Αφηρημένο

Σκοπός

Η ηπαρίνη δέσμευσης του επιδερμικού αυξητικού παράγοντα αυξητικού παράγοντα (ΗΒ-EGF) είναι ένα μέλος της οικογένειας του επιδερμικού αυξητικού παράγοντα. Το δεσμευμένο σε μεμβράνη proHB-EGF είναι γνωστό ότι είναι ένας πρόδρομος της διαλυτής μορφής του ΗΒ-EGF (SHB-EGF), το οποίο προωθεί τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων και την επιβίωση. Ενώ οι λειτουργίες της SHB-EGF έχουν μελετηθεί εκτενώς, δεν είναι ακόμη πλήρως κατανοητή, αν proHB-EGF εμπλέκεται επίσης στην κυτταρική γεγονότα σηματοδότησης. Σε αυτή τη μελέτη, χρησιμοποιήσαμε τα αντι-HB-EGF μονοκλωνικά αντισώματα Υ-142 και Υ-073, τα οποία έχουν διαφορετικές ειδικότητες προς proHB-EGF, προκειμένου να διευκρινίσει τις λειτουργίες proHB-EGF στα καρκινικά κύτταρα.

Πειραματική Σχεδιασμός

Οι βιολογικές δραστηριότητες των proHB-EGF αξιολογήθηκαν σε πολλαπλασιασμό των κυττάρων, την ενεργοποίηση της κασπάσης, και juxtacrine δοκιμασίες δραστικότητας με τη χρήση ενός 3D καλλιέργεια σφαιροειδές NUGC-3 κύτταρα.

Αποτελέσματα

Υ-142 και Y-073 εμφάνισαν παρόμοια δέσμευση και την εξουδετέρωση των δραστηριοτήτων για την SHB-EGF. Ωστόσο, μόνο το Υ-142 συνδέεται με proHB-EGF. Θα μπορούσαμε να ανιχνεύσει τη λειτουργία των ενδογενώς εκφράζονται proHB-EGF σε 3D πολιτισμό σφαιροειδές. Μπλόκο proHB-EGF με Y-142 μείωσε σχηματισμό σφαιροειδές, κατέστειλε τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων, και αυξημένη ενεργοποίηση της κασπάσης στο σφαιροειδές πολιτισμό 3D της NUGC-3 κύτταρα.

Συμπεράσματα

Τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι proHB- EGF δρα ως κυτταρικό πολλαπλασιασμό και την κυτταρική επιβίωση παράγοντας σε καρκινικά κύτταρα. Τα αποτελέσματα δείχνουν ότι proHB-ΕΤΠ μπορεί να διαδραματίσει σημαντικό ρόλο στην εξέλιξη του όγκου

Παράθεση:. Sato S, Kamada Η, Watanabe Τ, Tsuji Ι, Fan J (2013) Προσδιορισμός του πολλαπλασιασμού των καρκινικών κυττάρων και ΔΙΑΣΩΣΗΣ της proHB-EGF από Χρησιμοποιώντας ένα Anti-HB-EGF αντισωμάτων. PLoS ONE 8 (1): e54509. doi: 10.1371 /journal.pone.0054509

Επιμέλεια: Emilio Hirsch, Πανεπιστήμιο του Τορίνο, Ιταλία

Ελήφθη: 29, Αυγούστου του 2012? Αποδεκτές: 12, Δεκ, 2012? Δημοσιεύθηκε: 21 Ιανουαρίου του 2013

Copyright: © 2013 Sato et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Οι συγγραφείς δεν έχουν καμία υποστήριξη ή χρηματοδότηση για να αναφέρετε

Αντικρουόμενα συμφέροντα:. Όλοι οι συγγραφείς είναι /ήταν υπάλληλοι της Takeda Pharmaceutical Company Limited ή Takeda σαν Φρανσίσκο, Inc. και καταβλήθηκαν ως τέτοια. Δεν υπάρχουν διπλώματα ευρεσιτεχνίας, τα προϊόντα για την ανάπτυξη ή την εμπορία προϊόντων που να δηλώνουν. Αυτό δεν αλλάζει την τήρηση των συγγραφέων σε όλες τις PLoS ONE πολιτικές για την ανταλλαγή δεδομένων και υλικών, όπως περιγράφεται λεπτομερώς σε απευθείας σύνδεση στον οδηγό για τους συγγραφείς.

Εισαγωγή

HB-EGF είναι μέλος της του επιδερμικού αυξητικού παράγοντα (EGF) οικογένεια των αυξητικών παραγόντων [1]. Συντίθεται ως διαμεμβρανική πρωτεΐνη, proHB-EGF, που αποτελείται από ένα πεπτίδιο σήματος? ένα προ-πεπτίδιο? και σύνδεσης με ηπαρίνη, δίκην EGF, παραμεμβρανική, διαμεμβρανικές, και κυτταροπλασματικές περιοχές [2]. Κατά τη διάρκεια του κυτταρικού στρες, proHB-EGF υφίσταται εξωτομέα απόπτωση που απελευθερώνει τη διαλυτή μορφή, SHB-EGF, και η ενδοκυτταρική C-τερματικό θραύσμα (CTF) [3], [4]. SHB-EGF ασκεί μια ισχυρή μιτογόνο και /ή χημειοτακτική δραστηριότητα μέσω της ενεργοποίησης των υποδοχέων του EGFR και ErbB4 [1], [5], [6]. Η CTF μετατοπίζεται στον πυρήνα και επάγει την έκφραση γονιδίων του κυκλίνη και cyclinD2 καταστέλλοντας τη λειτουργία του PLZF και Bcl6, αντίστοιχα [7], [8].

