμένη θεραπεία νικοτίνης (Σχήμα 4 Β). Όπως p63 είναι ένας σημαντικός ρυθμιστής της απόπτωσης, και η αλλοίωση της αλληλεπίδρασης μεταξύ YAP1 και p63 θα έθιγε τα αποπτωτικά αντιδράσεις που προκαλούνται από ρ63. Σταθερά, παρατηρήσαμε μειωμένη απόπτωση KYSE510 κύτταρα κατεργασμένα με νικοτίνη (Σχήμα 5).

Β. KYSE510 κύτταρα εκτίθενται σε νικοτίνη για περισσότερο από 4 ημέρες οδήγησε σε προς τα πάνω ρύθμιση του συνολικού επιπέδου της πρωτεΐνης YAP1, συμπεριλαμβανομένων τόσο φωσφορυλιωμένου YAP1 και αποφωσφορυλιώθηκε YAP1 υποδεικνύεται από ανάλυση Western blot.

Η

Η νικοτίνη θεραπεία μείωσε την μητρική των αποπτωτικών κύτταρα στην κάτω δεξιά τεταρτημόριο.

η

ανάλυση Ανοσοϊστοχημεία των YAP1 σε κλινικά δείγματα

έχει δειχθεί ότι οι ασθενείς με καρκίνο του οισοφάγου προς τα πάνω ρύθμιση του YAP1 είχαν χειρότερη συνολική επιβίωση από εκείνους με φυσιολογική έκφραση YAP1 [11]. Έτσι χρησιμοποιήσαμε κλινική του οισοφάγου δείγματα καρκίνου του να εξετάσει τη συσχέτιση μεταξύ υπερέκφραση του YAP1 και το κάπνισμα τσιγάρων. Συλλέξαμε οισοφάγου δείγματα καρκίνου από 83 ασθενείς στο στάδιο Τ3, συμπεριλαμβανομένων των 29 μη καπνιστές και 54 καπνιστές. Διενεργήσαμε πείραμα ανοσοϊστοχημεία για να αναλύσει το επίπεδο έκφρασης των YAP1 στα δείγματα οισοφαγικού καρκίνου και διαπίστωσε ότι οι ασθενείς με καρκίνο με ιστορικό καπνίσματος έδειξε υψηλή έκφραση YAP1 σύγκριση με τους ασθενείς μη-καπνιστές (

P

& lt? 0,05) (Εικόνα 6 και Πίνακας 1). Έτσι, Τα ευρήματα αυτά πάνε μαζί με τις παρατηρήσεις μας που YAP1 ενεργοποιήθηκε με τη χορήγηση της νικοτίνης in vitro. Ωστόσο, εμείς δεν παρατηρούμε μια σημαντική διαφορά στη συνολική επιβίωση μεταξύ YAP1-υψηλής και YAP1-χαμηλή ομάδες, πιθανόν να οφείλεται σε αυτά τα δείγματα καρκίνου ήταν από Τ3 στάδιο του οισοφάγου ασθενείς.

Οι διαφάνειες σαρώθηκαν από το AperioScanScope CS. Δείγματα ιστών χωρίστηκαν σε 4 κατηγορίες με βάση την ένταση της χρώσης YAP1.

Η

Συζήτηση

Η νικοτίνη είναι μια καθιερωμένη ογκογόνο παράγοντας που συμβάλλει στην παθογένεση πολλών καρκίνων, συμπεριλαμβανομένων οισοφαγικού καρκίνος [3], [4]. Και η νικοτίνη είναι γνωστό ότι προάγει τον πολλαπλασιασμό των καρκινικών κυττάρων μέσω της ενεργοποίησης του κατεχολαμίνης σηματοδότησης καταρράκτη [4], [25], [26]. Σταθερά παρατηρήσαμε αυξημένο ρυθμό ανάπτυξης για καρκίνο του οισοφάγου κύτταρα με επεξεργασία νικοτίνη ή μέσω νοκ ντάουν της CHRNA3. Διάφορες ομάδες έχουν αναφέρει ότι η έκθεση νικοτίνη και το κάπνισμα τσιγάρων μπορεί να προωθήσει την απόκτηση του καρκίνου των βλαστικών κυττάρων, όπως και επιθηλιακά-μεσεγχυματικά μετάβαση στον καρκίνο του στόματος, κεφαλής και λαιμού καρκίνωμα πλακωδών κυττάρων, καρκίνο του πνεύμονα, και καρκίνου του μαστού [27] – [30]. Είναι ενδιαφέρον, Nallet-Staubet al. απέδειξαν ότι YAP1 και TAZ συμβάλλουν στην επεμβατική και μεταστατική ικανότητα των κυττάρων μελανώματος [31]. Και Chen et al. ανέφεραν YAP1 ως ένας σημαντικός μεσολαβητής του TLR4 /Nanog ογκογόνο οδό στη διατήρηση του πληθυσμού ογκογενή βλαστικά κύτταρα που μοιάζουν με (TICs) με καταστολή των κυτταροστατικών σηματοδότησης ΤΟΡ-β σε HCC [32]. Αυτές οι παρατηρήσεις είναι σύμφωνες με την πρώιμη παρατήρηση που απαιτείται YAP1 ομόλογο TAZ για τη διατήρηση της αυτο-ανανέωση και όγκο έναρξη ικανότητες σε βλαστικά κύτταρα του καρκίνου του μαστού [33]. Σε αυτή τη μελέτη, έχουμε δείξει ότι η χορήγηση της νικοτίνης ή CHRNA3 οδηγούν εξάντληση σε αύξηση της κυτταρικής ανάπτυξης και της μετανάστευσης, και επάγουν αντίσταση σε απόπτωση σε καρκίνο του οισοφάγου κύτταρα.