Εκτός του ότι είναι ένας πρόδρομος του SHB-EGF και CTF, proHB-EGF έχει μοναδικές ιδιότητες ως υποδοχέας τοξίνη διφθερίτιδας [9], ένα μόριο προσκόλλησης κυττάρου [10], και ένας παράγοντας juxtacrine [11]. Η τοξίνη της διφθερίτιδας σύνδεση προς proHB-EGF ενισχύεται από CD9 ή ηπαρίνη μόρια που μοιάζουν με [12], [13], και η σύνδεση προκαλεί την αναστολή της σύνθεσης πρωτεϊνών μέσω της εσωτερίκευσης του συμπλόκου τοξίνης διφθερίτιδας-proHB-EGF. Ως μόριο κυτταρικής προσκόλλησης, proHB-EGF συνεισφέρει στην βλαστοκύστης προσκόλληση στη μήτρα κατά τη διάρκεια της εμφύτευσης σε ποντικούς [10]. Η δραστηριότητα juxtacrine του proHB-EGF σημειώθηκε πρώτη φορά σε ένα σύστημα συγκαλλιέργειας, όπου proHB-EGF-υπερεκφράζουν κύτταρα σπάρθηκαν σε κύτταρα EGFR-υπερεκφράζουν [11]. Να απομονώσει και να αξιολογηθεί η σηματοδότηση ξεκίνησε από proHB-EGF χωριστά από ότι ξεκίνησε από SHB-EGF, οι proHB-EGF-υπερεκφράζουν κύτταρα μονιμοποιήθηκαν με φορμόλη, εμποδίζοντας έτσι την απελευθέρωση της SHB-EGF. Σε αυτό το σύστημα συγκαλλιέργειας, η proHB-EGF-κύτταρα που υπερεκφράζουν προωθείται σύνθεση του DNA και εμπόδισε την απόπτωση στα κύτταρα EGFR-υπερεκφράζουν σε μερικές από τις μελέτες όπου χρησιμοποιήθηκε [11], [14], [15]. Αντίθετα, όταν τα άθικτα proHB-EGF-κύτταρα που υπερεκφράζουν δεν μονιμοποιήθηκαν με φορμαλίνη, που ανέστειλε τη σύνθεση του DNA και προωθούνται απόπτωση στα κύτταρα EGFR-υπερεκφράζουν σε μία τροποποιημένη κατάσταση συγκαλλιέργεια [16]. Οι λειτουργίες του proHB-EGF αξιολογήθηκαν επίσης με την ανάλυση των επιπτώσεων της proHB-EGF υπερέκφραση σε αυτόνομη κυτταρικά γεγονότα. Η proHB-EGF υπερέκφραση καταστέλλεται ή προωθούνται κυτταρικού πολλαπλασιασμού σε διαφορετικές κυτταρικές σειρές [17], [18]. Έτσι, οι ρόλοι των proHB-EGF δεν έχουν σταθερά ή σαφώς διευκρινιστεί.

Σε αυτή τη μελέτη, έχουμε αξιολογήσει τις λειτουργίες της proHB-EGF στα καρκινικά κύτταρα με τη χρήση 2 αντι-HB-EGF μονοκλωνικά αντισώματα που έχουν διαφορετικές ειδικότητες προς proHB-EGF. Τα ευρήματά μας υποδηλώνουν ότι proHB-EGF παίζει ρόλο στον πολλαπλασιασμό και την επιβίωση των καρκινικών κυττάρων.

Υλικά και Μέθοδοι

Υλικά |

Η αντι-HB-EGF μονοκλωνικά αντισώματα Υ- 073 και Υ-142 και SHB-EGF είχαν προηγουμένως δημιουργούνται [19]. Εν συντομία, το Υ-142 παρασκευάστηκε με ανοσοποίηση BALB /c ποντίκια (Japan Clea) με υποδόριες ενέσεις αιμοκυανίνη πεταλίδας-συζευγμένο Shb-EGF και κοιλιακό ενέσεις 293F κυττάρων (Invitrogen) παροδικά επιμολυσμένα με ένα πλασμίδιο έκφρασης proHB-EGF. Υ-073 λήφθηκε με ανοσοποίηση ποντικών BALB /c με υποδόριες ενέσεις αιμοκυανίνη πεταλίδας-συζευγμένο Shb-EGF. Αμφότερα τα αντισώματα καθαρίστηκαν από το υπερκείμενο καλλιέργειας υβριδώματος τους με rProteinA Sepharose (GE Healthcare). SHB-EGF παρασκευάστηκε από το υπερκείμενο καλλιέργειας του 293F κυττάρων (Invitrogen) επιμολυσμένα με ένα πλασμίδιο έκφρασης SHB-EGF [19]. Χρησιμοποιήσαμε επίσης τα ακόλουθα αντιδραστήρια: IgG ποντικού ελέγχου και σημασμένο με υπεροξειδάση αρμορακίας (HRP-σημασμένο) αντι-ποντικού IgG αντίσωμα από Jackson ImmunoResearch Laboratories? Alexa488-επισημασμένο αντι-ποντικού αντίσωμα IgG, HRP-σημασμένο αντίσωμα IgG αντι-κατσίκας, και HRP-σημασμένο αντίσωμα IgG αντι-κουνελιού από την Invitrogen? αντι-αμφιρεγουλίνη (αντι-ARG) μονοκλωνικό αντίσωμα, αντι-HB-EGF πολυκλωνικό αντίσωμα, αντι-ΕΟΡΚ πολυκλωνικό αντίσωμα, και βιοτινυλιωμένο αντι-ΕΟΡΚ πολυκλωνικό αντίσωμα από την Κ & amp? D Systems? αντι-β-ακτίνης αντίσωμα από την Cell Signaling Technology? erlotinib από Σέλεκ Chemicals? βιοτινυλιωμένο αντίσωμα αντι-φωσφοτυροσίνης από την Millipore? sulfotagged στρεπταβιδίνης από Meso Scale Discovery? και φορβόλη 12-μυριστικό 13-οξικό άλας (ΡΜΑ) από Wako.

Cell Culture

NUGC-3 κύτταρα καρκίνου του στομάχου (Japanese συλλογή της έρευνας Bioresources), 5637 καρκινικών κυττάρων κύστης (American Type Culture Collection), και BxPC-3 παγκρεατικά καρκινικά κύτταρα (American Type Culture Collection) διατηρήθηκαν σε μέσο RPMI1640 συμπληρωμένο με 10% ορό. EFO-27 τα καρκινικά κύτταρα των ωοθηκών (DMSZ) διατηρήθηκαν σε μέσο ΚΡΜΙ1640 με 20% ορό. Τα κύτταρα διατηρήθηκαν σε τρυβλία κυτταρικής καλλιέργειας 2D, και για τα πειράματα σφαιροειδή καλλιέργεια 3D, μεταφέρθηκαν σε μια πλάκα καλλιέργειας Celltight σφαιροειδές (Sumitomo Bakelite).

Κυτταρομετρίας Ροής

Τα κύτταρα αποσπάστηκαν από ένα δίσκος καλλιέργειας με ρυθμιστικό διάλυμα διαχωρισμού κυττάρων (Invitrogen) και επωάστηκαν με μονοκλωνικό αντίσωμα αντι-HB-EGF ή αντι-ARG μονοκλωνικό αντίσωμα για 1 ώρα στους 4 ° C. Μετά από έκπλυση με PBS που περιέχει 1% αλβουμίνη βόειου ορού (BSA), τα κύτταρα επωάστηκαν με Alexa488-επισημασμένο δευτερογενές αντίσωμα για 1 ώρα στους 4 ° C. Η έκφραση πρωτεΐνης μετρήθηκε χρησιμοποιώντας ένα όργανο FACS CantoII (Becton Dickinson), και τα δεδομένα αναλύθηκαν στη συνέχεια με το λογισμικό FlowJo (Tree Star). Για να δημιουργηθεί ένα θετικό μάρτυρα για τη δέσμευση του αντι-ARG αντίσωμα, EFO-27 κύτταρα επιμολύνθηκαν με ένα πλασμίδιο έκφρασης ARG χρησιμοποιώντας Lipofectamine 2000 (Invitrogen).

SHB-δέσμευσης του EGF Δοκιμασία

Η δραστηριότητα σύνδεσης των αντι-ΗΒ-ΕΟΡ μονοκλωνικό αντίσωμα για SHB-EGF ανιχνεύθηκε όπως περιγράφηκε προηγουμένως [19]. SHB-EGF ή BSA ακινητοποιήθηκε στο 1 μg /mL σε πλάκα 96 φρεατίων όλη τη νύκτα στους 4 ° C. Μετά μη ειδική σύνδεση μπλοκαρίστηκε με PBS που περιείχε 1% BSA, το μονοκλωνικό αντίσωμα αντι-HB-EGF επωάσθηκε σε διάφορες συγκεντρώσεις στην πλάκα. HRP-σημασμένο αντίσωμα IgG αντι-ποντικού αντέδρασε στη συνέχεια για 1 ώρα σε θερμοκρασία δωματίου. ΤΜΒ Peroxidase ΕΙΑ Substrate (Bio-Rad) προστέθηκε στη συνέχεια σε κάθε φρεάτιο. δέσμευση σε SHB-EGF αντίσωμα ανιχνεύθηκε με μέτρηση της απορρόφησης στα 450 nm με τη χρήση ενός αναγνώστη πλάκας SPECTRA ΜΑΧ (Molecular Devices).

EGFR Δοκιμασία Φωσφορυλίωσης

Η ανασταλτική δράση του αντι-ΗΒ- EGF μονοκλωνικό αντίσωμα έναντι SHB-EGF-επαγόμενη φωσφορυλίωση του EGFR ανιχνεύθηκε όπως περιγράφηκε προηγουμένως [19]. NUGC-3 κύτταρα σπάρθηκαν σε 1 × 10

4 κύτταρα /φρεάτιο σε μέσο ΚΡΜΙ1640 με 1% ορό. Μετά από μία περίοδο επώασης 1-d, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με διάφορες συγκεντρώσεις του αντισώματος αντι-HB-EGF και 10 ηΜ SHB-EGF επί 15 λεπτά στους 37 ° C. Κυτταρολύματα παρασκευάστηκαν με ρυθμιστικό λύσης κυττάρου (Cell Signaling Technology) που περιέχει ένα κοκτέιλ αναστολέα πρωτεάσης (Roche Applied Science) και έναν αναστολέα φωσφατάσης κοκτέιλ (Sigma Aldrich) και χρησιμοποιήθηκαν για ανάλυση με ανίχνευση pEGFR κιτ ELISA (R &? D Systems).

πολλαπλασιασμού των κυττάρων και Caspase Δοκιμασίες

τα κύτταρα σπάρθηκαν σε μια συγκέντρωση 1 × 10

4 κύτταρα /φρεάτιο σε μέσο ΚΡΜΙ1640 που περιέχει 1% ορό σε πλάκες καλλιέργειας Celltight σφαιροειδές. Μετρήσαμε κασπάσης 3/7 ενεργοποίηση μετά από μία περίοδο επώασης 1-d χρησιμοποιώντας κασπάση-Glo 3/7 (Promega) και μετρήθηκε πολλαπλασιασμός των κυττάρων μετά από μία περίοδο επώασης 3-d χρησιμοποιώντας CellTiter-Glo (Promega). Οι μετρήσεις για τις δύο παραμέτρους ελήφθησαν χρησιμοποιώντας ένα όργανο Envision (Perkin Elmer). Ο πολλαπλασιασμός των κυττάρων υπολογίστηκε ως ποσοστό του επιπέδου πολλαπλασιασμού μετράται απουσία του αντισώματος.

siRNA Επιμόλυνση

NUGC-3 κύτταρα επιμολύνθηκαν με αρνητικό μάρτυρα siRNA ή ΗΒ-ΕΟΡ siRNA (Dharmacon) χρησιμοποιώντας Lipofectamine 2000 κατά τη διάρκεια της κυτταρικής καλλιέργειας 2D. Το ΗΒ-ΕΟΡ siRNA που χρησιμοποιούνται σε αυτή τη μελέτη ήταν ένα μίγμα 4 siRNAs, αγοράστηκε από την Dharmacon (cat. L-019624-00-005) και επιμολύνθηκε σε τελική συγκέντρωση 6 ηΜ (1,5 ηΜ για κάθε siRNA). Μετά την επιμόλυνση, τα κύτταρα μεταφέρθηκαν σε ένα 3D καλλιέργεια σφαιροειδές. κύτταρα siRNA επιμολυσμένα χρησιμοποιήθηκαν στη συνέχεια στη δοκιμασία πολλαπλασιασμού των κυττάρων. Μείωση στην έκφραση της πρωτεΐνης HB-EGF εξετάστηκε με western blot. έκφραση ΗΒ-ΕΟΡ ανιχνεύθηκε με πολυκλωνικό αντίσωμα αντι-HB-EGF και HRP-σημασμένο αντίσωμα IgG αντι-κατσίκας. β-ακτίνη, ένας εσωτερικός έλεγχος φόρτωσης, ανιχνεύθηκε με αντι-β-ακτίνης αντίσωμα και επισημασμένο με HRP αντίσωμα IgG αντι-κουνελιού.

Μέτρηση proHB-EGF Juxtacrine Δραστηριότητες

NUCG-3 τα κύτταρα επωάστηκαν με 200 ηΜ Y-142 ή Υ-073 για τους υποδεικνυόμενους χρόνους, με την προϋπόθεση σφαιροειδές καλλιέργειας. IgG ποντικού ελέγχου (200 ηΜ) και 1 ηΜ erlotinib χρησιμοποιήθηκαν επίσης στην δοκιμασία ως αρνητικός και θετικός έλεγχος, αντίστοιχα. Για την ανίχνευση της φωσφορυλίωσης του EGFR, κυτταρολύματα παρασκευάστηκαν όπως περιγράφεται παραπάνω επωάστηκαν σε πλάκα Reader Τομέα Imager 6000 (Meso Scale Discovery) προεπικαλυμμένα με αντι-ΕΟΡΚ πολυκλωνικό αντίσωμα. Η πλάκα στη συνέχεια επωάζεται με βιοτινυλιωμένο αντίσωμα αντι-φωσφοτυροσίνης, που ακολουθείται από επώαση με sulfotagged στρεπταβιδίνη. Για την ανίχνευση του συνολικού EGFR, τα κυτταρολύματα επωάστηκαν σε έναν τομέα Imager πλάκα 6000 Reader επικαλυμμένα με αντι-ΕΟΡΚ πολυκλωνικό αντίσωμα. Βιοτινυλιωμένη αντι-ΕΟΡΚ πολυκλωνικό αντίσωμα στη συνέχεια επωάστηκε στην πλάκα, που ακολουθείται από επώαση με sulfotagged στρεπταβιδίνη. Διαβάστε στη συνέχεια προστέθηκε ρυθμιστικό Τ (Meso Scale Discovery), και χημειοφωταύγεια μετρήθηκε με ένα όργανο Τομέα Imager 6000 (Meso Scale Discovery). Το σήμα φωσφορυλίωσης EGFR κανονικοποιήθηκε προς το συνολικό σήμα EGFR και στη συνέχεια υπολογίζεται ως το ποσοστό της μέγιστης φωσφορυλίωσης του EGFR που μετρήθηκε με την απουσία του Υ-142, Υ-073, τον έλεγχο IgG, και erlotinib.