G πρωτεΐνη υποδοχείς (GPCRs) μπορούν να ενεργοποιήσουν ή να αναστείλουν το μονοπάτι Hippo-YAP ανάλογα με τις συζευγμένων G πρωτεϊνών. Και Λυσοφωσφατιδικό οξύ (LPA), και σφιγγοσίνης-1-φωσφορικής (S1P) έχουν αναφερθεί ότι είναι τα ανάντη αγωνιστές σε αυτή την οδό σηματοδότησης για την ενεργοποίηση YAP1 /TAZ μέσω ρύθμισης δραστικότητας κινάσης Lats μέσω διαμόρφωσης δυναμική κυτταροσκελετού της ακτίνης [15]. GPCRs μπορούν να ενεργοποιήσουν το ασβέστιο καταρράκτη σηματοδότησης μέσω PLC /IP3R /PKC μονοπατιού [34]. Και σηματοδότηση ασβέστιο είναι γνωστό ότι ρυθμίζει δυναμική ακτίνη και κυτταρική κινητικότητα μέσω της διαφοροποίησης των κατάντη μονοπάτια σηματοδότησης Rho ΟΤΡάσης [34], [35]. Έτσι, η νικοτίνη μπορεί να ενεργοποιήσει YAP1 μέσω nAChRs μεσολάβηση εισροή ασβεστίου. Είναι ενδιαφέρον, παρατηρήσαμε PKC ειδικός αναστολέας Enzastaurin ήταν σε θέση να εμποδίσει την ενεργοποίηση του YAP1 με χορήγηση νικοτίνης, η οποία είναι συνεπής με το ρόλο της PKC στη δυναμικοποίηση διαύλων ασβεστίου για την ενίσχυση της εισροής ασβεστίου [36].

Στη μελέτη αυτή, προσδιορίσαμε οι αλληλεπιδράσεις μεταξύ nAChRs και YAP1, υποδεικνύοντας nAChRs μεσολάβηση σηματοδότησης μπορεί να έχει άμεση επίδραση στην ενεργοποίηση YAP1, το οποίο ενισχύεται περαιτέρω από τις παρατηρήσεις ότι CHRNA3 συν-εντοπίζεται με YAP1. Επιπλέον, παρατηρήσαμε μεταβληθεί φυσικές ενώσεις μεταξύ YAP1 και α-κατενίνης /β-κατενίνης /14-3-3 μετά την ενεργοποίηση του YAP1 με χορήγηση νικοτίνης σε καρκίνο του οισοφάγου κύτταρο. Έχει προηγουμένως αναφερθεί α-κατενίνης και β-κατενίνης αλληλεπιδρούν φυσικά με YAP1 να ρυθμίζεται αρνητικά δραστηριότητα YAP1 και η υποβάθμιση του [23], [24]. Η συσχέτιση μεταξύ YAP1 και α-κατενίνης διαμεσολαβείται από 14-3-3 και ότι IQGAP1 είναι ένας από τους εταίρους δέσμευσης υψηλής εμπιστοσύνης YAP1 [23]. Είναι ενδιαφέρον, 14-3-3 αλληλεπιδρά με nAChRs και πρόσδεσης nAChRs σε συγκεκριμένους τομείς της μεμβράνης μέσω μιας αλληλεπίδρασης με ένα σύμπλοκο πολλαπλών υπομονάδων, που περιλαμβάνει APC, EB1, IQGAP1 και MACF, τα οποία είναι στερεωμένα στο κυτταροσκελετό μικροσωληνίσκων [37]. 14-3-3 προωθεί επίσης την προς τα εμπρός μεταφορά των συγκροτημάτων Ν-cadherin /β-κατενίνης από το ER [38]. Επιπλέον, β-κατενίνης αλληλεπιδρά με rapsyn να ρυθμίσουν την ομαδοποίηση των nAChRs σε μυϊκά κύτταρα [39]. Σε αυτή τη μελέτη, παρατηρήσαμε θετικές αλληλεπιδράσεις μεταξύ 14-3-3 και CHRNA3 /CHRNA5 /CHRNB4 στο KYSE510 κυττάρων. Αυτά τα ευρήματα υποδηλώνουν nAChRs, 14-3-3, IQGAP1, α-κατενίνης και β-κατενίνης μπορεί να σχηματίσουν ένα κυτταροσκελετού αγκυροβολημένο αρνητική συγκρότημα ρύθμισης με YAP1, και 14-3-3 χρησιμεύει ως το κοινό πρόσδεσης του προσαρμογέα του συγκροτήματος. Αυτό το συγκρότημα ρυθμίζει αρνητικά την ενεργοποίηση YAP1 και πυρηνική μετατόπιση και πρόσδεσης YAP1 στην κυτταροσκελετού στο κυτταρόπλασμα. Έτσι, nAChRs ρυθμίζουν την ενεργοποίηση των YAP1 μέσω διάστασης του συμπλόκου σε απόκριση προς ανάντη σήματα.

Είναι ενδιαφέρον παρατηρήσαμε επίσης μια μειωμένη συσχέτιση Ρ63 με YAP1 με χορήγηση νικοτίνης, η οποία προωθεί την υποβάθμιση ρ63 και αναστέλλουν την απόπτωση.