Για η ανίχνευση της φωσφορυλίωσης της ERK1 /2 και ΑΚΤ, χρησιμοποιήσαμε το phosphoERK1 /2 και κιτ phosphoAkt (Meso Scale Discovery), αντίστοιχα, σύμφωνα με τις οδηγίες του προμηθευτή. Εν συντομία, κυτταρολύματα παρασκευάστηκαν όπως περιγράφεται παραπάνω προστέθηκαν στο πιάτο με κηλίδες αντι-ERK1 /2 και αντι phosphoERK1-2 αντισώματα /ή με κηλίδες αντι-ΑΚΤ και αντισώματα αντι-phosphoAkt. Στη συνέχεια, κάθε πλάκα επωάστηκε με sulfotagged /2 αντίσωμα αντι-ERK1 ή με sulfotagged αντι-ΑΚΤ αντίσωμα. Διαβάστε Τ ρυθμιστικό με συνέχεια προστέθηκε επιφανειοδραστικό και χημειοφωταύγεια μετρήθηκε με ένα Τομέας Imager 6000 μέσο. Το σήμα ERK1 /2 ή φωσφορυλίωση ΑΚΤ κανονικοποιήθηκε προς το συνολικό σήμα ERK1 /2 ή ΑΚΤ, αντίστοιχα. ERK1 /2 ή φωσφορυλίωση της ΑΚΤ στην συνέχεια υπολογίζεται ως το ποσοστό της μέγιστης ERK1 /2 ή ΑΚΤ φωσφορυλίωση, αντίστοιχα, η οποία μετράται απουσία του Υ-142, Υ-073, τον έλεγχο IgG, και erlotinib.

Ανίχνευση CTF

NUGC-3 κύτταρα επεξεργάστηκαν με 200 ηΜ Y-142 για 3 ημέρες ή 50 ηΜ ΡΜΑ για 30 λεπτά ως έλεγχος για εξωτομέα σκόρπισμα επαγωγή και την παραγωγή CTF. Τα κυτταρολύματα παρασκευάστηκαν όπως περιγράφεται παραπάνω υποβλήθηκαν σε στύπωμα western. Το θραύσμα CTF ανιχνεύτηκε χρησιμοποιώντας το αντι-CTF πολυκλωνικό αντίσωμα και επισημασμένο με HRP αντίσωμα IgG αντι-κουνελιού. Αντι-CTF πολυκλωνικό αντίσωμα παρήχθη με ανοσοποίηση ενός κουνελιού με ένα πεπτιδικό αντιγόνο που αντιστοιχεί στα αμινοξέα 185-208 του proHB-EGF, όπως περιγράφηκε προηγουμένως [20].

Αποτελέσματα

Χαρακτηρισμός Y -142 και Υ-073

Ένας μεγάλος αριθμός των εξουδετερωτικών αντισωμάτων αντι-HB-EGF παράχθηκαν χρησιμοποιώντας μια προσέγγιση υβριδώματος όπως αναφέρθηκε προηγουμένως [19]. Κατά τον χαρακτηρισμό των αντισωμάτων εξουδετέρωσης, βρήκαμε ότι τα αντισώματα έδειξαν δέσμευσης προς το παροδικά δεσμευμένη σε μεμβράνη μορφή του ΗΒ-EGF, proHB-EGF απόκλιση. Αυτό το εύρημα μας επέτρεψε να υποθέτουν ότι ο χαρακτηρισμός των αντισωμάτων θα οδηγήσει στην ταυτοποίηση της λειτουργίας proHB-EGF. Έχουμε επιλέξει 2 αντισώματα, Υ-142 ως συνδετικό proHB-EGF και Υ-073 ως συνδετικό υλικό μη-proHB-EGF, και συγκρίθηκαν τα χαρακτηριστικά τους σε καρκινικά κύτταρα. Πρώτον, επιβεβαίωσε ότι το Υ-142 και Υ-073 είχαν διαφορετικά προφίλ πρόσδεσης για καρκινικές κυτταρικές σειρές που εκφράζουν ενδογενώς proHB-EGF. Υ-142 συνδέεται προς τις δοκιμαζόμενες κυτταρικές γραμμές καρκίνου, ενώ το Υ-073 δεν έδειξε δέσμευση (Εικ. 1Α).

A. Η σύνδεση του αντι HB-EGF-αντισώματος σε proHB-EGF. Τα κύτταρα επωάστηκαν με αντίσωμα αντι-HB-EGF, που ακολουθείται από επώαση με Alexa488-επισημασμένο αντίσωμα αντι-ποντικού IgG. Η δέσμευση ανιχνεύθηκε με κυτταρομετρία ροής. Δεν IgG, μαύρη γραμμή? Υ-142, μαύρο ιστόγραμμα? Υ-073, γκρι ιστόγραμμα. Β Εκφραση του αμφιρεγουλίνη (ARG) σε καρκινικές κυτταρικές σειρές. Τα κύτταρα επωάστηκαν με αντι-ARG αντίσωμα, που ακολουθείται από επώαση με Alexa488-επισημασμένο αντίσωμα αντι-ποντικού IgG. Η δραστικότητα δέσμευσης του αντι-ARG αντίσωμα επιβεβαιώθηκε χρησιμοποιώντας EFO-27 κύτταρα επιμολυσμένα με ένα πλασμίδιο έκφρασης ARG. Δεν IgG, μαύρη γραμμή? αντι-ARG αντισώματος, γκρι ιστόγραμμα.

Η

συνδέτες EGFR περιλαμβάνουν HB-EGF, αμφιρεγουλίνη (ARG), παράγοντας αύξησης του όγκου α, β1 νεουρεγκιουλίνης, EGF, και betacellulin, και προηγούμενη μελέτη μας έδειξε ότι το Υ- 142 recognizesARG εκτός από ΗΒ-ΕΟΡ [21]. Και οι δύο συνδέτες εκφραζόμενη ως μορφή δεσμευμένη σε μεμβράνη στην επιφάνεια του κυττάρου [22]. Ως εκ τούτου, για να επιβεβαιωθεί ότι το Υ-142 σύνδεση σε κύτταρα οφειλόταν σε αναγνώριση της proHB-EGF, και όχι να ARG, ARG έκφραση εξετάστηκε με κυτταρομετρία ροής, και καμία έκφραση ARG ανιχνεύθηκε (Εικ. 1Β). Για να αποκλειστεί η πιθανότητα ότι το αντίσωμα αντι-ARG δεν είχαν δραστικότητα δέσμευσης για ARG, χρησιμοποιήσαμε επιμολυσμένα ARG ως θετικός έλεγχος. Αυτό το αποτέλεσμα επιβεβαίωσε επίσης ότι η πρόσδεση του Υ-142 για τις δοκιμαζόμενες κυτταρικές σειρές καρκίνου οφειλόταν σε αναγνώριση της proHB-EGF. Δοκιμάσαμε επίσης την ειδικότητα συνδέτη EGFR Υ-073, και το Υ-073 δεσμεύεται ειδικά με HB-EGF (δεν παρουσιάζονται τα δεδομένα).

Για να εξετασθεί περαιτέρω τα χαρακτηριστικά των αντισωμάτων, ελέγξαμε δραστικότητα δέσμευσης τους για SHB -EGF με ELISA. Είναι ενδιαφέρον ότι, Υ-142 και Y-073 συνδέεται με SHB-EGF με συγκρίσιμα ΕΚ

50 τιμές από 56 ρΜ και 110 ρΜ, αντίστοιχα, και κανένας από αυτούς δεν συνδέεται με το αρνητικό BSA ελέγχου (Εικ. 2Α). Επιπλέον, ελέγξαμε εξουδετέρωσης δραστικότητα τους επί SHB-EGF-επαγόμενη φωσφορυλίωση του EGFR. Η NUGC-3 κυτταρική γραμμή καρκίνου του στομάχου χρησιμοποιήθηκε για την ανίχνευση της φωσφορυλίωσης του EGFR, λόγω της υψηλής έκφρασης EGFR του. Όπως φαίνεται στο Σχ. 2Β, δύο από τα αντισώματα ανέστειλαν την φωσφορυλίωση του EGFR σε ένα εξαρτώμενο από τη συγκέντρωση τρόπο, με παρόμοιο IC

50 τιμές (Υ-142 = 3,8 ηΜ? Υ-073 = 4,1 ηΜ). Τα ευρήματα έδειξαν ότι μόνο το Υ-142 είχε την ικανότητα να συνδέονται με proHB-EGF, αν και οι δύο Υ-142 και Y-073 είχαν παρόμοια δέσμευση και την εξουδετέρωση των δραστηριοτήτων προς SHB-EGF.

Α. δραστηριότητα των Y-142 και Y-073 προς SHB-EGF δεσμευτική. Anti-HB-EGF αντίσωμα επωάστηκε σε διάφορες συγκεντρώσεις σε ένα SHB-EGF-επικαλυμμένα ή επικαλυμμένα με BSA πλάκα. Η σύνδεση αντισώματος ανιχνεύθηκε με ένα HRP-σημασμένο αντίσωμα αντι-ποντικού IgG. Υ-142 σύνδεση με BSA, λευκό τετράγωνο? Υ-073 σύνδεση με BSA, λευκό κύκλο? Υ-142 σύνδεση με SHB-EGF, μαύρο τετράγωνο? Υ-073 σύνδεση με SHB-EGF, μαύρο κύκλο. Τα σημεία δεδομένων αναπαριστούν τα μέσα ± τυπική απόκλιση (SD) των τιμών που αποκτήθηκαν εις διπλούν. δραστηριότητα Β εξουδετέρωσης των Υ-142 και Y-073 έναντι SHB-EGF-επαγόμενη φωσφορυλίωση του EGFR. Anti-HB-EGF αντίσωμα επωάστηκε στις υποδεικνυόμενες συγκεντρώσεις σε παρουσία 10 ηΜ SHB-EGF με NUGC-3 κύτταρα για 15 λεπτά στους 37 ° C. Τα κυτταρικά λύματα επωάστηκαν σε ένα τριβλίο αντίσωμα αντι-ΕΟΡΚ-επικάλυψη, που ακολουθείται από επώαση με HRP-σημασμένο αντίσωμα αντι-φωσφοτυροσίνης. Δεν SHB-EGF, λευκό κύκλο? SHB-EGF και IgG ελέγχου, λευκό τετράγωνο? SHB-EGF και Υ-142, μαύρο τετράγωνο? SHB-EGF και Υ-073, μαύρο κύκλο. Τα σημεία των δεδομένων αντιπροσωπεύουν τη μέση τιμή ± SD των τιμών που αποκτήθηκαν εις τριπλούν.

Η

κυτταρικού πολλαπλασιασμού και την επιβίωση Λειτουργίες του proHB-EGF

Μια προηγούμενη μελέτη έχει δείξει ότι proHB-EGF εμπλέκεται σε επαφής κυττάρου-κυττάρου [10]. Σε μια 3D καλλιέργεια σφαιροειδές, τα καρκινικά κύτταρα υφίστανται πιο εκτεταμένη κυττάρου-κυττάρου επαφές ό, τι σε μια καλλιέργεια 2D [23]. Έχουμε σκεφτεί ότι το κύτταρο-κύτταρο επαφή με τη μεσολάβηση αποτέλεσμα proHB-EGF μπορεί να είναι πιο έντονη και πιο εύκολο να ανιχνευθούν στο 3D πολιτισμό σφαιροειδές. Για το σκοπό αυτό, έχουμε δημιουργήσει ένα 3D δοκιμασία σφαιροειδή καλλιέργεια που βασίζεται σε κύτταρα με τη χρήση NUGC-3 κύτταρα. Όταν NUGC-3 κύτταρα σπάρθηκαν σε ένα πιάτο σφαιροειδές καλλιέργειας, σχημάτισαν ένα σφαιροειδές με μια μικρή μάζα κυττάρων στο κέντρο του πυρήνα και χαλαρά διανέμονται κύτταρα που περιβάλλουν τον πυρήνα (σκούρο γκρι και ανοιχτό γκρι, αντίστοιχα, στον έλεγχο PBS στο Σχ. 3Α ). Είναι ενδιαφέρον ότι, σύμφωνα με τη μέθοδο Υ-142, τα κύτταρα ήταν πιο διάχυτη και είχε ένα μικρότερο κεντρικό πυρήνα και ένα μεγαλύτερο φωτοστέφανο. Η μορφολογική αλλαγή που προκαλείται ειδικά από το Υ-142 προταθεί ότι αυτή η αλλαγή στη σφαιροειδή μορφολογία οφείλεται στη διαφοροποίηση των λειτουργιών proHB-EGF. Έχουμε διερευνηθούν περαιτέρω οι λειτουργίες proHB-EGF, χρησιμοποιώντας τη δοκιμασία 3D σφαιροειδές πολιτισμό. Στη δοκιμασία του πολλαπλασιασμού των κυττάρων, το Υ-142 ανέστειλε σημαντικά τον πολλαπλασιασμό των NUGC-3 σε εξαρτώμενο από τη συγκέντρωση τρόπο (Εικ. 3Β). Η αναστολή του πολλαπλασιασμού των κυττάρων έφθασε 72% στην μέγιστη συγκέντρωση αντισώματος. Σε αντίθεση, το Υ-073 δεν είχε καμία επίδραση επί του πολλαπλασιασμού. Παρόμοια αποτελέσματα ελήφθησαν σε άλλες κυτταρικές σειρές που δοκιμάστηκαν, δηλαδή, 5637 και BxPC-3 (Εικ. 3Β). Από το Y-073 ανέστειλε τις λειτουργίες της SHB-EGF και δεν είχε καμία επίδραση σε οποιαδήποτε από τις κυτταρικές σειρές proHB-EGF στον πολιτισμό σφαιροειδές, προτάθηκε ότι η λειτουργία των ενδογενών proHB-EGF ήταν κυρίαρχη στο σφαιροειδές πολιτισμό, σε σύγκριση με το λειτουργία των ενδογενών SHB-EGF. Αυτά τα αποτελέσματα έδειξαν ότι proHB-EGF λειτούργησε ως σημαντικός παράγοντας για τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων σε καρκινικά κύτταρα.

σφαιροειδές σχηματισμό και τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων από τη λειτουργία proHB-EGF αξιολογήθηκαν βάσει Υ-142 θεραπείας. Τα κύτταρα σπάρθηκαν σε ένα σφαιροειδές πλάκα καλλιέργειας με την παρουσία 1% ορού. Μετά από μία περίοδο επώασης 1-d, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με τις υποδεικνυόμενες συγκεντρώσεις αντι ΗΒ-ΕΟΡ-αντίσωμα και καλλιεργήθηκαν για 3 ημέρες. σχηματισμός Α σφαιροειδές NUGC-3 κύτταρα. Το μπαρ σε κάθε εικόνα δείχνει 500 μm. B. Αναστολή της proHB-EGF που εξαρτάται από τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων από το Υ-142. Ο πολλαπλασιασμός των κυττάρων μετρήθηκε με CellTiter-Glo και παρουσιάζεται ως το ποσοστό του πολλαπλασιασμού των PBS κατεργασμένα κύτταρα. Ελέγχου IgG, λευκό τετράγωνο? Υ-142, μαύρο τετράγωνο? Υ-073, μαύρο κύκλο. Τα σημεία των δεδομένων αντιπροσωπεύουν τη μέση τιμή ± SD των τιμών που αποκτήθηκαν εις τριπλούν. C. Αναγωγή σε πρωτεΐνες HB-EGF από HB-EGF siRNA. Κυτταρολύματα από επιμολυσμένα siRNA-NUGC-3 κύτταρα υποβλήθηκαν σε SDS-PAGE. HB-EGF ανιχνεύθηκε με κηλίδωση Western, με β-ακτίνη ως εσωτερικό έλεγχο. Δ Επιβεβαίωση του πολλαπλασιασμού proHB-EGF-εξαρτώμενη κυτταρική HB-EGF siRNA. NUGC-3 κύτταρα επιμολύνθηκαν με HB-EGF siRNA πριν από σφαιροειδές καλλιέργεια. Μία ημέρα μετά την επιμόλυνση siRNA, τα κύτταρα σπάρθηκαν σε ένα σφαιροειδές πλάκα καλλιέργειας. Ο πολλαπλασιασμός των κυττάρων μετρήθηκε με CellTiter-Glo και εμφανίζεται ως ποσοστό του κυτταρικού πολλαπλασιασμού του PBS κατεργασμένα κύτταρα. Τα σημεία των δεδομένων αντιπροσωπεύουν τη μέση τιμή ± SD των τιμών που αποκτήθηκαν εις τριπλούν.

Η

Για να επιβεβαιωθεί περαιτέρω ότι η αναστολή του πολλαπλασιασμού των κυττάρων που προκαλείται από την διατάραξη της λειτουργίας proHB-EGF, αξιολογήσαμε την επίδραση της ΗΒ- EGF siRNA επί του πολλαπλασιασμού των κυττάρων στην δοκιμασία σφαιροειδές για NUGC-3 κύτταρα. Μειωμένη έκφραση του proHB-EGF λόγω HB-EGF siRNA επιβεβαιώθηκε με κηλίδωση Western (Σχ. 3C). Σύμφωνα με την knockdown έκφρασης proHB-EGF, HB-EGF siRNA προκάλεσε μειωμένη πολλαπλασιασμό των κυττάρων (Σχ. 3D). Βρήκαμε ότι ο βαθμός της αναστολής του πολλαπλασιασμού των κυττάρων από ΗΒ-ΕΟΡ siRNA ήταν παρόμοια με αυτή που παρατηρήθηκε με το Υ-142. Τα αποτελέσματα αυτά συμφωνούν με την ιδέα ότι το Υ-142 αναστέλλει τη λειτουργία proHB-EGF, η οποία μπορεί να οδηγήσει σε μείωση του πολλαπλασιασμού των κυττάρων.

Για να εξερευνήσετε το μοριακό μηχανισμό που διέπει τις λειτουργίες των proHB-EGF στην κυτταρική επιβίωση, μετρήσαμε κασπάσης ενεργοποίηση, ένα γεγονός κλειδί στην απόπτωση [24], σε NUGC-3 κύτταρα. Όπως υποδεικνύεται στην Εικ. 4, το Υ-142 προώθησε την ενεργοποίηση της κασπάσης-3/7 (Εικ. 4), ενώ το Υ-073 δεν είχε καμία επίδραση. Αυτό το αποτέλεσμα έδειξε ότι proHB-EGF έχει δραστικότητα επιβίωσης κυττάρου σε καρκινικά κύτταρα και ότι η αναστολή proHB-EGF ενεργοποιεί κασπάση απόπτωση που διαμεσολαβείται.

Η δραστικότητα επιβίωσης κυττάρου proHB-EGF ελέγχθηκε με μέτρηση της ενεργοποίησης της κασπάσης. NUGC-3 κύτταρα σπάρθηκαν σε ένα σφαιροειδές πλάκα καλλιέργειας με την παρουσία 1% ορού. Μετά από μία περίοδο επώασης 1-d, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με Υ-142 και καλλιεργήθηκαν για 1 d. Η ενεργοποίηση της κασπάσης μετρήθηκε με κασπάση-Glo 3/7. Ελέγχου IgG, λευκό τετράγωνο? Υ-142, μαύρο τετράγωνο? Υ-073, μαύρο κύκλο. Τα σημεία των δεδομένων αντιπροσωπεύουν τη μέση τιμή ± SD των τιμών που αποκτήθηκαν εις τριπλούν.

Η

Η αναστολή της proHB-EGF Juxtacrine Δραστηριότητες από το Υ-142

Σε αντίθεση με SHB-EGF, το οποίο δρα αυτοκρινείς και παρακρινή μηχανισμούς, σηματοδότηση juxtacrine είναι ένας μηχανισμός μοναδική για proHB-EGF [11]. Υποθέσαμε ότι η επίδραση του Υ-142 μπορεί να διαμεσολαβείται κυρίως μέσω της αναστολής της proHB-EGF σηματοδότηση juxtacrine. Επειδή η δραστηριότητα juxtacrine αναφέρθηκε ότι είναι EGFR μεσολάβηση [11], μετρήσαμε τη φωσφορυλίωση του EGFR, καθώς και της κατάντη πρωτεϊνών του ERK1 /2 και ΑΚΤ, τα οποία εμπλέκονται στον πολλαπλασιασμό των κυττάρων και κασπάση απόπτωση που διαμεσολαβείται από, αντίστοιχα, σε NUGC -3 κύτταρα. Η erlotinib αναστολέα EGFR, χρησιμοποιήθηκε ως θετικός έλεγχος, ανέστειλε την φωσφορυλίωση του EGFR, ERK1 /2, και ΑΚΤ (Εικ. 5). Παρόμοια με την επίδραση της erlotinib, Υ-142 μείωσε τη φωσφορυλίωση του EGFR, ERK1 /2, και ΑΚΤ, ενώ το Υ-073, καθώς και IgG ελέγχου δεν το έκανε. Η αναστολή της φωσφορυλίωσης τους από το Υ-142 ήταν σημαντική στα 15 λεπτά μετά τη θεραπεία και διήρκεσε μέχρι 3 d, γεγονός που υποδηλώνει ότι το σήμα juxtacrine ήταν συστατικώς ενεργοποιημένο στο σφαιροειδές. Αυτά τα δεδομένα υποδηλώνουν ότι η δραστηριότητα juxtacrine proHB-EGF οδηγεί σε πολλαπλασιασμό των κυττάρων, καθώς και δραστηριότητες επιβίωσης των κυττάρων.

Δραστηριότητα juxtacrine

proHB-EGF μετρήθηκε χρησιμοποιώντας Υ-142. NUGC-3 κύτταρα σε ένα σφαιροειδές πλάκα καλλιέργειας υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 200 IgG ελέγχου ηΜ, 200 ηΜ Y-142, 200 ηΜ Y-073, ή 1 ηΜ erlotinib για τους υποδεικνυόμενους χρόνους. Α Φωσφορυλίωση του EGFR. B. Η φωσφορυλίωση του ERK1 /2. Γ φωσφορυλίωση της ΑΚΤ. Η φωσφορυλίωση υπολογίστηκε ως το ποσοστό της φωσφορυλίωσης του PBS κατεργασμένα κύτταρα. Τα σημεία των δεδομένων αντιπροσωπεύουν τη μέση τιμή ± SD των τιμών που αποκτήθηκαν εις τριπλούν. Η στατιστική ανάλυση εκτελέστηκε χρησιμοποιώντας το ζευγαρωμένο t-test (one-tailed, έναντι PBS-επεξεργασμένο δείγμα στο αντίστοιχο χρονικό σημείο). *, P & lt? 0,05? **, P & lt? 0.005? *** P & lt?. 0.0005

Η

Δεν Επίδραση της Y-142 για CTF Γενιάς

CTF, που παράγεται μαζί με την SHB-EGF από εξωτερικός τομέας απόπτωση, οδηγεί τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων [ ,,,0],25]. Για να αξιολογηθεί η συνεισφορά της CTF στην αναστολή του πολλαπλασιασμού των κυττάρων από το Υ-142, το ποσό CTF εξετάστηκε σε NUGC-3 κύτταρα. ΡΜΑ [26] χρησιμοποιήθηκε ως μάρτυρες για την τόνωση της εξωτομέα ρίχνοντας και CTF παραγωγής. Όπως φαίνεται στο Σχ. 6, η ποσότητα της CTF παράγεται παρουσία και απουσία του Υ-142 δεν ήταν σημαντικά διαφορετική, γεγονός που υποδηλώνει ότι το Υ-142 δεν είχε καμία επίδραση επί της παραγωγής CTF.

Η επίδραση της CTF στην παρατηρούμενη αναστολή του κυτταρικού πολλαπλασιασμού (Σχ. 3Β) εξετάστηκε με μέτρηση της ποσότητας της CTF. Κυτταρολύματα του ΡΜΑ-, IgG ελέγχου, Υ-142-, ή Υ-073-κατεργασμένα κύτταρα NUGC-3 υποβλήθηκαν σε SDS-PAGE. CTF ανιχνεύθηκε με αντι-CTF πολύκλωνο αντίσωμα στη δυτική αποτύπωση.

Η

Συζήτηση

HB-EGF αποτελείται από μια μορφή δεσμευμένη σε μεμβράνη (proHB-EGF), μια διαλυτή μορφή (SHB -EGF), και ένα Ο-τερματικό θραύσμα (CTF), και κάθε μορφή έχει ένα μοναδικό βιολογική δραστικότητα. Μεταξύ αυτών των 3 μορφές, η λειτουργία του SHB-EGF έχει ευρέως αξιολογηθεί χρησιμοποιώντας ανασυνδυασμένες πρωτεΐνες. Μέχρι σήμερα, η βιολογική δραστικότητα του proHB-EGF έχει προταθεί επί τη βάσει του αποτελέσματος της επιμολυσμένα proHB-EGF επί του πολλαπλασιασμού και την επιβίωση των κυττάρων που εκφράζουν EGFR [11], [14] – [16] ή επί τη βάσει του η επίδραση της proHB-EGF υπερέκφραση σε αυτόνομες κυτταρικό πολλαπλασιασμό [17], [18]. Ωστόσο, πληροφορίες σχετικά με τη λειτουργία proHB-EGF έχει λιγοστά και ασυνεπής, πιθανώς λόγω της έλλειψης μιας μεθόδου για την ειδική ενεργοποίηση ή αναστολή proHB-EGF. Σε ορισμένες άλλες μελέτες, uncleavable μεταλλαγμένο proHB-EGF (UC-proHB-EGF), η οποία έχει 2 αντικαταστάσεις αμινοξέων (Leu148 και Pro149) στην θέση διάσπασης, χρησιμοποιήθηκε για την αξιολόγηση proHB-EGF λειτουργία [26]. UC-proHB-EGF έχει αποδειχθεί ότι διαθέτει juxtacrine δραστικότητα σε κύτταρα που εκφράζουν EGFR-σταθεροποιημένο με φορμαλίνη [27]. Αν UC-proHB-EGF αντιπροσωπεύει πλήρως άγρια ​​λειτουργίες τύπου proHB-EGF ακόμα και σε ζωντανά κύτταρα, αυτή η μετάλλαξη μπορεί να είναι χρήσιμη για τον εντοπισμό λειτουργίες proHB-EGF στο σφαιροειδές πολιτισμό. Πρόσφατα, μια άλλη έκδοση του UC-proHB-EGF, του οποίου η θέση αποκοπής διεγράφη, χρησιμοποιήθηκε για να μελετήσει τις λειτουργίες proHB-EGF. Αυτό το UC-proHB-EGF απέτρεψε anoikis της Madin-Darby κύτταρα νεφρού σκύλου [28]. Ωστόσο, σε σύγκριση με αυτές τις προσεγγίσεις που χρησιμοποιούνται μέχρι σήμερα, υπάρχουν ορισμένα πλεονεκτήματα στην προσέγγισή μας χρησιμοποιώντας μια κουλτούρα 3D σφαιροειδές και ένα λειτουργικό αντίσωμα αντι-HB-EGF: οι λειτουργίες του ενδογενώς εκφράζονται proHB-EGF μπορεί να ανιχνευθεί, και στερέωση με φορμαλίνη, η οποία μπορεί να προκαλέσει αντικείμενα, δεν απαιτείται επειδή δεν υπάρχει ενδογενής λειτουργία SHB-EGF.

οι συσσωρευμένες εκθέσεις έδειξαν ότι σφαιροειδές μιμείται τον πολιτισμό το περιβάλλον του καρκίνου καλύτερο από ένα 2D πολιτισμού από την άποψη του κυττάρου-κυττάρου επαφές, ανθεκτικότητας στα φάρμακα, τα ναρκωτικά διείσδυση και θρεπτικά συστατικά της αποτελεσματικότητας [23], [29]? Ως εκ τούτου, οι λειτουργίες του ενδογενώς εκφράζονται proHB-EGF που βρέθηκαν στο 3D σφαιροειδές υποδηλώνουν ότι proHB-EGF μπορεί να παίζουν σημαντικό ρόλο στην πρόοδο του όγκου. Σε αυτή τη μελέτη, χρησιμοποιήσαμε 3 καρκινικές κυτταρικές σειρές που εκφράζουν ενδογενώς proHB-EGF. Υ-142 ανέστειλε τον πολλαπλασιασμό των NUGC-3 κύτταρα κατά 72%, 5.637 κύτταρα κατά 55%, και BxPC-3 κύτταρα κατά 24% στη μέγιστη συγκέντρωση (Σχ. 3Β). Όπως φαίνεται στο Σχ. 1A, οι 3 κυτταρικές σειρές έχουν διαφορετικά επίπεδα έκφρασης proHB-EGF (κύτταρα NUGC-3 & gt? 5637 κύτταρα & gt? BxPC-3 κύτταρα), η οποία μπορεί να εξηγήσει τη σχετική επίδραση των Y-142 για πολλαπλασιασμό. Οι κυτταρικές σειρές που προέρχονται από 3 στομάχι, κύστη, και του παγκρέατος καρκινικούς ιστούς, οι οποίες είναι γνωστό ότι υπερεκφράζουν HB-EGF [30] – [32]. HB-EGF έχει αναφερθεί να ρυθμίζεται προς τα πάνω σε άλλους τύπους καρκίνου, όπως του μαστού και των ωοθηκών και γλοιοβλαστώματος [33] – [35]? Ως εκ τούτου, proHB-EGF μπορεί να ασκήσει τις λειτουργίες της σε ένα ευρύ φάσμα τύπων καρκίνου.

Στην καλλιέργεια σφαιροειδές, η θεραπεία με το Υ-142 αύξησε τον αριθμό των κυττάρων που διαχέεται έξω από σφαιροειδή πυρήνα (Εικ. 3Α) . Η αναστολή της δραστικότητας juxtacrine proHB-EGF ανιχνεύεται ακόμα και 3 δ μετά την αγωγή Υ-142 (Εικ. 5), όταν η διάχυση των κυττάρων παρατηρήθηκε. Θεωρούμε ότι η proHB-EGF μεσολάβηση επαφής κυττάρου-κυττάρου συνδέεται άμεσα με τη δραστηριότητα της juxtacrine proHB-EGF. Τα αποτελέσματα της προηγούμενης μελέτης χρησιμοποιώντας UC-proHB-EGF υποστηρίζεται αυτό εικασίες από το ότι τα αποτελέσματα έδειξαν μια κυτταροπροστατευτική ρόλος του proHB-EGF ενισχύοντας EGFR μεσολάβηση επαφής μεταξύ κυττάρων και έδειξε ότι η ενεργοποίηση της κασπάσης ανεστάλη από την proHB-EGF /EGFR /AKT οδό [28]. Διαπιστώσαμε επίσης την ενεργοποίηση της κασπάσης και ανέστειλε EGFR και φωσφορυλίωση της ΑΚΤ από επεξεργασία Υ-142 στην καλλιέργεια σφαιροειδές (Εικ. 4, 5Α και 5C). Τα αποτελέσματά μας μπορεί να προέρχεται από την αναστολή της κυτταροπροστατευτικών ρόλος του proHB-EGF. Υποθέτουμε ότι η συνάρτηση αντι-κασπάση του proHB-EGF συμβάλλει στην επιβίωση των καρκινικών κυττάρων με αναστολή της απόπτωσης σήματα όπως αυτά που ενεργοποιούνται σε κύτταρα υποβάλλονται σε χημειοθεραπευτικούς παράγοντες, ραδιοθεραπεία, υποξία, και το ανοσοποιητικό μεσολάβηση κυττάρων κυτταροτοξικότητα. Μια προηγούμενη μελέτη ανέφερε ότι η αντι-αποπτωτική πρωτεΐνη BAG-1 μεσολαβεί στην επίδραση κυτταρικής επιβίωσης proHB-EGF [36]. Η τσάντα-1-προκαλούμενο αποτέλεσμα την επιβίωση των κυττάρων του proHB-EGF σημειώθηκε σε κύτταρα CHO, που στερούνται του EGFR, γεγονός που υποδηλώνει ότι η proHB-EGF /BAG-1 μονοπάτι χρησιμοποιεί EGFR-ανεξάρτητη κυτταρική επιβίωση σηματοδότησης. proHB-EGF μπορεί να χρησιμοποιεί τόσο τα EGFR-εξαρτώμενη και EGFR-ανεξάρτητες πορείες να ασκήσουν επιδράσεις επιβίωση των κυττάρων του. Επιπλέον, παρατηρήσαμε την αναστολή /2 φωσφορυλίωση ERK1 από Υ-142 (Σχ. 5Β), γεγονός που υποδηλώνει ότι το σήμα του πολλαπλασιασμού των κυττάρων από proHB-EGF προκαλείται μέσω της /2 οδό ERK1. Ενώ μέτρηση της δραστικότητας juxtacrine του proHB-EGF σε ένα 3D καλλιέργεια σφαιροειδές, σημειώσαμε την αναστολή της σηματοδότησης EGFR με Υ-142 (Εικ. 5), υποδηλώνοντας ότι proHB-EGF ασκεί την αντι-αποπτωτική και τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων λειτουργίες της γειτονικά κύτταρα μέσω μονοπάτι EGFR τους. Σε περιπτώσεις όπου τα καρκινικά κύτταρα εκφράζουν τόσο proHB-EGF και EGFR, το ίδιο κύτταρο μπορεί να δρα ως του δότη και του δέκτη των σημάτων επιβίωσης και πολλαπλασιασμό κυττάρου. Στο σύνολό τους, προβλέπουμε ότι proHB-EGF διεγείρει αποτελεσματικά την εξέλιξη του όγκου με την άμεση προώθηση του πολλαπλασιασμού των καρκινικών κυττάρων και αναστέλλοντας την απόπτωση. Όπως φαίνεται στο Σχ. 6, το Υ-142 δεν ανέστειλε εξωτομέα απόπτωση, οδηγώντας σε CTF παραγωγή. Ως εκ τούτου, κατέληξε στο συμπέρασμα ότι η βιολογική δραστηριότητα του Υ-142 που βρέθηκαν εδώ δεν οφείλεται στην αναστολή της παραγωγής CTF.